專利名稱：人類松弛素配方的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種穩(wěn)定的、均質(zhì)的、具有生物學(xué)活性的人類松弛素的配方及將該配方用于治療哺乳動(dòng)物的方法。
成熟的人類松弛素為一種卵巢激素肽，分子量大約為6，000道爾頓，已知與分娩前的產(chǎn)道改變有關(guān)，因而可以促進(jìn)生育過程。參見Hisaw，F(xiàn).L.，Pros.Soc.Exp.Biol.Med.，23，661-663(1926);Schwabe，C.etal.，Biochem.Biophys.Res.Comm.，75503-570(1977);James，R.etal.，Nature，267544-546(1977).該蛋白質(zhì)似乎是調(diào)整靶器官的結(jié)締組織的變化的，使在妊娠期及分娩中引起所需的器官結(jié)構(gòu)的變化。作為妊娠激素，松弛素所起的作用包括抑制早產(chǎn)及分娩時(shí)的子宮頸催熟。
雖然松弛素主要是妊娠激素，然而在非妊娠婦女及男性體內(nèi)亦可測出它的存在。參見Bryant-Greenwood，G.D.，EndocrineReviews.362-90(1982)及Weiss，G.，Ann.Rev.Physiol.，4643-52(1984)。
松弛素已從許多種生物中被提純，包括豬、鼠、馬、鯊、虎、大鼠、角鯊及人類，并且顯示出與胰島素及類胰島素生長因子至少在一級結(jié)構(gòu)及二級結(jié)構(gòu)上有同源性。對于人類，經(jīng)發(fā)現(xiàn)妊娠期黃體(CL)中含量最豐富。
兩種人類基因型，通過采用豬松弛素基因探針進(jìn)行基因組克隆而被確定，盡管人們發(fā)現(xiàn)在這兩種基因型中僅有一種(H2)在CL中被轉(zhuǎn)錄。參見(Hudson，P.etal.，Nature，301628-631(1984)andHudson，P.etal.，TheEMBOJournal，32333-2339(1984)。目前還不清楚，究竟另一種基因在另一個(gè)組織位點(diǎn)被表達(dá)呢，還是這只是一個(gè)擬基因。這兩種人類松弛素基因相互之間在核苷酸及氨基酸方面顯示了明顯的同源性，尤其是在B及C肽中。然而，亦存在若干顯著的序列分歧區(qū)域，尤其在A及B鏈中的氨基末端區(qū)域中。
與所測試的所有物種類似，H2松弛素的初級轉(zhuǎn)譯產(chǎn)品為一種前松弛素原，它是包括24個(gè)氨基酸的信號序列，在其后接著大約29個(gè)氨基酸的B鏈有104-107個(gè)氨基酸的聯(lián)接肽，以及大約有24個(gè)氨基酸的A鏈所組成。
H2松弛素是在卵巢中合成并被表達(dá)的這一事實(shí)寓意著，該松弛素為一個(gè)參與妊娠生理過程的蛋白順序。在對合成的人類松弛素(H2)及某些人類松弛素類似物就其生物學(xué)活性進(jìn)行測試時(shí)發(fā)現(xiàn)，存在一個(gè)松弛素核心，對于生物學(xué)活性是必需的，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了蛋氨酸上的某些取代氨基酸不影響生物學(xué)活性。參見Johnstonetal.，inPeptidesStructureandFunction，Proc.NinthAmericanPeptideSymposium，Deber，C.M.etal.(des.)(PierceChem.Co.1985)。
有許多應(yīng)用或引入豬松弛素作為藥物的方法，包括采用靜脈及肌肉輸注，已經(jīng)被發(fā)表。參見BirnbergandAbitol，Obstet.&Gynecol.，10366-370(1957);Eichneretal.，Am.J.Obstet.Gyn.，711035-1048(1956).
此外，豬松弛素的局部應(yīng)用已用于人類臨床試驗(yàn)，以催熟子宮頸及進(jìn)行引產(chǎn)。參見MacLennanetal.，Obstetrics&Gynecology，68598-601(1986);MacLennanetal.，TheLancet，i220-223(1989);MacLennanetal.，Obstetrics&Gynecology，58601-604(1981);MacLennanetal.，Aust.NZJ.Obstet.Gynaec.，2568-71(1985).在這些研究中，是將溶于蒸餾水的豬松弛素混以水溶性甲基纖維素顆粒以產(chǎn)生粘滯的凝膠。已發(fā)現(xiàn)2mg的劑量可以改善子宮頸的狀態(tài)。參見MacLennanetal.(1981)，supra.
