專利名稱：人工合成胰島素模擬肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬有機(jī)化合物，涉及化學(xué)合成多肽，尤其涉及人工合成胰島素模擬肽及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)是機(jī)體內(nèi)的一類重要的生物大分子，但作為藥物用于疾病的治療有其固有的缺點(diǎn)，比如蛋白質(zhì)分子量大、制備困難、具有較大抗原性等。而研究保留蛋白質(zhì)生物活性位點(diǎn)的小肽現(xiàn)已成為一個熱點(diǎn)，這些小肽可以一定程度上克服生產(chǎn)和使用上存在的問題，不失為開發(fā)藥物的又一途徑。
早在1986年Geysen就認(rèn)為，含有關(guān)鍵殘基的短肽能夠模擬蛋白質(zhì)上的決定簇；多數(shù)情況下，蛋白質(zhì)之間的相互作用或識別是通過局部肽段間的相互作用來實現(xiàn)的。而胰島素與其受體的結(jié)合以及其功能的發(fā)揮可能主要依靠幾個氨基酸來實現(xiàn)，少數(shù)幾個氨基酸就能起到結(jié)合活性并發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)活性。由于胰島素分子含A、B雙鏈結(jié)構(gòu)(A鏈由21個氨基酸組成，B鏈由30個氨基酸組成)，存在雙鏈之間的二硫鍵正確配對問題，通常合成較為困難，合成成本較高。自Smith 1985年建立噬菌體展示技術(shù)以來，此技術(shù)已在各個方面得到了廣泛的應(yīng)用，并且成功的篩選到了很多功能性的多肽。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種人工合成胰島素模擬肽，由9個氨基酸組成，選自a、b二種中的一種，能于胰島素抗體結(jié)合，溶于水，各氨基酸之間通過肽鍵相連，本發(fā)明提供的胰島素模擬肽a的氨基酸序列為CPTSQANSC，分子量為910；胰島素模擬肽b的氨基酸序列為 其中第1位的Cys與第9位的Cys之間形成二硫鍵，分子量為908。
本發(fā)明的另一個目的是提供該人工合成胰島素模擬肽在制備降血糖藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)①本發(fā)明的多肽有機(jī)化合物，由于肽鏈較短，故可以用人工化學(xué)合成的方法大量合成。以前者為例，可以得到大量較純的小肽。
②本發(fā)明的胰島素模擬肽僅為單鏈9肽結(jié)構(gòu)，比雙鏈的胰島素更容易合成，而且不存在雙鏈的正確配對問題，因而制備成本低，產(chǎn)品純度高。
③本發(fā)明的多肽有機(jī)化合物能與人體內(nèi)的胰島素受體特異性結(jié)合，可以產(chǎn)生與胰島素類似的降血糖作用，可用于糖尿病的治療。


圖1為細(xì)胞競爭性ELISA測定結(jié)果。
圖2為胰島素模擬肽對正常ICR小鼠血糖水平的影響。
圖3為胰島素模擬肽對糖尿病小鼠模型血糖濃度的影響。
具體實施例方式
本發(fā)明結(jié)合以下實施例和附圖作進(jìn)一步的說明。
實施例1用抗胰島素多克隆抗體作為靶蛋白，用噬菌體展示的方法篩選噬菌體9肽庫(Ph.D.-C7CTM)得到陽性噬菌體克隆噬菌體展示方法利用基因工程手段將合成的一組一定長度的隨機(jī)序列寡核苷酸片段克隆到特定表達(dá)載體中，使其表達(dá)產(chǎn)物以融合蛋白的形式呈現(xiàn)在絲狀噬菌體表面。由于肽庫中包含了該長度小肽的所有可能的氨基酸排列順序或其中的絕大部分，每一個噬菌體呈現(xiàn)其中的一種肽段，因而庫容量極大，易于篩選和擴(kuò)增。用噬菌體肽庫感染大腸桿菌，使重組入噬菌體的隨機(jī)的寡核苷酸片段在大腸桿菌內(nèi)復(fù)制，并在噬菌體的外殼蛋白中表達(dá)出來。然后，把靶蛋白包被在酶標(biāo)板上。用此噬菌體肽庫與靶蛋白混合后，洗板。如果噬菌體上的外殼蛋白能與靶蛋白結(jié)合，就不會被洗掉。最后用酸性洗脫液(0.1M甘氨酸-鹽酸緩沖液，pH 2.2)把噬菌體洗脫下來。連續(xù)這樣篩3-4輪，就能篩出與靶蛋白結(jié)合力較強(qiáng)的噬菌體。
