專利名稱：可注射聚乳酸微載體/殼聚糖水凝膠復(fù)合支架的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種可注射聚乳酸微載體/殼聚糖水凝膠復(fù)合支架的制備方法，尤其是用于組織工程中的可注射性支架。
背景技術(shù)：
可注射性支架是將細胞與一種具有流動性的、生物相容性好的材料復(fù)合，直接通過注射器注射到機體缺損部位。材料能在原位形成具有一定機械強度、一定形狀并且可與體液進行交換的支架，細胞在支架中生長并最終形成組織。也可將材料直接注入體內(nèi)，利用注射物周圍組織的細胞擴展生長增殖形成組織。由于具有微創(chuàng)性、體內(nèi)培養(yǎng)環(huán)境以及低費用等特點，可注射性支架具有重要的臨床應(yīng)用價值和良好的發(fā)展前景。可注射性支架主要分為可注射性水凝膠支架和可注射性細胞微載體?？勺⑸湫运z支架主要通過溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變在體內(nèi)成型，具有良好的細胞相容性和易成型等特點，但是強度低，降解快。而可注射性細胞微載體需采用液體作為輸運載體注射到受損部位在體內(nèi)堆砌成型，操作方便，但不容易成型，并存在體內(nèi)游走的問題。目前，國內(nèi)外基本上都注重于單組分性能的提高，未見將兩者結(jié)合以獲得最優(yōu)化的性能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為組織工程提供一種可注射聚乳酸微載體/殼聚糖水凝膠復(fù)合支架的制備方法。
本發(fā)明的可注射聚乳酸細胞微載體/殼聚糖水凝膠復(fù)合支架的制備方法，包括以下步驟1)在常溫下，將殼聚糖(CS)溶解在含甲基丙烯酸(MA)的溶液中，然后加入水溶性碳二亞胺(EDAC)，于常溫下進行反應(yīng)，水溶性碳二亞胺與甲基丙烯酸的摩爾比為0.25～1.5，反應(yīng)結(jié)束后，置于三蒸水中透析除去未反應(yīng)物質(zhì)及副產(chǎn)物，凍干得到接枝甲基丙烯酸的殼聚糖(CM)；2)在常溫下，將接枝甲基丙烯酸的殼聚糖溶解在含乳酸(LA)的溶液中，然后加入水溶性碳二亞胺，于常溫下進行反應(yīng)，水溶性碳二亞胺與乳酸的摩爾比為0.3～1.8，反應(yīng)結(jié)束后，置于三蒸水中透析除去未反應(yīng)物質(zhì)及副產(chǎn)物，凍干得到接枝甲基丙烯酸和乳酸的殼聚糖(CML)；3)在室溫下，將接枝甲基丙烯酸和乳酸的殼聚糖衍生物溶解在水或磷酸鹽緩沖液(PBS)中，配制成濃度為1～2.5％的殼聚糖衍生物溶液，然后加入魔芋葡甘聚糖(KGM)粉末，魔芋葡甘聚糖在殼聚糖衍生物溶液中的濃度為0.6～1％。攪拌均勻后，加入2.5～15mM引發(fā)體系過硫酸銨(APS)和四甲基乙二胺(TMEDA)，過硫酸銨和四甲基乙二胺的摩爾比為1∶1，混合均勻；4)將聚乳酸微載體加入到步驟3)的混合液中，其中聚乳酸微載體在混合液中的重量體積比為2.5％～10％，混合均勻后，置于25℃～45℃下反應(yīng)形成聚乳酸細胞微載體/殼聚糖水凝膠復(fù)合支架。
上述的聚乳酸微載體是表面具有膠原的聚乳酸微球，可直接進行復(fù)合，也可在其表面預(yù)先負載所需的細胞(如軟骨細胞、成骨細胞或肝細胞等)后進行復(fù)合。
本發(fā)明方法操作工藝簡單、實施條件溫和。利用高粘度的魔芋葡甘聚糖作為增稠劑提高接枝甲基丙烯酸和乳酸的殼聚糖溶液的粘度，確保聚乳酸微載體在溶液中的懸浮，以利于注射的順利進行。以凝膠預(yù)聚物為運輸載體將微載體注射到所需部位，并在原位凝膠化形成具有一定形狀的微載體/水凝膠復(fù)合支架，水凝膠有利于微載體的成型，并且將其包裹，可以防止其在體內(nèi)的游走；同時微載體可以有效提高水凝膠的強度，二者復(fù)合具有一定的協(xié)同效應(yīng)。該復(fù)合支架無毒，具生物降解性和生物相容性。本發(fā)明方法提供了一種新結(jié)構(gòu)的細胞支架及其制備方法，能夠用于組織工程和整形修復(fù)中。


