專利名稱：利用微磁珠和激光快速破碎細胞或病毒的方法和裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用微磁珠和激光快速破碎(disruption)細胞或病毒的方法和裝置。
背景技術(shù)：
一般地，具體的病原菌(pathogenic bacteria)的分子診斷以四個步驟進行1)細胞裂解，2)DNA分離，3)DNA擴增和4)DNA檢測。
在許多應(yīng)用中需要從細胞有效地提取DNA，并且在分子診斷中是不可缺少的，尤其是在病原菌的鑒定和定量中。分子診斷通常在提取DNA后通過DNA擴增而進行。DNA擴增包括聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)、連接酶鏈式反應(yīng)、鏈置換擴增、基于核酸的擴增、修復(fù)鏈式(repair chain)反應(yīng)、解旋酶(helicase)鏈式反應(yīng)、QB復(fù)制酶(replicase)擴增、連接激活轉(zhuǎn)錄(ligation activated transcription)。
使用具有結(jié)合DNA傾向的物質(zhì)來實施從細胞分離DNA的方法。用于DNA分離的物質(zhì)的實例包括硅石(silica)、玻璃纖維、陰離子交換樹脂和磁珠(Rudi，K.等，Biotechniqures 22，506-511(1997)；和Deggerdal，A.等，Biotechniqures 22，554-557(1997))。為避免手工步驟和消除操作者的誤差，研制一些用于高通量(high-throughput)DNA提取的自動化儀器。
細胞裂解通常通過機械法、化學(xué)法、熱法、電法、超聲波法或微波法得以實施(Michael T.Taylor等，Anal.Chem.，73，492-496(2001))。
化學(xué)法包括利用裂解劑破碎細胞以釋放DNA。使用離液劑(chaotropic)進行細胞提取物的附加處理是為變性蛋白質(zhì)所必需的?；瘜W(xué)裂解法不利在于使用粗制化學(xué)品來破碎細胞。由于它們會干擾隨后的PCR，必須在PCR前純化DNA。化學(xué)法是費力費時的，需要昂貴的消耗品而且經(jīng)常得到低DNA產(chǎn)量。熱法包括凍/融的循環(huán)，但經(jīng)常不能破碎細胞內(nèi)的許多結(jié)構(gòu)。
加熱是破碎細胞壁或膜的可選擇方法。簡單加熱不利在于它導(dǎo)致蛋白質(zhì)的變性，其可附著于釋放的DNA。它們也可干擾DNA擴增。物理法使用龐大的和昂貴的壓力裝置，其不適合芯片實驗室(Lab-on-a-chip)(LOC)應(yīng)用。
超聲波處理是物理法的替換方案，其中細胞溶液或懸浮液置于超聲波浴(bath)中的小室中。超聲波破碎在細胞裂解中具有許多缺點。首先，超聲能的分布不均勻。超聲能的不均勻分布帶來不一致的結(jié)果。其次，由于在超聲波浴中能量分散，經(jīng)常需要幾分鐘來完全破碎細胞。最后，超聲波法產(chǎn)生令人不適的聲波。
激光在細胞破碎中具有許多優(yōu)點，可容易地應(yīng)用于LOC(Huaina Li等，AnalChem，73，4625-4631(2001))。
美國公開專利2003/96429A1公開激光誘導(dǎo)的細胞裂解系統(tǒng)。當只使用激光時，并沒有出現(xiàn)高效的細胞裂解。作為使用很清澈的溶液中的大腸桿菌進行實驗的結(jié)果，可以確定當只用激光照射時，可獲得較低的細胞裂解率。在激光照射150秒鐘后，測量的DNA濃度是3.77ng/ul，這是因為激光能量沒有有效地轉(zhuǎn)入細胞。依靠常規(guī)加熱法在95℃煮沸細胞5分鐘后，測量的DNA濃度是6.15ng/μl。
美國專利6,685,730公開用于增強組織修復(fù)的光學(xué)吸收性納米粒子(optically-absorbing nanoparticle)。該專利包括連接組織的方法，包括將可在一個或多個波長吸收光的、具有1至1000納米尺寸的納米粒子輸送到要被連接的組織；和將所述的納米粒子暴露于可被該納米粒子吸收的一個或多個波長的光。該方法通過使用激光和納米粒子只引起細胞的功能喪失，并沒有描述通過振蕩含有細胞和微粒的溶液而破碎細胞的方法。
因此，為克服以上問題，發(fā)明者進行深入研究并發(fā)現(xiàn)使用微磁珠和激光，當振蕩含有細胞或病毒的溶液時，所述的細胞或病毒能得以快速地破碎。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供破碎細胞或病毒的方法，該方法包括將磁珠加入含有細胞或病毒的溶液中；振蕩磁珠；和用激光照射磁珠以破碎細胞或病毒。
本發(fā)明還提供用于破碎細胞或病毒的裝置，包括具有輸入樣品和磁珠的入口(inlet hole)的細胞裂解小室；連接于所述小室并使該小室中的樣品和磁珠混合的振蕩器；和連接于所述小室并提供激光的激光發(fā)生器(laser generator)。
本發(fā)明還提供用于破碎細胞或病毒的裝置，包括具有輸入樣品和磁珠的入口的細胞裂解芯片(chip)；通過振蕩傳遞部件(vibration transfer part)連接于所述芯片的振蕩器以在該芯片上混合所述的樣品和磁珠，連接于所述芯片的振蕩傳遞部件將振蕩傳遞到所述芯片；連接于所述芯片的激光發(fā)生器提供激光；和連接于所述芯片的抗蒸發(fā)部件(anti-evaporation part)以抑制所述樣品的蒸發(fā)。
本發(fā)明還提供用于破碎細胞或病毒的裝置的細胞裂解芯片，包括具有暴露的頂面和底面(opened top surface and bottom surface)的芯片體，并包括反應(yīng)室、入口(inlet hole)和出口(outlet hole)；連接于芯片體頂面的芯片蓋(cover)以關(guān)閉所述反應(yīng)室的上部(upper portion)，可允許激光穿過，并具有入口和出口；以及通過芯片連接部件(chip bonding part)連接于芯片體底面的芯片底部(chip bottom)，以關(guān)閉所述反應(yīng)室的下部、入口以及出口。


通過結(jié)合附圖對本發(fā)明的代表性的實施方案進行詳細描述，本發(fā)明的以上和其他特征以及優(yōu)點將會變得更加清楚，其中圖1是利用微磁珠和激光用于細胞裂解的系統(tǒng)的示意圖；圖2A是根據(jù)本發(fā)明實施方案利用激光和微磁珠用于微芯片上細胞裂解的系統(tǒng)的示意圖；圖2B是圖2A中顯示的系統(tǒng)的設(shè)計；圖3是細胞裂解裝置的隔片部的照片；圖4是在利用微磁珠和激光在用于破碎細胞的裝置中所用微芯片的實施方案的示意圖；圖5是根據(jù)本發(fā)明實施方案的微芯片的照片；圖6表示在激光照射后確定細胞生存力的結(jié)果；圖7顯示僅存在微磁珠時，激光照射有效地釋放細菌DNA；圖8顯示通過激光照射釋放的DNA比通過常規(guī)方法制備的DNA可被Taq聚合酶更高效地擴增；圖9顯示磁珠大小的影響；圖10是顯示Pyrex 7740和抗反射(AR)包被的Pyrex 7740的透射率(transmittance)的曲線圖；圖11是在激光照射后根據(jù)本發(fā)明實施方案的細胞裂解芯片的照片；圖12是表示相對于磁珠濃度，從大腸桿菌細胞釋放的DNA的PCR結(jié)果曲線圖；圖13是顯示相對于振蕩器電壓，從大腸桿菌細胞釋放的DNA的PCR結(jié)果曲線圖；
圖14是顯示相對于激光功率(laser power)，從表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)細胞(1×105細胞/μl)中釋放的DNA的PCR結(jié)果曲線圖；圖15是顯示相對于激光功率，從表皮葡萄球菌細胞(1×102細胞/μl)中釋放的DNA的PCR結(jié)果曲線圖；圖16是顯示從表皮葡萄球菌細胞和變異鏈球菌(Streptococcus mutans)細胞中釋放的DNA的PCR結(jié)果曲線圖；圖17是顯示相對于激光功率，從大腸桿菌細胞(1×105細胞/μl)中釋放的DNA的PCR結(jié)果曲線圖；圖18是顯示相對于激光功率，從大腸桿菌細胞(1×102細胞/μl)中釋放的DNA的PCR結(jié)果曲線圖；圖19是顯示相對于激光功率，大腸桿菌樣品的溫度的曲線圖；圖20是顯示相對于磁珠的表面電荷和珠子材質(zhì)，從大腸桿菌細胞(1×105細胞/μl)中釋放的DNA的PCR結(jié)果曲線圖；圖21顯示根據(jù)本發(fā)明實施方案的磁珠表面上的亞氨二乙酸(IDA)、Cu-IDA、芘(pyrene)和硫醇官能團的合成過程；圖22是相對于磁珠表面上的官能團，從大腸桿菌細胞中釋放的DNA的PCR結(jié)果[交點(crossing point)(Cp)]的曲線圖；圖23顯示合成磁珠表面上的聚羧基官能團的實施方案；圖24是顯示相對于磁珠表面上的官能團和珠子溶液的pH，從大腸桿菌細胞中釋放的DNA的PCR結(jié)果(Cp)的曲線圖；圖25是顯示存在10％血清時相對于磁珠表面上的官能團，從大腸桿菌細胞中釋放的DNA的PCR結(jié)果(Cp)的曲線圖；圖26是顯示存在10％血清時相對于磁珠表面上的官能團，從乙型肝炎病毒(HBV)中釋放的DNA的PCR結(jié)果(PCR產(chǎn)物的濃度)的曲線圖；圖27是顯示相對于激光照射，大腸桿菌細胞生存力的照片；和圖28是激光照射攜帶pCRII-TOPO(Invitrogen)質(zhì)粒的大腸桿菌BL21細胞后，DNA分析的照片。
