專利名稱：用于組織工程的可注射性殼聚糖水凝膠的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于組織工程的可注射性殼聚糖水凝膠的制備方法。
背景技術(shù)：
可注射性水凝膠支架是將一種具有流動(dòng)性的水凝膠預(yù)聚物與異體或自體細(xì)胞復(fù)合后直接注射到機(jī)體缺損部位，或不與細(xì)胞復(fù)合而直接注入體內(nèi)，材料到達(dá)缺損部位后能在物理或化學(xué)刺激下原位形成具有一定機(jī)械強(qiáng)度、形狀并且可與體液進(jìn)行交換的支架。其中不與細(xì)胞復(fù)合而直接注入體內(nèi)的支架可利用注射物周圍組織的細(xì)胞擴(kuò)展生長(zhǎng)增殖形成組織。其優(yōu)點(diǎn)主要在于細(xì)胞的體內(nèi)培養(yǎng)環(huán)境以及微創(chuàng)性。同時(shí)，水凝膠材料通常具有良好生物相容性，其水溶液環(huán)境有利于保護(hù)細(xì)胞以及生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)和分泌產(chǎn)物的運(yùn)輸，易用細(xì)胞粘附配體進(jìn)行改性。但水凝膠的操作比較難以控制，且機(jī)械強(qiáng)度一般較低。目前，采用的水凝膠材料包括天然材料如海藻酸鹽、膠原、透明質(zhì)酸、瓊脂、殼聚糖和明膠等以及聚合物材料如聚反丁烯二酸丙二醇酯、聚乙二醇以及聚氧化乙烯氧化丙烯共聚物等。凝膠在體內(nèi)的凝膠方法有溫敏型、化學(xué)交聯(lián)型、離子交聯(lián)型以及特異性交聯(lián)等。
殼聚糖具有生物降解性和良好的生物相容性，被廣泛地用于藥物載體和組織工程。由于分子間氫鍵強(qiáng)作用力，殼聚糖只在酸性條件下溶解。它可通過(guò)pH值改變、共價(jià)鍵或離子鍵交聯(lián)形成水凝膠。但是酸溶性和凝膠方法限制了殼聚糖作為可注射水凝膠在體內(nèi)組織修復(fù)中的應(yīng)用。因此，對(duì)殼聚糖分子結(jié)構(gòu)的改性以促進(jìn)其在中性條件下的水溶性以及建立溫和的凝膠方法非常重要。目前，文獻(xiàn)報(bào)道了采用甘油磷酸鹽(Glycerol-2-phosphate，β-GP)將殼聚糖酸性溶液調(diào)節(jié)至中性，在37℃下形成水凝膠。在殼聚糖分子鏈的氨基上接枝聚異丙基丙烯酰胺或氨基與異丁酸酐反應(yīng)形成異丙基酰胺基團(tuán)，所得衍生物不僅具水溶性，而且為溫敏型水凝膠。上述材料可與軟骨細(xì)胞或干細(xì)胞復(fù)合，在動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)中獲得積極的結(jié)果。但以上殼聚糖水凝膠由于是物理凝膠，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，而且鹽以及不可降解的聚異丙基丙烯酰胺的存在會(huì)影響細(xì)胞的活性以及組織相容性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于組織工程的可注射性殼聚糖水凝膠的制備方法。
本發(fā)明的用于組織工程的可注射性殼聚糖水凝膠的制備方法，包括以下步驟