圖1是在不同EDAC與MA的摩爾比下MA接枝量的變化曲線；圖2是在不同EDAC與LA的摩爾比下LA接枝量的變化曲線；圖3是在37℃下，聚乳酸微載體在KGM/CML溶液中懸浮15分鐘后的照片；其中CML濃度為1％，圖中標記的是KGM濃度；圖4是37℃和5mMAPS/TMEDA下，加入不同KGM含量的1％CML的凝膠時間；圖5是在37℃和5mM APS/TMEDA下制備的不同KGM含量的1％CML凝膠在水中24h的平衡溶脹比；圖6是在37℃和5mM APS/TMEDA下制備的不同KGM含量的1％CML凝膠的動態(tài)彈性模量，圖中標注的為KGM含量；圖7是在37℃和5mM APS/TMEDA下制備的不同聚乳酸微載體含量的0.6％KGM/1％CML復(fù)合支架的動態(tài)彈性模量，圖中標注為微載體的重量體積含量；圖8是在37℃和5mM APS/TMEDA下制備的不同聚乳酸微載體含量的0.6％KGM/1％CML復(fù)合支架干燥后的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，圖下標注為微載體的重量體積含量，(a)為2.5％，(b)為5％，(c)為10％；圖9是軟骨細胞在5％微載體/0.6％KGM/1％CML復(fù)合支架中的細胞活性，細胞種植密度為600×104/ml；圖10是采用激光共聚焦顯微鏡(CLSM)觀察軟骨細胞在5％微載體/0.6％KGM/1％CML復(fù)合支架中的生長行為，圖中(a)為1天，(b)為6天，(c)為12天；圖11是采用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察軟骨細胞在5％微載體/0.6％KGM/1％CML復(fù)合支架中的形態(tài)，圖中(a)，(b)均為1天，(c)，(d)均為6天，(e)，(f)均為12天。
圖12是采用SEM觀察軟骨細胞在5％微載體/0.6％KGM/1％CML復(fù)合支架中的形態(tài)，圖中(a)為球形細胞，(b)為細胞團，(c)為鋪展的細胞層。
具體實施例方式
實例1稱取殼聚糖(CS)800mg置于250ml錐形瓶中，加入100ml三蒸水和420μlMA(0.48mmol)，待CS完全溶解后，加入930mg EDAC(0.48mmol)，然后在室溫下，攪拌反應(yīng)24h。為去除未反應(yīng)的MA和其他小分子產(chǎn)物，將反應(yīng)混合液置入截止分子量為10,000Da透析袋中，在大量三蒸水和室溫下透析3d，每天換2～3次三蒸水。最后將此液體凍結(jié)，凍干，得到MA接枝的殼聚糖(CM)。CM收率均大于90％，MA接枝量約為23％，見圖1；可在水中溶脹。將上述的400mgCM溶解在含210μl LA(0.2mmol)的50ml三蒸水中，完全溶解后加入460mgEDAC(0.24mmol)。此混合液在室溫下攪拌24h后，將反應(yīng)混合液置入截止分子量為10,000Da透析袋中，在大量三蒸水和室溫下透析3d，每天換2～3次三蒸水。最后將此液體凍結(jié)，凍干，得到接枝MA和LA的殼聚糖(CML)。CML的收率均大于90％，LA接枝量約為52％，見圖2。將100mg接枝率為23％的甲基丙烯酸和接枝率為52％的乳酸的殼聚糖衍生物(CML)溶解在水中，配制成10ml 1％CML溶液，然后加入60mg KGM粉末，混合均勻。加入50μl 1M過硫酸銨(APS)和50μl 1M和四甲基乙二胺(TMEDA)溶液，混合均勻。然后加入500mg聚乳酸微載體，在混合液中微載體的重量體積比為5％，混合均勻后，用1ml針筒(無針頭)注射到模具中。置于37℃下，8min后得到微載體/水凝膠復(fù)合支架。該復(fù)合支架的動態(tài)彈性模量在頻率為0.1～100rad/s時為0.12～1.15MPa，見圖7，干燥后其內(nèi)部結(jié)構(gòu)見圖8b。
