一種德谷胰島素結(jié)晶的制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及人胰島素類(lèi)似物結(jié)晶的制備方法，具體涉及一種德谷胰島素結(jié)晶的制備方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]糖尿病是一種常見(jiàn)的以高血糖為特征的終身性代謝疾病，近年來(lái)隨著各國(guó)社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和居民生活方式的改變，肥胖人群和糖尿病患病人數(shù)迅速增加，糖尿病也已成為21世紀(jì)世界范圍內(nèi)的一種流行病。在中國(guó)，糖尿病患病人數(shù)現(xiàn)已高達(dá)1.14億，成為繼腫瘤和心腦血管疾病之后的第三個(gè)嚴(yán)重危害人民健康的重要慢性非傳染性疾病，糖尿病高并發(fā)癥的發(fā)生導(dǎo)致高致殘率和高致死率，給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。
[0003]胰島素治療是控制血糖和治療糖尿病的重要手段。隨著臨床用藥的不同需求和胰島素技術(shù)的不斷發(fā)展，人們開(kāi)發(fā)出了具有不同作用時(shí)效的胰島素類(lèi)似物，如速效胰島素類(lèi)似物門(mén)冬胰島素和賴(lài)脯胰島素，長(zhǎng)效胰島素類(lèi)似物甘精胰島素和地特胰島素，長(zhǎng)效胰島素是口服藥物失效時(shí)聯(lián)合治療的首選用藥。
[0004]德谷胰島素是一種新型超長(zhǎng)效胰島素，其分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是去掉人胰島素B鏈30位蘇氨酸，通過(guò)I個(gè)谷氨酸分子將16碳脂肪二酸側(cè)鏈連接在B29位賴(lài)氨酸殘基(參見(jiàn)專(zhuān)利TO2005012347)，其作用特點(diǎn)是半衰期長(zhǎng)，體內(nèi)作用時(shí)間超過(guò)42小時(shí)，并且低血糖發(fā)生率低，具有平穩(wěn)的藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，可以持久、平穩(wěn)、長(zhǎng)期降糖。
[0005]結(jié)晶是原料藥生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)，而結(jié)晶后的德谷胰島素具有均一的晶型，顆粒大，沉降快，易與上清分離，冷凍干燥時(shí)間短，更適合工業(yè)化生產(chǎn)；并且以固態(tài)晶體形式存在的德谷胰島素，相比較于不定形固體粉末以及溶液狀態(tài)的形式，對(duì)于產(chǎn)品穩(wěn)定性、貯存性能等均更有優(yōu)勢(shì)。因此，迫切需要研宄德谷胰島素的結(jié)晶工藝。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種德谷胰島素結(jié)晶的制備方法。該制備方法可大規(guī)模地制備高質(zhì)量和高收率的德谷胰島素-鋅結(jié)晶。該晶體具有穩(wěn)定的固體分子形式，顆粒大，沉降快，易與上清分離，冷凍干燥時(shí)間短，生產(chǎn)效率高，易于放大工業(yè)生產(chǎn)。
[0007]本發(fā)明的另一目的在于提供所述德谷胰島素結(jié)晶的制備方法的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種德谷胰島素結(jié)晶的制備方法，包括如下步驟:在0.05?0.27M組氨酸體系，并且含體積百分比8?15%有機(jī)溶劑的條件下，從含有德谷胰島素、鋅離子、酚類(lèi)物質(zhì)及鹽的結(jié)晶液中，在PH值為6.5?8條件下使德谷胰島素結(jié)晶，得到德谷胰島素結(jié)晶。