1)在常溫下，將殼聚糖(CS)溶解在含甲基丙烯酸(MA)的溶液中，然后加入水溶性碳二亞胺(EDAC)，于常溫下進(jìn)行反應(yīng)，水溶性碳二亞胺與甲基丙烯酸的摩爾比為0.25～1.5，反應(yīng)結(jié)束后，置于三蒸水中透析除去未反應(yīng)物質(zhì)及副產(chǎn)物，凍干得到接枝甲基丙烯酸的殼聚糖(CM)；2)在常溫下，將接枝甲基丙烯酸的殼聚糖溶解在含乳酸(LA)的溶液中，然后加入水溶性碳二亞胺，于常溫下進(jìn)行反應(yīng)，水溶性碳二亞胺與乳酸的摩爾比為0.3～1.8，反應(yīng)結(jié)束后，置于三蒸水中透析除去未反應(yīng)物質(zhì)及副產(chǎn)物，凍干得到接枝甲基丙烯酸和乳酸的殼聚糖(CML)；3)將接枝甲基丙烯酸和乳酸的殼聚糖溶解在水或磷酸鹽緩沖液(PBS)中，配制濃度為1％～2.5％的接枝甲基丙烯酸和乳酸的殼聚糖溶液，然后加入氧化還原引發(fā)體系過(guò)硫酸銨(APS)和四甲基乙二胺(TMEDA)，過(guò)硫酸銨和四甲基乙二胺的摩爾比為1∶1，引發(fā)體系的最終濃度均為2.5mM～15mM，25℃～45℃下反應(yīng)形成殼聚糖水凝膠。
本發(fā)明方法操作工藝簡(jiǎn)單、實(shí)施條件溫和。利用在碳二亞胺存在下，氨基和羧基以及羥基可縮合形成酰胺鍵以及酯鍵的方法制備可聚合的水溶性殼聚糖?？梢酝ㄟ^(guò)改變碳二亞胺與甲基丙烯酸以及乳酸的摩爾比來(lái)調(diào)控甲基丙烯酸以及乳酸的接枝量。反應(yīng)過(guò)程中的小分子物質(zhì)可通過(guò)透析的方法去除。在生物相容性的過(guò)硫酸銨(APS)和四甲基乙二胺(TMEDA)的引發(fā)作用下，殼聚糖衍生物可通過(guò)雙鍵交聯(lián)形成殼聚糖水凝膠，其凝膠時(shí)間可通過(guò)引發(fā)劑濃度和反應(yīng)溫度進(jìn)行調(diào)節(jié)。特別是在常溫下凝膠時(shí)間較長(zhǎng)，而在體溫下凝膠時(shí)間較短的特點(diǎn)非常有利于其作為可注射性水凝膠支架的應(yīng)用。本發(fā)明方法為制備可聚合的水溶性殼聚糖以及殼聚糖水凝膠提供了一種簡(jiǎn)單可行的新方法。所得的殼聚糖衍生物以及殼聚糖水凝膠可用于藥物控釋體系以及組織工程中的可注射性水凝膠支架。


圖1是制備可聚合的水溶性殼聚糖的示意圖及分子結(jié)構(gòu)；圖2是殼聚糖、CM和CML的紅外譜圖；圖3是CML的1HNMRR譜圖，溶劑為D2O；圖4是在不同EDAC與MA的摩爾比下MA接枝量的變化曲線；圖5是在不同EDAC與LA的摩爾比下LA接枝量的變化曲線；圖6是37℃下，1％CML在不同引發(fā)劑濃度下的凝膠時(shí)間；圖7是不同溫度下，1％CML在5mM引發(fā)劑濃度下的凝膠時(shí)間；
圖8是37℃下，不同濃度的CML溶液在5mM引發(fā)劑濃度下的凝膠時(shí)間；圖9是37℃下，1％CML在不同引發(fā)劑濃度下制備的殼聚糖水凝膠在PBS中的平衡溶脹比；圖10是37℃下，1％CML在5mM引發(fā)劑下制備的殼聚糖水凝膠在PBS和1mg/ml溶菌酶/PBS溶液中的降解；圖11是殼聚糖衍生物的3T3細(xì)胞毒性，細(xì)胞種植密度2×104/孔；圖12是殼聚糖水凝膠的3T3細(xì)胞毒性，細(xì)胞種植密度10×104/孔；圖13是軟骨細(xì)胞在殼聚糖水凝膠中的(a)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和(b)DNA含量隨培養(yǎng)時(shí)間的變化，細(xì)胞種植密度400×104/ml；圖14是采用CLSM觀察不同培養(yǎng)時(shí)間下，軟骨細(xì)胞在殼聚糖水凝膠中的生長(zhǎng)情況，細(xì)胞種植密度400×104/ml，采用熒光素二乙酯染活細(xì)胞(實(shí)線箭頭)，溴化乙錠染死細(xì)胞(虛線箭頭)；其中(a)為1天，(b)為3天，(c)為6天，(d)9天，(e)為12天。