具體實施例方式
在下文，本發(fā)明得到更詳細地描述。
根據(jù)本發(fā)明實施方案破碎細胞或病毒的方法包括將磁珠加入含有細胞或病毒的溶液中；振蕩磁珠；和用激光照射磁珠以破碎細胞或病毒。
在該方法中，將激光射入含有磁珠的溶液中，磁珠由于激光的能量而引起燒蝕(ablation)，并將沖擊波(shock waves)、蒸氣壓和熱量傳遞到細胞表面。此時，物理沖擊(shock)也可施加于細胞表面。通過激光加熱的磁珠提高所述溶液的溫度并直接破碎細胞。所述溶液中的磁珠并不充當單純的熱導(dǎo)體，而將熱、機械和物理沖擊施加于細胞表面，從而有效地破碎細胞表面。
利用磁珠和激光的快速細胞裂解通過在液體介質(zhì)中加熱和激光燒蝕(laserablation)得以進行。所述的激光連同微磁珠把熱源轉(zhuǎn)換為高度受熱的磁珠的物理和機械沖擊以促進細胞裂解。近年來，小尺寸、大功率的激光二極管得到快速地發(fā)展，使用相同技術(shù)的很小的細胞裂解裝置將能夠安裝于芯片實驗室(Lab-on-acbip)(LOC)上。此外，借助于光學(xué)纖維、鏡子或透鏡或直接這樣做，激光可將動力和能量集中在芯片上的具體區(qū)域。
磁珠的最大優(yōu)點是減化DNA分離步驟，因為借助于微磁珠和激光的細胞裂解可導(dǎo)致蛋白質(zhì)的變性。變性的蛋白質(zhì)和細胞碎片附著于磁珠并通過重力或磁力得以除去。結(jié)果，降低了檢測極限，DNA提取時間由于省略了DNA提取過程的一個步驟而顯著地縮短，聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)分析的結(jié)果由于信號幅度的增加而顯著地改善。利用微磁珠和激光破碎細胞所需的總時間僅僅是40秒鐘。
激光燒蝕(laser ablation)指物質(zhì)暴露于激光束中產(chǎn)生的現(xiàn)象。激光燒蝕可將物質(zhì)表面的溫度從幾百度快速提高到幾千度。如果物質(zhì)表面的溫度被提高到汽化點或更高，表面的飽和蒸氣壓根據(jù)液相物質(zhì)的蒸發(fā)作用而快速地提高。飽和蒸氣壓通過Clausius-Clapeyron方程以溫度函數(shù)表示，并在大功率脈沖激光過程的情況下通常上升到幾十個大氣壓(atm)或更高。通過噴出的蒸氣而施加于物質(zhì)表面的壓力稱作“排斥壓(repulsive pressure)”，并且排斥壓值是約0.56Psat，其中Psat表示蒸氣壓。
在使用具有極大的瞬時強度的激光(如脈沖激光)的過程中可產(chǎn)生沖擊波。在從幾毫微秒(nano second)到幾十毫微秒短時間地被加熱到汽化點或更高的物質(zhì)的表面上生成的蒸氣，從幾個大氣壓增長到幾十個大氣壓的壓力，并形成沖擊波，同時膨脹到周圍空氣中。由于極高的壓力，膨脹的蒸氣對物質(zhì)施加約0.56Ps(其中Ps表示表面的飽和蒸氣壓)。
在本發(fā)明的實施方案中，所述的激光包括脈沖激光或連續(xù)波(CW)激光。
在很低的激光功率時，不能有效地發(fā)生激光燒蝕。對于CW激光，該激光功率是10mW或更高，對于脈沖激光則是1mJ/脈沖或更高。優(yōu)選地，脈沖激光是3mJ/脈沖或更高，CW激光具有100mW或更高的功率。這是因為當CW低于10mW和脈沖激光低于1mJ/脈沖時，不能傳遞破碎細胞的充足能量。
在本發(fā)明的實施方案中，所述的激光應(yīng)該在磁珠可吸收激光能量的特異波長范圍內(nèi)得以產(chǎn)生。優(yōu)選激光在400nm或更高的波長范圍內(nèi)，更優(yōu)選在750nm到1300nm的波長范圍內(nèi)得以產(chǎn)生。這是因為DNA在低于400nm的波長變性或被破壞。所述的激光也可在一個或多個波長范圍內(nèi)產(chǎn)生。就是說，激光可具有在上述范圍內(nèi)的一個波長或兩個或多個不同波長。
在本發(fā)明的實施方案中，所述磁珠的直徑優(yōu)選從50nm到1,000μm，更優(yōu)選從1μm到50μm。當磁珠的直徑小于50nm時，物理和機械沖擊不足以導(dǎo)致細胞裂解。當磁珠直徑超過1,000μm時，則不適于LOC。所述的磁珠也可以是兩種或多種尺寸的珠子混合物。就是說，磁珠具有彼此相等的尺寸或者是具有不同尺寸的珠子混合物。
在本發(fā)明的實施方案中，所述的磁珠可以是任何的磁化物質(zhì)。具體地說，磁珠優(yōu)選包括至少一種選自鐵磁Fe、Ni、Cr或其氧化物的物質(zhì)。
在本發(fā)明的實施方案中，所述的磁珠可以是用鐵磁金屬包被的聚合物、有機物、硅或玻璃。
在本發(fā)明的實施方案中，磁珠表面優(yōu)選帶負電荷以使DNA不會附著在其上面。因為DNA帶負電荷，由于排斥力它不會附著于帶負電荷的磁珠。當DNA附著于所述磁珠時，在破碎細胞后很難從磁珠分離DNA，這使得DNA純化變得困難。
在本發(fā)明的實施方案中，磁珠表面上的官能團可以是親水性的，并且含有磁珠的溶液具有6-9的pH。從裂解的細胞中獲得的DNA的擴增效率可根據(jù)磁珠表面上的官能團和含有磁珠的溶液的pH而變化。當官能團的親水性增強時，細胞裂解后DNA的擴增效率得以提高。優(yōu)選地，官能團是具有負電荷的羧基或其衍生物。羧基衍生物包括亞氨二乙酸(IDA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、檸檬酸、多羧酸(polycarboxylic acid)等等。含有磁珠的溶液的pH優(yōu)選是6-9。如果pH在以上范圍之外，細胞裂解后DNA的擴增效率降低。
在本發(fā)明的實施方案中，所述的溶液選自唾液、尿液、血液、血清或細胞培養(yǎng)物溶液。所述的溶液可以是任何含有核酸的溶液，諸如動物細胞、植物細胞、細菌、病毒、噬菌體等等。
根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案用于快速破碎細胞或病毒的裝置包括具有輸入樣品和微磁珠的入口的細胞裂解小室；連接于所述小室并該小室中的樣品和微磁珠混合的振蕩器(vibrator)；以及連接于所述小室并提供激光的激光發(fā)生器。
圖1是利用激光和微磁珠(macro magnetic beads)，用于細胞裂解的系統(tǒng)的實施方案的示意圖。樣品通過入口得以供應(yīng)。將樣品與磁珠徹底地混合。樣品和磁珠的徹底混合通過振蕩器得以進行。當振蕩所述的混合物時發(fā)射出激光。細胞裂解小室窗口應(yīng)該由激光能充分穿過的物質(zhì)組成。暴露于激光的磁珠將光轉(zhuǎn)化為熱，也就是出現(xiàn)激光燒蝕。熱、振蕩、沖擊波、蒸氣壓等等由于有效的熱傳遞和持續(xù)振蕩引起的磁珠與細胞的碰撞而得以充分地轉(zhuǎn)化。當細胞裂解小室的溫度通過激光得以提高時，打開石蠟閥(paraffin valve)，這可通過石蠟閥的厚度得以控制。在破碎足夠的細胞后，關(guān)閉激光并且剩下的微磁珠通過電磁體得以除去。如果石蠟閥通過加熱得以除去，將得到的溶液上樣至擴增純化的DNA的PCR小室。
在本發(fā)明的實施方案中，所述的振蕩器包括超聲波儀、利用磁場的振蕩器、利用電場的振蕩器、機械振蕩器例如渦流儀(vortex)等等，或壓電(piezoelectric)材料。所述的振蕩器連接于細胞裂解小室，并可以是任何能振蕩細胞和微磁珠的混合溶液的裝置。
在本發(fā)明的實施方案中，用于快速破碎細胞或病毒的裝置還可包括完成細胞裂解后，連接于所述的細胞裂解小室并除去細胞裂解小室中磁珠的電磁體(electromagnet)。該電磁體可連接于所述的細胞裂解小室，并且為了LOC實現(xiàn)(implementation)的目的，完成細胞裂解后磁珠可通過所述的電磁體得以除去，以使所破碎的細胞溶液能直接上樣至PCR小室而不必進行磁珠的分離。為了被電磁體除去，所述的珠子應(yīng)該能被磁化。
在本發(fā)明的實施方案中，如果需要純化更完全的DNA，用于快速破碎細胞或病毒的裝置還可包括通過PCR小室前的通道連接于細胞裂解小室的DNA純化小室。如果利用磁場或電場的石蠟閥或MEMS結(jié)構(gòu)的閥門在完成細胞裂解后被打開，所述的DNA純化小室可連接于所述的細胞裂解小室以純化DNA。
在本發(fā)明的實施方案中，用于快速破碎細胞或病毒的裝置還可包括位于連接所述細胞裂解小室的通道的石蠟閥，其厚度由細胞裂解時間控制。當細胞裂解小室的溫度通過激光得以提高時，打開石蠟閥，這可由該石蠟閥的厚度得以控制。
