專利名稱：用于殺蟲劑分析的方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了一種基于電荷耦聯(lián)裝置的用于殺蟲劑分析的快速檢測試劑盒。本發(fā)明還提供了一種基于電荷耦聯(lián)裝置的用于殺蟲劑分析的檢測試劑盒的制造方法，及其用于檢測水、食物和環(huán)境中殺蟲劑水平的用途。
背景技術(shù)：
與水和農(nóng)業(yè)有關(guān)的環(huán)境保護迫切需要對人類健康的關(guān)注。由于使用污染的水和食物，發(fā)生了重大健康問題。許多國家在農(nóng)業(yè)中應(yīng)用有機氯和有機磷殺蟲劑。近幾十年來，由于在農(nóng)業(yè)中增加使用殺蟲劑，地表水、食物原料和食品正被殺蟲劑殘留物污染。
污染監(jiān)測和保護機構(gòu)需要快速靈敏的分析污染物的方法。通常用于殺蟲劑分析的分析方法包括液相色譜法、氣相色譜法以及ELISA法(Lehotay，S.J.，通過直接的樣品導(dǎo)入/氣相色譜/質(zhì)譜法聯(lián)用對水果和蔬菜的混合提取物中的殺蟲劑殘留物的分析，J.AOAC Int.，2002，83，680-697；Sasaki.K.，Suzuki.K.，and Sito.Y.，(1987)‘作物中有機磷殺蟲劑的簡易清除和氣相色譜檢測’Journal of the Association of Official analytical ChemistsInternational，70，460-464.Fernandez.M.，Pico，Y.，Girotti，S.，Manes，J.，‘通過液相色譜-大氣壓化學電離-質(zhì)譜法分析蜜蜂體內(nèi)有機磷殺蟲劑’，J.Agric.Food chem.2001，49，3540-3547)。
這些傳統(tǒng)方法的靈敏度達到了ppb水平，但耗時、費力且需要熟練的技術(shù)員和昂貴的儀器裝置。生物傳感器是另一種快速、經(jīng)濟地檢測殺蟲劑裝置方法。應(yīng)用生物傳感器對殺蟲劑進行快速定性檢測方面的文獻很少。特別是，沒有快速定性方法用于檢測水和食物材料中的甲基對硫磷(MP)殺蟲劑殘留物。
參見美國專利6,569,384(發(fā)明者Greenbaum；Elias(Oak Ridge，TN)；Sanders；Charlene A.(Knoxville，TN)May 27，2003，′用于檢測化學戰(zhàn)劑的基于組織的水質(zhì)生物傳感器′)。他們描述了一種裝置，用于將水導(dǎo)入細胞和將水從細胞中導(dǎo)出，用于分析自然發(fā)生的、自由生活的天然光合生物在水中的光合活性；一種用于測定導(dǎo)入細胞中的有機體的光合活性的熒光計；以及一種用于分析熒光計的原始數(shù)據(jù)和發(fā)出信號的電子包，表明至少存在一種μg/ml(ppm水平)濃度的殺蟲劑。該方法的局限為，對殺蟲劑的檢測僅達到ppb水平、耗時，并且對任何殺蟲劑都不是特異性的。該方法將非特異性地對許多有機磷和氨基甲酸酯殺蟲劑作出反應(yīng)。
參見纖維素試紙免疫測定法，其描述于Mosiello，L.，Cremisini，C.，Sergre，L.，Chiavarini，S.and Spano，M.(1998)，用于分析水樣品中的萎去津和特丁津的纖維素試紙免疫測定方法.J.Agric.Food Chem.46，3847-3851中。在該方法中，將抗體固定于尼龍膜上，當他們使用反射儀時，檢測極限為1.2至10μg/L-1(ppb水平)。該方法的檢測極限為ppb水平。報道顯示，存在于該方法中的主要問題是精確度不夠，可能是因為尼龍膜或聚苯乙烯透明膜(transperants)上的單克隆抗體的同質(zhì)性以及彩色TMB電荷轉(zhuǎn)移復(fù)合體不穩(wěn)定。
可參見用于殺蟲劑檢測的檢測試劑盒和方法，其描述于Eliezer，Z，Steven，S.Stanely E.C，Sciences，C的W093 14222中。在此出版物中，描述了將昆蟲腦用作生物傳感器。然而，該專利未描述殺蟲劑的檢測極限或分析所需的持續(xù)時間。
