專利名稱：一種高溫脂肪酶基因及其應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種編碼嗜熱菌(Gebacillus species)TW-1脂肪酶的DNA序列及其表達產(chǎn)物，還涉及該含該酶基因的重組質(zhì)粒和表達相應(yīng)酶的重組菌株。
背景技術(shù)：
脂肪酶是一類可以催化分解酯酰甘油的水解酶類。它特異性地在油-水兩相界面上分解酯酰甘油中的酯鍵，最終產(chǎn)物是甘油及不同鏈長的脂肪酸。同時，也可以催化逆反應(yīng)，即甘油和脂肪酸的成酯反應(yīng)。
不同于大多數(shù)水解酶類，脂肪酶的最獨特之處在于其反應(yīng)體系的非均一性。水溶性的脂肪美可以在油-水兩相界面進行催化反應(yīng)。
近年來，隨著環(huán)境污染加劇、及人們環(huán)保意識的增強，人們對化學洗滌劑的抵制越來越明顯，活性酶添加劑型洗滌劑越來越受到人們的青睞。目前，脂肪酶已成為國際上最重要的工業(yè)酶類之一。來源不同的脂肪酶的所具有底物專一性、穩(wěn)定性、最適反應(yīng)溫度、pH、對金屬離子及去污劑的耐受能力等都有顯著的差異。其中，熱穩(wěn)定脂肪酶憑借其高度的熱穩(wěn)定性而具有更廣泛的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供的脂肪酶新穎之處在于1、對熱有較高的耐受范圍(40-90度)；2、極端pH值有較寬的適應(yīng)性(6.0-9.0)。3、對去污劑(Tween 20，Chaps或Triton X-100)及酶抑制劑(EDTA，2-ME，SDS，PMSF or DTT)有較強的耐受性。
本發(fā)明的目的是提供一種熱穩(wěn)定脂肪酶及其編碼基因。一種熱穩(wěn)定脂肪酶，是指具有SEQ NO.2氨基酸序列(417個氨基酸)的蛋白質(zhì)，或者是將序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸取代、缺失或添加，并且具有序列2的相同活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種構(gòu)建熱脂肪酶工程菌及生產(chǎn)熱穩(wěn)定脂肪酶的方法及用該方法所生產(chǎn)的熱穩(wěn)定脂肪酶的應(yīng)用。
當用大腸桿菌為宿主細胞時，得到大腸埃希氏菌[Escherichia coliBL21(DE3)]，該菌株已于2005年5月20日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏號為CGMCC NoM205046。


附圖1脂肪酶基因的克隆。泳道1，PCR回收產(chǎn)物；2，重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物(EcoR I+Hind III)；3，PCR回收產(chǎn)物。
附圖2脂肪酶在大腸桿菌表達系統(tǒng)中的表達。泳道1，只含空載的菌，未誘導；2，只含空載的菌，誘導；3，含重組質(zhì)粒的菌，未誘導；4，含重組質(zhì)粒的菌，誘導。
附圖3溫度對酶活的影響。
A，重組酶與粗酶的最適反應(yīng)溫度測定。酶與底物在不同溫度下反應(yīng)15分，然后進行酶活測定。
B，重組酶與粗酶的溫度耐受測定。酶先在不同溫度下溫育15分，然后加底物反應(yīng)15分，再進行酶活測定。
附圖4pH對酶活的影響。
A，重組酶與粗酶的最適反應(yīng)pH測定。酶與底物在不同pH下反應(yīng)15分，然后進行酶活測定。
B，重組酶與粗酶的pH耐受測定。酶先在不同pH下溫育15分，然后加底物反應(yīng)15分，再進行酶活測定。
附圖5去污劑和抑制劑對酶活的影響。
重組酶和粗酶在抑制劑(1mM)及去污劑(0.1％)作用下酶活測定。
表1金屬離子對酶活的影響。在不同濃度的金屬離子作用下，對酶活的測定。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等所著的《分子克隆實驗室手冊》(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，2001)中所述的實驗條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1.嗜熱菌(Gebacillus species)TW-1總DNA的提取及脂肪酶基因的克隆采用從中國廈門東南部熱泉分離的嗜熱菌(Gebacillus species TW-1)，常規(guī)或采用基因組提取試劑盒提取其總DNA。采用下列簡并引物Lip15’-ATGATGAAA(GT)GCTG(CT)CGG-3’，Lip25’-TTAAGGC(TC)GCAA(GA)CTCGC-3’，或者來源于簡并引物的一對特異引物。PCR反應(yīng)體系如下94℃，4分鐘，一個循環(huán)；94℃，45秒，60℃，45秒，72℃，75秒，30個循環(huán)；72℃，7分鐘一個循環(huán)。產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖電泳驗證得到一個約1.2K的DNA片段。