此外，豬松弛素還可用聚1，2-亞乙基二醇模壓成丸藥，用以催熟人類子宮頸。參見Evansetal.，Am.J.Obstet.Gynecol.，147410-414(1983).豬松弛素也可采用懸浮于滅菌的K-Y凝膠及磷酸鹽緩沖的食鹽水進(jìn)行配制，采用一個(gè)滅菌的授精管以使之輸入子宮頸口。在子宮頸口輸入3，000單位的松弛素之后的8小時(shí)之內(nèi)，子宮頸的擴(kuò)張不斷增加。參見PerezgrovasandAnderson，BiologyofReproduction，26765-776(1982)。
公開于1983年8月24日的公開號為86，694的歐洲專利揭示了如何制備豬的前松弛素原、豬松弛素原及豬松弛素。發(fā)表于1987年8月26日的澳大利亞第561，670號專利及公開于1983年1月5日的公開號為68，375的歐洲專利及文獻(xiàn)Haleyetal.，DNA，1155-162(1982)揭示了如何制備豬松弛素。
公開于1984年2月22日的公開號為101，309的歐洲專利及發(fā)表于1988年7月19日的第4，758，516號美國專利分別地揭示了對人類H1-松弛素及H2松弛素及其類似物編碼的基因序列進(jìn)行的分子克隆及特性鑒定。公開于1988年3月16日的公開號為260，149的歐洲專利揭示了人類松弛素原的配方。發(fā)表于1981年5月12日的美國專利第4，267，101號揭示了一種自胎膜獲得人類松弛素的方法。公開于1988年1月7日的公開號為251，615的歐洲專利揭示使還原的人類松弛素A鏈或其類似物與還原的人類松弛素B-鏈或其類似物在某些條件(包括pH值大于7.0)下進(jìn)行結(jié)合的方法。
美國專利第4，267，101號揭示了一種自胎膜制取人類松弛素的方法。文獻(xiàn)Sherwood，inThePhysiologyofReproduction，ed.byKnobilandNeill，(NewYork，RavenPress，(1988)，p.585-673，于第587頁揭示了藉助松弛素于酸性溶劑中的穩(wěn)定特性而進(jìn)行的提取及分離的方法的幾乎所有的操作方法。此外，在第588頁上還指出，在松弛素提取過程中采用強(qiáng)酸性介質(zhì)，從低pH值本身及使高分子量蛋白酶沉淀這兩方面使蛋白水解減少至最低程度。文獻(xiàn)EldridgeandFields，Endocrinology，1172512-2519(1985)報(bào)道免的松弛素具有一個(gè)等電點(diǎn)，經(jīng)等電聚焦測定，為6.5左右。這是與文獻(xiàn)Fieldsetal，Ann.NYAcad.Sci，38075(1982)的發(fā)現(xiàn)相違背，該文獻(xiàn)作者發(fā)現(xiàn)的兔松弛素等電點(diǎn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)地高于此。
另外，發(fā)表于1960年12月13日的第2，964，448號美國專利揭示了可注射的松弛素組合物，包括溶于注射用油中的松弛素(最好為低酸度的)，及鋁的脂肪酸鹽。
本發(fā)明的一個(gè)目的是，提供一種可用于治療的即通過局部或非腸胃道給藥的具有生物學(xué)活性的、穩(wěn)定的、人類松弛素的均質(zhì)配方。本發(fā)明的另一個(gè)目的是，提供一種在液態(tài)可以允許長期貯藏，而便于在施用前的存放及運(yùn)輸。本發(fā)明的另外一個(gè)目的是減少人類松弛素的凝聚及降解從而提供一種可抵抗因溫度的波動(dòng)而引起降解的配方。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種用于子宮頸的凝膠人類松弛素。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種具有附加的治療及物理學(xué)/化學(xué)優(yōu)點(diǎn)的人類松弛素配方。