上述報道的現(xiàn)有技術(shù)方法耗時。此外，大多數(shù)已知方法對分析物是非特異性的，并需要使用者具有良好的技術(shù)知識。因此，需要一種改進的方法和檢測試劑盒用于殺蟲劑分析。
發(fā)明目的因此，本發(fā)明的一個重要目的是提供一種用于殺蟲劑檢測的快速檢測試劑盒，該試劑盒消除了上述缺點。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于殺蟲劑檢測的快速靈敏(ppt水平)的檢測試劑盒，該試劑盒使用免疫化學發(fā)光原理。
發(fā)明概述本發(fā)明利用一種新的方式，化學發(fā)光(CL)和生化反應(yīng)產(chǎn)生光，其在高靈敏度(ppt水平)上與殺蟲劑濃度呈正比，達到了本發(fā)明的上述和其它目的。目前還沒有關(guān)于使用化學發(fā)光(CL)檢測殺蟲劑特別是甲基/乙基對硫磷(MP/EP)的報道。據(jù)悉，基于CL的檢測試劑盒檢測極低濃度的分析物是非常靈敏的。CL方法具有眾多優(yōu)點，如分析靈敏快速、結(jié)果可靠且設(shè)備低廉，因此，該檢測試劑盒已成為殺蟲劑檢測中的一種引人注目的分析工具。這方面，參見(J Wang C.Zhang，H.Wang，F(xiàn).Yang and X.Zhang，2001，用于敵敵畏殺蟲劑檢測的基于發(fā)光氨的化學發(fā)光流式注射法進展，54，1185-1193)，其中他們已在ppm水平上(0.2-3.1μg/ml)檢測到敵敵畏。然而，該方法不能用于甲基對硫磷的檢測。應(yīng)當注意，在上述提及的現(xiàn)有技術(shù)方法中均未包括抗體-抗原反應(yīng)。相反，本發(fā)明的新穎性在于抗體-抗原反應(yīng)的使用，對電荷耦聯(lián)裝置(CCD)耦聯(lián)的殺蟲劑是特異性的。使用化學發(fā)光和CCD照相機高靈敏地(達到ppt水平)檢測殺蟲劑未見報道。本發(fā)明開發(fā)的基于CL的檢測試劑盒能使快速、靈敏的殺蟲劑檢測達到ppt水平。本發(fā)明的另一新穎性在于使用了如鐵氰化鉀的電子介質(zhì)，以放大產(chǎn)生的非常低水平的光信號，因此能從ppm至ppt水平清楚地區(qū)別不同的殺蟲劑濃度。
發(fā)明詳述現(xiàn)在將參考以下附圖詳細地描述本發(fā)明，其中

圖1顯示利用過氧化氫的HRP酶催化的電子供體底物的氧化；及圖2顯示本發(fā)明殺蟲劑檢測試劑盒使用的流程圖。
基于免疫化學發(fā)光(ICL)的殺蟲劑檢測原理本發(fā)明基于下述發(fā)現(xiàn)，即在過氧化氫(H2O2)存在時，辣根過氧化物酶(HRP)催化發(fā)光氨(luminol，魯米諾)的氧化。發(fā)光氨一旦氧化即達到激發(fā)態(tài)，然后通過發(fā)光衰變到基態(tài)。使用該方法利用相應(yīng)的抗體可檢測各種殺蟲劑，如乙基對硫磷(EP)和甲基對硫磷。
按照下述方案，HRP酶利用過氧化氫催化電子供體底物的氧化。
殺蟲劑檢測將過量的MP抗體固定于免疫生物反應(yīng)器柱中的載體基質(zhì)上。殺蟲劑分子與固定抗體結(jié)合。在此過程中，一些抗體位點(抗原決定簇)保持未結(jié)合狀態(tài)。這些未結(jié)合位點可用于結(jié)合MP-HRP-軛合物。將定量的MP-HRP-軛合物通過該柱，因此，保留的抗體抗原決定簇位點被該軛合物占據(jù)。再將該抗體柱充分洗滌。將這些固定的具有基質(zhì)的殺蟲劑和MP-HRP-軛合物的取出，然后用于上述化學發(fā)光反應(yīng)。然而，在該反應(yīng)中，產(chǎn)生的光強度非常低。為使光強度增強，加入電子介質(zhì)K3FeCN6。殺蟲劑濃度高時，有更多未反應(yīng)的H2O2，其與K3FeCN6反應(yīng)，并產(chǎn)生增強的光強度，該光強度與殺蟲劑濃度呈正比。
