專利名稱：一種抗天牛Bt基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域中的植物抗蟲基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
研究背景我國是一個森林資源匱乏、林木病蟲害發(fā)生頻繁與嚴(yán)重的國家。隨著人口增加及社會發(fā)展進程中對資源、環(huán)境形成的壓力，林木病蟲害大面積成災(zāi)的致發(fā)因素逐漸增多。以天牛為代表的蛀干害蟲是多種林木的毀滅性害蟲，也是環(huán)境惡化、林木衰退情況下容易暴發(fā)成災(zāi)的類群(參見張世權(quán)，《華北天牛及其防治》，1994，北京中國林業(yè)出版社，第150-261頁；黃競方和駱有慶，《森林病蟲通訊》，1991，(1)29-33頁)。目前我國已知楊樹天牛的種類多達107種，分布于28個省、市和自治區(qū)，是一類地域分布廣、危害損失最大、防治難度也最大的蛀干害蟲。其中，對楊樹危害最嚴(yán)重的天牛種類有光肩星天牛(Anoplophra glabripennis(Motsch.))、黃斑星天牛(Anoplophra nobilis Ganglbauer)、桑天牛(Aprionagermari(Hope.))、云斑天牛(Batocera horsfieldi(Hope.))及青楊枝天牛(Saperda populnea Linnaeus)等(參見黃競方和駱有慶，《森林病蟲通訊》，1991，(1)29-33頁)。
遭受楊樹天牛危害后，楊樹的生長量和材質(zhì)、防護效能等都會有很大損失。我國舉世矚目的“三北”防護林生態(tài)工程所覆蓋的500多個旗、縣中，有300多個旗、縣發(fā)生了天牛災(zāi)害，面積超過26.64萬公頃，蟲害發(fā)生率高達60％以上，由此導(dǎo)致大量樹木被迫砍伐，被毀木材超過1700萬立方米，直接經(jīng)濟損失超過50億元人民幣(參見駱有慶和李建光，《北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報》，1999，21(4)6-12頁；熊善松，《森林病蟲通訊》，1995，(1)20-22頁)。據(jù)統(tǒng)計，僅內(nèi)蒙古被砍伐的樹木就近2000萬株。而且，楊樹天牛在“三北”地區(qū)的危害仍處于蔓延之勢，現(xiàn)已侵入河西走廊、青海、毛烏素沙地和科爾沁沙地。另外，天牛的寄主種類也在不斷增加，例如，在內(nèi)蒙古大青山的天然次生林中已發(fā)現(xiàn)光肩星天牛嚴(yán)重危害著白樺、椴樹等，且有可能引起天牛向天然次生林的蔓延(李文杰和鄔承先，《楊樹天牛綜合管理》，1993，北京中國林業(yè)出版社，第147-267頁)。因此，如果天牛得不到有效防治，將會嚴(yán)重危害“三北”防護林及平原綠化工程的建設(shè)，甚至對天然次生林也構(gòu)成巨大的威脅，給我國農(nóng)業(yè)、林業(yè)生產(chǎn)和人民生活帶來嚴(yán)重的負(fù)面影響。
因為楊樹是我國的重要造林樹種，但并非歐美地區(qū)的造林樹種，所以天牛的防治對其他國家來說，遠(yuǎn)沒有我國這樣迫切。
無論是在國際上還是在國內(nèi)，此前只有在農(nóng)業(yè)上利用蘇云金芽孢桿菌對土豆的鞘翅目害蟲的防治研究，而尚未見對林木抗天牛轉(zhuǎn)基因研究的報道。國內(nèi)外與抗蟲基因研究相關(guān)的情況和相關(guān)專利申請情況主要包括1981年Schnepf等首次從蘇云金芽孢桿菌中分離克隆了Bt基因；Adang等(1990)通過改造Bt基因的密碼子代替細(xì)菌的常用密碼子，人工合成了Bt毒蛋白基因(專利號EP0359472)；Fischhoff等(1990)去除Bt基因中存在的富含AT區(qū)域，提高編碼區(qū)的GC堿基，合成了Bt毒蛋白基因(專利號EP0385962)；郭三堆等自主設(shè)計合成了能夠在植物細(xì)胞中高效表達的GFMCryIA基因(中國專利號ZL95119563.8)；賈士榮等人工合成了幾丁質(zhì)酶(Chi)、β-1，3葡聚糖酶(Glu)、葡萄糖氧化酶(GO)基因，構(gòu)建了植物表達載體(中國專利號99100394.2及9100393.4)；朱楨等申請了CpTI基因的專利；郭三堆等申請了雙價抗蟲(Bt+CpTI)基因的專利；楊勝利申請了抗逆透明顫菌紅蛋白(VHb)基因?qū)＠?