人類松弛素-2衍生物以及由其制備人類松弛素-2的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及藥物合成技術領域，具體涉及人類松弛素_2衍生物以及由其制備人 類松弛素-2的方法。
【背景技術】
[0002] 人類松弛素-2,通常簡稱為RLN2,藥物名稱也被命名為Relaxin，即松弛肽，是人 體內發(fā)現(xiàn)的一種多肽激素。人類松弛素-2由兩條鏈組成，A鏈含24個氨基酸且存在鏈內 二硫鍵，B鏈含29個氨基酸，A鏈與B鏈通過兩個二硫鍵相連，其結構式如下：
[0004] 近年來的一系列研究發(fā)現(xiàn)，人類松弛素-2對心力衰竭等心血管疾病具有顯著的 治療作用，能夠擴張體循環(huán)血管、擴張腎臟血管并增加動脈順應性。美國專利US5166191A 已經(jīng)公開了人類松弛素用于治療心血管疾病，尤其是急性和慢性心力衰竭的方法專利。
[0005] 人類松弛素_2的制備方法國內外均有報道，其中Erika E. Bullesbach和 Christian Schwabe公開了一種人類松弛素-2的固相合成方法(參見Erika E. Bullesbach and Christian Schwabe: "Totalsynthesis of human relaxin and human relaxin derivatives by solid-phasepeptide synthesis and site-directed chain combination，'，the Journal of Biological Chemistry, 1991,第 266 卷，第 17 期，第 10754-10761頁)。在該方法中，松弛素-2的A鏈采用Fmoc法合成，B鏈采用Boc法合成， 合成過程需要采用HF處理兩次，并且需要三步進行鏈的組合，不同的二硫鍵采用不同的保 護基、不同的脫保護劑，因此操作極其復雜，并且產(chǎn)率很低，以使用的人類松弛素-2的B鏈 計算，總產(chǎn)率僅為1.4%?？梢哉J為，從經(jīng)濟學上講，其在大規(guī)模生產(chǎn)中不可接受。
[0006] 2010年，Kostas K. Barlos等公開了一種人類松弛素-2的化學合成方法(參見 Kostas K. Barlos等："An optimized chemical synthesis of human relaxin-2，'，Journal of P印tide Science, 2010,第16卷，第4期，第200-211頁)。在該方法中，松弛素-2的A 鏈和B鏈均采用Fmoc法合成，二硫鍵的形成采用隨機組合法，各個半胱氨酸的側鏈采用同 一保護基。這一方法可提高松弛素-2的產(chǎn)率，但產(chǎn)率也僅為48%，且松弛素-2的B鏈的合 成工藝復雜，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0007] CN102180964A公開了一種人類松弛素-2的固相合成方法，松弛素-2的A鏈和B 鏈均采用Fmoc法合成，但氨基酸側鏈采用特殊基團保護，不同半胱氨酸側鏈采用交叉保護 基。然而，此類保護基團不易脫除，工業(yè)化有一定難度。
[0008] 目前，單鏈小分子多肽的合成技術已經(jīng)成熟。雖然松弛素-2的A鏈和B鏈的固相 合成已經(jīng)可以得到較好的收率，但是將A鏈和B鏈鏈接制備松弛素-2的固相合成方法的收 率仍然較低。

【發(fā)明內容】

[0009] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術中存在的上述缺陷，通過各個半胱氨酸的側鏈采用常用的不 同側鏈保護基，通過不同氧化方法得到人類松弛素-2的A鏈衍生物和B鏈衍生物，從而制 備人類松弛素-2。該方法操作簡單、設備要求低，易于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0010] 為此，本發(fā)明一方面提供了人類松弛素_2的A鏈衍生物A-1，其具有如下所示的結 構，
[0011] pGlu-Leu-Tyr-Ser-Ala-Leu-Ala-Asn-Lys-Cys-Cys(Acm)-His-Val-Gly-Cys-Thr -Lys-Arg-Ser-Leu-Ala-Arg-Phe-Cys-OH0
[0012] 該衍生物A-I的制備方法，包括如下步驟：
[0013] 1、Fmoc-Cys (Trt) -OH和樹脂反應，獲得Fmoc-Cys (Trt)-樹脂，其中樹脂優(yōu)選為 2-CTC樹脂；
[0014] 2、Fmoc-Cys(Trt)-樹脂采用逐一偶聯(lián)的方式偶聯(lián)Fmoc保護基團的其他氨基酸， 獲得A鏈肽樹脂；
[0015] 3、A鏈肽樹脂經(jīng)裂解反應，獲得A鏈衍生物A-I。
[0016] 本發(fā)明另一方面提供了人類松弛素-2的A鏈衍生物A-2,其具有如下所示的結構，
[0018] 該衍生物A-2的制備方法，包括如下步驟：
[0019] 1、按照上述方法制備A鏈衍生物A-I;
[0020] 2、A鏈衍生物A-I經(jīng)氧化獲得A鏈衍生物A-2。
[0021] 本發(fā)明另一方面提供了人類松弛素_2的A鏈衍生物A-3,其具有如下所示的結構，
L0023」 該佑生物A-3的制備萬法，包括如卜步驟：
[0024] 1、按照上述方法制備A鏈衍生物A-2;
[0025] 2、A鏈衍生物A-2與2, 2' -二吡啶二硫PySSPy反應，獲得A鏈衍生物A-3。
