專(zhuān)利名稱(chēng)：能可逆性增殖的表達(dá)胰島素的人胰島細(xì)胞株及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能可逆性增殖的表達(dá)胰島素的人胰島細(xì)胞株。本發(fā)明還涉及用于糖尿病的治療劑和胰島素的制造方法。
背景技術(shù)：
根據(jù)胰島素活性降低的原因，可以將糖尿病分為1型糖尿病(青少年糖尿病)和2型糖尿病兩大類(lèi)。
1型糖尿病是由于自身免疫異常導(dǎo)致產(chǎn)生胰島素的胰腺β細(xì)胞特異性受損而發(fā)生的(參照Atkinson MA，Maclaren NK.，N.Engl.J.Med.3311428-1436，1994)。胰腺β細(xì)胞的再生替代療法之一的移植被認(rèn)為是從根本上的治療。作為這種方法有胰腺移植和胰島移植。這兩種移植的目的在于可以非常嚴(yán)格地調(diào)節(jié)血糖，避免發(fā)生低血糖，進(jìn)而避免發(fā)生長(zhǎng)期并發(fā)癥。其目的不僅僅在于使患者從胰島素療法所產(chǎn)生的日常煩惱中解脫出來(lái)從而提高生活質(zhì)量(QOL)。作為以治療胰島素依賴(lài)性糖尿病為最終目標(biāo)的方法，移植療法是一種在將來(lái)比胰島素療法更具潛力的治療方法。但是，胰腺移植中存在著手術(shù)侵襲大，而且因伴隨移植的外分泌腺產(chǎn)生的并發(fā)癥而成為重癥等問(wèn)題。與之相反，可以說(shuō)目的在于去除導(dǎo)致伴隨移植操作的并發(fā)癥的外分泌腺，僅僅分離、移植胰腺β細(xì)胞的胰島移植是現(xiàn)在通過(guò)最接近生理的方法能夠有望恢復(fù)到糖尿病發(fā)病以前的狀態(tài)的治療方法。而且，即使在胰島素的分泌保持在一定程度的2型糖尿病中，也會(huì)隨著疾病階段的發(fā)展由于糖毒性和β細(xì)胞的衰竭引起胰島素的不足，但是由于可用于移植的胰島不足這一嚴(yán)峻的現(xiàn)實(shí)，2型糖尿病現(xiàn)在不適于胰島移植。將來(lái)，在能夠供給豐富的移植胰島時(shí)，很有可能將胰島移植用于呈胰島素耐受性的胰島素依賴(lài)型糖尿病。
據(jù)報(bào)道稱(chēng)，就2000年加拿大埃德蒙頓的Alberta大學(xué)提供的7個(gè)臨床胰島移植病例，通過(guò)后來(lái)稱(chēng)之為“埃德蒙頓方案”的免疫抑制劑的全新使用方法，所有接受胰島移植的1型糖尿病病例可以擺脫胰島素(參照Shapiro AM，Lakey JR，Ryan EA，等人，N.Engl.J.Med.343230-238，2000)。可以認(rèn)為對(duì)于胰島素依賴(lài)型糖尿病患者而言，胰島移植是現(xiàn)在最理想的治療方法。
胰島是胰腺的內(nèi)分泌腺組織，其體積不超過(guò)胰腺總體積的2％。胰島是內(nèi)分泌細(xì)胞的細(xì)胞群，其由α細(xì)胞、β細(xì)胞、PP細(xì)胞、δ細(xì)胞等構(gòu)成。具有降低血糖作用的唯一的內(nèi)源性激素胰島素是由胰島的β細(xì)胞分泌的。β細(xì)胞占構(gòu)成胰島的所有細(xì)胞的80-85％，不僅分泌胰島素，而且可以感知血中的糖分。這種目的在于通過(guò)從胰腺中分離胰島，移植到胰島素依賴(lài)型糖尿病患者中以替代和再生業(yè)已衰竭的血糖降低系統(tǒng)的方法就是胰島移植。
但是，現(xiàn)行的胰島移植中，存在由于使用免疫抑制劑產(chǎn)生的安全性問(wèn)題，而且存在所謂移植胰島不足的大問(wèn)題。所謂移植胰島不足的問(wèn)題是，無(wú)論怎樣提高現(xiàn)在的胰島分離技術(shù)，胰腺移植/胰島分離所需要的從腦死亡的人體中摘出的胰腺都比需要這種胰腺的患者數(shù)少得多，而且未見(jiàn)到今后有解決該問(wèn)題的可能。
因此，制備具有與胰島或胰腺β細(xì)胞相同功能的細(xì)胞可對(duì)社會(huì)做出很大的貢獻(xiàn)并且對(duì)醫(yī)療經(jīng)濟(jì)有著巨大的影響。而且，在近年來(lái)急速發(fā)展且倍受關(guān)注的干細(xì)胞研究中也顯示出向胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞分化誘導(dǎo)的可能性(參照Lumelsky N，Blondel O，Laeng P，等人，Science2921389-1394，2001；Assady S，Maor G，Amit M等人，Diabetes501691-1697，2001)，這也成為進(jìn)一步促進(jìn)對(duì)人為生產(chǎn)胰腺β細(xì)胞的關(guān)注的因素。
現(xiàn)在，正在對(duì)可作為代替人成熟胰島β細(xì)胞的細(xì)胞的供給源的人ES細(xì)胞、組織干細(xì)胞等進(jìn)行積極的研究。有報(bào)道稱(chēng)通過(guò)分化誘導(dǎo)在一部分細(xì)胞(小鼠ES細(xì)胞和肝干細(xì)胞)中確認(rèn)有胰島素的表達(dá)，但是尚不清楚在哪個(gè)階段，導(dǎo)入了哪個(gè)基因才能有效地分泌胰島素。而且，這樣制備的干細(xì)胞的使用實(shí)質(zhì)上包含著具有多分化能力和活躍的增殖能力的細(xì)胞難以由自身控制的困難，因此可認(rèn)為實(shí)現(xiàn)應(yīng)用今后尚需相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間。