在本發(fā)明的實施方案中，用于快速破碎細胞或病毒的裝置還包括通過通道連接于所述細胞裂解小室的DNA擴增小室。由于如上所述可獲得由微磁珠純化的效果，所述的DNA擴增小室可直接連接于所述的細胞裂解小室。
在本發(fā)明的實施方案中，用于快速破碎細胞或病毒的裝置還包括通過通道連接于所述細胞純化小室的DNA擴增小室。為了LOC實現(xiàn)的目的，需要純化的DNA的擴增系統(tǒng)。純化的DNA利用分光光度計、微磁珠、電化學(xué)法、電致化學(xué)發(fā)光法(electrochemiluminescence)、輻射和熒光標記、實時PCR法等等得以檢測。所述的PCR法是最適合于充分擴增需要的DNA?？蓱?yīng)用其他DNA擴增法，而通過實時PCR法等進行直接檢測也是可能的。
根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案用于破碎細胞或病毒的裝置包括具有輸入樣品和磁珠的入口的細胞裂解芯片；通過振蕩傳遞部件連接于所述芯片的振蕩器以在該芯片中混合所述的樣品和磁珠，連接于所述芯片的振蕩傳遞部件將振蕩傳遞到芯片；連接于所述芯片的激光發(fā)生器提供激光；和連接于所述芯片的抗蒸發(fā)部件以抑制所述樣品的蒸發(fā)。
圖2A是利用了激光和微芯片上的微磁珠，在細胞裂解中應(yīng)用的系統(tǒng)的實施方案的示意圖，圖2B是圖2A中所示系統(tǒng)的設(shè)計。細胞裂解芯片是利用通過入口導(dǎo)入的樣品和磁珠而裂解細胞或病毒的裝置。所述的細胞裂解芯片包括芯片蓋、芯片體、芯片連接部件(a chip bonding part)以及芯片底部。隨后將更加具體地描述細胞裂解芯片的元件。所述細胞裂解芯片功能是作為裂解細胞或病毒的反應(yīng)室。
所述的振蕩器通過振蕩傳遞部件連接于所述的細胞裂解芯片，并使該細胞裂解芯片中的樣品和磁珠混合。所述的振蕩器可以是豎直振蕩。所述的振蕩器包括超聲波儀、利用磁場的振蕩器、利用電場的振蕩器、機械振蕩器例如渦流儀等等，或壓電材料。所述的振蕩器可以是任何能振蕩細胞和微磁珠的混合溶液的裝置。所述的振蕩器可以是用于移動電話(mobile phone)的振蕩傳動器(motor)。
通過細胞裂解芯片底部表面，振蕩傳遞部件可傳遞由振蕩器對小室產(chǎn)生的振蕩。所述的振蕩傳遞部件可由金屬例如鋁組成。
所述的激光發(fā)生器連接于所述的細胞裂解芯片并提供對該細胞裂解芯片的激光。
所述的抗蒸發(fā)部件連接于所述的細胞裂解芯片以防止樣品免于蒸發(fā)。當使用激光裂解細胞時，由于溫度提高而出現(xiàn)蒸發(fā)。因此，抗蒸發(fā)部件為減少蒸發(fā)所必需。所述的抗蒸發(fā)部件應(yīng)當具有能承受10psi(磅/平方英寸)或更高壓力的結(jié)構(gòu)。所述的抗蒸發(fā)部件可包括隔片(septa)。有可能光學(xué)磁帶連接于入口和出口，然后隔片固定于所述的細胞裂解芯片上。圖3是該細胞裂解裝置的隔片的照片。所述的隔片可以是閥門、聚合物結(jié)構(gòu)或金屬結(jié)構(gòu)，但只要能抑制蒸發(fā)，隔片就不具體地被限制為這些。
在本發(fā)明的實施方案中，所述的激光可包括脈沖激光或連續(xù)波(CW)激光。
在很低的激光功率時，不能有效地發(fā)生激光燒蝕。對于CW激光，該激光功率是10mW或更高，對于脈沖激光則是1mJ/脈沖或更高。這是因為當CW低于10mW和脈沖激光低于1mJ/脈沖時，不能傳遞破碎細胞的充足能量。
在本發(fā)明的實施方案中，所述的激光應(yīng)該在磁珠可吸收激光能量的特異波長范圍內(nèi)得以產(chǎn)生。優(yōu)選激光在400nm或更多的波長范圍內(nèi)，更優(yōu)選在750nm到1300nm的波長范圍內(nèi)得以產(chǎn)生。這是因為DNA在低于400nm的波長內(nèi)變性或被破壞。所述的激光也可在一個或多個波長范圍內(nèi)得以產(chǎn)生。就是說，激光可具有在上述范圍內(nèi)的一個波長或兩個或多個不同波長。
在本發(fā)明的實施方案中，所述磁珠的直徑優(yōu)選從50nm到1,000μm，更優(yōu)選從1μm到50μm。當磁珠的直徑小于50nm時，物理和機械沖擊不足以導(dǎo)致細胞裂解。當磁珠直徑超過1,000μm時，則不適于LOC。所述的磁珠也可以是兩種或多種尺寸的珠子混合物。就是說，磁珠具有彼此相等的尺寸或者是具有不同尺寸的珠子混合物。
在本發(fā)明的實施方案中，所述的磁珠可以是任何的磁化物質(zhì)。具體地說，磁珠優(yōu)選包括至少一種選自鐵磁Fe、Ni、Cr或其氧化物的物質(zhì)。
在本發(fā)明的實施方案中，所述的磁珠是鐵磁金屬包被的聚合物、有機物、硅或玻璃。
在本發(fā)明的實施方案中，磁珠表面優(yōu)選帶負電荷以使DNA不會附著在其上面。因為DNA帶負電荷，由于排斥力它不會附著于帶負電荷的磁珠。當DNA附著于所述磁珠時，在破碎細胞后很難從磁珠分離DNA，這使得DNA純化變得困難。
在本發(fā)明的實施方案中，所述的樣品選自唾液、尿液、血液、血清或細胞培養(yǎng)物溶液。所述的樣品可以是任何含有核酸的溶液，諸如動物細胞、植物細胞、細菌、病毒、噬菌體等等。
根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案用于破碎細胞或病毒的裝置的細胞裂解芯片包括具有暴露(opened)的頂面和底面的芯片體，包括反應(yīng)室、入口和出口；連接于芯片體頂面的芯片蓋以關(guān)閉所述反應(yīng)室的上部，允許激光穿過，并具有入口和出口；以及通過芯片連接部件連接于芯片體底面的芯片底部，以關(guān)閉所述反應(yīng)室的下部、入口以及出口。
圖4是使用微磁珠和激光，在用于破碎細胞的裝置中用到的微芯片的實施方案的示意圖。關(guān)于圖4，芯片體具有暴露的頂面和底面，并包括反應(yīng)室、入口和出口。所述的芯片體可以是能承受100℃或更高溫度的硅片。所述的芯片體可由玻璃、聚合物或硅組成。優(yōu)選玻璃是Pyrex7740。所述的芯片體具有連接于芯片蓋的頂面，和連接于芯片連接部件的底面。所述芯片體的內(nèi)表面可以進行疏水性處理，以抑制產(chǎn)生氣泡。例如，芯片體的內(nèi)表面可以用Sigmacoat進行包被。
芯片蓋連接于芯片體的頂面以關(guān)閉反應(yīng)室的上部。所述的芯片蓋可允許激光穿過，并具有入口和出口。所述的芯片蓋可由玻璃、聚合物、氧化銦錫(indium tinoxide)(ITO)玻璃等等組成。優(yōu)選玻璃是Pyrex 7740。優(yōu)選地，芯片蓋的原料可承受高溫并具有90％或更高的透射率。所述的芯片蓋可具有抗反射(AR)包被，以提高激光的透射率?？墒褂帽绢I(lǐng)域公知的方法形成所述的抗反射包被。因此，所述的芯片蓋可使用AR包被的Pyrex 7740得以制備。
芯片底部通過芯片連接部件連接于芯片體的底面，以關(guān)閉反應(yīng)室的下部、入口以及出口。所述芯片底部可由聚合物、硅、玻璃、ITO玻璃等等組成。優(yōu)選地，芯片底部的原料能承受高溫并是彈性的。所述的芯片底部優(yōu)選由能有效傳遞由振蕩器對芯片體產(chǎn)生的振蕩的材料組成，例如，聚碳酸酯薄膜(polycarbonate film)。
所述的芯片連接部件將芯片底部連接于芯片體，并作為含有樣品的反應(yīng)室的輔助裝置。所述的連接借助于選自膠帶(adhesive tape)和膠粘劑(adhesive)的粘合材料得以完成。盡管所述反應(yīng)室僅僅利用所述的芯片體和芯片底部得以形成，可發(fā)生反應(yīng)溶液的泄漏。所述的芯片連接部件可抑制反應(yīng)溶液的泄漏。圖5是根據(jù)本發(fā)明實施方案的微芯片的照片。
現(xiàn)在本發(fā)明根據(jù)下列實施例得以更詳細的描述。下列實施例僅僅用于說明性目的，并非限制本發(fā)明的范圍。
預(yù)備實施例1細胞裂解系統(tǒng)如圖1所示，將下列制備的細菌細胞(90μl)和微磁珠(30μl，DynabeadsM-270羧酸，DYNAL，挪威)在位于小管導(dǎo)向裝置(vial guide)(AMITECH，韓國)的小瓶中混合。當通過渦流攪拌小瓶時，在獨立實驗的特定時間中，將808nm、13.8W高功率的激光束(HLU25F100-808，LIMO，德國)應(yīng)用于所述的混合物以破碎細胞(參見圖1)。
預(yù)備實施例2細菌菌株和確定細菌細胞的生存力將大腸桿菌菌株BL21和變異鏈球菌(ATCC#35668)在腦心浸液(BHI)培養(yǎng)基中于37℃充分通氣培養(yǎng)，直至指數(shù)生長期(OD600＝0.5～1.0)。細菌細胞通過離心進行收獲并以3ml磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)溶液洗滌兩次。所述的細胞重懸于PBS(細胞密度1×105細胞/μl)?；罴毎麛?shù)量通過單個細胞形成菌落的能力進行測定。在激光束輻射后，將等分量的大腸桿菌細胞(1×103)涂布于BHI平板。將該平板在37℃過夜溫育，并對菌落的數(shù)目進行計數(shù)。