[0026] 在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，在制備衍生物A-I的步驟2中，所述的Fmoc保護 基團的其他氛基酸分別為 Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Ser (tbu)-〇H、Fmoc-Arg(pbf)-〇H、Fmoc-Lys(boc)-〇H、Fmoc-Thr (tbu)-〇H、 Fmoc-Cys (Trt)-〇H> Fmoc-Gly-〇H> Fmoc-Val-〇H> Fmoc-His (trt)-〇H> Fmoc-Cys (Acm)-〇H> Fmoc-Cys (Trt)-〇H、Fmoc-Lys (boc)-〇H、Fmoc-Asn (trt)-〇H、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ser(tbu)-〇H、Fmoc-Tyr(tbu)-〇H、Fmoc-Leu-OH 和 pGlu-〇H。
[0027] 在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，在制備衍生物A-I的步驟3中，采用的裂解液為TFA :ΡΗ0Η:PHSME:EDT:H20=80:5:5:2. 5:5 (v:v)〇
[0028] 本發(fā)明另一方面提供了人類松弛素-2的B鏈衍生物B-1，其具有如下所示的結構，
[0029] H-Asp-Ser-Trp-Met-Glu-Glu-Val-Ile-Lys-Leu-Cys(Acm)-Gly-Arg-Glu-Leu-Va I-Arg-Ala-Gln-Ile-Ala-Ile-Cys-Gly-Met-Ser-Thr-Trp-Ser-OH
[0030] 該衍生物B-I的制備方法，包括如下步驟：
[0031] 1、Fmoc-Ser (tbu) -OH和樹脂反應，獲得Fmoc-Ser (tbu)-樹脂，其中樹脂優(yōu)選為 wang樹脂；
[0032] 2、Fmoc-Ser (tbu)-樹脂采用逐一偶聯(lián)的方式偶聯(lián)Fmoc保護基團的其他氨基酸， 獲得B鏈肽樹脂；
[0033] 3、B鏈肽樹脂經(jīng)裂解反應，獲得B鏈衍生物B-I。
[0034] 本發(fā)明另一方面提供了人類松弛素_2的B鏈衍生物B-2,其具有如下所示的結構，
[0036] 該衍生物Β-2的制備方法，包括如下步驟：
[0037] 1、按照上述方法制備B鏈衍生物B-I;
[0038] 2、B鏈衍生物B-I與2, 2' -二吡啶二硫PySSPy反應，獲得B鏈衍生物Β-2。
[0039] 在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，在制備衍生物B-I的步驟2中，所述的Fmoc保護 基團的其他氨基酸分別為 Fmoc-Trp (Boc) -OH、Fmoc-Thr (tbu) -OH、Fmoc-Ser (tbu) -0Η、 Fmoc-Met-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Cys (Trt)-OH、Fmoc-IIe_0H、Fmoc-Ala-OH、 Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Gln (trt) -OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg (Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、 Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu) -OH> Fmoc-Arg(Pbf) -OH>Fmoc-Gly - 0H>Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Leu - OH、Fmoc-Lys (boc) - OH、Fmoc-Ile - OH、Fmoc-Val - OH、Fmoc-Glu (OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu) - OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Trp (Boc)-OH、Fmoc-Ser(tbu)-OH、 Fmoc-Asp(OtBu)-OH。
[0040] 在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，在制備衍生物B-I的步驟3中，采用的裂解液為TFA :PHOH:PHSME:EDT:H20=80:5:5:2. 5:5 (v:v)〇
[0041] 本發(fā)明另一方面提供了一種制備人類松弛素-2的方法，包括如下步驟：
[0042] 1、按照上述方法制備人類松弛素-2的B鏈衍生物B-2 ;
[0043] 2、按照上述方法制備人類松弛素-2的A鏈衍生物A-2 ;
[0044] 3、將步驟1制備的B鏈衍生物B-2與步驟2制備的A鏈衍生物A-2反應，獲得具 有如下所示的A-B:
[0045]
[0046] 4、步驟3獲得的A-B經(jīng)氧化獲得人類松弛素-2粗品；
[0047] 5、步驟4獲得的人類松弛素-2粗品經(jīng)純化、轉鹽和凍干后獲得人類松弛素-2純 品。
[0048] 本發(fā)明另一方面還提供了另外一種制備人類松弛素-2的方法，包括如下步驟：
[0049] 1、按照上述方法制備人類松弛素-2的A鏈衍生物A-3 ;
[0050] 2、按照上述方法制備人類松弛素-2的B鏈衍生物B-I ;
[0051] 3、將步驟1制備的A鏈衍生物A-3與步驟2制備的B鏈衍生物B-I反應，獲得具 有如下所示的A-B:
[0052]
[0053] 4、步驟3獲得的A-B經(jīng)氧化獲得人類松弛素-2粗品