而且，一方面利用豬組織/細(xì)胞的研究獲得進(jìn)展，另一方面逐漸顯現(xiàn)出人畜共感染性疾病、生物體組織適應(yīng)性和倫理問(wèn)題等問(wèn)題。尤其是病毒的潛在的危險(xiǎn)性逐漸成為很大的問(wèn)題。例如，由于豬的臟器、細(xì)胞攜帶的來(lái)源于豬的病毒感染宿主而引起疾病的危險(xiǎn)性(尤其是，由于內(nèi)源性豬特異性逆轉(zhuǎn)錄病毒(porcine endogenous retrovirus；PERV)插入到染色體中，因此不可能排除)，這存在病毒擴(kuò)散感染到家人和醫(yī)務(wù)人員，進(jìn)而將新病毒感染擴(kuò)散到社會(huì)的危險(xiǎn)性等。
因此，現(xiàn)在希望建立容易處理的胰島素分泌人胰島細(xì)胞株作為代替人成熟胰島β細(xì)胞的細(xì)胞供給源。但是，時(shí)至今日，許多研究人員積極地致力于使人胰島細(xì)胞無(wú)限增殖，但是沒(méi)有一個(gè)關(guān)于產(chǎn)生胰島素的人胰島細(xì)胞株的報(bào)道?？梢哉J(rèn)為這是因?yàn)?)由于產(chǎn)生胰島素的β細(xì)胞存在于胰島內(nèi)部，因此導(dǎo)入基因存在困難、2)為了建立無(wú)限增殖細(xì)胞株，使用病毒來(lái)源的癌基因(猿猴病毒40腫瘤抗原等)可使細(xì)胞的壽命延長(zhǎng)，但是無(wú)法實(shí)現(xiàn)完全的無(wú)限增殖。事實(shí)上，人細(xì)胞能夠超越增殖衰減而持續(xù)無(wú)限增殖的頻率低(參見(jiàn)Shay JW，WrightWE，Exp.Cell Res.184109-118，1989；Ray FA，K raemer PM，Carcinogenesis 141511-1516，1993)。進(jìn)而，據(jù)報(bào)道使用SV40T的細(xì)胞在體外的自然無(wú)限增殖的可能性大約為3.3×10-7，據(jù)稱(chēng)這需要內(nèi)源性端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性的自然表達(dá)(參見(jiàn)Bondar AG，Science279349-352，1998Zhu J等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA963723-3728，1999；Halvorsen TL等人，Mol.CellBoil.191864-1870，1999)。
本發(fā)明解決了以往的問(wèn)題，以提供能夠產(chǎn)生胰島素并且能夠容易地確保獲得滿(mǎn)足所需細(xì)胞數(shù)目的人胰島細(xì)胞株為課題。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述課題我們反復(fù)進(jìn)行了積極的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在從健康人分離的人胰島細(xì)胞中導(dǎo)入表達(dá)人端粒末端轉(zhuǎn)移酶逆轉(zhuǎn)錄酶(以下簡(jiǎn)稱(chēng)為“hTERT基因”)的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體-SSR#197(參見(jiàn)WatanabeT等人，Transplantation 15；75(11)1873-1880，2003)和表達(dá)猿猴病毒40腫瘤抗原基因(以下簡(jiǎn)稱(chēng)為“SV40T基因”)的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體SSR#69(參見(jiàn)Westerman KA，Leboulch P.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 938971-8976，1996)時(shí)，可以建立一種能可逆性增殖的無(wú)限增殖細(xì)胞的細(xì)胞株，其特征為具有胰島素產(chǎn)生能力，并且在除去hTERT和SV40T基因后可以增強(qiáng)胰島素的表達(dá)的細(xì)胞株，從而完成本發(fā)明。
也就是說(shuō)，本發(fā)明涉及一種可逆性無(wú)限增殖人胰島細(xì)胞株或其傳代細(xì)胞株，該細(xì)胞株是含有分別夾在一對(duì)LoxP序列之間的hTERT基因和SV40T基因的可逆性無(wú)限增殖的人胰島細(xì)胞株，其特征在于其具有產(chǎn)生胰島素的能力，并且在除去所述hTERT基因和SV40T基因之后可以增強(qiáng)胰島素的表達(dá)。