如從整體來考慮本發(fā)明說明書，本發(fā)明的這些目的及其它的目的將成明顯的。
由上可知，本發(fā)明提供一種具有生物學(xué)活性的藥物組合物，可用于調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物的生殖生理，包括一種溶于可將該組成物pH保持于大約4-7、較佳為4.5-5.5的緩沖液的有效數(shù)量的人類松弛素。另外，該配方最好是等滲的。
該組合物可以為液態(tài)、凍干狀態(tài)、冷凍液體或凝膠形態(tài)。如果組合物是凝膠形態(tài)的，最為進(jìn)一步包括水溶性的多糖或聚1，2-亞乙基二醇，最好是包括甲基纖維素。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種使哺乳動(dòng)物調(diào)節(jié)生殖生理的方法，包括對哺乳類生物施以治療學(xué)上有效數(shù)量的該組合物。
直至本發(fā)明提出之時(shí)，才令人滿意地在酸性境遇下使人類松弛素的降解率當(dāng)用HPLC測試時(shí)達(dá)到最低的水平。因而，可以減低配方的免疫原性，從而提高了它的安全度。由于此項(xiàng)發(fā)現(xiàn)，使人類松弛素的配方經(jīng)制備后可保持其生物學(xué)活性，并具有較長的貯存壽命期，而且既可以在冷凍干燥的情況下也可以不通過冷凍干燥而施于人類達(dá)到治療目的。該松弛素較好的是在pH5左右進(jìn)行配制，這樣的情況下，在5℃下的貯存壽命期至少長達(dá)2年(假定位于HPLC主峰區(qū)面積中可接受的衰減量為10%)。
附圖的簡要說明

圖1a-1e表示在3種不同溫度下，pH自3至7.5的范圍內(nèi)，對應(yīng)于五種不同的配方的人類松弛素所作的反相高效液相色譜(RP-HPLC)主峰組分隨時(shí)間變化的函數(shù)曲線圖。
圖2表示用RP-HPLC在三種不同的溫度下測得的，配方的pH值對人類松弛素配方的降解速率的影響的曲線圖。
圖3a-3e表示在3種不同的溫度下，pH自3至7.5的范圍內(nèi)，時(shí)間對五種配方的人類松弛素的活性的影響的函數(shù)曲線圖。
圖4表示在25℃下，在pH5的加入不同的穩(wěn)定劑的檸檬酸鹽配方的反相HPLC主峰的降解速率的條狀圖。
圖5表示通過靜脈、皮下及陰道內(nèi)給藥對妊娠期兔子進(jìn)行短期施用，在血清中的濃度隨時(shí)間變化的曲線圖。
圖6表示在苯并紅紫存在與不存在的情況下通過皮下對妊娠期兔子進(jìn)行短期給藥，在血清中的濃度隨時(shí)間變化的曲線圖。
對較佳實(shí)施例的描述人類松弛素在這里是指一類具有特定激素功能的功能蛋白，諸如對人類及可能的其他哺乳動(dòng)物的生殖生理進(jìn)行調(diào)節(jié)，包括而又不限于，維持妊娠、導(dǎo)致分娩及增進(jìn)精子的泳動(dòng)以助于受精。作為特例，包括這些用途施用于涉及妊娠的生殖功能，同樣用于其他的生物學(xué)功能如通過對恥骨聯(lián)合或恥骨韌帶產(chǎn)生影響及調(diào)整膠原絲從而使產(chǎn)道形成而導(dǎo)致生產(chǎn);對于子宮肌層的阻抑作用;形成子宮內(nèi)膜以便植入;在黃體水解(luteolysis)中的作用;乳腺的生長及分化;增進(jìn)精子的泳動(dòng);并可能增進(jìn)精子透入子宮頸的能力。人類松弛素及其類似物的功能既可通過其對于鼠的恥骨聯(lián)合的作用在體外測定，也可以通過采用一個(gè)子宮細(xì)胞系在體外對cAMP水平的上升進(jìn)行測定。在此特指藥物組合物的術(shù)語“生物學(xué)活性”，在上文是指人類松弛素。
人類松弛素及其制備方法，包括在重組細(xì)胞培養(yǎng)中合成的方法，請參見(e.g.，EP101，309and112，149，supra)。