；加拿大Performance Plants公司(Kingston，加拿大)擁有氣孔閉合抗干旱基因?qū)＠膶Ｓ性S可證。但目前尚未見有關(guān)針對我國楊樹主要蛀干害蟲—天牛的轉(zhuǎn)基因抗性研究報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的主要是為了從蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensisBerliner，簡稱Bt)中克隆抗天?；?，并通過應(yīng)用該基因，防治楊樹等林木遭受天牛危害，從而為我國林業(yè)的天牛防治提供一條新的有效途徑，替代農(nóng)藥使用從而減少環(huán)境污染。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的1.質(zhì)粒載體及基因情況說明該基因所使用的載體為Promega公司(Madison，WI，USA)的pGEM-T質(zhì)粒載體和Novagen公司(Darmstadt，Germany)的原核表達載體pET30-b。后者所使用的限制性內(nèi)切酶位點為Nco I(基因5’端)和Sac I(基因3’端)。該基因全長為1956bp，編碼651個氨基酸。質(zhì)粒提取按北京鼎國生物技術(shù)公司(北京市海淀區(qū))質(zhì)粒提取試劑盒提供的步驟進行。
2.基因克隆過程(1)Bt886菌株的獲得該菌株來自中國微生物菌種保藏管理委員會林業(yè)微生物菌種保藏中心(中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護研究所)，是從擬谷盜(Tribolium Macleby)蟲尸中分離得到，并在牛肉膏、蛋白胨培養(yǎng)基上培養(yǎng)、鑒定，屬蘇云金芽孢桿菌，命名為Bt886菌株。其形態(tài)特征為營養(yǎng)體粗壯，兩端鈍圓，大小為1.2-1.8μm×3.0-5.0μm。孢子囊較營養(yǎng)體稍膨脹，產(chǎn)生卵圓形孢子，大小為0.8-1.0μm×2.0μm，同時伴生方形伴孢晶體。經(jīng)室內(nèi)生物測定，該菌株對鞘翅目蛀干害蟲桑天牛、青楊天牛、光肩星天牛等具有較強的毒殺能力。
(2)引物設(shè)計在發(fā)明人先前設(shè)計、篩選的引物基礎(chǔ)上，發(fā)明人通過檢索GenBank數(shù)據(jù)庫，下載得到蘇云金芽孢桿菌殺鞘翅目的cry3類基因，然后應(yīng)用Clustal X軟件分析比較保守區(qū)，設(shè)計、篩選出一對全長cry3Aa同源基因的PCR引物(F-2k/R-2k)作為PCR擴增引物F-2k5’ATG ATA AGA AAG GGA GGA AGA 3’R-2k5’TTA ATT CAC TGG AAT AAA TTC 3’(3)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增以從蘇云金芽孢桿菌Bt886中提取的質(zhì)粒DNA為模板，以F-2k/R-2k為引物，利用高保真的DNA Polymorase plus進行PGR擴增，得到一條約2.0Kb清晰的擴增條帶(見附

圖1)。