將表皮葡萄球菌(ATCC#14990→12228)在營養(yǎng)瓊脂(NA)培養(yǎng)基中于37℃充分通氣培養(yǎng)，直至指數(shù)生長期(OD600＝0.5～1.0)。細菌細胞通過離心進行收獲并以3ml磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)溶液洗滌兩次。所述的細胞重懸于PBS(細胞密度1×105細胞/μl)。活細胞數(shù)量通過單個細胞形成菌落的能力進行測定。在激光束輻射后，將等分量的表皮葡萄球菌細胞(1×103)涂布于NA平板。將該平板在37℃過夜溫育，并對菌落的數(shù)目進行計數(shù)。
預(yù)備實施例3提取細菌基因組DNA為了比較通過激光法釋放DNA的效率和其他公知的常規(guī)方法的效率，將大腸桿菌基因組DNA(來自0.9×105個細胞，其相當于每次激光裂解用到的細胞數(shù)的)應(yīng)用煮沸法于95℃、5分鐘得以制備。
預(yù)備實施例4對來自細菌的DNA釋放進行定量為了監(jiān)控細胞裂解并定量來自裂解的細胞的DNA釋放的量，使用AgilentBioanalyzer隨后是聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增。下列引物對用于PCR引物A(SEQID No1)；引物B(SEQ ID No2)。該引物對與編碼16S核糖體RNA的基因的各個末端互補，允許在PCR過程中擴增它的全部編碼區(qū)。
使用Taq聚合酶(Solgent.Co，Ltd，韓國)進行25輪循環(huán)的大腸桿菌PCR擴增(95℃1分鐘的預(yù)變性，95℃5秒鐘的變性，60℃13秒鐘的退火，和72℃15秒鐘的延伸，以及72℃1分鐘的附加延伸)。對于革蘭氏陽性細菌細胞；使用Taq聚合酶(Solgent.Co，Ltd，韓國)進行30輪循環(huán)的變性鏈霉菌和表皮葡萄球菌的PCR擴增(95℃1分鐘的預(yù)變性，95℃5秒鐘的變性，60℃13秒鐘的退火，和72℃15秒鐘的延伸，以及72℃1分鐘的附加延伸)。在擴增循環(huán)結(jié)束后，通過60至90℃緩慢加熱(0.1℃/s)樣品得到解鏈曲線。通過LightCycler(Roche DiagnosticsCorporation，IN，美國)，并使用含有1×FastStart DNA Master SYBR(Roche DiagnosticsCorporation，IN，美國)、0.25μM的正向和反向引物(Genotech，韓國)、4mMMgCl2(Roche Diagnostics Corporation)、D.W(PCR級，Roche DiagnosticsCorporation，IN，美國)的總體積20μl的反應(yīng)混合液進行PCR。利用商業(yè)可獲得的DNA 500分析大小篩分試劑組，擴增的DNA在Agilent BioAnalyzer 2100(AgilentTechnologies，Palo Alto，加拿大)中得以分析。
預(yù)備實施例5本發(fā)明的細胞裂解芯片的制作用于10μl樣品體積的7.5mm×15mm芯片尺寸的微芯片，通過利用硅氧烷(silicone)、玻璃、聚碳酸酯薄膜和雙面膠帶(Double Coated Tape)(9495MP，3M，MN，美國)得以制作。如圖4所示，對于激光誘導(dǎo)的樣品制備，所述制作過程由兩個影印法步驟和通過雙面膠帶與聚碳酸酯薄膜的連接步驟而組成。清潔直徑六英寸和厚度500μm的玻璃晶片，并通過BF410膜光刻膠(film photoresist)壓為薄片。通過光刻法對所述的光刻膠形成圖案，以形成用于樣品入口和出口通道的直徑1.5mm的孔。通過噴砂(sand blast)法在所述玻璃晶片上形成孔。所述的硅晶片是具有直徑六英寸和厚度680μm的兩面拋光的硅基片。由于成本關(guān)系通過噴砂法在硅晶片上形成小室。為了最優(yōu)化點樣，在硅晶片的噴砂處理的表面包被Sigmacoat(Sigma-aldrich，MO，美國)。然后，利用厚度150μm的雙面膠帶，將厚度100μm的聚碳酸薄膜連接到硅晶片。
預(yù)備實施例6激光誘導(dǎo)的芯片內(nèi)(on-chip)樣品的制備系統(tǒng)如圖2A所示，為了細菌細胞裂解，將下列制備的細菌細胞(1μl)和微磁珠(9μl，約9×106珠/μl，DynabeadsMyOneTMCarboxylic Acid，DYNAL，挪威)在已置于芯片導(dǎo)向組件(guide module)(AMITECH，韓國)的微芯片中進行混合。由于磁珠和珠子材質(zhì)的表面電荷的影響，額外制備硅珠(3.0μm，Bangs Laboratories Inc.，IN，美國)、末端氨基化的聚苯乙烯磁珠(1.5μm，Bangs Laboratories Inc.，IN，美國)、聚苯乙烯珠(4.16μm，Bangs Laboratories Inc.，IN，美國)和末端羧酸化的聚苯乙烯磁珠。
當利用鋁振蕩條(bar)通過硬幣式振蕩馬達(coin-type vibration motor)(DMJBRK20X，三星機電，韓國)蕩微芯片時，在每個實驗中利用具有0.22NA分散度(divergence)的光纖耦合激光系統(tǒng)(fiber-coupled laser systems)(HLU25F100-808，LIMO，德國)，808nm(1W)的高功率激光束得以應(yīng)用以破碎所示時期的細胞。所述的激光功率通過30瓦Broadband Power/Energy Meter(MELLESGRIOT，美國)得以測量。通過在水中波長的吸光系數(shù)選擇激光波長。在水中具有0.021773(cm-1)吸光系數(shù)的808nm的大多數(shù)激光束可通過水傳播并到達所述的微磁珠。為了本發(fā)明的目的，也可應(yīng)用可見激光束，但不能應(yīng)用作為手提式裝置的高功率激光二極管，因為成本效率不佳。此外，IR波長在水中的吸光系數(shù)非常高；大多數(shù)IR激光能量可在水中得以吸收，使得其不適合這種應(yīng)用。紫外線(UV)激光束不適合細胞裂解和DNA純化，因為已知紫外線照射可導(dǎo)致DNA損傷。以紫外線照射的DNA積累胸腺嘧啶二聚體作為主要的光化產(chǎn)物(photoproduct)。因此，使用具有808nm光譜的連續(xù)激光二極管。
應(yīng)用主要使用于移動式電話(DMJBRK20X，三星機電，韓國)中的振蕩馬達(motor)和鋁(AMITECH，韓國)，設(shè)計用于芯片內(nèi)樣品制備測試組件的振蕩系統(tǒng)，從而以12,000轉(zhuǎn)/分僅僅振蕩樣品小室區(qū)中可彎曲的微芯片聚碳酸酯薄膜。振蕩馬達的振蕩功率通過電源(E3620A，Agilent，CA，美國)進行調(diào)節(jié)。微芯片小室中的樣品溫度通過具有數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)(34970A，Agilent，CA，美國)的熱電偶(thermocouple)(K型，Omega)進行測量。如圖3所示，在含有磁珠的樣品溶液上樣后，入口和出口都用光學(xué)透明膠帶(Applied Biosystems，CA，美國)進行密封。為了確定在激光照射期間沒有發(fā)生泄漏，入口和出口都用位于芯片內(nèi)樣品制備測試組件的頂蓋上的兩個彈性體(elastomers)(Thermogreen LB-2，Sigma-Aldrich，MO，美國)進行壓緊(compress)。
預(yù)備實施例7活細胞和死細胞與磁珠的照片為了觀察激光照射后樣品溶液中剩余的活細胞和死細胞，根據(jù)供應(yīng)商推薦的方法，利用Live/DeadBacLightTMBacterial Viability試劑盒(L7012，Molecular Probe，OR，美國)進行染色。使用顯微鏡(Eclipse TE 300，Nikon，日本)拍攝圖像。
預(yù)備實施例8激光照射后DNA分析使用各種方法，從含有pCRII-TOPO(Invitrogen)質(zhì)粒的相同數(shù)量的BL21細胞中分離基因組和質(zhì)粒DNA。對于激光裂解，將細胞與磁珠進行混合，并用激光照射40秒，在酚/氯仿/異戊醇抽提凈化后，DNA通過含有0.3M乙酸鈉的乙醇沉淀得以純化。對于煮沸裂解，將細胞在95℃加熱5分鐘，并且DNA隨激光裂解得以純化。將Qiagen QIAprepMiniprep試劑盒用于分離質(zhì)粒。將Qiagen QIAampDNAMini試劑盒用于分離BL21的基因組DNA。將DNA和1kb分子量標記通過0.7％瓊脂糖凝膠進行電泳。