[0009]所述的德谷胰島素結(jié)晶的制備方法，優(yōu)選包含如下步驟:
[0010](I)配制含有0.05?0.27M組氨酸、I?8g/L德谷胰島素、體積百分比為8?15%的有機(jī)溶劑、質(zhì)量體積百分比為0.2?0.5%的酚類(lèi)物質(zhì)、0.3?2.4M鹽的結(jié)晶液；[0011 ] (2)調(diào)節(jié)結(jié)晶液pH值至6.5?8，加入鋅離子，鋅離子的用量按鋅離子與德谷胰島素按摩爾比(2?15):3計(jì)；結(jié)晶；
[0012](3)然后在2?8°C條件下靜置結(jié)晶，獲得穩(wěn)定的德谷胰島素結(jié)晶。
[0013]步驟(I)和步驟⑵宜在I?30°C條件下進(jìn)行，優(yōu)選為10?30°C，更優(yōu)選為20?28 °C，最優(yōu)選為25 °C。
[0014]德谷胰島素因修飾脂肪酸側(cè)鏈與其他胰島素差異較大，所以結(jié)晶較為困難，結(jié)晶過(guò)程中組氨酸的加入以及PH值的調(diào)節(jié)是影響結(jié)晶效果的關(guān)鍵因素。
[0015]所述的組氨酸是德谷胰島素形成結(jié)晶的關(guān)鍵因素之一。在沒(méi)有組氨酸的條件下，德谷胰島素只能形成細(xì)小晶體顆粒，固液分離慢，不適合工業(yè)生產(chǎn)。發(fā)明人經(jīng)大量的實(shí)驗(yàn)研宄發(fā)現(xiàn)，只有當(dāng)結(jié)晶液中存在有0.05?0.27M組氨酸，德谷胰島素才能形成穩(wěn)定的晶體，沉降快，生產(chǎn)效率高，易于放大到工業(yè)生產(chǎn)。分析可能原因是:(1)和其它胰島素一樣，德谷胰島素在鋅離子作用下形成六聚體結(jié)構(gòu):T6、T3R3和R6，其物理及化學(xué)穩(wěn)定性:R6 >> T3R3>>T6 (Rahuel-Clermont et al.1997) ; (2)在苯酚的作用下，德谷胰島素六聚體趨向形成T3R3和R6構(gòu)象；(3)在組氨酸的作用下，德谷胰島素分子形成均一穩(wěn)定的R6構(gòu)象，通過(guò)調(diào)節(jié)結(jié)晶體系中的有機(jī)溶劑濃度、酚濃度、鋅離子比例、鹽濃度和pH，德谷胰島素-鋅R6六聚體堆積成穩(wěn)定均一的晶體結(jié)構(gòu)。
[0016]所述的pH值也是德谷胰島素形成結(jié)晶的關(guān)鍵因素之一。由于德谷胰島素的等電點(diǎn)介于PH4.5?5.0，本發(fā)明中結(jié)晶的條件是pH6.5?8.0，優(yōu)選pH6.7?7.3，能形成粒徑更大和結(jié)構(gòu)更規(guī)則的結(jié)晶。本發(fā)明結(jié)晶液的PH值可通過(guò)使用酸和堿進(jìn)行調(diào)節(jié)，優(yōu)選使用醋酸和氨水進(jìn)行調(diào)節(jié)。
[0017]所述的有機(jī)溶劑降低了結(jié)晶液中德谷胰島素的溶解度，促使德谷胰島素結(jié)晶的形成，因此結(jié)晶液中有機(jī)溶劑的濃度不宜低于8% (體積/體積)，同時(shí)，如果有機(jī)溶劑的濃度過(guò)高，又會(huì)增加蛋白質(zhì)的溶解度，引起蛋白質(zhì)重新溶解，因此結(jié)晶液中有機(jī)溶劑的濃度也不宜超過(guò)15% (體積/體積)。在本發(fā)明中，所述有機(jī)溶劑為任何本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的易溶于水的有機(jī)溶劑，如乙腈、乙醇、正丙醇、異丙醇等，其中優(yōu)選的有機(jī)溶劑為乙腈。