如圖1所示，在過氧化氫(H2O2)存在時，辣根過氧化物酶(HRP)催化發(fā)光氨的氧化，發(fā)光氨一旦氧化，達到激發(fā)態(tài)，然后通過發(fā)光衰變到基態(tài)。使用該方法利用不同的抗體可檢測不同的殺蟲劑，如乙基對硫磷(EP)和甲基對硫磷。
圖2示例性描述本發(fā)明的方法和試劑盒(或裝置)。本發(fā)明的試劑盒(或裝置)使用免疫化學發(fā)光在ppt水平快速檢測殺蟲劑，包括用于填裝固定抗體的毛細管柱6。將欲檢測殺蟲劑含量的樣品溶液2源與所述的柱6可操作地連接。將緩沖液1源與所述的柱可操作地連接以平衡抗體并洗滌未被結(jié)合的殺蟲劑。尿素H2O2發(fā)光氨和K3Fe(CN)6源也可操作地與所述的柱6連接。優(yōu)選地，將所有所述的試劑來源通過蠕動泵5與所述的柱6連接?；旌系乃鲈噭?dǎo)致發(fā)光，其發(fā)生在與所述的柱6連接的柱7I。將產(chǎn)生的光以CCD照相機8捕獲，以記錄產(chǎn)生的光強度，該照相機與計算機9連接，以與對照樣品進行比較。
本發(fā)明檢測水中存在殺蟲劑的方法的優(yōu)選實施方案包括下述
(1).將從雞中產(chǎn)生并從蛋黃中純化(IgY-MP)的甲基對硫磷(MP)抗體，通過還原氨化固定于瓊脂糖基質(zhì)上(Hermanson G.T，A.K Mallia andSmitjh P.K，Immobilized affinity ligand techniques(固定親和配體的技術(shù))Academic press，1992，69-75)，將該抗體加入裝填的柱中后進行流式ELISA，根據(jù)以下所述使用不同濃度的MP和MP-HRP軛合物。2).將150μl固定抗體裝填于玻璃毛細管柱中，并以10倍柱床體積的冷PBS(pH7.4，50mM)平衡。將包含殺蟲劑的50μl該溶液樣品以50μl/min流速過柱。3).持續(xù)通PBS 5min以洗滌未被結(jié)合的殺蟲劑。4).將25μl MP-HRP軛合物以50μl/min流速過柱。5)使用包含0.1％BSA的PBS將未被結(jié)合的軛合物洗脫15min。6).最后，將包含基質(zhì)的軛合物從柱中取出并用于下述的化學發(fā)光檢測向上述獲得的包含基質(zhì)的50μl軛合物中加入25μl尿素H2O2(10mM的Milli Q溶液)，于室溫放置2min。然后將25μl 0.1mM發(fā)光氨加至25μl0.5％K3Fe(CN)6(在Milli Q水中制備)，充分混合。該過程中產(chǎn)生的光立即被暗室中的CCD照相機捕獲。將圖像中的光強度與不具有殺蟲劑的對照相比較。發(fā)現(xiàn)對照組中產(chǎn)生的光較少，而在包含殺蟲劑的樣品中產(chǎn)生的光較多。還觀察到在殺蟲劑濃度較高時產(chǎn)生的光較多，而在包含較少殺蟲劑的樣品中觀察到的光較少。
僅以示例性說明的方式給出下述實施例，因此其不應(yīng)構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限制。
實施例該實施例示例性說明本發(fā)明，如圖2的流程所示。參見圖2，將150μl固定抗體裝填于玻璃毛細管柱6中，并以10倍柱床體積的冷PBS(pH7.4，50mM)平衡。將包含殺蟲劑2的50μl樣品溶液以50μl/min流速通過柱6。連續(xù)5min通PBS 1以洗滌未被結(jié)合的殺蟲劑。將25μl MP-HRP軛合物3以50μl/min流速過柱6。使用包含0.1％BSA的PBS 1將未被結(jié)合的軛合物洗脫15min。優(yōu)選地，將上述的所有試劑經(jīng)由蠕動泵5通入柱6。最后，將包含基質(zhì)的軛合物從柱中取出用于下述的化學發(fā)光檢測
向上述獲得的包含基質(zhì)的50μl軛合物中加入25μl尿素H2O2(10mM的Milli Q溶液)，于室溫放置2min。如7所示，然后將25μl 0.1mM發(fā)光氨加至25μl 0.5％K3Fe(CN)6中，充分混合。在此過程中產(chǎn)生的光立即被暗室中的CCD照相機8捕獲。通過計算機9，將圖像中的光強度與不合殺蟲劑的對照組比較。