測此噬菌體的DNA序列得到重組寡核苷酸的序列，亦知道了相應(yīng)小肽的序列。然后可通過人工化學(xué)合成的方法得到該9肽。本發(fā)明提供的胰島素模擬肽包括a、b兩種，能與胰島素抗體特異性結(jié)合，溶于水，各氨基酸之間通過肽鍵相連。
本發(fā)明提供的胰島素模擬肽a的氨基酸序列為CPTSQANSC，分子量為910；胰島素模擬肽b的氨基酸序列為 (其中第1位的Cys與第9位的Cys之間形成二硫鍵)，分子量為908。
實施例2細(xì)胞競爭性ELISA試驗試驗方法培養(yǎng)HepG2細(xì)胞至對數(shù)生長期，等量接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。24小時后PBS洗滌2次，用10％Formalin-PBS固定15min，PBS洗滌3次后用3％H2O2處理10min。PBS洗滌3次，2％BSA 37℃封閉1小時后PBST洗滌3次，加入10-9M胰島素，37℃作用90min。PBST洗滌3次后加入不同濃度的小肽，37℃競爭90min。PBST洗滌3次，一抗37℃孵育1小時后PBST洗滌5次，加入二抗37℃孵育1小時。PBST洗滌5次，PBS洗滌1次后顯色，酶標(biāo)儀讀取波長在450nm處的吸光度(OD450)。實驗中同時設(shè)立空白孔和陽性孔，各個濃度都重復(fù)3孔。
試驗結(jié)果結(jié)果參見圖1，胰島素模擬肽能夠競爭抑制胰島素與其受體的結(jié)合，并且抑制作用呈劑量依賴性。當(dāng)小肽劑量到達(dá)10-7M時，其能夠完全抑制胰島素與其受體的結(jié)合，半數(shù)抑制率大約在10-9M水平。這些都表明我們篩選到了具有胰島素相似表位的小肽，具體見圖1。圖1是胰島素模擬肽的細(xì)胞競爭性ELISA結(jié)果，橫坐標(biāo)表示的小肽劑量(10-12～10-6M)，縱坐標(biāo)表示的是抑制率。其中抑制率(％)＝(陽性對照孔OD450-多肽處理孔OD450)/陽性對照孔OD450×100％。
實施例3模擬肽對正常ICR小鼠血糖的影響試驗方法正常ICR小鼠30只，隨機(jī)分為正常對照組(10只)，胰島素對照組(10只)和胰島素模擬肽處理組(10只)。各實驗組小鼠分別標(biāo)記，測禁食12h空腹血糖后，胰島素模擬肽處理組小鼠給予注射1mg/ml的多肽溶液100μl(0.9％生理鹽水配制)，胰島素對照組以2U/kg劑量注射人胰島素，正常對照組予以等體積0.9％生理鹽水注射。注射45分鐘后分別取血，用鄰甲苯胺法測定血糖值，比較注射前后血糖的變化。
試驗結(jié)果結(jié)果參見圖2，圖2為胰島素模擬肽對正常ICR小鼠血糖水平的影響。結(jié)果顯示，對正常ICR小鼠，胰島素模擬肽有良好的降血糖作用。胰島素和胰島素模擬肽注射前后的數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，兩者都有明顯的降血糖作用(P＜0.05)，而對照組小鼠處理前后血糖變化沒有顯著意義。具體的數(shù)據(jù)見表1和圖2。圖2表示的是胰島素模擬肽對正常ICR小鼠血糖的影響，其中柱形圖中第一個表示的是注射等體積的生理鹽水后的小鼠血糖變化，第二個表示的是注射胰島素后的小鼠血糖變化，第三個表示的是注射胰島素模擬肽后的小鼠血糖變化。
表1 實驗前后正常ICR小鼠血糖水平的比較(x±s mM)

實施例4胰島素模擬肽對四氧嘧啶糖尿病模型小鼠血糖的影響試驗方法1四氧嘧啶糖尿病小鼠模型的建立將ICR雄性小鼠禁食12h后，自由飲水，四氧嘧啶用0.9％生理鹽水配制成1％的溶液，以200mg/kg體重劑量給小鼠腹腔注射。注射后第7天測定空腹血糖，空腹血糖≥11.1mM確定為糖尿病小鼠。
試驗方法2動物分組及處理將糖尿病小鼠按空腹血糖和體重隨機(jī)分為模型對照組和實驗組(每組各8只)。將各組小鼠禁食12h后，實驗組小鼠予以注射1mg/ml的胰島素模擬肽溶液100μl(0.9％生理鹽水配制)；模型對照組給予等體積0.9％生理鹽水。注射前及注射45分鐘后各取血一次，用鄰甲苯胺法測定血糖值，比較注射前后的血糖變化。