實施例1磁珠存在時激光照射對細胞存活的影響研究磁珠存在時激光照射對細胞存活的影響。圖6顯示激光照射后測定細胞生存力的結(jié)果。將細胞(3×103)在存在(A和B)或缺乏(C)微磁珠時用激光照射指定時間，然后在LB平板上涂布。將該平板在37℃過夜溫育，然后計數(shù)形成的菌落數(shù)目(A在存在微磁珠時激光照射指定時間后懸浮液中的細胞；B在激光照射后通過洗滌磁珠回收的細胞；C如A的細胞的相同條件下的細胞，除了在缺乏微磁珠時進行激光照射；注意通過激光束對細胞照射延長的時間；D無激光照射的陽性對照)。
如圖6所示，由于激光照射，細菌細胞喪失生存力。生存力的損失可通過加入磁珠得以顯著地增長。在激光照射3秒后，5％的原始細胞(3000個細胞中的153個細胞)在磁珠的存在下得以幸存，并且激光照射10秒后，沒有細胞幸存(圖6A)。相反，在缺乏磁珠時，即使激光照射30秒后，約三分之二的原始細胞(約2000個細胞)幸存(圖6C)。為了鑒定細胞非特異結(jié)合于珠子，將所述的珠子用高鹽緩沖溶液(PBS+0.3M NaCl)洗滌，而且所述的洗滌溶液也用于檢查活細胞(圖6B)?；厥丈贁?shù)活細胞，并且幸存動力學(xué)與從所述懸浮液回收的細胞的動力學(xué)相同，這表明來自珠子的細胞類似于用珠子之間的溶液收集的細胞。這些結(jié)果表明在存在磁珠時，由于激光照射可導(dǎo)致細胞快速破碎，它可用于釋放任何類型的DNA，例如存在于活細胞的基因組DNA、游離型(episomal)DNA或病毒DNA。
實施例2激光照射對細胞釋放DNA的影響如以上觀察，由于生存力的損失不必要涉及需要細胞釋放DNA的細胞裂解，溶液中DNA的存在可通過利用以上描述的PCR來擴增16S rDNA而得以檢驗。圖7表明僅僅在磁珠存在時激光照射可有效地釋放細菌DNA。條形圖代表擴增的DNA濃度(ng/μl)。PCR產(chǎn)物量通過Agilent BioAnalyzer 2100進行定量。誤差棒(errorbar)代表平均值的標準偏差。
如圖7所示，當溶液用作模板DNA源時，16S rDNA得以最有效地擴增。此外，PCR產(chǎn)物量與照射時間成正比，并且所述的磁珠可顯著地(20倍或更多)提高PCR效率。這些結(jié)果與細胞生存力一致。就是說，這些結(jié)果表明細胞生存力的損失不是由無細胞裂解的細胞熱鈍化引起，而是由細胞的物理破碎引起。
實施例3比較激光燒蝕細胞裂解與微磁珠和化學(xué)細胞裂解的DNA釋放效率為了直接比較根據(jù)本發(fā)明的細胞裂解的DNA釋放效率與常規(guī)化學(xué)細胞裂解的效率，使用DNeasy，其為用于細胞裂解和純化釋放的DNA的Qiagen試劑盒。圖8表明通過激光燒蝕釋放的DNA比通過常規(guī)方法制備的DNA，可更有效地被Taq聚合酶擴增。在所有的實驗中，通過使用相同數(shù)量的細胞制備DNA。條形圖代表擴增的DNA濃度(ng/μl)。PCR產(chǎn)物量通過Agilent BioAnalyzer 2100進行定量。誤差棒代表平均值的標準偏差。
如圖8所示，存在磁珠時，在激光照射后16S rDNA可與獲得的DNA進行更有效地擴增?？紤]到Qiagen試劑盒對于含有細胞數(shù)量少(＜1×109)的樣品不是最適的，可能利用Qiagen試劑盒回收的DNA的量比預(yù)期的少。盡管如此，由于容易將該技術(shù)整合于LOC，通過激光聯(lián)合磁珠進行細胞裂解可提供在應(yīng)用中更大的多能性。此外，可以觀察到應(yīng)用激光燒蝕釋放的DNA比通過Qiagen試劑盒或煮沸法獲得的DNA，PCR擴增效率更高。這表明激光照射釋放DNA至少相同于或大于其他兩種常規(guī)方法的DNA的量。如果釋放出相同量的DNA，用來自激光燒蝕的DNA進行更有效地PCR擴增，這表明抑制物質(zhì)的釋放通過激光燒蝕得以最小化。
實施例4磁珠尺寸對細胞裂解效率的影響研究磁珠尺寸對細胞的DNA釋放的影響。圖9顯示磁珠尺寸的影響。條形圖代表擴增的DNA濃度(ng/μl)。PCR產(chǎn)物數(shù)量通過AgilentBioAnalyzer2100得以定量。誤差棒代表平均值的標準偏差。
如圖9所示，在細胞裂解中，直徑2.7μm的磁珠效率更高于5-nm金粒子(G1402，Sigma，MO，美國)。
實施例5對芯片蓋的激光透射率(transmittance)測試為了檢測激光發(fā)生器產(chǎn)生的激光能有效地穿過芯片蓋，將Pyrex 7740和AR包被的Pyrex 7740(Corning)用作芯片蓋。利用30瓦Broadband Power/Energy Meter(MELLES GRIOT，美國)以1、2、3和4瓦的激光功率測量激光透射率。圖10顯示對Pyrex7740和AR包被的Pyrex 7740的激光透射率。如圖10所示，AR包被的Pyrex 7740比未被AR包被的Pyrex 7740高約1.75％的激光透射率。因此，AR包被的Pyrex 7740適合于有效提供進入細胞裂解芯片的激光。
實施例6對細胞裂解芯片的抗蒸發(fā)測試由于激光可產(chǎn)生蒸氣壓，為了檢查本發(fā)明的細胞裂解芯片引起蒸發(fā)，進行蒸發(fā)測試。對于以上制備的細胞裂解芯片，以1、2、3和4瓦的激光功率進行至少200次相同的實驗。圖11是激光照射后本發(fā)明的細胞裂解芯片的照片。在2瓦或更低的激光功率，由于提高了樣品溶液的溫度，蒸氣壓上升，并且沒有發(fā)生細胞裂解芯片內(nèi)的蒸發(fā)。
實施例7磁珠數(shù)量對細胞裂解效率的影響研究磁珠數(shù)量對細胞裂解效率，即釋放的DNA量的影響。將不同數(shù)量的珠子加入樣品溶液(0至9×106個珠子/μl)中，并以1瓦激光輻射功率在808nm照射40秒鐘。圖12是相對于磁珠數(shù)量，大腸桿菌細胞釋放的DNA的PCR結(jié)果顯示圖。交叉點(crossing point)(Cp)是當在實時PCR中首次測定可探測熒光時的循環(huán)數(shù)。就是說，當DNA起始濃度提高時，Cp值降低。Cp還與DNA純化有關(guān)。當DNA純度提高時，Cp值降低。因此，當Cp值更低時，溶液中DNA是更純化的形態(tài)。
如圖12所示，當加入更多的磁珠時，釋放的DNA量增加。在高于5×106個珠子/μl的珠子濃度，可獲得有效的細胞裂解和DNA釋放的高效率。同樣，為了準確測定起始目標的拷貝數(shù)，通過作為已知的實時PCR儀器的LightCycler(RocheDiagnostics Corporation，IN，美國)檢測擴增大腸桿菌DNA的Cp值。如圖12所示，當加入更多的磁珠時，Cp值降低。這個結(jié)果說明當加入更多的磁珠時，起始目標的拷貝數(shù)增加。
實施例8振蕩功率對細胞裂解效率的影響為了檢查振蕩功率對細胞裂解效率的影響，使用0-4伏振蕩馬達的電壓。在每個反應(yīng)中，使用革蘭氏陰性細菌細胞的大腸桿菌細胞(1×105細胞/μl)。用0.5瓦激光輻射功率在808nm對10μl樣品照射40秒。細胞裂解芯片和光纖的間隔是1mm。樣品中珠子濃度是5×106個珠子/μl，并對每個條件重復(fù)測定三次。圖13是相對于振蕩馬達的電壓，大腸桿菌細胞釋放的DNA的PCR結(jié)果顯示圖。在圖13中，煮沸(陽性對照)指當在95℃將大腸桿菌細胞煮沸5分鐘后，對釋放的DNA進行PCR的情形；而陰性對照指當僅使用無DNA的蒸餾水進行PCR的情形。條形圖代表擴增的DNA濃度(ng/μl)。PCR產(chǎn)物量通過Agilent BioAnalyzer 2100進行定量。誤差棒代表平均值的標準偏差。當擴增的DNA量增加時，裂解的細胞數(shù)目增加，表明細胞裂解效率提高。
如圖13所示，當振蕩馬達的電壓升高時，細胞裂解效率提高。高于3伏的振蕩馬達的電壓足夠得到比使用煮沸法更高的細胞裂解效率。此外，當振蕩馬達的電壓升高時，由于提高了細胞裂解效率，釋放的DNA量增加，從而Cp值降低。
因此，用磁珠混合細胞或病毒后，細胞裂解效率通過振蕩得到提高。
實施例9激光輻射功率對革蘭氏陽性細菌細胞的裂解效率的影響為了檢查激光輻射功率對革蘭氏陽性細菌細胞的裂解效率的影響，使用0.5-3瓦的激光輻射功率。除了使用革蘭氏陽性細菌細胞的表皮葡萄球菌(1×105細胞/μl)細包之外，實施如實施例8中的相同實驗，細胞裂解芯片和光纖的間隔是3mm，并且樣品中珠子濃度9×106個珠子/μl。圖14是表皮葡萄球菌細胞(1×105細胞/μl)釋放的DNA的PCR結(jié)果顯示圖。在圖14中，對照指當在以13,200轉(zhuǎn)/分對表皮葡萄球菌細胞離心5分鐘后獲得的上清液進行PCR的情形；煮沸(陽性對照)指當在95℃將表皮葡萄球菌細胞煮沸5分鐘后，對釋放的DNA進行PCR的情形；而陰性對照指當僅使用無DNA的蒸餾水進行PCR的情形。條形圖代表擴增的DNA濃度(ng/μl)。PCR產(chǎn)物量通過Agilent BioAnalyzer 2100進行定量。誤差棒代表平均值的標準偏差。如圖14所示，當激光輻射功率提高時，細胞裂解效率提高。具體地，高于1瓦的激光輻射功率足以獲得相同于或高于使用煮沸法的細胞裂解效率。因此，當使用本發(fā)明的微芯片裂解細胞或病毒時，激光輻射功率可顯著地降低。
為了檢查細胞濃度對細胞裂解效率的影響，實施上述相同的實驗，除了使用革蘭氏陽性細菌細胞的表皮葡萄球菌細胞(1×102細胞/μl)之外。