[0018]所述的德谷胰島素可以為干燥/凍干固體粉末或純化收集的液體樣品中的一種；其制備方法可參照專(zhuān)利W02005012347中披露的方法進(jìn)行；所述的德谷胰島素在所述的結(jié)晶液中的濃度為I?8g/L，優(yōu)選為1.35?5.lg/L。
[0019]所述的鹽是指易溶于水的強(qiáng)電解質(zhì)鹽，包含但不局限于氯化鈉、醋酸鈉、檸檬酸鈉、醋酸錢(qián)、硫酸錢(qián)等，優(yōu)選氯化鈉，濃度為0.3?2.4M，優(yōu)選為1.2?2.4M。
[0020]所述的鋅離子以鋅鹽形式加入，例如但不局限于氯化鋅、氧化鋅、乙酸鋅、溴化鋅、硫酸鋅等，優(yōu)選為醋酸鋅。鋅離子的用量?jī)?yōu)選按鋅離子與德谷胰島素按摩爾比(2?15):3計(jì)，優(yōu)選為(2?9):3。如果鋅化合物的濃度過(guò)低會(huì)使德谷胰島素結(jié)晶不完全，如果鋅化合物濃度過(guò)高，會(huì)使結(jié)晶的顆粒變小，甚至形成無(wú)定形沉淀。
[0021]所述的酚類(lèi)物質(zhì)是指能夠提供酚羥基的物質(zhì)，如但不局限于間苯二酚、苯酚、甲酚、間甲酚、對(duì)羥基苯甲酸、對(duì)羥基苯甲酸甲酯等，優(yōu)選為苯酚；濃度為質(zhì)量體積比0.2?0.5%，更優(yōu)選為質(zhì)量體積比0.2?0.22%。
[0022]步驟(2)中所述的結(jié)晶可在I?30°C條件下進(jìn)行，優(yōu)選為10?30°C，更優(yōu)選為20?28°C進(jìn)行，從而增加結(jié)晶前的溶解度。
[0023]步驟(2)中所述的結(jié)晶的時(shí)間優(yōu)選為3?6小時(shí)。
[0024]步驟(2)中所述的結(jié)晶優(yōu)選于攪拌狀態(tài)下進(jìn)行。
[0025]所述的攪拌速度優(yōu)選為60?120r/min，更優(yōu)選為100r/min。
[0026]步驟(3)中所述的結(jié)晶可在I?30°C下進(jìn)行，優(yōu)選為在2?8°C，從而提高德谷胰島素結(jié)晶收率。
[0027]步驟(3)中所述的結(jié)晶的時(shí)間優(yōu)選為14?22小時(shí)。
[0028]在工業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程中，為了使德谷胰島素更純，可以選擇重結(jié)晶工藝，為了降低結(jié)晶中的其他溶劑含量，也可以采取水洗結(jié)晶的方法。
[0029]所述德谷胰島素結(jié)晶的制備方法在工業(yè)化制備德谷胰島素結(jié)晶中進(jìn)行應(yīng)用。
[0030]本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果:
[0031](I)本發(fā)明提供了一種新的組氨酸結(jié)晶體系，該結(jié)晶體系克服了應(yīng)用其它胰島素結(jié)晶體系不能使德谷胰島素結(jié)晶的缺陷。
[0032](2)本發(fā)明結(jié)晶方法的實(shí)施生產(chǎn)效率高，穩(wěn)定性好，適合于德谷胰島素的工業(yè)化生產(chǎn)。
【附圖說(shuō)明】
[0033]圖1是實(shí)施例1制備的德谷胰島素結(jié)晶在顯微鏡下160倍放大圖。
[0034]圖2是實(shí)施例2制備的德谷胰島素結(jié)晶在顯微鏡下160倍放大圖。
[0035]圖3是實(shí)施例3制備的德谷胰島素結(jié)晶在顯微鏡下160倍放大圖。
[0036]圖4是實(shí)施例4制備的德谷胰島素結(jié)晶在顯微鏡下160倍放大圖。