實例2稱取殼聚糖800mg置于250ml錐形瓶中，加入100ml三蒸水和420μl MA(0.48mmol)，待CS完全溶解后，加入232.5mg EDAC(0.12mmol)，然后在室溫下，攪拌反應(yīng)24h。為去除未反應(yīng)的MA和其他小分子產(chǎn)物，將反應(yīng)混合液置入截止分子量為10,000Da透析袋中，在大量三蒸水和室溫下透析3d，每天換2～3次三蒸水。最后將此液體凍結(jié)，凍干，得到MA接枝的殼聚糖(CM)。CM收率均大于90％，MA接枝量約為11.74％，見圖1。
實例3將實例1得到的MA接枝量約為23％的400mg CM溶解在含210μl LA(0.2mmol)的50ml三蒸水中，完全溶解后加入115mg EDAC(0.06mmol)。此反應(yīng)混合液在室溫下攪拌24h后，置入截止分子量為10,000Da透析袋中，在大量三蒸水和室溫下透析3d，每天換2～3次三蒸水。最后將此液體凍結(jié)，凍干，得到產(chǎn)物為MA和LA接枝殼聚糖(CML)。CML的收率均大于90％，LA接枝量約為43.2％，見圖2。
實例4將實例1得到的100mg CML溶解在水中，配制成10ml 1％CML溶液，然后加入100mg KGM粉末，混合均勻，KGM含量為1％。然后加入250mg聚乳酸微載體，置于37℃水浴中，15分鐘后可見聚乳酸微載體懸浮在1％KGM/1％CML溶液中，有利于注射的進行。見圖3。
實例5將實例1得到的100mg CML溶解在水中，配制成10ml 1％CML溶液，然后加入60mg KGM粉末，混合均勻。加入50μl 1M過硫酸銨(APS)和50μl 1M四甲基乙二胺(TMEDA)溶液，混合均勻后，直接置于37℃下。其凝膠時間為5.4min，見圖4。平衡溶脹比為65，見圖5。動態(tài)彈性模量在頻率為0.1～100rad/s時為1.2KPa～24.4KPa，見圖6。
實例6將實例1得到的100mg CML溶解在水中，配制成10ml 1％CML溶液，然后加入60mg KGM粉末，混合均勻。加入50μl 1M過硫酸銨(APS)和50μl 1M四甲基乙二胺(TMEDA)溶液。加入250mg聚乳酸微載體，其微載體含量為2.5％，混合均勻后，用1ml針筒(無針頭)注射到模具中，置于37℃下，8min后可得微載體/水凝膠復(fù)合支架。該復(fù)合支架的動態(tài)彈性模量在頻率為0.1～100rad/s時為13KPa～258KPa，見圖7，干燥后其內(nèi)部結(jié)構(gòu)見圖8a。
實例7將實例1得到的100mg CML溶解在水中，配制成10ml 1％CML溶液，然后加入60mg KGM粉末，混合均勻。加入50μl 1M過硫酸銨(APS)和50μl 1M四甲基乙二胺(TMEDA)溶液。加入1g聚乳酸微載體，其微載體重量體積含量為10％，混合均勻后，用1ml針筒(無針頭)注射到模具中，置于37℃下，8min后可得微載體/水凝膠復(fù)合支架。該復(fù)合支架的動態(tài)彈性模量在頻率為0.1～100rad/s時為0.87～2.15MPa，見圖7，干燥后其內(nèi)部結(jié)構(gòu)見圖8c。