圖15是相對于激光功率，表皮葡萄球菌細胞(1×102細胞/μl)釋放的DNA的PCR結(jié)果顯示圖。在圖15中，對照指當在以13,200轉(zhuǎn)/分對表皮葡萄球菌細胞離心5分鐘后獲得的上清液進行PCR的情形；煮沸(陽性對照)指當在95℃將表皮葡萄球菌細胞煮沸5分鐘后，對釋放的DNA進行PCR的情形；以及陰性對照指當僅使用無DNA的蒸餾水進行PCR的情形。條形圖代表擴增的DNA濃度(ng/μl)。PCR產(chǎn)物量通過Agilent BioAnalyzer 2100進行定量。誤差棒代表平均值的標準偏差。如圖15所示，當激光輻射功率提高時，細胞裂解效率提高。具體地，3瓦的激光輻射功率比使用煮沸法可提供更高的細胞裂解效率。因此，無論細胞濃度，使用本發(fā)明的方法，革蘭氏陽性細菌細胞可得到有效地裂解。
此外，為了檢查使用本發(fā)明的細胞裂解芯片可有效地裂解另一種的革蘭氏陽性細菌細胞變性鏈霉菌，實施與上述的相同實驗，除了使用表皮葡萄球菌細胞和變異鏈球菌細胞，并且以1瓦的激光輻射功率使用40秒之外。
圖16是表皮葡萄球菌細胞和變性鏈霉菌細胞釋放的DNA的PCR結(jié)果顯示圖。在圖16中，樣品1指當對表皮葡萄球菌細胞釋放的DNA進行PCR的情形；樣品2指當在以95℃煮沸葡萄球菌細胞5分鐘后對釋放的DNA進行PCR的情形；樣品3指當對變性鏈霉菌細胞釋放的DNA進行PCR的情形；樣品4指當在以95℃煮沸變性鏈霉菌細胞5分鐘后對釋放的DNA進行PCR的情形；以及樣品5指當僅使用無DNA的蒸餾水進行PCR的情形。條形圖代表擴增的DNA濃度(ng/μl)。PCR產(chǎn)物量通過Agilent BioAnalyzer 2100進行定量。誤差棒代表平均值的標準偏差。如圖16所示，本發(fā)明的細胞裂解方法比使用煮沸法，對于表皮葡萄球菌細胞和變性鏈霉菌細胞具有更好的細胞裂解效率。
實施例10激光功率對革蘭氏陰性細菌細胞的裂解效率的影響為了檢查激光輻射功率對革蘭氏陰性細菌細胞的裂解效率的影響，使用0-3瓦的激光輻射功率。除了使用革蘭氏陰性細菌細胞的大腸桿菌細胞(1×105細胞/μl)之外，實施如實施例9中的相同實驗。圖17是大腸桿菌細胞(1×105細胞/μl)釋放的DNA的PCR結(jié)果顯示圖。在圖17中，煮沸(陽性對照)指當在95℃將大腸桿菌細胞煮沸5分鐘后，對釋放的DNA進行PCR的情形；以及陰性對照指當僅使用無DNA的蒸餾水進行PCR的情形。條形圖代表擴增的DNA濃度(ng/μl)。PCR產(chǎn)物量通過Agilent BioAnalyzer 2100進行定量。誤差棒(bars)代表平均值的標準偏差。如圖17所示，當激光輻射功率提高時，細胞裂解效率提高。具體地，高于1瓦的激光輻射功率比使用煮沸法，足夠得到更高的細胞裂解效率。此外，當激光輻射功率提高時，Cp值降低，表明釋放的DNA量增加。但是，高于2瓦的激光輻射功率已經(jīng)飽和。這個結(jié)果說明當激光輻射功率增加時，起始目標的拷貝數(shù)增加直到所有細胞得到裂解。
因此，使用本發(fā)明的微芯片裂解細胞或病毒時，激光輻射功率可得以顯著地降低。
為了檢查細胞濃度對細胞的裂解效率的影響，實施與上述相同的實驗，除了使用革蘭氏陰性細菌細胞的大腸桿菌細胞(1×102細胞/μl)之外。
圖18是大腸桿菌細胞(1×102細胞/μl)釋放的DNA的PCR結(jié)果顯示圖。在圖18中，對照指當在以13,200轉(zhuǎn)/分對大腸桿菌細胞離心5分鐘后獲得的上清液進行PCR的情形；煮沸(陽性對照)指當在95℃將大腸桿菌細胞煮沸5分鐘后，對釋放的DNA進行PCR的情形；以及陰性對照指當僅使用無DNA的蒸餾水進行PCR的情形。條形圖代表擴增的DNA濃度(ng/μl)。PCR產(chǎn)物量通過AgilentBioAnalyzer 2100進行定量。誤差棒代表平均值的標準偏差。如圖18所示，當激光輻射功率提高時，細胞裂解效率提高。具體地，高于0.5瓦的激光輻射功率比使用煮沸法，足夠得到更高的細胞裂解效率。3瓦的激光輻射功率比使用煮沸法，可提供更高的細胞裂解效率。因此，使用本發(fā)明的微芯片裂解細胞或病毒時，激光輻射功率可得以顯著地降低。
所以，無論細胞濃度，使用本發(fā)明的方法，革蘭氏陰性細菌細胞可有效地得以裂解。
實施例11激光輻射功率對大腸桿菌樣品溫度的影響為了檢查激光輻射功率對大腸桿菌溫度的影響，使用0.5、1以及2瓦的激光輻射功率。除了使用革蘭氏陰性細菌細胞的大腸桿菌細胞(1×105細胞/μl)之外，實施如實施例10中相同的實驗。圖19是相對于激光輻射功率，大腸桿菌樣品的溫度變化顯示圖。如圖19所示，樣品溫度隨著激光輻射功率而升高。具體地，在以高于1瓦的激光輻射功率照射幾秒鐘后，樣品溫度可迅速升高超過65℃。
實施例12磁珠和珠子材料的表面電荷的影響為了檢查磁珠和珠子材料的表面電荷對細胞裂解效率的影響，使用四種不同類型的珠子。除了珠子濃度是0.5％之外，實施如實施例10中相同的實驗。圖20是相對于磁珠和珠子材料的表面電荷，大腸桿菌細胞(1×105細/μl)釋放的DNA的PCR結(jié)果顯示圖。在圖20中，樣品1、2、3和4指對分別使用末端氨基化的聚苯乙烯磁珠、硅珠、聚苯乙烯珠和末端羧酸化的聚苯乙烯磁珠而釋放的DNA進行PCR的情形。樣品5(陽性對照)指當在95℃將大腸桿菌細胞煮沸5分鐘后，對釋放的DNA進行PCR的情形，以及樣品6(陰性對照)指當僅使用無DNA的蒸餾水進行PCR的情形。條形圖代表擴增的DNA濃度(ng/μl)。PCR產(chǎn)物量通過AgilentBioAnalyzer 2100進行定量。誤差棒代表平均值的標準偏差。如圖20所示，僅僅存在末端羧酸化的聚苯乙烯磁珠時，激光照射可有效地釋放大腸桿菌DNA。
此外，以四種類型的磁珠研究樣品溶液溫度(數(shù)據(jù)未顯示)。由于用1瓦激光輻射功率時硅珠吸收激光束不充分，含有硅珠的樣品溶液溫度可非常緩慢地升高。類似于末端羧酸化的聚苯乙烯微珠，含有末端氨基化的聚苯乙烯微珠的樣品溶液溫度可升高，但由于所述珠子表面的氨基官能團的正電荷的靜電相互作用，釋放的DNA結(jié)合于微珠。由于微珠的熱容量，聚苯乙烯珠的樣品溶液溫度以硅珠和磁珠之間的中檔速度而升高。
末端羧酸化的聚苯乙烯磁珠的最大優(yōu)點在于可減化DNA分離的步驟，因為利用激光和微磁珠的細胞裂解可導(dǎo)致蛋白質(zhì)的變性和消除。變性的蛋白質(zhì)和細胞碎片通過吸附作用粘附于磁珠的聚苯乙烯表面，這有利于通過重力或磁場得以輕松除去。由于珠子的羧酸負電荷的電荷排斥，DNA不結(jié)合珠子。通過降低檢測極限、減少DNA提取時間和增加信號幅度，這可顯著地提高PCR產(chǎn)量。
實施例13磁珠表面的官能團對DNA擴增效率的影響為了檢查磁珠表面的官能團對細胞裂解效率的影響，對細胞裂解釋放的DNA的擴增效率進行研究。首先，在磁珠表面合成多種官能團。圖21顯示在磁珠表面上合成亞氨基乙酸(iminoacetic acid)(IDA)、芘和硫醇官能團的實施方案。以下是在磁珠(Dynabeads)上合成各個官能團的方法(1)IDA-珠采用具有氨基官能團(DynabeadsM-270Amine，30mg/ml)的500μl磁珠，然后利用磁體除去溶液。將500μlNMP(1-甲基-2-吡咯烷酮)與珠子充分混合，然后除去溶液。該過程重復(fù)三次。將溴乙酸乙酯(6μl)和三乙胺(10μl)的NMP(500μl)溶液與珠子充分混合，并于45℃放置1天。反應(yīng)完成后，用500μl的NMP(×3)洗滌珠子，再用500μl的乙醇(×3)洗滌珠子。利用磁體除去溶液，然后將500μl以1∶1(v/v)混合的1N的NaOH和乙醇溶液加入所述的珠子，并在室溫放置1小時。所述反應(yīng)完成后，用500μl的乙醇(×3)洗滌珠子，再用500μl的三蒸水(×3)洗滌珠子。此后，除去溶液，并加入500μl所需的緩沖液。冷凍保藏生成物。
(2)Cu-IDA-珠將Cu(NO3)2(100mg)和TEA(100μl)的NMP(500μl)溶液加入IDA珠，然后將生成物放置1天。所述反應(yīng)完成后，用500μlNMP(×3)、500μl乙醇(×3)和三蒸水(×3)洗滌珠子。此后，除去溶液，并加入500μl所需的緩沖液。冷凍保藏生成物。
(3)芘-珠采用500μl具有氨基官能團(DynabeadsM-270Amine，30mg/ml)的磁珠，然后利用磁體除去溶液。將500μlNMP(1-甲基-2-吡咯烷酮)與珠子充分混合，然后除去溶液。該過程重復(fù)三次。將1-吡丁酸(pyrenebutyric acid)(15mg)、HBTU(o-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸(o-benzotriazole-1-yl-N，N，N’，N’-tetramethyluroniumhexafluorophosphate))(22mg)和TEA(三乙胺)(7μl)的NMP(500μl)溶液與珠子充分混合，并于室溫放置1天。所述反應(yīng)完成后，用500μl的NMP(×3)、500μl的乙醇(×3)以及500μl的三蒸水(×3)洗滌珠子。此后，除去溶液，并加入500μl所需的緩沖液。冷凍保藏生成物。