圖15是采用SEM觀察軟骨細(xì)胞在殼聚糖水凝膠中的形態(tài)；其中(a)，(b)均為3天，(c)，(d)均為12天。
具體實(shí)施例方式
實(shí)例1稱取殼聚糖800mg置于250ml錐形瓶中，加入100ml三蒸水和420μlMA(0.48mmol)，待CS完全溶解后，加入930mg EDAC(0.48mmol)，然后在室溫下，攪拌反應(yīng)24h。為去除未反應(yīng)的MA和其他小分子產(chǎn)物，將混合液置入截止分子量為10,000Da透析袋中，在大量三蒸水和室溫下透析3d，每天換2～3次三蒸水。最后將此液體凍結(jié)，凍干，得到MA接枝的殼聚糖(CM)。CM收率均大于90％，其結(jié)構(gòu)變化見(jiàn)圖2；MA接枝量約為23％，見(jiàn)圖4；可在水中溶脹。將上述400mg CM溶解在含210μl LA(0.2mmol)的50ml三蒸水中，完全溶解后加入460mg EDAC(0.24mmol)。此混合液在室溫下攪拌24h后，將混合液置入截止分子量為10,000Da透析袋中，在大量三蒸水和室溫下透析3d，每天換2～3次三蒸水。最后將此液體凍結(jié)，凍干，得到接枝MA和LA的殼聚糖(CML)。CML的收率均大于90％，其結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖2和圖3；LA接枝量約為52％，見(jiàn)圖5；在水中可完全溶解。將CML溶解在三蒸水中，配制成1％(w/v)CML溶液。將氧化劑過(guò)硫酸銨(APS)和還原劑四甲基乙二胺(TMEDA)分別配制成1mol/l的水溶液。將5μl APS溶液和5μl TMEDA溶液按順序加入到1％CML溶液中，混合均勻，引發(fā)劑最終濃度為5mM。APS與TMEDA的摩爾比為1∶1?；旌弦和ㄟ^(guò)注射器移至模具中，在37℃下反應(yīng)形成水凝膠。其凝膠時(shí)間為5.5min，該凝膠在PBS中的平衡溶脹比約為30。見(jiàn)圖6，圖7、圖8和圖9。
實(shí)例2稱取殼聚糖800mg置于250ml錐形瓶中，加入100ml三蒸水和420μlMA(0.48mmol)，待CS完全溶解后，加入232.5mg EDAC(0.12mmol)，然后在室溫下，攪拌反應(yīng)24h。為去除未反應(yīng)的MA和其他小分子產(chǎn)物，將混合液置入截止分子量為10,000Da透析袋中，在大量三蒸水和室溫下透析3d，每天換2～3次三蒸水。最后將此液體凍結(jié)，凍干，得到MA接枝的殼聚糖(CM)。CM收率均大于90％，MA接枝量約為11.74％，見(jiàn)圖4。
實(shí)例3將MA接枝量約為23％的400mg CM溶解在含210μl LA(0.2mmol)的50ml三蒸水中，完全溶解后加入115mg EDAC(0.06mmol)。此混合液在室溫下攪拌24h后，將混合液置入截止分子量為10,000Da透析袋中，在大量三蒸水和室溫下透析3d，每天換2～3次三蒸水。最后將此液體凍結(jié)，凍干，得到產(chǎn)物為MA和LA接枝殼聚糖(CML)。CML的收率均大于90％，LA接枝量約為43.2％，見(jiàn)圖5。
實(shí)例4將CML(MA接枝量23％和LA接枝量52％)溶解在水中，配制成2.5％的CML溶液，然后加入濃度為5mM的APS和5mM的TMEDA，APS與TMEDA的摩爾比為1∶1。37℃下放置約為8min可形成不可流動(dòng)的殼聚糖水凝膠，見(jiàn)圖8。