(4)基因序列測定經(jīng)由上海聯(lián)合基因有限公司(上海市)測定，得到的cry3A基因序列見SEQ ID NO 1，其編碼的毒蛋白氨基酸序列見SEQ ID N0 2。由結(jié)果可知，該基因的DNA序列共有1956個堿基，由它編碼的蛋白質(zhì)具有652個氨基酸。經(jīng)與已發(fā)表的cry3A基因(參見張杰，“對鞘目害蟲高毒力Btcry基因分離克隆和工程菌的構(gòu)建”(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文)，2000)相比，本基因共有6個堿基改變，由其編碼的蛋白質(zhì)共有2個氨基酸改變，證明本發(fā)明得到的基因為一新的cry3A基因，命名為Bt886cry3A。
(5)載體構(gòu)建應(yīng)用上述步驟中得到的基因進行原核載體構(gòu)建。載體構(gòu)建中的連接反應(yīng)參照美國Invitrogen公司(California，USA)的《T4 Ligase使用說明書》進行，其中的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌及藍(lán)白斑篩選步驟參照《分子克隆實驗指南》第二版(金冬雁等譯，科學(xué)出版社，1992)進行。
(6)大腸桿菌轉(zhuǎn)化及陽性克隆子的篩選A.轉(zhuǎn)化(a)取DNA連接產(chǎn)物5μl，冰浴下加入到200μl大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，冰浴30分鐘；(b)42℃熱激90秒，而后迅速置于冰上1-2分鐘；(c)加入800μl LB液體培養(yǎng)基，37℃，200rpm振蕩復(fù)蘇，以表達質(zhì)粒載體上的抗生素抗性標(biāo)記基因；(d)在含相應(yīng)抗生素平板上均勻地鋪上X-Gal和IPTG，37℃預(yù)熱30分鐘以上；(e)取50-200μl復(fù)蘇菌液均勻地涂布在平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16h。
B.篩選(a)取數(shù)個1.5ml滅菌離心管，各加入50μl滅菌純水，做好標(biāo)記；
(b)用無菌牙簽或接種針挑取轉(zhuǎn)化后的白色菌落于上述離心管中，沸水浴5分鐘；(c)8000rpm離心30秒，以上清液為模板，用相應(yīng)的PCR引物作PCR擴增檢測；(d)對PCR陽性菌落進一步小量提取質(zhì)粒做酶切檢測，確認(rèn)陽性轉(zhuǎn)化子。
C.質(zhì)粒提取質(zhì)粒提取按北京鼎國生物技術(shù)公司質(zhì)粒提取試劑盒進行。然后用0.8％Agrose膠電泳，觀察質(zhì)粒提取的結(jié)果。
3.技術(shù)效果蟲試以pET30-b質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株BL21和滅菌水為陰性對照，采用2齡的桑天牛幼蟲作毒性實驗。將IPTG誘導(dǎo)表達產(chǎn)物以一定濃度與滅菌過的麥麩(1∶6 v/v)混勻，25℃飼喂2齡的桑天牛幼蟲，10頭為一組，每組設(shè)2個重復(fù)。每隔7天進行一次稱重。結(jié)果表明，在第1次稱重時，在處理組與對照組的平均體重之間已有較大差異；3周后，處理組與帶有空質(zhì)粒的大腸桿菌陰性對照相比，蟲體平均體重減輕了77％(見表1)，處理的死亡率為76.7％，帶有空質(zhì)粒的大腸桿菌陰性試蟲死亡率為0(見表2)。表明由克隆的Bt886cry3A基因編碼的毒蛋白對桑天牛幼蟲具有相當(dāng)強的毒殺和抑制作用。
通過本發(fā)明，獲得一種新的抗天?；駼t886cry3A；進一步，通過應(yīng)用該基因，使楊樹等林木及其它易遭受天牛危害的植物獲得對天?？剐?，從而在林木的天牛防治過程中替代農(nóng)藥的使用，減少環(huán)境污染，為我國林木的天牛防治提供一條新的方法。