上述可逆性無(wú)限增殖人胰島細(xì)胞株優(yōu)選是NAKT-13(保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所，專(zhuān)利生物保藏中心，地址是日本茨城筑波市東1-1-1中央第6號(hào)(郵政編號(hào)305-8566)，保藏日是2003年9月4日，保藏號(hào)為FERM BP-08461)。
本發(fā)明還涉及通過(guò)從上述可逆性無(wú)限增殖人胰島細(xì)胞株或其傳代細(xì)胞株中除去hTERT基因和SV40T基因獲得的人胰島細(xì)胞。
本發(fā)明進(jìn)而還涉及含有通過(guò)從上述可逆性無(wú)限增殖人胰島細(xì)胞株或其傳代細(xì)胞株中除去hTERT基因和SV40T基因獲得的人胰島細(xì)胞的用于糖尿病的治療劑。
本發(fā)明還涉及胰島素的制備方法，特征在于該方法使用上述可逆性無(wú)限增殖人胰島細(xì)胞株或其傳代細(xì)胞株，或者使用通過(guò)從上述可逆性無(wú)限增殖人胰島細(xì)胞株或其傳代細(xì)胞株中除去hTERT基因和SV40T基因獲得的人胰島細(xì)胞。


圖1是表示本發(fā)明的可逆性無(wú)限增殖人胰島細(xì)胞株的制備方法和通過(guò)從上述可逆性無(wú)限增殖人胰島細(xì)胞株或其傳代細(xì)胞株中除去hTERT基因和SV40T基因可獲得的人胰島細(xì)胞的制備方法的示意圖。其中，ATG表示起始密碼子，Ψ表示包裝信號(hào)，LoxP表示LoxP序列，hTERT表示hTERT基因，EGFP表示增強(qiáng)的綠色熒光蛋白質(zhì)基因，MoMLVLTR表示Moloney小鼠白血病病毒長(zhǎng)末端重復(fù)序列，ECMV IRES表示腦心肌炎病毒內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)，HygroR表示潮霉素抗性基因，HSV-TK表示單純皰疹病毒胸苷激酶基因，SV40T表示SV40T基因，NeoR表示新霉素抗性基因。
圖2是表示NAKT-13細(xì)胞(保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所，專(zhuān)利生物保藏中心，地址是日本茨城筑波市東1-1-1中央第6號(hào)(郵政編號(hào)305-8566)，保藏日是2003年9月4日，保藏號(hào)為FERMBP-08461)的相差顯微鏡照片。1表示核，2表示神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞樣的突起。
圖3是表示通過(guò)胰島素免疫染色法染色的NAKT-13細(xì)胞(保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所，專(zhuān)利生物保藏中心，地址是日本茨城筑波市東1-1-1中央第6號(hào)(郵政編號(hào)305-8566)，保藏日是2003年9月4日，保藏號(hào)為FERM BP-08461)的照片。無(wú)論深淺顯出紅色的部分1都表示細(xì)胞核，無(wú)論深淺顯出綠色的部分3都表示胰島素。
圖4是為了更明確地表示胰島素和細(xì)胞核而繪制的圖3的示意圖。1對(duì)應(yīng)于圖3的1，表示細(xì)胞核。并且，3對(duì)應(yīng)于圖3的3，表示胰島素。
圖5是表示通過(guò)胰島素免疫染色法染色的經(jīng)AxCANCre處理的NAKT-13細(xì)胞的照片。無(wú)論深淺顯出紅色的部分1都表示細(xì)胞核，無(wú)論深淺顯出綠色的部分3都表示胰島素。
圖6是為了更明確地表示胰島素和細(xì)胞核而繪制的圖5的示意圖。1對(duì)應(yīng)于圖5的1，表示細(xì)胞核。并且，3對(duì)應(yīng)于圖5的3，表示胰島素。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明中，所謂“可逆性無(wú)限增殖”或“能夠可逆性增殖的”是指將無(wú)限增殖基因轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞中，使該細(xì)胞處于可以無(wú)限增殖的狀態(tài)，在增殖到目的細(xì)胞數(shù)后，通過(guò)去除該無(wú)限增殖基因，可以停止細(xì)胞增殖，使細(xì)胞恢復(fù)到原來(lái)的高安全性狀態(tài)的狀態(tài)。
本發(fā)明的可逆性無(wú)限增殖的人胰島細(xì)胞株是含有分別夾在一對(duì)LoxP序列之間的hTERT基因和SV40T基因的人胰島細(xì)胞株。更為詳細(xì)的是，通過(guò)將含有夾在一對(duì)LoxP序列之間的hTERT基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體-SSR#197和含有夾在一對(duì)LoxP序列之間的SV40T的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體-SSR#6 9導(dǎo)入到從健康人分離的胰島細(xì)胞中獲得的具有胰島素產(chǎn)生能力，并且在除去hTERT基因和SV40T基因后可以增強(qiáng)胰島素的表達(dá)的細(xì)胞。