[0037]圖5是實(shí)施例5制備的德谷胰島素結(jié)晶在顯微鏡下160倍放大圖。
[0038]圖6是實(shí)施例6制備的德谷胰島素結(jié)晶在顯微鏡下160倍放大圖。
[0039]圖7是實(shí)施例7實(shí)驗(yàn)A制備的德谷胰島素結(jié)晶在顯微鏡下160倍放大圖。
[0040]圖8是實(shí)施例7實(shí)驗(yàn)B制備的德谷胰島素結(jié)晶在顯微鏡下160倍放大圖。
[0041]圖9是實(shí)施例7實(shí)驗(yàn)C制備的德谷胰島素結(jié)晶在顯微鏡下160倍放大圖。
【具體實(shí)施方式】
[0042]下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0043]材料
[0044]德谷胰島素:參考文獻(xiàn)申請(qǐng)?zhí)枮椤癢02005012347”、名稱(chēng)為“NOVEL INSULINDERIVATIVES”的專(zhuān)利申請(qǐng)中實(shí)施例4的方法進(jìn)行制備；
[0045]組氨酸來(lái)源于阿拉丁化學(xué)試劑有限公司，批號(hào):H1414079 ;
[0046]乙酸鋅來(lái)源于廣東光華化學(xué)廠有限公司，批號(hào):120813 ;
[0047]水飽和酚來(lái)源于北京拜爾迪生物科技公司，批號(hào):3105376 ;
[0048]乙酸來(lái)源于西隴化工股份有限公司，批號(hào):1410171 ;
[0049]氯化鈉來(lái)源于西隴化工股份有限公司，批號(hào):114050249 ;
[0050]乙酸銨來(lái)源于西隴化工股份有限公司，批號(hào):1406011 ;
[0051]氨水來(lái)源于西隴化工股份有限公司，批號(hào):1301071 ;
[0052]乙腈來(lái)源于天津市康科德科技有限公司，批號(hào)51408084 ;
[0053]其余試劑至少為分析純。
[0054]實(shí)施例1
[0055]制備德谷胰島素結(jié)晶液，該結(jié)晶液所含的組分和濃度分別為:德谷胰島素3.72g/L，醋酸錢(qián) 0.063mol/L，乙腈 8% (v/v)，間苯二酸 0.22% (w/v)，醋酸鋅 0.4mmol/L(與德谷胰島素的摩爾比為6:4)，組氨酸0.2mol/L，氯化鈉1.2mol/Lo
[0056]制備過(guò)程如下:
[0057]①制備濃度為12.4g/L的德谷胰島素溶液，其中含濃度為27% (v/v)的乙腈，濃度為0.21mol/L的醋酸錢(qián)，用氨水調(diào)節(jié)pH值至7.5。
[0058]②制備A溶液，其中含有0.2mol/L組氨酸和1.65mol/L氯化鈉，用3M醋酸調(diào)pH值至7.0。
[0059]③取30ml上述德谷胰島素溶液裝于250ml三角瓶，再往其中依次加入30ml的純化水、0.22g間苯二酚、1.86g組氨酸和3.16g氯化鈉，溶解完全后加入40ml A溶液，用3M醋酸調(diào)PH值至7.0，最后加入80 μ I濃度為0.5Μ的醋酸鋅溶液，結(jié)晶開(kāi)始。將裝有結(jié)晶液的三角瓶放在搖床上轉(zhuǎn)速100r/min，室溫25°C結(jié)晶3h，將其降溫至4°C靜置，繼續(xù)結(jié)晶20h。然后取少量混懸進(jìn)行鏡檢，可見(jiàn)均一性較好，晶體形狀規(guī)則，如圖1所示。
[0060]實(shí)施例2
[0061]制備德谷胰島素結(jié)晶液，該結(jié)晶液所含的組分和濃度分別為:德谷胰島素2g/L，醋酸錢(qián)0.063mol/L，乙腈10% (v/v)，苯酸0.2% (w/v)，醋酸鋅0.2mmol/L(與德谷胰島素的含量摩爾比為4:6