附圖及說明圖1Bt886cry3A基因PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖其中泳道1為1Kb標(biāo)記物(從大到小依次為10.0Kb、8.0Kb、7.0Kb、6.0Kb、5.0Kb、3.0Kb、2.5Kb、2.0Kb、1.5Kb、1.0Kb、750bp、500bp、250bp)
泳道2-4為Bt886cry3A基因PCR擴增產(chǎn)物(為同一產(chǎn)物)。
圖2Bt886cry3A基因蟲試(對桑天牛)效果圖其中，從左到右，依次為對照(H2O)標(biāo)示為飼喂水+人工飲料的桑天牛幼蟲21天后生長情況；對照(E.coli)標(biāo)示為飼喂未轉(zhuǎn)化Bt886cry3A基因的大腸桿菌+人工飲料的桑天牛幼蟲21天后生長情況；處理(抑制生長)標(biāo)示為飼喂轉(zhuǎn)化Bt886cry3A基因的大腸桿菌+人工飲料的桑天牛幼蟲21天后存活幼蟲生長情況；處理(死亡)標(biāo)示為飼喂轉(zhuǎn)化Bt886cry3A基因的大腸桿菌+人工飲料的桑天牛幼蟲21天后死亡幼蟲。
圖3Bt886cry3A基因蟲試(對黃粉甲)效果圖其中，左邊為對照的健康幼蟲，蟲體發(fā)育正常；右邊為飼喂毒蛋白后的拒食幼蟲，蟲體小、畸形，不能正常取食。
具體實施方案以下敘述本發(fā)明的實施例。應(yīng)該說明的是，這些實施例對本發(fā)明只有說明作用，沒有限制作用。
實施例1.
以pET30-b質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株BL21和滅菌水為陰性對照，采用2齡的桑天牛幼蟲作毒性實驗。將IPTG誘導(dǎo)表達產(chǎn)物以一定的濃度與滅菌過的麥麩(1∶6 v/v)混勻，25℃飼喂2齡的桑天牛幼蟲，10頭為一組，每組2個重復(fù)，每隔7天稱重一次(結(jié)果見表1和表2)。7天后第一次稱重，結(jié)果表明，處理組與對照組平均體重已有較大的差異；3周后，處理組(平均體重為0.112g)與帶有空質(zhì)粒的大腸桿菌陰性對照(平均體重為0.381g)相比，存活幼蟲的蟲體平均體重減輕了77.0％(見表1)，處理的死亡率為76.7％，帶有空質(zhì)粒的大腸桿菌陰性試蟲死亡率為0(見表2)。表明所克隆的Bt886cry3A基因編碼的毒蛋白對桑天牛幼蟲具有相當(dāng)強的毒殺和抑制作用。
表1.Bt886cry3A基因蟲試結(jié)果桑天牛蟲體重量變化表0天(g) 7天(g) 14天(g) 21天(g)對照-水0.0190.0920.2180.408對照-水0.0220.1750.2680.588對照-水0.0210.1250.2630.468對照-大腸桿菌 0.0220.1020.2050.368對照-大腸桿菌 0.0240.1370.2550.440對照-大腸桿菌 0.0200.0760.1660.336處理-cry3Aa0.0200.0410.0750.125處理-cry3Aa0.0230.0460.0770.126處理-cry3Aa0.0220.0410.0650.085求和-水0.0620.3920.7491.464求和-大腸桿菌 0.0660.3150.6261.144求和-處理 0.0650.1280.2170.336平均-水0.0210.1310.2500.488平均-大腸桿菌 0.0220.1050.2090.381平均-處理 0.0220.0430.0720.112體重減輕率0.770表2 Bt886cry3A基因蟲試結(jié)果桑天牛幼蟲死亡數(shù)據(jù)表0天(g) 7天(g) 14天(g) 21天(g) 死亡率(21天)對照-水 10 10 10 10 0對照-水 10 10 10 10 0對照-水 10 10 10 10 0對照-大腸桿菌 10 10 10 10 0對照-大腸桿菌 10 10 10 10 0
對照-大腸桿菌 10 1010 10 0處理-cry3Aa 10 7 22 0.8處理-cry3Aa 10 9 43 0.7處理-cry3Aa 10 7 22 0.8平均-水0平均-大腸桿菌 0平均-處理 0.767實施例2.