“松弛素”術(shù)語包括來自重組或天然來源的人類松弛素或松弛素的變體，諸如氨基酸序列的變體。通過采用快速原子轟擊的質(zhì)譜分光離子化作用，發(fā)現(xiàn)在黃體及血清中的人類松弛素的主要種類為H2松弛素，具有一個(gè)切除末端的B鏈，即，松弛素H2(B29A24)，B鏈的四個(gè)C末端氨基酸缺失，故而B鏈頭端在29位上有一個(gè)絲氨酸。該主要類型(在此稱為“短松弛素”以對應(yīng)于有含33個(gè)氨基酸的B鏈的“長松弛素”)在此被優(yōu)先采用。
術(shù)語“人類松弛素”還包括具有其他插入、取代或缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基、糖基化變體、非糖基化的人類松弛素，及其有機(jī)及無機(jī)鹽、人類松弛素共價(jià)修飾的衍生物、人類前松弛素原及人類松弛素原。通過采用重組DNA技術(shù)，松弛素變體可以通過改變基礎(chǔ)的DNA來制備。所有因松弛素分子結(jié)構(gòu)的改變而產(chǎn)生的變體，只要它還保持人類松弛素的生物學(xué)功能，就應(yīng)該包括于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。具有所述的生物學(xué)功能的那些人類松弛素可以通過上述的體外測試法而方便地加以確定。
變體可以通過將松弛素編碼序列經(jīng)一種或多種方法加以改變在所選基因的特定位置內(nèi)引入天冬氨酸-編碼密碼子的方法來制備。產(chǎn)生的變體蛋白質(zhì)可以用稀酸加以處理，以釋放所需的蛋白質(zhì)或肽，從而使該蛋白質(zhì)更易于分離及純化。
松弛素也可以通過制造一個(gè)松弛素鏈及泛激素(ubiquitin)的熔合蛋白質(zhì)，并用泛激素(ubiquitin)水解酶裂解蛋白質(zhì)的方法來制備。此外，利用了一個(gè)編碼反活化(trans-activating)蛋白質(zhì)的載體的松弛素原的酵母表達(dá)系統(tǒng)也可以采用。
如公開了1988年1月7日的歐洲專利第251，615號所述，這里所指的松弛素可以通過合成A及B鏈及將之提純并組裝而加以制備。在合成松弛素時(shí)一般采用A與B鏈的摩爾比為4∶1。所獲產(chǎn)物可用本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)的具有一般熟練程度的人員用任何已知的方式加以提純，例如包括反相HPLC，離子交換層析，凝膠過濾，滲析或其他方法或兼用以上這些操作方法。
配于組合物中的松弛素的有效數(shù)量是以若干情況為基礎(chǔ)進(jìn)行選擇的，包括治療的特定條件，患者的病史及治療途徑或采用的治療日程等。所述的治療的條件包括難產(chǎn)、抑制早產(chǎn)及醫(yī)治某些結(jié)締組織的疾病諸如硬皮病等。治療途徑包括不經(jīng)腸胃的給藥，諸如，皮下、腹膜內(nèi)、靜脈及肌肉注射施用。
用于治療有病的妊娠的平均常用(current)劑量，是按照許多對于一般熟練度的藥師為公知的指征來改變的，包括施用途徑及治療日程、妊娠階段、松弛素的類型、接受治療的患者的狀態(tài)、組合物的形式及其他的醫(yī)師們知道的因素。作為舉例，在臨床上，局部施用的有效數(shù)量大約為5至10ml中含有大約1至3mg松弛素的凝膠是合適的。靜脈注射使用的平均劑量在每公斤體重含大約0.1μg至1，500mg的范圍，以達(dá)到生殖的作用，諸如形成產(chǎn)道等。
配方的pH維持于4至7左右，較佳為4至6左右，再佳為4.5至5.5左右，最佳為5左右。不過最佳的pH還取決于配方的離子強(qiáng)度及配方的貯存溫度。配方最好為等滲的，且配方的離子強(qiáng)度至少為0.1μ左右，較佳為0.1至0.2μ左右，最佳為0.15μ左右，而配方的重量克分子滲透度(osmolality)優(yōu)選為200至300mmol/kg左右，較佳為240-260mmol/kg左右。如貯存溫度為40℃左右，pH較佳時(shí)為4至7左右。而如貯存溫度為25℃左右，pH較佳時(shí)為4至5。