不過(guò)這其中優(yōu)選NAKT-13細(xì)胞株(保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專(zhuān)利生物保藏中心，地址是日本茨城筑波市東1-1-1中央第6號(hào)(郵政編號(hào)305-8566)，保藏日是2003年9月4日，保藏號(hào)為FERM BP-08461)。并且，如圖2(NAKT-13細(xì)胞株(保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所，專(zhuān)利生物保藏中心，地址是日本茨城筑波市東1-1-1中央第6號(hào)(郵政編號(hào)305-8566)，保藏日是2003年9月4日，保藏號(hào)為FERM BP-08461))所示，本發(fā)明的可逆性無(wú)限增殖胰島細(xì)胞具有小型、伸出突起(部分2)的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的特征。
本發(fā)明中使用的從健康人分離的胰島細(xì)胞，可以按照公知的方法從人胰腺中分離(參照Staudacher C，Ricordi C，Stella M，Socci C，Cammelli L，F(xiàn)errari G，Dicarlo V.Minerva Chir.311665-1668，1985或Ricordi C，F(xiàn)inke EH，Lacy PE.，Diabetes 35649-653，1986)。
所謂“胰島素表達(dá)增強(qiáng)”是指與除去前相比，通過(guò)除去無(wú)限增殖基因胰島素的表達(dá)量增加，例如，優(yōu)選增加2～100倍。
胰島素的表達(dá)，可以通過(guò)公知的方法例如采用胰島素抗體的胰島素免疫染色法進(jìn)行評(píng)價(jià)，可以通過(guò)測(cè)定經(jīng)胰島素染色的試樣的熒光強(qiáng)度比較其表達(dá)量。這種熒光強(qiáng)度的比較，可以使用圖像處理分析軟件NIH image(Vol.62)(由美國(guó)NIH(National Institute of Health)無(wú)償分發(fā))。
逆轉(zhuǎn)錄病毒載體-SSR#197中，除hTERT基因之外，還編碼增強(qiáng)的綠色熒光蛋白質(zhì)基因(EGFP)，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體-SSR#69中除SV40T基因之外，還編碼潮霉素抗性基因(HygroR)與單純皰疹病毒胸苷激酶基因(HSV-TK)的融合基因以及新霉素抗性基因(NeoR)?？梢园凑崭鞣N公知的方法，例如上述Watanabe T等人，Transplantation15；75(11)1873-1880，2003和Westerman KA，Leboulch P.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 938971-8976，1996中記載的方法對(duì)它們進(jìn)行制備。
上述LoxP序列是可被Cre重組酶識(shí)別的公知的位點(diǎn)特異性重組序列，其是可在這種序列之間進(jìn)行所謂DNA鏈的切斷，鏈的交換和結(jié)合的同源重組的特異序列。相同的DNA分子上存在相同方向的一對(duì)LoxP序列時(shí)，切除它們之間夾著的DNA序列從而形成環(huán)狀分子(切除反應(yīng))。
上述hTERT基因是源于正常細(xì)胞的TERT基因。hTERT基因是在血液、皮膚、腸道粘膜、子宮內(nèi)膜等歷時(shí)一生進(jìn)行重復(fù)再生的器官的干細(xì)胞/前體細(xì)胞中以及在每當(dāng)暴露于特定的抗原時(shí)可克隆增殖的淋巴細(xì)胞中自然表達(dá)增強(qiáng)的基因。
上述SV40T基因是公知的DNA型腫瘤病毒的腫瘤抗原(T抗原)基因。
逆轉(zhuǎn)錄病毒載體SSR#197和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體SSR#69的導(dǎo)入可以通過(guò)向培養(yǎng)細(xì)胞直接接種這兩種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的方法進(jìn)行。
作為通過(guò)將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體直接接種于培養(yǎng)細(xì)胞將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入培養(yǎng)細(xì)胞的方法，可以使用任意方法只要可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的即可。例如，也可以通過(guò)培養(yǎng)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體產(chǎn)生細(xì)胞，將其培養(yǎng)上清接種于另外培養(yǎng)的胰島細(xì)胞中，從而完成導(dǎo)入。可以通過(guò)本領(lǐng)域中公知的方法確定各細(xì)胞的培養(yǎng)條件和接種濃度等各種條件。