將含該Bt886cry3A基因的蘇云金芽孢桿菌菌株所產(chǎn)生的伴孢晶體飼喂桑天牛。在牛肉膏、蛋白胨培養(yǎng)基上培養(yǎng)蘇云金芽孢桿菌，30℃條件下培養(yǎng)72小時，待菌苔長滿后用無菌接種環(huán)刮下，與滅菌過的天牛人工飼料按1∶10(w/w)混合后飼喂幼蟲。以含cry1基因的蘇云金芽孢桿菌菌株所產(chǎn)生的伴孢晶體做對照，結(jié)果表明含該Bt886cry3A基因的蘇云金芽孢桿菌菌株所產(chǎn)生的伴孢晶體對桑天牛的毒殺力在4天時平均為75％，在10天時平均為100％(全部死亡)。
實施例3.
將含該Bt886cry3A基因的蘇云金芽孢桿菌菌株所產(chǎn)生的伴孢晶體飼喂光肩星天牛。飼料配制同實施例2。以含cry1基因的蘇云金芽孢桿菌菌株所產(chǎn)生的伴孢晶體做對照，結(jié)果表明含該Bt886cry3A基因的蘇云金芽孢桿菌菌株所產(chǎn)生的伴孢晶體對光肩星天牛的毒殺力在30天時平均為60％。
實施例4.
將含該Bt886cry3A基因的蘇云金芽孢桿菌菌株所產(chǎn)生的伴孢晶體飼喂青楊天牛。飼料配制同實施例2。以含cry1基因的蘇云金芽孢桿菌菌株所產(chǎn)生的伴孢晶體做對照，結(jié)果表明含該Bt886cry3A基因的蘇云金芽孢桿菌菌株所產(chǎn)生的伴孢晶體對青楊天牛的毒殺力在4天時平均為100％(全部死亡)。
實施例5.
以pET30-b質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株BL21和滅菌水為陰性對照，采用2-3齡的黃粉甲幼蟲作毒性實驗。將經(jīng)過超聲波破壁處理后的表達產(chǎn)物以一定的濃度與滅菌過的麥麩混勻，25℃飼喂黃粉甲幼蟲(結(jié)果見表3)。結(jié)果表明，本發(fā)明所克隆的Bt886cry3A基因編碼的毒蛋白對黃粉甲幼蟲具有相當(dāng)強的毒殺和抑制作用(見附圖3)。3周后幼蟲體重較0天減輕節(jié)31.3％，而對照組-E.coli和CK(-)-H2O較0天分別增加了10％和55.6％，死亡率為10％。
表3 大腸桿菌表達產(chǎn)物對黃粉甲幼蟲的生物活性測定結(jié)果 附本發(fā)明涉及的基因序列和蛋白質(zhì)序列SEQ ID NO 1(Bt886cry3A基因的核苷酸序列)1 ATGATAAGAA AGGGAGGAAG AAAAATGAAT CCGAACAATC GAAGTGAACA51 TGATACAATA AAAACTACTG AAAATAATGA GGTGCCAACT AACCATGTTC101 AATATCCTTT AGCGGAAACT CCAAATCCAA CACTAGAAGA TTTAAATTAT151 AAAGAGTTTT TAAGAATGAC TGCAGATAAT AATACGGAAG CACTAGATAG201 CTCTACAACA AAAGATGTCA TTCAAAAAGG CATTTCCGTA GTAGGTGATC251 TCCTAGGCGT AGTAGGTTTC CCGTTTGGTG GAGCGCTTGT TTCGTTTTAT301 ACAAACTTTT TAAATACTAT TTGGCCAAGT GAAGACCCGT GGAAGGCTTT351 TATGGAACAA GTAGAAGCAT TGATGGATCA GAAAATAGCT GATTATGCAA401 AAAATAAAGC TCTTGCAGAG TTACAGGGCC TTCAAAATAA TGTCGAAGAT451 TATGTGAGTG CATTGAGTTC ATGGCAAAAA AATCCTGTGA GTTCACGAAA501 TCCACATAGC CAGGGGCGGA TAAGAGAGCT GTTTTCTCAA GCAGAAAGTC