在此，配方的pH最好用一種能將pH維持在所需的范圍的緩沖劑來維持。某種緩沖劑是否被采用，取決于其緩沖容量，更為具體地說，取決于其pK值。所舉的例子包括某些有機(jī)酸緩沖劑及組氨酸。合適的有機(jī)酸緩沖劑(有機(jī)酸及其鹽的緩沖劑)包括(例如)檸檬酸鹽緩沖劑(例如檸檬酸一鈉及二鈉鹽的混合物，檸檬酸-檸檬酸三鈉鹽的混合物，檸檬酸-檸檬酸單鈉鹽的混合物，等等)，琥珀酸緩沖劑(例如琥珀酸-琥珀酸單鈉鹽的混合物，琥珀酸-氫氧化鈉混合物，琥珀酸-琥珀酸二鈉鹽混合物，等等)，酒石酸緩沖劑(例如酒石酸-酒石酸鈉鹽混合物，酒石酸-酒石酸鉀鹽混合物，酒石酸氫氧化鈉混合物，等等)，蘋果酸鹽緩沖劑，葡糖酸鹽緩沖劑(例如葡糖酸葡糖酸鈉鹽混合物，葡糖酸氫氧化物混合物，葡糖酸葡糖酸鉀鹽混合物，等等)，硼酸緩沖劑，咪唑緩沖劑，乳酸鹽緩沖劑(例如乳酸乳酸鈉混合物，乳酸-氫氧化鈉，乳酸乳酸鉀鹽混合物，等等)及乙酸緩沖劑(例如乙酸乙酸鈉鹽混合物，乙酸-氫氧化鈉混合物，等等)。在此，最佳的緩沖劑為檸檬酸鹽及乙酸鹽緩沖劑，其中尤以檸檬酸鹽為佳。值得指出的是，慣常使用的磷酸及(Tris)三羥甲基氨基甲烷緩沖劑不能將pH值保持在配方所需的水平。
在此，較佳的配方應(yīng)具有適當(dāng)?shù)牡葷B性及重量克分子滲透度(osmolality)以利于非經(jīng)腸胃的應(yīng)用，尤其是靜脈輸注。如果離子強(qiáng)度及重量克分子滲透度(osmolality)不在上述的優(yōu)選范圍，那么就須調(diào)至此范圍，某種藥劑可以加入配方以調(diào)節(jié)重量克分子滲透度(osmolality)至適當(dāng)。這類藥劑包括(例如)堿金屬鹽及堿土金屬鹽諸如鹵化物，例如，氯化鈉及鉀，溴化鎂等等，及中性的多羥糖醇，諸如甘露糖醇。其中最佳試劑為氯化鈉。
為了使配方穩(wěn)定及冷凍干燥，配方中也還可以加入一種藥物可接受的藥劑。例子包括多羥基糖醇，諸如，三元醇或高級醇，最佳的為甘油、赤蘚醇、阿糖醇、木糖醇及山梨醇、甘露糖醇，此外還可用直鏈醇，諸如乙醇及丙二醇。這些藥劑可以單獨(dú)或聯(lián)合使用。該藥劑在配方中所占的重量百分比優(yōu)選的為1至25%左右，更好的為2至10%。以其他組成部分的重量計(jì)算。
此外，在此，該組合物中含有一種在局部使用時(shí)，可增進(jìn)子宮頸及陰道吸收的藥劑。這類吸收增進(jìn)劑的例子包括那些具有類似于膽固醇的結(jié)構(gòu)的分子，諸如甘膽酸鹽例如甘膽酸鈉，膽酸鹽，例如膽酸鈉及梭鏈孢酸及其衍生物，包括鹽類及酯類，諸如24，25-?；请p氫梭鏈孢酸鹽(tourodihydrofusidate);非離子型表面活性劑;具有7至25左右的碳原子的脂肪酸的衍生物，諸如油酸煙酰胺;煙酸或水楊酸或其鹽類或酯類;以及阿佐恩(azone)。
此處優(yōu)選的人類松弛素溶于pH為5的10mM檸檬酸緩沖液，其中存在的氯化鈉使總離子強(qiáng)度大約為0.15μ，具有合適的重量克分子滲透度(osmolality)。
在此的該配方可以為液態(tài)冷凍或凝膠態(tài)也可以為凍干狀態(tài)并重新組成。本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)人員可以確定任何附加的賦形劑的類型及數(shù)量，諸如糖醇，可對于最利于凍干是必需的。甘露糖醇是該優(yōu)選的添加劑中的一種。在此的該配方可在延長了的時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定，并可以液態(tài)在各種溫度下加以貯存。該液態(tài)配方與盛放于塑料容器相比，較理想應(yīng)貯存于玻璃容器中。此外，該配方可以被冷凍、融熔、再冷凍、再融熔而不產(chǎn)生不良影響。優(yōu)選的貯存溫度位于-20至30℃范圍，更為優(yōu)選的溫度范圍為2至8℃左右。此處的液態(tài)的該配方至少可在30天內(nèi)保持其生物學(xué)活性，且從1年的數(shù)據(jù)推斷，可至少保持物理學(xué)上的穩(wěn)定性達(dá)2年時(shí)間。