監(jiān)測了不同濃度殺蟲劑(MP)，包括100ppb、1ppb、500ppt和10ppt以及不含任何殺蟲劑的對照組的ICL強度。能被識別的清晰可見的CL強度高達10ppt。從圖2底部可以看出，在較低殺蟲劑濃度時，樣品與對照之間的CL差異很難區(qū)別。該檢測試劑盒裝置可檢測是否存在水平達10ppt的殺蟲劑。
本發(fā)明用于殺蟲劑分析的簡易圖像檢檢測劑盒可檢測水、食物和環(huán)境中的殺蟲劑，甚至普通人也能夠檢測。
權(quán)利要求
1.利用免疫化學發(fā)光在ppt水平快速檢測殺蟲劑的方法，包括將在玻璃毛細管柱中填裝的固定抗體填裝，將欲檢測殺蟲劑含量的樣品溶液通過所述柱從而形成殺蟲劑-抗體軛合物，從所述柱中除去所述的殺蟲劑-抗體軛合物，然后加入尿素H2O2，再加入發(fā)光氨和K3Fe(CN)6，將所述的溶液充分混合直到產(chǎn)生光，然后以CCD照相機捕獲產(chǎn)生的光，所產(chǎn)生的光強度與所述樣品中的殺蟲劑含量成正比。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的抗體包括由雞產(chǎn)生的甲基對硫磷(MP)抗體，其從蛋黃中純化(IgY-MP)，然后固定于瓊脂糖基質(zhì)上。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述的尿素H2O2使用范圍為10-50μl。
4.如前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述的發(fā)光氨使用范圍為10-50μl。
5.如前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述的K3Fe(CN)6使用范圍為10-150μl。
6.如前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中加入尿素H2O2后，將所述的殺蟲劑-抗體軛合物于室溫保持約2分鐘。
7.如前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中向所述的柱加入磷酸鹽緩沖液以洗滌未被結(jié)合的殺蟲劑。
8.利用免疫化學發(fā)光在ppt水平快速檢測殺蟲劑的試劑盒，包括用于填裝固定抗體的毛細管柱，欲檢測殺蟲劑含量的樣品溶液源，所述樣品溶液源與所述的柱可操作地連接，與所述的柱可操作地連接的殺蟲劑源，與所述的柱可操作地連接的緩沖液源，與所述的柱可操作地連接的尿素H2O2源，與所述的柱可操作連接的發(fā)光氨源，及與所述的柱可操作連接的K3Fe(CN)6源，以致將所有的試劑充分混合，直到產(chǎn)生光，并捕獲所產(chǎn)生的光，以及記錄所產(chǎn)生的光強度的CCD照相機，所述光強度為所述樣品中存在的殺蟲劑水平的函數(shù)。
9.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其中將計算機與所述的CCD照相機連接，以將所述檢測樣品產(chǎn)生的光與對照樣品進行比較。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用免疫化學發(fā)光在ppt水平快速檢測殺蟲劑的方法。該方法包括將固定抗體裝填于玻璃毛細管柱中，將欲檢測殺蟲劑含量的樣品溶液通過所述的柱形成殺蟲劑－抗體軛合物，從柱中除去所述的殺蟲劑－抗體軛合物，然后加入尿素H
文檔編號C12Q1/00GK1886660SQ200380110943
公開日2006年12月27日 申請日期2003年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月31日
發(fā)明者姆納·辛弗·薩庫爾, 奈坎卡特·卡訥什·卡蘭斯, 麥斯奧·阿楠薩拉麥阿·庫瑪爾, 班咖勞爾·艾什瓦爾·阿米塔拉尼, 阿蒂瑪爾·帕沙, 尼蒂如·高帕拉·克瑞什納·卡蘭斯 申請人:科學與工業(yè)研究委員會