(4)硫醇-珠采用500μl具有氨基官能團(DynabeadsM-270Amine，30mg/ml)的磁珠，然后利用磁體除去溶液。將500μlNMP與珠子充分混合，然后除去溶液。該過程重復(fù)三次。將3-巰基丙酸(10μl)、HBTU(22mg)和TEA(7μl)的NMP(500μl)溶液與珠子充分混合，并于室溫放置1天。所述反應(yīng)完成后，用500μl的NMP(×3)和500μl的乙醇(×3)洗滌珠子。利用磁體除去溶液，然后將500μl以1∶1(v/v)混合的1N的NaOH和乙醇溶液加入所述的珠子，并在室溫放置1小時。所述反應(yīng)完成后，用500μl的乙醇(×3)再用500μl的三蒸水(×3)洗滌珠子。此后，除去溶液，并加入500μl所需的緩沖液。冷凍保藏生成物。
使用合成了各個官能團的磁珠，對DNA擴增效率進行研究。除了使用大腸桿菌細胞(1×107細胞/μl)之外，實施如實施例12中相同的實驗。圖22是相對于磁珠表面的官能團，大腸桿菌細胞釋放的DNA的PCR結(jié)果(Cp)顯示圖。在圖22中，羧基珠指當使用DynabeadsMyOneTMCarboxylic Acid(DYNAL，挪威)裂解細胞后進行PCR的情形。煮沸(陽性對照)指當在95℃將大腸桿菌細胞煮沸5分鐘后，對釋放的DNA進行PCR的情形；對照指對以13,200轉(zhuǎn)/分對大腸桿菌細胞離心5分鐘后的上清液進行PCR的情形；以及陰性對照(NTC)指當僅使用無DNA的蒸餾水進行PCR的情形。如圖22所示，官能團之中的IDA具有最低的Cp值，并且硫醇的Cp值小于Cu-IDA的Cp值。此外，當官能團的親水性增加時，Cp值降低。就是說，IDA具有低于硫醇的Cp值。從以上結(jié)果可以看出具有羧基官能團的珠子，其是親水性的，具有最佳的細胞裂解效率，且具有封閉的官能團Cu-IDA珠具有低的細胞裂解效率。
實施例14含有磁珠的溶液的pH對DNA擴增效率的影響為了檢查含有磁珠的溶液的pH對DNA擴增效率的影響，使用三種類型的磁珠，即，具有羧基的磁珠(Dynabeads)、具有IDA的磁珠以及聚羧基磁珠。由于在上述實驗結(jié)果中，具有羧基官能團的珠子具有最佳的細胞裂解效率，合成具有許多羧基官能團的聚羧基珠。圖23顯示在磁珠表面上合成聚羧基官能團的過程。以下是在磁珠(Dynabeads)上合成所述的官能團的方法采用具有氨基官能團(DynabeadsM-270Amine，30mg/ml)的500μl磁珠，然后利用磁體除去溶液。將500μlNMP與珠子充分混合，然后除去溶液。該步驟重復(fù)三次。將聚(乙烯-alt-馬來酐)(100mg)和三乙胺(10μl)的NMP(500μl)溶液與珠子充分混合，并于室溫放置1天。所述反應(yīng)完成后，用500μl的NMP(×3)再用500μl的乙醇(×3)洗滌珠子。利用磁體除去溶液，然后將500μl100mM的Tris-HCl緩沖溶液(pH9.0)加入所述的珠子，并在室溫放置1小時。所述反應(yīng)完成后，用500μl的乙醇(×3)再用500μl的三蒸水(×3)洗滌珠子。此后，除去溶液，并加入500μl所需的緩沖液。冷凍保藏生成物。
除了將三種類型的珠子調(diào)整到pH5、7和9之外，實施如實施例13中相同的實驗。圖24是相對于磁珠表面的官能團和珠子溶液的pH，大腸桿菌細胞釋放的DNA的PCR結(jié)果(Cp)顯示圖。在圖24中，對照指當使用DynabeadsMyOneTMCarboxylic Acid(DYNAL，挪威)裂解細胞后進行PCR的情形。如圖24所示，當pH升高時，Cp值降低。因此，可以看出細胞裂解效率隨著含有磁珠的溶液的pH升高而升高。然而在相同的pH時，由于官能團，細胞裂解效率并沒有明顯地改變。
實施例15存在抑制劑時，比較PCR效率在實施例13和14中，當使用純大腸桿菌細胞時，細胞裂解效率取決于含有磁珠的溶液的pH。當所述的表面官能團是羧基時，由于它的結(jié)構(gòu)，細胞裂解效率沒有明顯地變化。這因為當僅僅使用純大腸桿菌細胞時，細胞碎片對PCR的抑制作用并不明顯。因此，為了檢查磁珠表面的官能團對于PCR抑制劑去除的影響，根據(jù)磁珠的類型和pH比較了細胞裂解效率。
首先，除了加入作為抑制劑的10％血清和將含有磁珠的溶液的pH調(diào)整到7和9之外，實施如實施例14中相同的實驗。圖25是存在10％血清時相對于磁珠表面的官能團，大腸桿菌細胞釋放的DNA的PCR結(jié)果(Cp)顯示圖。在圖25中，對照指當存在10％血清時使用DynabeadsMyOneTMCarboxylic Acid(DYNAL，挪威)裂解細胞后進行PCR的情形；和PTC(陽性對照)指當在大腸桿菌釋放的DNA中加入10％血清后進行PCR的情形。如圖25所示，具有相同官能團的磁珠的Cp值變化取決于pH。就是說，羧基和IDA在pH7比在pH9時具有更低的Cp值，而聚羧基在pH9比在pH7時具有更低的Cp值。因此，可以看出當適當組合羧基官能團和含有磁珠的溶液的pH時，抑制劑對PCR的影響可得以顯著地降低。
接著，除了使用乙型肝炎病毒(HBV)代替大腸桿菌以及將含有磁珠的溶液的pH調(diào)整到7之外，實施上述相同的實驗。下列引物對可用于PCR正向引物(SEQID No3)；反向引物(SEQ ID No4)。此引物對是對應(yīng)于HBV基因組核心區(qū)域的位點。圖26是存在10％血清時相對于磁珠表面的官能團，HBV釋放的DNA的PCR結(jié)果(PCR產(chǎn)物的濃度)顯示圖。在圖26中，對照指當存在10％血清時使用DynabeadsMyOneTMCarboxylic Acid(DYNAL，挪威)裂解HBV后進行PCR的情形；和PTC(陽性對照)指當對分離自HBV的DNA沒有10％血清進行PCR的情形。如圖26所示，即使存在10％血清時也可生成所述的PCR產(chǎn)物。因此，當適當組合羧基官能團和含有磁珠的溶液的pH時，抑制劑對PCR的影響可得以顯著地降低。
實施例16根據(jù)激光照射研究細胞生存力為了觀察根據(jù)激光照射存在于樣品溶液中的活細胞和死細胞，使用大腸桿菌細胞。圖27是顯示根據(jù)激光照射大腸桿菌細胞的生存力的照片。在圖27中，A組是激光照射前沒有微磁珠的大腸桿菌細胞的圖像；B組是存在微磁珠時，在808nm以0.5瓦激光輻射功率進行激光照射40秒鐘后大腸桿菌細胞的圖像；以及C組是存在微磁珠時，在808nm以1瓦激光輻射功率進行激光照射40秒鐘后大腸桿菌細胞的圖像。染成綠色的細胞是活細胞，染成紅色的細胞是死細胞。如圖27所示，在激光照射后多數(shù)細胞是活的，死細胞的比例隨著激光輻射功率的增加而提高。
實施例17激光照射對基因組DNA損傷的影響為了檢查激光照射是否損傷基因組DNA，檢查在以激光照射40秒鐘后分離的DNA是否受到剪切。圖28是對攜帶pCRII-TOPO(Invitrogen)質(zhì)粒的大腸桿菌BL21細胞激光照射后DNA分析的照片。在圖28中，泳道1指使用本發(fā)明的方法分離DNA的情形；泳道2指在95℃煮沸5分鐘后分離DNA的情形；泳道3指使用Qiagen QIAprepMiniprep試劑盒分離質(zhì)粒DNA的情形；泳道4指使用Qiagen QIAampDNAmini試劑盒分離BL21的基因組DNA的情形；以及泳道5指使用Qiagen QIAampDNA mini試劑盒，從無質(zhì)粒的大腸桿菌BL21細胞中分離BL21的基因組DNA的情形。泳道5用于鑒定基因組DNA的正確條帶。如圖28所示，DNA未受到損傷。正如所料，采用用于制備質(zhì)粒的QIAprep mini試劑盒(Qiagen)，基因組DNA帶有很少的污染(contamination)(泳道3)。有意思的是，通過本發(fā)明的方法，優(yōu)先分離含有更少質(zhì)粒DNA污染的基因組DNA。相反，在蛋白酶K處理所述細菌后，采用用于基因組DNA分離的、應(yīng)用了硅石-凝膠-膜技術(shù)的QIAamp mini試劑盒，會出現(xiàn)很多質(zhì)粒DNA污染(泳道4)。這可以解釋為什么使用通過本發(fā)明的方法分離的DNA比使用通過Qiagen試劑盒分離的DNA進行PCR擴增，可獲得更好的產(chǎn)量。
在本發(fā)明中，通過組合激光和微磁珠，開發(fā)了用于高效細胞裂解的新方法；當將激光束應(yīng)用于該樣品中，細胞懸浮液中存在的微磁珠導(dǎo)致快速的細胞裂解，使得細菌細胞在幾秒鐘內(nèi)得到破碎。更重要的是，此法破碎的細胞所釋放的DNA比通過其他兩種常規(guī)方法裂解細胞的DNA可得到更有效地擴增，這表明在細胞裂解期間，干擾DNA擴增的物質(zhì)的釋放與其他方法相比是最小的。這種便利、高效的細胞裂解和DNA釋放使得新的細胞裂解法十分適合被整合到LOC應(yīng)用中。