為了獲得一種凝膠配方，該液態(tài)組成物將典型地混以有效數(shù)量的水溶性的多糖或聚1，2-亞乙基二醇以形成具有合適粘滯度的施于局部的凝膠。可以采納的多糖包括(例如)纖維素衍生物諸如醚化了的纖維素包括烷基纖維素羥烷基纖維素，及烷羥基烷基纖維素，例如，甲基纖維素、羥乙基纖維素、羰甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素及羥丙基纖維素;淀粉及分級淀粉;瓊脂;褐藻酸及褐藻酸鹽;阿拉伯樹膠;支鏈淀粉;瓊脂糖;角叉膠;葡萄糖;糊精;果聚糖;菊粉;甘露聚糖;木聚糖;阿刺伯聚糖(arabinans);聚氨基葡糖;糖原;葡聚糖;及合成生物聚合物;以及膠質(zhì)物諸如蒼耳烷膠;瓜耳膠;刺槐豆膠;阿拉伯樹膠;黃蓍膠;刺梧桐樹膠;及其衍生物及混合物。在此優(yōu)選的膠劑為對于生物學(xué)系統(tǒng)不發(fā)生作用的，無毒的，易于制備并且并不太稀或太粘，并不使混于其中的松弛素失去穩(wěn)定性者。
多糖最好為醚化的纖維素衍生物，更為理想的為明確指定的，經(jīng)純化的列于美國藥典中者，例如甲基纖維素及羥烷基纖維素衍生物，諸如羥丙纖維素，羥乙基纖維素及羥丙甲基纖維素。在此最為優(yōu)選的為甲基纖維素。
可用于形成凝膠的聚1，2-亞乙基二醇在典型的情況下為高分子量與低分子量的聚1，2-亞乙基二醇的混合物，以便獲得合適的粘度。例如，當(dāng)將一種分子量為400-600的聚1，2-亞乙基二醇與一種分子量為1，500的聚1，2-亞乙基二醇以適當(dāng)?shù)谋壤旌蠒r(shí)，可以滿意地得到一種膏漿。
術(shù)語“水溶性”用于多糖及聚1，2-亞乙基二醇系指包括膠溶液及懸浮液等等。一般地，纖維素的水溶性取決于醚基取代的程度，在此適用的穩(wěn)定的衍生物應(yīng)在纖維素鏈的每個(gè)葡糖酐單位具有足夠數(shù)量的這類醚基，以使該衍生物具有水溶性。在一般情況下，每個(gè)葡糖酐單位至少有0.35醚基的取代程度是足夠的。此外，纖維素取代物可以為堿金屬鹽的形式，例如，Li、Na、K或Cs鹽。
如果在凝膠中采用了甲基纖維素，較好情況下，含量大約為凝膠的2-5%，而松弛素的含量為每毫升凝膠含100-1，000μg左右，更好地，甲基纖維素含量為凝膠的3%，松弛素含量為每毫升300-1000μg。
當(dāng)然，如果配方為一種光敏性的凝膠，理想情況下，應(yīng)含有一種或多種藥劑，諸如抗氧化劑(優(yōu)先用維生素C，最好至少0.5%)，及/或助溶劑(優(yōu)先用甘油及/或乙醇，最好在20%左右的含量，而最理想的為甘油)用于當(dāng)凝膠暴露于光線之下時(shí)抑制或防止光氧化作用。例如，可將甲基纖維素凝膠貯存于用錫箔遮蓋的，或有色的管狀瓶，以阻止光線射入。
以下的實(shí)施例對本發(fā)明加以描述，而并不對本發(fā)明的范圍加以限制。
實(shí)施例1用pH值自3至10范圍的幾個(gè)10mM的緩沖液對人類松弛素的穩(wěn)定性加以研究(研究1)。同時(shí)也對離子強(qiáng)度的增加對于配方的穩(wěn)定性的影響加以研究(研究2)。
樣品的制備對于研究1及2，人類的長松弛素(H2型，具有33個(gè)氨基酸的B鏈)是通過固相合成法合成A及B鏈(上述歐洲專利第112，149號對之加以揭示)來獲得的。參見文獻(xiàn)Barany，G.andMerrifieldetal.，(1980)inThePeptides，21-284，Gross，E.andMeienhofer，J.，eds.，AcademicPress，NewYork.