實施例2.脂肪酶基因的DNA的重組，表達及酶的純化采用基因工程工具酶，將擴增的DNA片段連接到質(zhì)粒載體pETGST中。然后用連接產(chǎn)物Escherichia coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞，涂布在LB平板(含Amp 100μg/ml)上。挑取陽性菌落，提取質(zhì)粒。然后采用雙酶切和測序的方法鑒定脂肪酶的DNA片段已正確重組進了表達載體。
挑取含有重組質(zhì)粒的單菌落于5ml LB液體培養(yǎng)基(含Amp 100μg/ml)，37℃搖培過夜。吸取1ml菌液于新的1000ml LB液體培養(yǎng)基(含Amp100μg/ml)，37℃搖培至OD600為0.6左右，加入IPTG至終濃度0.5mM，繼續(xù)震蕩培養(yǎng)4hr。
菌液離心，去上清。將細胞用適量PBS(pH 7.4)重懸，超聲裂解菌體，離心去沉淀，上清中的重組蛋白脂肪酶用GST柱進行親和純化。
實施例3.脂肪酶活性測定按照Ruiz et al[16][16]C.Ruiz，F(xiàn).I.J.Pastor，P.Diaz，Analysisof Bacillus megaterium lipolytic system and cloning of LipA，a novelsubfamily I.4 bacterial lipase，F(xiàn)EMS Microbiol.Lett.217(2002)263-267.等建立的酶活測定方法10mM對硝基丁酸酯(p-nitrophenylbutyrate，PNPB)，溶于乙腈/乙醇/50mM磷酸鉀緩沖液(1∶4∶95)[17].適量酶液與底物混合后，60℃溫育15分鐘，通過測定405nm波長下的吸光值判定酶活。[18].酶的定義為，每分鐘釋放出1μmol的PNPB的量的酶定義為一個單位。
實施例4.脂肪酶的性質(zhì)鑒定(1)酶最適反應(yīng)溫度的測定酶與底物在不同溫度下反應(yīng)15分，通過405nm波長下的吸光值判定酶活。重組酶與粗酶的溫度耐受測定。酶先在不同溫度下溫育15分，然后加底物反應(yīng)15分，再進行酶活測定。
(2)重組酶與粗酶的最適反應(yīng)pH測定酶與底物在不同pH下反應(yīng)15分，然后進行酶活測定。重組酶與粗酶的pH耐受測定酶先在不同pH下溫育15分，然后加底物反應(yīng)15分，再進行酶活測定。
(3)去污劑和抑制劑對酶活的影響重組酶和粗酶在抑制劑(1mM)及去污劑(0.1％)作用15分鐘后進行酶活測定。
(4)金屬離子對酶活的影響在不同濃度的金屬離子作用15分鐘后，對酶活進行測定附序表SEQ NO.11 ATGATGAAAG GCTGTCGGGT TATGTTTGTG TTGCTCGGAT TATGGCTTGT ATTCGGCCTA61TCGGTCCCGG GAGGGCGGGC TGAAGCGGCA ACTTCACGCG CCAACGATGC ACCCATCGTG121 CTTCTCCATG GTTTTACCGG CTGGGGAAGA GAAGAAATGT TTGGGTTCAA GTACTGGGGC181 GGCGTGCGCG GCGATATCGA ACAATGGCTG AACGACAACG GTTATCGAAC TTATACGCTG241 GCGGTCGGAC CGCTCTCGAG CAACTGGGAC CGGGCGTGTG AAGCGTATGC TCAGCTTGTC301 GGCGGGACGG TCGATTATGG GGCAGCCCAT GCGGCAAAGC ACGGCCATGC GCGGTTTGGC361 CGCACTTATC CCGGCCTGTT GCCGGAATTG AAAAGGGGTG GCCGCATCCA TATCATCGCC421 CACAGCCAAG GGGGGCAGAC GGCCCGCATG CTTGTCTCGC TCCTAGAGAA CGGAAGCCAA481 GAAGAGCGGG AGTACGCCAA GGCGCACAAC GTGTCGTTGT CACCGTTGTT TGAAGGTGGA541 CATCATTTTG TGTTGAGTGT GACGACCATC GCCACTCCTC ATGACGGGAC GACGCTTGTC601 AACATGGTTG ATTTCACCGA TCGCTTTTTT GACTTGCAAA AAGCGGTGTT GGAAGCGGCG661 GCTGTCGCCA