試驗結(jié)果結(jié)果參見圖3，胰島素模擬肽對正常小鼠有降血糖作用，我們復(fù)制了四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型。根據(jù)實驗結(jié)果，這些糖尿病模型小鼠注射多肽前后血糖變化有顯著差異(P＜0.05)，說明該小肽有明顯降血糖作用，而糖尿病對照組血糖變化前后無顯著差異(P＞0.05)。具體結(jié)果見表2和圖3。圖3表示的是胰島素模擬肽對四氧嘧啶性糖尿病小鼠的血糖影響，柱形圖中第一個表示的是注射等體積生理鹽水后糖尿病小鼠的血糖變化，第二個表示的是注射胰島素模擬肽后糖尿病小鼠的血糖變化。
表2 實驗前后糖尿病小鼠血糖水平的比較(x±s mM)

通過上面給出的部分實施例，說明了本發(fā)明提供的胰島素模擬肽可以與胰島素受體結(jié)合，在正常和糖尿病小鼠模型中產(chǎn)生明顯的降血糖作用。由于胰島素模擬肽的結(jié)構(gòu)簡單，合成方便和經(jīng)濟(jì)，可用于降血糖藥物的開發(fā)。
無需進(jìn)一步詳細(xì)闡述，相信采用前面所公開的內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員可最大限度地應(yīng)用本發(fā)明。因此，前面的優(yōu)選具體實施方案應(yīng)理解為僅是舉例說明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
<110>浙江大學(xué)<120>人工合成胰島素模擬肽及其應(yīng)用<160>2<210>1<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)核苷酸序列設(shè)計，用于降血糖藥物制備<400>1Cys-Pro-Thr-Ser-Gln-Ala-Asn-Ser-Cys1 5<210>2<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)核苷酸序列設(shè)計，用于降血糖藥物制備<400>2Cys-Pro-Thr-Ser-Gln-Ala-Asn-Ser-Cys1 5(其中第1位的Cys與第9位的Cys之間形成二硫鍵)
權(quán)利要求
1.人工合成胰島素模擬肽，其特征是由9個氨基酸組成，選自a、b二種中的一種，能于胰島素抗體結(jié)合，溶于水，各氨基酸之間通過肽鍵相連，其中胰島素模擬肽a的氨基酸序列為CPTSQANSC，分子量為910；胰島素模擬肽b的氨基酸序列為 分子量為908。
2.人工合成胰島素模擬肽，其特征是胰島素模擬肽b的氨基酸序列中第1位的Cys與第9位的Cys之間形成二硫鍵。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的人工合成胰島素模擬肽在制備降血糖藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種多肽有機(jī)化合物，為人工合成胰島素模擬肽，由9個氨基酸組成，包括a、b二種，能于胰島素抗體結(jié)合，溶于水，各氨基酸之間通過肽鍵相連。本發(fā)明提供的多肽有機(jī)化合物由于肽鏈較短僅為單鏈9肽結(jié)構(gòu)，故可以用人工化學(xué)合成的方法大量合成；比雙鏈的胰島素更容易合成，而且不存在雙鏈的正確配對問題，因而制備成本低，產(chǎn)品純度高；能與人體內(nèi)的胰島素受體特異性結(jié)合，可以產(chǎn)生與胰島素類似的降血糖作用，在制備降血糖藥物中應(yīng)用，可以代替胰島素，用于糖尿病的治療。
文檔編號A61P3/10GK1803830SQ200510062000
公開日2006年7月19日 申請日期2005年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月14日
發(fā)明者詹金彪, 裘鋒平 申請人:浙江大學(xué)