如以上所述，根據(jù)本發(fā)明的方法，在40秒鐘內(nèi)快速裂解細胞是可行的，用于破碎細胞或病毒的裝置利用激光二極管可得以小型化，在破碎細胞或病毒后可直接實施DNA純化步驟，并在除去與隨后反應(yīng)的抑制劑進行吸附的細胞碎片和磁珠后，將含有DNA的溶液轉(zhuǎn)入隨后的步驟。此外，通過本發(fā)明的細胞裂解芯片，蒸發(fā)問題得以解決，振蕩通過磁珠可有效地傳遞到細胞，粗糙表面上的微流化問題通過疏水化處理所述芯片的內(nèi)表面而得以解決，而且所述的細胞裂解芯片可應(yīng)用于LOC。
雖然本發(fā)明已借助其中的示范性實施例進行了具體說明和詳細描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解根據(jù)下列權(quán)利要求的限定，不脫離本發(fā)明的精神和范圍，可在形式上和實質(zhì)上進行各種改變。
序列表<110>三星電子株式會社(Samsung Electronics Co.，Ltd.)<120>利用微磁珠和激光快速破碎細胞或病毒的方法和裝置<160>2<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>1cccagactcc tacgcgaggc 20<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>2gtattaccgc aactgctggc ac 2權(quán)利要求
1.破碎細胞或病毒的方法，該方法包括將磁珠加入含有細胞或病毒的溶液中；振蕩磁珠；和用激光照射磁珠以破碎細胞或病毒。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述的激光包括脈沖激光或連續(xù)波(CW)激光。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述的脈沖激光是1mJ/脈沖或更高，而且所述的CW激光具有10mW或更高的功率。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述的脈沖激光是32mJ/脈沖或更高，而且所述的CW激光具有100mW或更高的功率。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述的激光在400nm或更高的波長范圍內(nèi)產(chǎn)生。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述的激光在750nm到1300nm波長范圍內(nèi)產(chǎn)生。
7.權(quán)利要求5的方法，其中所述的激光在一種或多種波長范圍產(chǎn)生。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述磁珠的尺寸是50nm-1000μm。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述磁珠的尺寸是1-50μm。
10.權(quán)利要求8的方法，其中所述的磁珠是具有兩種或多種尺寸的珠子混合物。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述的磁珠包括至少一種選自鐵磁Fe、Ni、Cr或其氧化物的物質(zhì)。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述的磁珠是用鐵磁金屬包被的聚合物、有機物、硅或玻璃。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述磁珠表面的官能團是親水性的和帶負電荷的。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述磁珠表明的官能團是羧基或其衍生物。
15.權(quán)利要求1的方法，其中含有磁珠的溶液具有6至9的pH。
16.權(quán)利要求1的方法，其中所述的溶液選自唾液、尿液、血液、血清或細胞培養(yǎng)物溶液。
17.一種用于破碎細胞或病毒的裝置，包括具有輸入樣品和磁珠的入口的細胞裂解小室；連接于小室并使所述小室中的樣品和磁珠混合的振蕩器；和連接于所述小室并提供激光的激光發(fā)生器。
18.權(quán)利要求17的裝置，其中所述的振蕩器選自超聲波儀、利用磁場的振蕩器、利用電場的振蕩器、機械振蕩器，或壓電材料。
19.權(quán)利要求17的裝置，還包括完成細胞裂解后，連接于所述細胞裂解小室并可除去細胞裂解小室中磁珠的電磁體。
20.權(quán)利要求17的裝置，還包括穿過通道連接于所述細胞裂解小室的DNA純化小室。
21.權(quán)利要求17的裝置，還包括穿過通道連接于所述細胞裂解小室的DNA擴增小室。
22.權(quán)利要求20的裝置，還包括穿過通道連接于所述DNA純化小室的DNA擴增小室。
23.一種用于破碎細胞或病毒的裝置，包括具有輸入樣品和磁珠的入口的細胞裂解芯片；通過振蕩傳遞部件連接于所述芯片的振蕩器以在該芯片上混合所述的樣品和磁珠，連接于所述芯片的振蕩傳遞部件將振蕩傳遞到所述芯片；連接于所述芯片的激光發(fā)生器提供激光；和連接于所述芯片的抗蒸發(fā)部件以抑制所述樣品的蒸發(fā)。
24.權(quán)利要求23的裝置，其中所述的振蕩器選自利用磁場的振蕩器、利用電場的振蕩器、機械振蕩器，或壓電材料。
25.權(quán)利要求24的裝置，其中所述的振蕩器通過振蕩傳遞部件可將振蕩傳遞到細胞裂解芯片的底部。
26.權(quán)利要求23的裝置，其中所述的抗蒸發(fā)部件包括隔片。
27.權(quán)利要求26的裝置，其中所述的隔片選自閥門、聚合物結(jié)構(gòu)、或金屬結(jié)構(gòu)。
28.一種用于破碎權(quán)利要求23-27任一項的用于破碎細胞或病毒的裝置的細胞裂解芯片，包括具有暴露的頂面和底面的芯片體，并包括反應(yīng)室、入口和出口；連接于芯片體頂面的芯片蓋以關(guān)閉所述反應(yīng)室的上部，可允許激光穿過，并具有入口和出口；以及通過芯片連接部件連接于芯片體底面的芯片底部，以關(guān)閉所述反應(yīng)室的下部、入口以及出口。
29.權(quán)利要求28的芯片，其中芯片蓋由選自玻璃、聚合物或氧化銦錫(ITO)玻璃的材料組成。
30.權(quán)利要求29的芯片，其中所述的芯片蓋是抗反射(AR)包被的。
31.權(quán)利要求30的芯片，其中所述的芯片蓋是AR包被的Pyrex7740。
32.權(quán)利要求28的芯片，其中所述的芯片底部由選自玻璃、聚合物、硅氧烷或雙面膠的材料組成。
33.權(quán)利要求28的芯片，其中所述的芯片底部由選自聚合物、硅氧烷、玻璃或氧化銦錫(ITO)玻璃的材料組成。
34.權(quán)利要求33的芯片，其中所述的芯片連接部件通過選自膠帶或膠連劑的粘合材料將所述的芯片體與芯片底部連接。
35.權(quán)利要求23的裝置，其中所述的激光包括脈沖激光或連續(xù)波CW)激光。
36.權(quán)利要求35的裝置，其中所述的脈沖激光是3mJ/脈沖或更高，而且所述的CW激光具有100mW或更高的功率。
37.權(quán)利要求23的裝置，其中所述的激光在400nm或更高的波長范圍內(nèi)產(chǎn)生。
38.權(quán)利要求37的裝置，其中所述的激光在一種或多種波長范圍內(nèi)產(chǎn)生。
39.權(quán)利要求23的裝置，其中所述磁珠的尺寸是50nm到1000μm。
40.權(quán)利要求39的裝置，其中所述的磁珠是具有兩種或多種尺寸的珠子混合物。
41.權(quán)利要求23的裝置，其中所述的磁珠包括至少一種選自鐵磁Fe、Ni、Cr或其氧化物的物質(zhì)。
42.權(quán)利要求23的裝置，其中所述的磁珠是用鐵磁金屬包被的聚合物、有機物、硅或玻璃。
43.權(quán)利要求23的裝置，其中所述的樣品選自唾液、尿液、血液、血清或細胞培養(yǎng)物溶液。
全文摘要
本發(fā)明提供一種利用微磁珠和激光快速破碎細胞或病毒的方法和裝置。根據(jù)利用微磁珠和激光快速破碎細胞或病毒的方法和裝置，在40秒鐘內(nèi)細胞裂解是可行的，該裝置利用激光二極管可得以小型化，在破碎細胞或病毒后可直接實施DNA純化步驟，并在用電磁體除去與隨后反應(yīng)的抑制劑進行吸附的細胞碎片和珠子后，將含有DNA的溶液轉(zhuǎn)入隨后的步驟。此外，通過本發(fā)明的細胞裂解芯片，蒸發(fā)問題得以解決，并且振蕩通過磁珠可有效地傳遞到細胞，粗糙表面上的微流化問題通過疏水化處理芯片的內(nèi)表面得以解決，以及細胞裂解芯片可應(yīng)用于LOC。
文檔編號C12N5/00GK1818054SQ20051011916
公開日2006年8月16日 申請日期2005年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月19日
發(fā)明者李廷健, 權(quán)映男, 金玲雅, 李妙龍, 俞信伊, 趙蓮子, 鄭光鎬, 劉昌恩, 梁承妍 申請人:三星電子株式會社