并且，如果考慮到對(duì)細(xì)胞的影響，例如染色體的穩(wěn)定性，向培養(yǎng)細(xì)胞的接種次數(shù)優(yōu)選僅1次。但是，如果考慮到這種載體的導(dǎo)入效率，優(yōu)選向細(xì)胞接種多次。因此，本發(fā)明中最優(yōu)選1天感染兩次，每次感染4小時(shí)，總共進(jìn)行3天。
本申請(qǐng)說(shuō)明書(shū)中，Cre重組酶是特異識(shí)別LoxP序列的公知的重組酶，只要可以切除夾在LoxP序列中的核苷酸序列即可，沒(méi)有特別的限定。本發(fā)明中，為了切除存在于可逆性無(wú)限增殖人胰島細(xì)胞株的染色體上的夾在LoxP序列間的hTERT基因和SV40T基因，使用Cre重組酶。通過(guò)從可逆性無(wú)限增殖人胰島細(xì)胞株的染色體上切除夾在LoxP序列間的hTERT基因和SV40T基因獲得的細(xì)胞沒(méi)有癌變的危險(xiǎn)性，因此是安全的，適于細(xì)胞移植。
作為通過(guò)使用Cre重組酶，在體外大量培養(yǎng)的可逆性無(wú)限增殖胰島細(xì)胞株中除去hTERT基因和SV40T基因的方法，可例舉(1)通過(guò)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率良好的腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)Cre重組酶的方法，(2)用磷酸鈣法在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加Cre重組酶DNA的方法，(3)在培養(yǎng)上清中加入源自人免疫缺陷病毒(HIV)的TAT蛋白質(zhì)與Cre重組酶的融合蛋白質(zhì)的方法，(4)在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入陽(yáng)離子化的Cre重組酶蛋白質(zhì)的方法，還有(5)通過(guò)導(dǎo)入藥物誘導(dǎo)性Cre重組酶表達(dá)載體，附以可通過(guò)添加藥物而使該基因自由地去除的系統(tǒng)的方法等。在不使用腺病毒載體的方法中，優(yōu)選沒(méi)有病毒載體引起的進(jìn)一步的重復(fù)感染。
通過(guò)從本發(fā)明的可逆性無(wú)限增殖胰島細(xì)胞株中除去hTERT基因和SV40T基因獲得的人胰島細(xì)胞(以下簡(jiǎn)稱(chēng)“恢復(fù)的人胰島細(xì)胞”)，例如如圖5(恢復(fù)的NAKT-13細(xì)胞)所示，胰島素表達(dá)增強(qiáng)，細(xì)胞相互間自然地凝集，形成與正常胰島結(jié)構(gòu)類(lèi)似的形態(tài)。
本發(fā)明的用于糖尿病的治療劑可以使用含有上述恢復(fù)的人胰島細(xì)胞的細(xì)胞制劑。本發(fā)明的用于糖尿病的治療劑，除上述恢復(fù)的人胰島細(xì)胞之外還可以含有在糖尿病的治療中可以使用的成分作為其它的活性成分。作為這種活性成分，可例舉曲格列酮(troglitazone)等。此外，由于目的在于促進(jìn)胰島素的分泌，優(yōu)選添加煙酰胺。本說(shuō)明書(shū)中的所謂的細(xì)胞制劑，可舉例有在培養(yǎng)基、等滲液或緩沖液中懸浮了的上述人胰島細(xì)胞的懸浮液，或者通過(guò)離心等濃縮了的團(tuán)狀顆粒(pellet)等細(xì)胞塊。適當(dāng)選擇培養(yǎng)基、等滲液或緩沖液以適應(yīng)上述人胰島細(xì)胞。進(jìn)而，上述細(xì)胞制劑也可以加入DMSO等保護(hù)劑，冷凍保存。并且，考慮到上述細(xì)胞制劑要接種于人體內(nèi)，如果預(yù)先消除細(xì)胞增殖性會(huì)更安全。作為細(xì)胞制劑，為了更為安全地利用，可在保留作為細(xì)胞制劑的功能，使病原細(xì)胞的蛋白質(zhì)變性程度的條件下進(jìn)行加熱處理、放射線(xiàn)處理或絲裂霉素C處理等處理。
移植恢復(fù)的人胰島細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞優(yōu)選經(jīng)門(mén)靜脈移植到肝臟。作為這種方法，例如通過(guò)在右下腹部開(kāi)一小切口，露出腸系膜的細(xì)血管，直視下插入導(dǎo)管移植細(xì)胞的方法，或者根據(jù)回聲確定肝臟的門(mén)靜脈，通過(guò)導(dǎo)管穿刺移植細(xì)胞的方法。尤其是，由于侵襲小因而優(yōu)選以回聲進(jìn)行細(xì)胞移植的方法。
并且，該治療劑的給藥量(移植量)，優(yōu)選例如1億～100億個(gè)細(xì)胞/個(gè)體，更優(yōu)選10億～100億個(gè)細(xì)胞/個(gè)體，最優(yōu)選的是10億～20億個(gè)細(xì)胞/個(gè)體。