實(shí)例5在1％CML(MA接枝量23％和LA接枝量52％)溶液中加入濃度為5mM的APS和5mM的TMEDA，APS與TMEDA的摩爾比為1∶1。，在37℃下形成殼聚糖水凝膠。殼聚糖水凝膠浸泡在PBS中平衡24h后，凍干后稱重(W1)。然后將凝膠浸泡在1mg/ml溶菌酶/PBS溶液中，每隔1d或3d取樣，凍干，稱重(W2)。凍干水凝膠余重比按下式計(jì)算水凝膠余重比＝W2/W1×100％殼聚糖凝膠在PBS中降解緩慢，而在溶菌酶存在下，8天降解完全，見(jiàn)圖10。
實(shí)例6稱取200mg CML(MA接枝量23％和LA接枝量52％)用紫外光照射3h滅菌后，溶解在10ml含10％小牛血清的DMEM中，并在37℃下孵育24h，備用。用血球計(jì)數(shù)板對(duì)3T3細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)后，在96孔培養(yǎng)板中種植3T3細(xì)胞，每孔2×104個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)基200μl。培養(yǎng)24h后，將孔中的培養(yǎng)基吸出，加入200μl含CML的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。定期測(cè)定3T3細(xì)胞的MTT活性，計(jì)算相對(duì)增殖率。評(píng)價(jià)CML的細(xì)胞毒性。采用含10％小牛血清的DMEM作為陰性對(duì)照。相對(duì)增殖率計(jì)算公式如下
相對(duì)增殖率＝OD樣品/OD對(duì)照×100％式中OD代表MTT測(cè)試液的吸光度。
CML的3T3細(xì)胞毒性為1級(jí)毒性，符合組織工程中對(duì)材料的要求。見(jiàn)圖11。
實(shí)例7采用水凝膠的析出液測(cè)定水凝膠的細(xì)胞毒性。稱取一定量的CML(MA接枝量23％和LA接枝量52％)用紫外光照射3h滅菌后，先加入滅菌的三蒸水配制成2％的CML溶液，然后加入雙倍PBS配制成1％的CML/PBS溶液。分別稱取一定量的APS和TMEDA用PBS配制成1mol/l的溶液，用0.22μm濾膜過(guò)濾滅菌。加入濃度為5mM的APS和5mM的TMEDA，APS與TMEDA的摩爾比為1∶1，在37℃下引發(fā)制備水凝膠，然后加入含10％小牛血清的DMEM，在37℃下孵育24h，凝膠/DMEM為100mg/ml，備用。將收集的3T3細(xì)胞計(jì)數(shù)后，每孔種植10×104細(xì)胞，每孔加200μl新鮮DMEM，培養(yǎng)24h后，吸去培養(yǎng)基，加入析出液，測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)間的細(xì)胞活性，計(jì)算相對(duì)增殖率。用含10％小牛血清的DMEM作為陰性對(duì)照。殼聚糖水凝膠的細(xì)胞毒性為1級(jí)毒性，符合組織工程中對(duì)材料的要求。見(jiàn)圖12。