551 ATTTTCGTAA TTCAATGCCT TCGTTTGCAA TTTCTGGATA CGAGGTTCTA601 TTTCTAACAA CATATGCACA AGCTGCCAAC ATACATTTAT TTTTACTAAA651 AGACGCTCAA ATTTATGGAG AAGAATGGGG ATACGAAAAA GAAGATATTG701 CTGAATTTTA TAAAAGACAA CTAAAACTTA CGCAAGAATA TACTGACCAT751 TGTGTCAAAT GGTATAATGT TGGATTAGAT AAATTAAGAG GTTCATCTTA801 TGAATCTTGG GTAAACTTTA ACCGTTATCG CAGAGAGATG ACATTAACAG851 TATTAGATTT AATTGCACTA TTTCCATTGT ATGATGTTCG GCTATACCCA901 AAAGAAGTTA AAACCGAATT AACAAGAGAC GTTTTAACAG ATCCAATTGT951 CGGAGTCAAC AACCTTAGGG GCTATGGAAC AACCTTCTCT AATATAGAAA1001 ATTATATTCG AAAACCACAT CTATTTGACT ATCTGCATAG AATTCAATTT1051 CACACGCGGT TCCGACCAGG ATACTATGGA AATGACTCTT TCAATTATTG1101 GTCCGGTAAT TATGTTTCAA CTAGACCAAG CATAGGATCA AATGATATAA1151 TCACATCTCC ATTCTATGGA AATAAATCCA GTGAACCTGT ACAAAATTTA1201 GAATTTAATG GAGAAAAAGT CTATAGAGCC GTAGCAAATA CAAATCTTGC1251 GGTCTGGCCG TCCGCTGTAT ATTCAGGTGT TACAAAAGTG GAATTTAGCC1301 AATATAATGA TCAAACAGAT GAAGCAAGTA CACAAACGTA CGACTCAAAA1351 AGAAATGTTG GCGCGGTCAG CTGGGATTCT ATCGATCAAT TGCCTCCAGA1401 AACAACAGAT GAACCTCCAG AAAAGGGATA TAGCCATCAA CTCAATTATG1451 TAATGTGCTT TTTAATGCAG GGTAGTAGAG GAACAATCCC AGTGTTAACT1501 TGGACACATA AAAGTGTAGA CTTTTTTAAC ATGATTGATT CGAAAAAAAT1551 TACACAACTT CCGTTAGTAA AGGCATATAA GTTACAATCT GGTGCTTCCG1601 TTGTCGCAGG TCCTAGGTTT ACAGGAGGAG ATATCATTCA ATGCACAGAA1651 AATGGAAGTG CGGCAACTAT TTACGTTACA CCGGATGTGT CGTACTCTCA1701 AAAACATCGA GCTAGAATTC ATTATGCTTC TACATCTCAG ATAACATTTA1751 CACTCAGTTT AGACGGGGCA CCATTTAATC AATACTATTT CGATAAAACG1801 ATAAATAAAG GAGACACATT AACGTATAAT TCATTTAATT TAGCAAGTTT1851 CAGCACACCA TTCGAATTAT CGGGGAATAA CTTACAAATA GGCGTCACAG1901 GATTAAGTGC TGGAGATAAA GTTTATATAG ACAAAATTGA ATTTATTCCA1951 GTGAAT