可以使用本發(fā)明的可逆性無(wú)限增殖人胰島細(xì)胞株和恢復(fù)的人胰島細(xì)胞作為例如以糖尿病為靶的移植治療或生物人工胰腺的來(lái)源。作為移植治療或生物人工胰腺，可以列舉有例如在以高分子原料制成的裝置中封入了胰島素分泌細(xì)胞的擴(kuò)散腔型(diffusion-chamber type)、微囊型、中空纖維型模件(元件)與分離/培養(yǎng)細(xì)胞組合在一起的雜合型人工胰腺等。生物人工胰腺有以下三種形態(tài)安置在體外與血管連接的，留在體內(nèi)與血管連接的，或者不與血管連接留在腹腔內(nèi)的。本發(fā)明的可逆性無(wú)限增殖人胰島細(xì)胞株和恢復(fù)的人胰島細(xì)胞，無(wú)論哪一種都可以在任意形態(tài)的生物人工胰腺中使用。
并且，本發(fā)明的可逆性無(wú)限增殖人胰島細(xì)胞株和恢復(fù)的人胰島細(xì)胞，無(wú)論哪一種都可以在胰島素的制造中使用。為了增強(qiáng)胰島素的表達(dá)，優(yōu)選在大量培養(yǎng)可逆性無(wú)限增殖人胰島細(xì)胞后，除去hTERT基因和SV40T基因的恢復(fù)的人胰島細(xì)胞作為有效制備胰島素的恢復(fù)的人胰島細(xì)胞。
可以通過(guò)以親合層析柱等通常在蛋白質(zhì)的純化中使用的方法純化從細(xì)胞培養(yǎng)物中除去細(xì)胞后得到的培養(yǎng)液，進(jìn)行胰島素的制備。
下面，給出具體的實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明，但是本發(fā)明并不限于此。
實(shí)施例1可逆性無(wú)限增殖人胰島細(xì)胞株NAKT-13(保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專(zhuān)利生物保藏中心，地址是日本茨城筑波市東1-1-1中央第6號(hào)(郵政編號(hào)305-8566)，保藏日是2003年9月4日，保藏號(hào)為FERM BP-08461)的建立在立體顯微鏡(STEMI，Carl Zeiss公司，德國(guó))下用手動(dòng)挑選法(hand pickup)法從加拿大Alberta大學(xué)提供的從健康人分離的胰島細(xì)胞(加拿大Alberta大學(xué)，人胰島移植方案，由Jonathan RT.Lakey博士提供，公眾可以獲得)中挑選出10個(gè)呈現(xiàn)球形的清晰形態(tài)的胰島細(xì)胞，將它們接種于T25培養(yǎng)瓶中。使用由WILLIAM’S培養(yǎng)液E(SIGMA公司，圣路易斯，美國(guó))中加入10％胎牛血清(FCS，SIGMA公司)，10-7mol/l胰島素(S IGMA公司)，10-6mol/l地塞米松(SIGMA公司)，25μg/ml表皮生長(zhǎng)因子(EGF，SIGMA公司)，10mM煙酰胺(SIGMA公司)，抗生素青霉素G/鏈霉素(SIGMA公司)組成的培養(yǎng)液作為基礎(chǔ)培養(yǎng)液。自接種起第3天，以4ml作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，不進(jìn)行培養(yǎng)液的更換。從第4天起，更換培養(yǎng)液時(shí)，2ml基礎(chǔ)培養(yǎng)液中分別加入分別經(jīng)0.45微米的過(guò)濾器篩濾的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體SSR#197產(chǎn)生細(xì)胞的培養(yǎng)上清和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體SSR#69產(chǎn)生細(xì)胞的培養(yǎng)上清各1ml，以總共4ml培養(yǎng)4小時(shí)，1天進(jìn)行兩次基因?qū)搿Ｔ诘?，6，8天(總共6次)時(shí)，同樣重復(fù)上述操作。
并且，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體SSR#197產(chǎn)生細(xì)胞的培養(yǎng)上清和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體SSR#69產(chǎn)生細(xì)胞的培養(yǎng)上清的制備按以下方式進(jìn)行。
使用美國(guó)馬薩諸塞州劍橋的哈佛馬薩諸塞工科大學(xué)的PhilippeLeboulch博士提供的可產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒載體SSR#197的Crip細(xì)胞(SSR#197)(Watanabe T等人，Transplantation 15；75(11)1873-1880，2003)(效價(jià)4×106cfu/ml)和可產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒載體SSR#6 9的Crip細(xì)胞(SSR#69)(Westerman KA，Leboulch P.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 938971-8976，1996)(效價(jià)4×106cfu/ml)，以10萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/cm2將各Crip細(xì)胞接種于T75培養(yǎng)瓶中，于10ml的DMEM+10％NCS(新生小牛血清)培養(yǎng)液中培養(yǎng)。在細(xì)胞密度達(dá)到90％的時(shí)間點(diǎn)，用10ml的DMEM+10％NCS培養(yǎng)液替換培養(yǎng)液。更換培養(yǎng)液后培養(yǎng)24小時(shí)，分別獲得含有逆轉(zhuǎn)錄病毒載體SSR#197和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體SSR#69的培養(yǎng)上清。