GCAACGTGCC GTACACGAGT CAAGTATACG ATTTTAAGCT CGACCAATGG721 GGACTGCGCC GCCAGCCGGG TGAATCGTTC GACCATTATT TTGAACGGCT CAAGCGCTCC781 CCTGTTTGGA CGTCGACAGA TACCGCCCGC TACGATTTAT CCGTTTCCGG AGCTGAGAAG841 TTGAATCAAT GGGTGCAAGC AAGCCCGAAT ACGTATTATT TGAGCTTTGC CACAGAACGG901 ACGTATCGCG GAGCGCTCAC AGGCAACTAT TATCCCGAAC TCGGAATGAA TGCATTCAGC961 GCGGTCGTAT GCGCTCCGTT TCTCGGTTCG TACCGCAATC CGACGCTCGG CATTGACGAC1021 CGCTGGCTTG AAAACGATGG TATTGTCAAT ACGGTTTCCA TGAACGGTCC AAAGCGTGGA1081 TCAAGCGATC GGATCGTACC GTATGACGGG GCGTTGAAAA AAGGGGTTTG GAATGACATG1141 GGAACGTACA ATGTCGACCA TTTGGAAATC ATCGGCGTTG ACCCGAATCC GTCATTTGAT1201 ATTCGCGCCT TTTATTTGCG ACTTGCCGAG CAGTTGGCGA GCTTGCAGCC TTAASEQ NO.21 MMKGCRVMFV LLGLWLVFGL SVPGGRAEAA TSRANDAPIV LLHGFTGWGR EEMFGFKYWG61GVRGDIEQWL NDNGYRTYTL AVGPLSSNWD RACEAYAQLV GGTVDYGAAH AAKHGHARFG121 RTYPGLLPEL KRGGRIHIIA HSQGGQTARM LVSLLENGSQ EEREYAKAHN VSLSPLFEGG181 HHFVLSVTTI ATPHDGTTLV NMVDFTDRFF DLQKAVLEAA AVASNVPYTS QVYDFKLDQW241 GLRRQPGESF DHYFERLKRS PVWTSTDTAR YDLSVSGAEK LNQWVQASPN TYYLSFATER301 TYRGALTGNY YPELGMNAFS AVVCAPFLGS YRNPTLGIDD RWLENDGIVN TVSMNGPKRG361 SSDRIVPYDG ALKKGVWNDM GTYNVDHLEI IGVDPNPSFD IRAFYLRLAE QLASLQP
權(quán)利要求
1.一種來源于嗜熱菌的高溫脂肪酶或其功能類似物，其核苷酸序列與SEQNO.1所示的核苷酸序列具有至少90％的同源性。
2.根據(jù)權(quán)利1要求1所述的酶或其功能類似物，其氨基酸序列與SEQ NO.2所示的氨基酸序列具有至少90％的同源性。
3.一種編碼權(quán)利要求1至2中任意一項所述的高溫脂肪酶或其功能類似物的基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求所述的基因，它具有SEQ NO.1所示的核苷酸序列。
5.一種含有權(quán)利要求4所述的核苷酸序列的重組質(zhì)粒，是pLIP。
6.一種含有權(quán)利要求4或5所述的高溫脂肪酶或其功能類似物的基因的表達載體。
7.一種含有權(quán)利要求6所述表達載體的重組桿菌。
8.一種含有權(quán)利要求7所述的表達載體的重組大腸桿菌BL-21LIP，保藏號為CCTCC NOM205046。
9.一種制備高溫脂肪酶的方法，是重組大腸桿菌BL-21LIP，按微生物發(fā)酵和酶工程技術(shù)制備高溫脂肪酶。
全文摘要
本發(fā)明屬于酶基因工程和酶工程領(lǐng)域。具體地說，涉及一種編碼嗜熱菌(Gebacillus species)TW－1脂肪酶的DNA序列及其表達產(chǎn)物，還涉及含該酶基因的重組質(zhì)粒和表達相應(yīng)酶的重組菌株，及利用該工程菌制備熱穩(wěn)定脂肪酶的方法和應(yīng)用。本發(fā)明提供的脂肪酶新穎之處在于1.對熱有較高的耐受范圍(40－90攝氏度)；2.極端pH值有較寬的適應(yīng)性(6.0－9.0)。3.對去污劑(Tween 20，Chaps或Triton X－100)及酶抑制劑(EDTA，2－ME，SDS，PMSF or DTT)有較強的耐受性。
文檔編號C12N15/55GK1900276SQ20051008564
公開日2007年1月24日 申請日期2005年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月21日
發(fā)明者章曉波, 李鶴賓 申請人:國家海洋局第三海洋研究所