專利名稱：用Fusarium sp.N4－2菌株生產(chǎn)堿性脂肪酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生堿性脂肪酶的微生物Fusarium sp.N4-2菌株。
背景技術(shù)：
據(jù)本發(fā)明人通過(guò)查閱資料、文獻(xiàn)檢索所知，產(chǎn)生堿性脂肪酶的菌種主要來(lái)源于芽孢桿菌，無(wú)色桿菌，產(chǎn)堿桿菌和一些真菌。Eurotiales，Mucorales，Endomycetales中的某些菌株均可以產(chǎn)生堿性脂肪酶。但是國(guó)內(nèi)未見(jiàn)有鐮孢霉產(chǎn)堿性脂肪酶的報(bào)道。本發(fā)明菌株的形態(tài)和特征與鐮孢霉屬(Fusarium)相符。
堿性脂肪酶在工業(yè)上主要應(yīng)用于洗滌劑行業(yè)中作為添加劑使用，要求其在較寬的溫度和pH范圍內(nèi)具有較高的酶活性和穩(wěn)定性。還必須與洗滌劑中的表明活性劑、蛋白酶和多種氧化劑相融合。目前來(lái)源于微生物的堿性脂肪酶反應(yīng)的最適反應(yīng)溫度一般為30℃-65℃，最適反應(yīng)pH一般在8.5-10.0。本發(fā)明中Fusarium sp.N4-2菌株所產(chǎn)堿性脂肪酶的最適反應(yīng)溫度為30℃，最適反應(yīng)pH為9.0，且酶的最穩(wěn)定pH為9.0。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種來(lái)源于堿湖魚內(nèi)臟的菌株Fusarium sp.N4-2并利用該菌株生產(chǎn)堿性脂肪酶的方法，以及相關(guān)的酶學(xué)性質(zhì)。
本發(fā)明分離純化出一株來(lái)源于堿湖魚內(nèi)臟的菌株Fusarium sp.N4-2，保藏單位簡(jiǎn)稱CCTCC，保藏號(hào)為M205013，具有產(chǎn)堿性脂肪酶的的特性。本發(fā)明的特點(diǎn)是本發(fā)明首次分離出產(chǎn)堿性脂肪酶的Fusarium sp.N4-2菌株。該菌株在馬鈴薯培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，呈放射狀生長(zhǎng)，菌落為白色，培養(yǎng)物背部為淡黃色，菌絲為細(xì)長(zhǎng)的絨毛狀，直徑為2.5～7.0μm。30℃培養(yǎng)72h菌落直徑為0.5～1.0cm。大型分生孢子呈鐮刀形或梭形，內(nèi)有2～4個(gè)隔膜，以三隔膜的孢子居多，三隔膜的孢子大小為20～30μm×5.0～6.5μm，兩隔膜孢子大小為18～22μm×5.0～6.5μm，四隔膜孢子大小為38～42μm×6.0～6.25μm，小型分生孢子較少，有足細(xì)胞和間生的厚垣孢子。經(jīng)鑒定屬于鐮孢霉屬(Fusarium)(圖1為菌絲及孢子形態(tài))。
該菌種具有營(yíng)養(yǎng)要求范圍廣，容易培養(yǎng)和培養(yǎng)時(shí)間短的特點(diǎn)。特別是在本發(fā)明中營(yíng)養(yǎng)條件貧瘠的培養(yǎng)基中可以迅速的生長(zhǎng)，得到較高的產(chǎn)酶量。發(fā)酵培養(yǎng)52h，其發(fā)酵液中堿性脂肪酶的活力達(dá)到1001.4U/mg(30℃下測(cè)定)。用本發(fā)明的菌株作為堿性脂肪酶的生產(chǎn)菌株，具有產(chǎn)品的活性高、穩(wěn)定性好、生產(chǎn)周期短、成本低的特點(diǎn)，能夠?qū)崿F(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
通過(guò)分離純化，SDS-PAGE確定該菌株產(chǎn)生的堿性脂肪酶的分子量為36.8kDa(圖2)。
對(duì)該堿性脂肪酶的性質(zhì)研究表明，最適反應(yīng)溫度為30℃，0℃時(shí)測(cè)定仍能夠有50％的酶活，在10℃～50℃時(shí)測(cè)定，酶活力較高仍能保持80％以上，因此，此酶是一個(gè)耐低溫的堿性脂肪酶；酶的最適反應(yīng)pH為9.0，且此酶在pH為9.0時(shí)的穩(wěn)定性最高，并且此酶在8.0～11.0的范圍內(nèi)保持較高的活性，對(duì)堿性環(huán)境有較強(qiáng)的耐受性。該酶具有良好的抗表面活性劑與氧化劑特性。與吐溫-80、膽酸鈉、Trixon-X100于30℃下保溫1小時(shí)后，堿性脂肪酶活力均有不同程度的提高(圖3)。此酶對(duì)NaClO和H2O2均有一定程度的耐受性(圖4、圖5)。
通過(guò)查閱文獻(xiàn)、資料檢索可知，此鐮孢菌菌株產(chǎn)堿性脂肪酶未見(jiàn)有報(bào)到，且此菌株Fusarium sp.N4-2所產(chǎn)堿性脂肪酶的分子量與已報(bào)到的堿性脂肪酶的分子量不同(表1)。