A及B鏈經(jīng)HPLC提純(三氟乙酸(TFA)/乙腈梯度)，在pH為10.2左右的0.2-1MCAPS緩沖液(3-[環(huán)己基氨基]丙磺酸，Calbiochem出品)、0.75M鹽酸胍、10%(V/V)甲醇(Burdick及Jackson)形成的體系中，在總蛋白質(zhì)含量在0.25-2.0mg/ml的條件下，以A∶B鏈為4∶1重量比例組裝A及B鏈。該溶液經(jīng)沖入氮?dú)獠⒂?0℃下攪拌過液(12-18小時(shí))。將該樣品經(jīng)滲析至合適的緩沖液(磷酸鹽緩沖的鹽水、0.01%吐溫20，或0.1%乙酸)，隨后用VydacC-4HPLC進(jìn)行上柱，采用TFA/乙腈梯度洗脫。松弛素組份用HPLC確定，隨后真空除去樣品中的TFA緩沖液。將由此獲得的松弛素進(jìn)行真空冷凍干燥。
將124mg(大約作為肽的含量為80%重量比例)長松弛素用于研究1而將20mg(大約作為肽的含量為67重量%)用于研究2。兩種樣品均用白色的冷凍干燥粉末含有高至15%重量比的三氟乙酸(TFA)制成的樣品。加入充足的Milli-Q水(通過由Millipore公司制造的由活性炭及離子交換劑的水凈化系統(tǒng)的去離子水)以使溶液中肽的濃度為1mg/ml。通過在5℃下使用Spectrapor7(截留3500MW)的透析管，將溶于Milli-Q水中的長松弛素轉(zhuǎn)入合適的配方緩沖系統(tǒng)。將該透析管預(yù)先在含有1ml β-巰基乙醇、3.36g EDTA及4.2gNa HCO3的2升Milli-Q水中洗滌，隨后在60至70℃下在2升Milli-Q水中洗滌四次。之后將該透析管于5℃貯存于50%(w/v)的乙醇中，在透析之前再反復(fù)洗滌。
所有樣品在透析之后立即用紫外吸收分光光度儀對其濃度進(jìn)行測定，采用消光系數(shù)2.18(mg/ml)-1cm-1，以定量分析胺基酸的方法測定對蛋氨酸殘基為賴氨酸所取代的松弛素類似物的測定，用以校正受光線散射影響的濃度。將各個(gè)樣品在層流櫥(hood)中經(jīng)0.2μMillex GV-4(0.01平方英寸表面積)無菌過濾濾器過濾，注入滅菌的100μL、300μL或1.5ml硼硅酸鹽玻璃瓶(wheaton)，蓋上用聚四氟乙烯襯底的螺旋蓋子，并將之分別貯存于5、25及40℃。濃度可準(zhǔn)確地指明所需物已濾入小瓶，因?yàn)楦鱾€(gè)單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)表明在1mg/ml進(jìn)行過濾，并不使蛋白質(zhì)的濃度發(fā)生顯著的下降。
在研究1中將每一緩沖液的三只小瓶貯存在每一個(gè)溫度下，以期可對誤差進(jìn)行估測，并為了確定樣品是否因多次從同一小瓶中取樣而遭污染。
對于研究3，采用松弛素H2(B33A24)Apyro-Glu′，其中H2指在人類卵巢中表達(dá)的人類基因，A及B指人類松弛素各自的鏈，A或B之后的數(shù)字是指鏈的長度，即為包括A或B鏈的氨基酸數(shù)字，氨基酸之前的下標(biāo)，注明了氨基酸所在的鏈為A鏈或是B鏈，而氨基酸之后的上標(biāo)標(biāo)明了在鏈中所處的位置。上述的公開號為251，615的歐洲專利對于這種類似物的制備及鏈的重組作了一般性地描述。蛋白質(zhì)按上述方法提純并用于研究1及2。