實(shí)例8將100mg CML(MA接枝量23％和LA接枝量52％)消毒后，配制成1％CML/PBS溶液，備用。將收集的細(xì)胞計(jì)數(shù)后，離心，棄去上清液。加入0.5ml PBS，吹打至細(xì)胞完全分散，形成高濃度的細(xì)胞懸液，備用。在10ml 1％CML/PBS溶液中按順序分別加入0.22μm濾膜過(guò)濾滅菌的50μl 1M APS/PBS溶液和50μl 1M TMEDA/PBS溶液，APS與TMEDA的摩爾比為1∶1，混合均勻。將細(xì)胞懸液加入到該混合溶液中，混合均勻。用1ml注射器將含細(xì)胞的混合液注射到模具中，每個(gè)模具0.25ml。完畢后，立刻將模具放入37℃的培養(yǎng)箱中孵育。10min后，取出，可見(jiàn)溶液失去流動(dòng)性，形成水凝膠。立刻將包覆細(xì)胞的水凝膠轉(zhuǎn)移到24孔培養(yǎng)板中，加入2ml含10％小牛血清的DMEM后，放入培養(yǎng)箱。30min后，換液一次。再過(guò)90min后，棄去上清液，每孔加入2ml含20％小牛血清的DMEM，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每?jī)商鞊Q液一次。軟骨細(xì)胞在水凝膠能保持活性，但不增殖，后期有部分細(xì)胞死亡，見(jiàn)圖13。細(xì)胞形態(tài)為圓形，見(jiàn)圖14和圖15。
權(quán)利要求
1.用于組織工程的可注射性殼聚糖水凝膠的制備方法，包括以下步驟1)在常溫下，將殼聚糖溶解在含甲基丙烯酸的溶液中，然后加入長(zhǎng)溶性碳二亞胺，于常溫下進(jìn)行反應(yīng)，水溶性碳二亞胺與甲基丙烯酸的摩爾比為0.25～1.5，反應(yīng)結(jié)束后，置于三蒸水中透析除去未反應(yīng)物質(zhì)及副產(chǎn)物，凍干得到接枝甲基丙烯酸的殼聚糖；2)在常溫下，將接枝甲基丙烯酸的殼聚糖溶解在含乳酸的溶液中，然后加入水溶性碳二亞胺，于常溫下進(jìn)行反應(yīng)，水溶性碳二亞胺與乳酸的摩爾比為0.3～1.8，反應(yīng)結(jié)束后，置于三蒸水中透析除去未反應(yīng)物質(zhì)及副產(chǎn)物，凍干得到接枝甲基丙烯酸和乳酸的殼聚糖；3)將接枝甲基丙烯酸和乳酸的殼聚糖溶解在水或磷酸鹽緩沖液中，配制濃度為1％～2.5％的接枝甲基丙烯酸和乳酸的殼聚糖溶液，然后加入氧化還原引發(fā)體系過(guò)硫酸銨和四甲基乙二胺，過(guò)硫酸銨和四甲基乙二胺的摩爾比為1∶1，引發(fā)體系的最終濃度均為2.5mM～15mM，25℃～45℃下反應(yīng)形成殼聚糖水凝膠。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種用于組織工程的可注射性殼聚糖水凝膠的制備方法。采用碳化二亞胺縮合的方法依次將甲基丙烯酸和乳酸接枝在殼聚糖分子鏈中，所得的殼聚糖衍生物同時(shí)具有可聚合的不飽和碳一碳雙鍵和水溶性。采用過(guò)硫酸銨和四甲基乙二胺氧化還原引發(fā)體系，使上述殼聚糖衍生物通過(guò)雙鍵交聯(lián)形成殼聚糖水凝膠。該殼聚糖水凝膠無(wú)毒，具生物降解性和生物相容性。本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單，可用于組織工程中的可注射性水凝膠支架。
文檔編號(hào)A61L27/52GK1799645SQ200510061869
公開(kāi)日2006年7月12日 申請(qǐng)日期2005年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月7日
發(fā)明者高長(zhǎng)有, 洪奕, 沈家驄 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)