自上述人胰島細(xì)胞的接種第10天(自最終感染第2天)起，將基礎(chǔ)培養(yǎng)液改變?yōu)橛傻推咸烟荄MEM(Giboco公司，奧克蘭，新澤西州)中加入10％FCS、10mM煙酰胺、320μl/l潮霉素、青霉素G/鏈霉素組成的培養(yǎng)液，用100μg/ml潮霉素(SIGMA公司)進(jìn)行篩選。在出現(xiàn)潮霉素抗性株時(shí)，采用克隆環(huán)使細(xì)胞克隆化。各個(gè)克隆細(xì)胞增殖時(shí)，通過(guò)用流式細(xì)胞儀MoFlo(Dako Cytomation株式會(huì)社，京都，日本)回收GFP陽(yáng)性細(xì)胞，建立可逆性無(wú)限增殖人胰島細(xì)胞株NAKT-13(保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專(zhuān)利生物保藏中心，地址是日本茨城筑波市東1-1-1中央第6號(hào)(郵政編號(hào)305-8566)，保藏日是2003年9月4日，保藏號(hào)為FERM BP-08461)。將該NAKT-13保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專(zhuān)利生物保藏中心(地址是日本茨城筑波市東1-1-1中央第6號(hào)(郵政編號(hào)305-8566)，保藏日是2003年9月4日，保藏號(hào)為FERM BP-08461)。如圖2所示，所獲得的細(xì)胞株NAKT-13(保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專(zhuān)利生物保藏中心，地址是日本茨城筑波市東1-1-1中央第6號(hào)(郵政編號(hào)305-8566)，保藏日是2003年9月4日，保藏號(hào)為FERM BP-08461)具有小型、伸出突起(部分2)的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的特征。
實(shí)施例2從可逆性無(wú)限增殖人胰島細(xì)胞株中去除hTERT基因和SV40T基因?qū)?shí)施例1中獲得的可逆性無(wú)限增殖人胰島細(xì)胞株以10萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/ml培養(yǎng)于以由低葡萄糖DMEM(Giboco公司，奧克蘭，新澤西州)中加入10％FCS、10mM煙酰胺、青霉素G/鏈霉素組成的培養(yǎng)基中。自培養(yǎng)開(kāi)始24小時(shí)時(shí)，在培養(yǎng)基中添加1 MOI(MOI感染復(fù)數(shù))表達(dá)Cre重組酶的腺病毒載體AxCANCre，這之后持續(xù)感染48小時(shí)。用PBS洗滌細(xì)胞2次，進(jìn)行培養(yǎng)基的更換。如圖5所示，得到的恢復(fù)的NAKT-13細(xì)胞具有細(xì)胞相互間自然地凝集，形成與正常胰島結(jié)構(gòu)類(lèi)似的形態(tài)的特征。
實(shí)施例3胰島素表達(dá)和形態(tài)將實(shí)施例1和2獲得的細(xì)胞(各5萬(wàn)個(gè)細(xì)胞)接種于6孔板中鋪了蓋玻片的位置上，使用由低葡萄糖DMEM(Giboco公司，奧克蘭，新澤西州)中加入10％FCS、10mM煙酰胺、青霉素G/鏈霉素組成的培養(yǎng)基作為培養(yǎng)基，培養(yǎng)24小時(shí)直至細(xì)胞密度達(dá)到60％。接著，將培養(yǎng)基換成由高葡萄糖DMEM(Giboco公司，奧克蘭，新澤西州)中加入10％FCS，10mM煙酰胺、青霉素G/鏈霉素組成的培養(yǎng)基，培養(yǎng)6小時(shí)。
培養(yǎng)結(jié)束后，以兔抗人胰島素抗體(Dako Cytomation株式會(huì)社制，京都，日本)使用的免疫染色法，研究細(xì)胞中胰島素的表達(dá)。染色結(jié)果示于圖3和5中。并且，圖4和6分別是圖3和5的示意圖。圖3和5分別表示的是實(shí)施例1獲得的NAKT-13細(xì)胞(保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專(zhuān)利生物保藏中心，地址是日本茨城筑波市東1-1-1中央第6號(hào)(郵政編號(hào)305-8566)，保藏日是2003年9月4日，保藏號(hào)為FERM BP-08461)和實(shí)施例2獲得的恢復(fù)的NAKT-13細(xì)胞。圖3和圖5中，無(wú)論深淺顯出紅色的部分1都表示細(xì)胞核，無(wú)論深淺顯出綠色的部分3都表示胰島素。