實例8將實例1得到的CML、KGM采用紫外光照射消毒；聚乳酸微載體采用75％酒精浸泡消毒；APS和TMEDA與磷酸鹽緩沖液(PBS)配制成1M的溶液后，采用孔徑為0.22μm醋酸纖維素膜過濾消毒。將軟骨細胞預(yù)先種植在250mg聚乳酸微載體表面，7天后細胞長滿后備用。將50mg CML先溶解在5ml PBS中，配制成1％CML/PBS溶液后，加入30mg KGM粉末，混合均勻。加入引發(fā)劑APS/TMEDA的PBS溶液，最終濃度為5mM。先將0.5ml高濃度的細胞懸液加入到凝膠預(yù)聚物中，混合均勻，細胞種植密度為600×104/ml。然后加入負載細胞的微載體，含量為5％。用1ml針筒將此混合物注射到模具中，置于37℃下，8min后，形成復(fù)合支架。將該復(fù)合支架轉(zhuǎn)移到24孔培養(yǎng)板中，加入含20％小牛血清的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，每2～3天換液。軟骨細胞活性先增加后不變，見圖9。細胞在凝膠化和混合過程中有部分死亡，細胞會向微載體表面遷移、粘附、鋪展和增殖，并且有細胞團存在，見圖10和圖11。凝膠中的細胞為圓形，并存在細胞團，微載體表面的細胞為鋪展的細胞層，見圖12。
權(quán)利要求
1.可注射聚乳酸微載體/殼聚糖水凝膠復(fù)合支架的制備方法，包括以下步驟1)在常溫下，將殼聚糖溶解在含甲基丙烯酸的溶液中，然后加入水溶性碳二亞胺，于常溫下進行反應(yīng)，水溶性碳二亞胺與甲基丙烯酸的摩爾比為0.25～1.5，反應(yīng)結(jié)束后，置于三蒸水中透析除去未反應(yīng)物質(zhì)及副產(chǎn)物，凍干得到接枝甲基丙烯酸的殼聚糖；2)在常溫下，將接枝甲基丙烯酸的殼聚糖溶解在含乳酸的溶液中，然后加入水溶性碳二亞胺，于常溫下進行反應(yīng)，水溶性碳二亞胺與乳酸的摩爾比為0.3～1.8，反應(yīng)結(jié)束后，置于三蒸水中透析除去未反應(yīng)物質(zhì)及副產(chǎn)物，凍干得到接枝甲基丙烯酸和乳酸的殼聚糖；3)在室溫下，將接枝甲基丙烯酸和乳酸的殼聚糖衍生物溶解在水或磷酸鹽緩沖液中，配制成濃度為1～2.5％的殼聚糖衍生物溶液，然后加入魔芋葡甘聚糖粉末，魔芋葡甘聚糖在殼聚糖衍生物溶液中的濃度為0.6～1％，攪拌均勻后，加入2.5～15mM引發(fā)體系過硫酸銨和四甲基乙二胺，過硫酸銨和四甲基乙二胺的摩爾比為1∶1，混合均勻；4)將聚乳酸微載體加入到步驟3)的混合液中，其中聚乳酸微載體在混合液中的重量體積比為2.5％～10％，混合均勻后，于25℃～45℃下反應(yīng)形成聚乳酸細胞微載體/殼聚糖水凝膠復(fù)合支架。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可注射聚乳酸微載體/殼聚糖水凝膠復(fù)合支架的制備方法，其特征是聚乳酸微載體是表面具有膠原的聚乳酸微球。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的可注射聚乳酸微載體/殼聚糖水凝膠復(fù)合支架的制備方法，其特征是在聚乳酸微載體表面負載細胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種可注射聚乳酸微載體/殼聚糖水凝膠復(fù)合支架的制備方法。采用碳二亞胺縮合的方法依次將甲基丙烯酸和乳酸接枝在殼聚糖分子鏈中，獲得可聚合的水溶性殼聚糖衍生物。將聚乳酸微載體與殼聚糖水凝膠預(yù)聚物混合，同時加入增稠劑魔芋葡甘聚糖提高預(yù)聚物溶液的粘度以確保聚乳酸微載體的懸浮，便于注射過程的操作。采用過硫酸銨和四甲基乙二胺氧化還原引發(fā)體系，使上述復(fù)合物在體溫下原位凝膠化形成細胞微載體/殼聚糖水凝膠的復(fù)合支架。本發(fā)明工藝簡單，制得的復(fù)合支架不僅解決了可注射性微載體在體內(nèi)不易成型和游走的問題，而且能顯著提高水凝膠的強度，具有協(xié)同作用。該復(fù)合支架無毒，具生物降解性和生物相容性，可望用于組織工程中的可注射性支架。
文檔編號A61L27/34GK1799644SQ200510061868
公開日2006年7月12日 申請日期2005年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月7日
發(fā)明者高長有, 洪奕, 沈家驄 申請人:浙江大學(xué)