圖1，菌株Fusarium sp.N4-2的菌絲及孢子形態(tài)。
圖2，純化的堿性脂肪酶的SDS-PAGE電泳結(jié)果。左邊為純酶單帶，右邊為標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量。
圖3，不同濃度的吐溫-80、膽酸鈉、Trixon-X100于30℃下保溫1小時(shí)后，殘余酶活力。
圖4，不同濃度的NaClO與此酶在30℃下保溫1小時(shí)后，殘余酶活力。
圖5，不同濃度的H2O2與此酶在30℃下保溫1小時(shí)后，殘余酶活力。
具體實(shí)施例方式
從堿湖魚內(nèi)臟中無(wú)菌采取樣品，將樣品均勻的涂布在固體的花生油平板培養(yǎng)基上，在30℃下培養(yǎng)48h，選取在花生油平板上生長(zhǎng)良好且產(chǎn)生透明圈大的菌落，通過(guò)測(cè)定其發(fā)酵液的堿性脂肪酶活力，得到一株堿性脂肪高產(chǎn)菌株。對(duì)該菌株進(jìn)行形態(tài)觀察鑒定為鐮孢霉屬(Fusarium)?；ㄉ凸腆w平板培養(yǎng)基的組成為花生油20ml，蛋白胨5g，牛肉膏5g，(NH4)2SO45g，MgSO40.5g，K2HPO44g，CaCl20.2g，NaNO32g，聚乙烯醇(PVA)1.2g，瓊脂12g，H2O1000ml，pH9.5。
菌種Fusarium sp.N4-2經(jīng)固體的土豆培養(yǎng)基(pH 9.5)培養(yǎng)生長(zhǎng)良好后，接種到裝有75ml的發(fā)酵培養(yǎng)基橄欖油30g，酵母膏5g，(NH4)2SO43g，MgSO40.75g，CaCl20.2g，K2HPO44g，PVA 1.8g，H2O1000ml，pH9.5的250ml的三角瓶中，30℃振蕩培養(yǎng)52h，培養(yǎng)液在4℃下3500rpm離心10min去除菌體，獲得發(fā)酵酶液。堿性脂肪酶比活力的測(cè)定方法(1)酶活力測(cè)定的條件將橄欖油與2％的聚乙烯醇溶液按1∶3(v/v)混合，在組織攪拌機(jī)中高速勻漿混合為乳白色的乳化液。取乳化液底物與pH為9.5的甘氨酸-NaOH緩沖液以4∶5混合，調(diào)節(jié)pH到9.5，作為反應(yīng)液。在9ml反應(yīng)液中加入1ml酶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，30℃反應(yīng)10min，加入15ml無(wú)水乙醇終止反應(yīng)，定義每分鐘催化水解橄欖油產(chǎn)生1μmol的脂肪酸的酶量定義為一個(gè)酶活力單位(U)。(2)蛋白含量的測(cè)定Folin酚法測(cè)定堿性脂肪酶樣品中的蛋白質(zhì)含量。(3)比活力計(jì)算公式比活力(U/mg)＝酶活力(U/ml)÷蛋白含量(mg/ml)該菌種產(chǎn)生堿性脂肪酶的分子量測(cè)定采用丙酮沉淀得到的酶蛋白在50mmol甘氨酸-NaOH pH9.0的緩沖液中復(fù)溶，經(jīng)Q-sepharose陰離子交換柱層析分離純化。SDS-PAGE得到一條單帶，分子最為36.8kDa。
表1菌株Fusarium sp.N4-2產(chǎn)酶與其它菌株產(chǎn)酶的比較

權(quán)利要求
1.對(duì)堿性脂肪酶生產(chǎn)菌種Fusarium sp.N4-2 CCTCC M205013實(shí)施專利保護(hù)。
2.對(duì)利用Fusarium sp.N4-2 CCTCC M205013產(chǎn)生堿性脂肪酶實(shí)施專利保護(hù)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生堿性脂肪酶的微生物菌株及利用該菌株生產(chǎn)堿性脂肪酶的方法。本發(fā)明分離純化出一株來(lái)源于堿湖魚內(nèi)臟的菌株，此菌株具有產(chǎn)堿性脂肪酶的的特性。該菌種具有營(yíng)養(yǎng)要求范圍廣，容易培養(yǎng)和培養(yǎng)時(shí)間短的特點(diǎn)。用本發(fā)明的菌株作為堿性脂肪酶的生產(chǎn)菌株，具有產(chǎn)品的活性高、pH及熱穩(wěn)定性好、可抗表面活性劑和氧化劑、生產(chǎn)周期短、成本低等特點(diǎn)，易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化的生產(chǎn)。能夠開(kāi)發(fā)成一種新型的應(yīng)用于常溫和低溫洗滌劑的酶制劑，也可以應(yīng)用于食品改性劑和風(fēng)味調(diào)節(jié)劑。
文檔編號(hào)C12N9/20GK1958783SQ20051011977
公開(kāi)日2007年5月9日 申請(qǐng)日期2005年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月5日
發(fā)明者江曉路, 劉瑞志 申請(qǐng)人:中國(guó)海洋大學(xué)