根據(jù)圖3，可確認(rèn)在實(shí)施例1獲得的NAKT-13細(xì)胞(保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專(zhuān)利生物保藏中心，地址是日本茨城筑波市東1-1-1中央第6號(hào)(郵政編號(hào)305-8566)，保藏日是2003年9月4日，保藏號(hào)為FERM BP-08461)的胰島素的表達(dá)。并且，根據(jù)圖3和5，在實(shí)施例2獲得的恢復(fù)的NAKT-13細(xì)胞中，通過(guò)使用圖像處理分析軟件NIH image(Vol.62)(由美國(guó)NIH無(wú)償分發(fā))比較熒光強(qiáng)度，確認(rèn)出其胰島素的表達(dá)比恢復(fù)前的無(wú)限增殖胰島細(xì)胞顯著增加30倍。
產(chǎn)業(yè)上的可利用性根據(jù)本發(fā)明的可逆性無(wú)限增殖人胰島細(xì)胞株，可以容易地確保獲得足夠數(shù)量的具有胰島素產(chǎn)生能力的細(xì)胞以滿(mǎn)足需要。并且，從該細(xì)胞株中除去hTERT基因和SV40T基因獲得的恢復(fù)的人胰島細(xì)胞顯示出增強(qiáng)的胰島素表達(dá)，并且安全，在糖尿病治療中非常有用。
進(jìn)而，基于本發(fā)明的細(xì)胞，可以使胰島素的制備或者將擴(kuò)散腔型、微囊型、中空纖維型模件(元件)與分離/培養(yǎng)細(xì)胞組合在一起的雜合型生物人工胰腺的開(kāi)發(fā)成為可能。
權(quán)利要求
1.可逆性無(wú)限增殖人胰島細(xì)胞株或其傳代細(xì)胞株，其為含有分別夾在一對(duì)LoxP序列之間的hTERT基因和SV40T基因的可逆性無(wú)限增殖的人胰島細(xì)胞株，其特征在于該細(xì)胞株具有產(chǎn)生胰島素的能力，并且在除去所述hTERT基因和SV40T基因之后能增強(qiáng)胰島素的表達(dá)。
2.權(quán)利要求1的可逆性無(wú)限增殖人胰島細(xì)胞株或其傳代細(xì)胞株，所述可逆性無(wú)限增殖人胰島細(xì)胞株是NAKT-13(保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所，專(zhuān)利生物保藏中心，地址是日本茨城筑波市東1-1-1中央第6號(hào)(郵政編號(hào)305-8566)，保藏日是2003年9月4日，保藏號(hào)為FERM BP-08461)。
3.人胰島細(xì)胞，其通過(guò)從權(quán)利要求1的可逆性無(wú)限增殖人胰島細(xì)胞株或其傳代細(xì)胞株中除去hTERT基因和SV40T基因獲得。
4.用于糖尿病的治療劑，其中含有通過(guò)權(quán)利要求1的可逆性無(wú)限增殖人胰島細(xì)胞株或其傳代細(xì)胞株中除去hTERT基因和SV40T基因獲得的人胰島細(xì)胞。
5.制備胰島素的方法，其特征在于該方法使用權(quán)利要求1記載的可逆性無(wú)限增殖人胰島細(xì)胞株或其傳代細(xì)胞株，或者使用權(quán)利要求3記載的人胰腺等細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種可逆性無(wú)限增殖人胰島細(xì)胞株，其是含有分別夾在一對(duì)LoxP序列之間的hTERT基因和SV40T基因的可逆性無(wú)限增殖的人胰島細(xì)胞株，其特征在于其具有產(chǎn)生胰島素的能力，并且在除去所述hTERT基因和SV40T基因之后可以增強(qiáng)胰島素的表達(dá)，尤其是涉及NAKT－13(保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所，專(zhuān)利生物保藏中心，地址是日本茨城筑波市東1－1－1中央第6號(hào)(郵政編號(hào)305－8566)，保藏日是2003年9月4日，保藏號(hào)為FERM BP－08461)或其傳代細(xì)胞株，通過(guò)從該可逆性無(wú)限增殖人胰島細(xì)胞株或其傳代細(xì)胞株中除去hTERT基因和SV40T基因獲得的人胰島細(xì)胞，以及這些細(xì)胞的用途。通過(guò)使用本發(fā)明的可逆性無(wú)限增殖人胰腺細(xì)胞株，可以容易地確保獲得滿(mǎn)足所需數(shù)量的胰島產(chǎn)生細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N5/10GK1878864SQ200380110670
公開(kāi)日2006年12月13日 申請(qǐng)日期2003年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月10日
發(fā)明者田中紀(jì)章, 小林直哉, 成島道樹(shù), 田中齋仁 申請(qǐng)人:日本可樂(lè)麗醫(yī)療器材株式會(huì)社, 田中紀(jì)章, 小林直哉