SEQ ID N0 2(Bt886cry3A基因編碼的毒蛋白的氨基酸序列)1 MIRKGGRKMN PNNRSEHDTI KTTENNEVPT NHVQYPLAET PNPTLEDLNY51 KEFLRMTADN NTEALDSSTT KDVIQKGISV VGDLLGVVGF PFGGALVSFY101 TNFLNTIWPS EDPWKAFMEQ VEALMDQKIA DYAKNKALAE LQGLQNNVED151 YVSALSSWQK NPVSSRNPHS QGRIRELFSQ AESHFRNSMP SFAISGYEVL201 FLTTYAQAAN IHLFLLKDAQ IYGEEWGYEK EDIAEFYKRQ LKLTQEYTDH251 CVKWYNVGLD KLRGSSYESW VNFNRYRREM TLTVLDLIAL FPLYDVRLYP301 KEVKTELTRD VLTDPIVGVN NLRGYGTTFS NIENYIRKPH LFDYLHRIQF351 HTRFRPGYYG NDSFNYWSGN YVSTRPSIGS NDIITSPFYG NKSSEPVQNL401 EFNGEKVYRA VANTNLAVWP SAVYSGVTKV EFSQYNDQTD EASTQTYDSK451 RNVGAVSWDS IDQLPPETTD EPPEKGYSHQ LNYVMCFLMQ GSRGTIPVLT501 WTHKSVDFFN MIDSKKITQL PLVKAYKLQS GASVVAGPRF TGGDIIQCTE551 NGSAATIYVT PDVSYSQKHR ARIHYASTSQ ITFTLSLDGA PFNQYYFDKT601 INKGDTLTYN SFNLASFSTP FELSGNNLQI GVTGLSAGDK VYIDKIEFIP651 VN
權(quán)利要求
1.一種Bt基因(Bt886cry3A)的DNA序列，其特征是該DNA序列具有如SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。
2.一種蛋白質(zhì)的氨基酸序列，其特征是該蛋白質(zhì)的氨基酸序列是由權(quán)利要求1的DNA序列所編碼，且具有如SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。
3.一種原核生物的表達質(zhì)粒，其特征是該質(zhì)粒是應(yīng)用權(quán)利要求1的DNA序列所構(gòu)建。
4.權(quán)利要求3的表達質(zhì)粒，其中所說的原核生物是大腸桿菌。
5.一種防治昆蟲的方法，其特征是該方法應(yīng)用權(quán)利要求1的DNA序列。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所說的昆蟲是天牛、黃粉甲。
7.一種獲得抗天牛轉(zhuǎn)基因植物的方法，其特征是該方法應(yīng)用權(quán)利要求1的DNA序列。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域中的植物抗蟲基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及一種抗天牛的Bt886cry3A基因的DNA序列和由它編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，該基因的DNA序列具有1956個堿基，由它編碼的蛋白質(zhì)具有652個氨基酸。進一步，本發(fā)明涉及由上述Bt886cry3A基因構(gòu)建的原核生物表達質(zhì)粒、涉及應(yīng)用上述Bt886cry3A基因防治昆蟲尤其是鞘翅目昆蟲如天牛和黃粉甲的方法和涉及應(yīng)用上述Bt886cry3A基因的DNA序列獲得抗鞘翅目昆蟲的轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明可廣泛應(yīng)用于林木的天牛等鞘翅目昆蟲的生物防治。
文檔編號C12N15/32GK1556209SQ200410000020
公開日2004年12月22日 申請日期2004年1月2日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月2日
發(fā)明者盧孟柱, 戴連韻, 王學(xué)聘, 田穎川, 陳軍 申請人:中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所