按上述方式將36ml濃度大約為4.65mg/ml的人類焦glu松弛素配制于pH5.0的10mM檸檬酸鹽中，并加入NaCl以使之成為等滲。將該蛋白質(zhì)稀釋成1mg/ml(用分光光度計(jì)測定，采用消光系數(shù)為2.18)。將總量為1.4ml的每個(gè)配方滅菌地在層流櫥中濾入1.5ml的備有蓋子的經(jīng)高壓消毒的玻璃瓶中。在對于冷凍及凍融作用的研究中，蛋白質(zhì)也被稀釋成為2mg/ml并在冷凍后進(jìn)行研究。
穩(wěn)定性的研究方案研究1將溶于水中的濃度大約為1mg/ml的20ml的長松弛素20ml份通過透析轉(zhuǎn)入10mM甘氨酸(pH3)、10mM檸檬酸鹽(pH5)、10mM乙酸鹽(pH5)、10mM組氨酸(pH6)及10mMTris緩沖劑(pH7.5)的由表Ⅰ提供的準(zhǔn)確的配方中，并計(jì)算檸檬酸鹽緩沖劑成份含量以使pH為5.0。在所有緩沖劑補(bǔ)充NaCl以使溶液達(dá)到等滲(0.154μ)。濃度按前述方式測定，樣品經(jīng)滅菌過濾，并按表Ⅱ所列的方案裝瓶。將所獲的135只100-μL-微型瓶及90只1.5-ml-小瓶放置于5、25及40℃進(jìn)行穩(wěn)定性測試。樣品在0、7、21及30天時(shí)用反相高效液相色譜(HPLC)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)及環(huán)AMP進(jìn)行測定。除這些測試之外，樣品還用近紫外圓二色性分析及用分析型超離心在0及30天時(shí)進(jìn)行測定。此外，在5℃對于檸檬酸配方用反相HPLC進(jìn)行五個(gè)目的分析，在-20℃進(jìn)行六十天的分析。
研究2將濃度大約為1mg/ml的溶于水中的1ml的長松弛素，通過透析轉(zhuǎn)移入由10mM乙酸鹽、檸檬酸鹽及琥珀酸鹽緩沖劑形成的pH為5的不添加鹽的或添加0.1M或0.5MNaCl的溶液中(緩沖劑組成列于表Ⅰ)。將所獲的九種樣品分別地滅菌過濾，分成三份相同的體積并存于滅菌的300μL玻璃微型瓶中。所得大約含量為9mg的27只小瓶在5、25及40℃下，進(jìn)行長至40天時(shí)間的穩(wěn)定性測試。樣品用ELISA及C4反相HPLC測定進(jìn)行并用在第0、7、14、28及40天進(jìn)行C4反相HPLC測試。將剩下的3mg松弛素在5℃下放入Milli-Q水中，用作對照材料。研究1及連續(xù)的穩(wěn)定性研究表明，在5℃下用反相HPLC測得至少可穩(wěn)定五個(gè)月。這些觀察結(jié)果是在接下的穩(wěn)定性研究中對各參考樣品進(jìn)行重復(fù)的觀察得到的。
表Ⅰ1.0mg/ml的松弛素液體實(shí)驗(yàn)性的配方研究1配方配方每ml組成10mM甘氨酸，pH3.00.74mg甘氨酸-HCl(6.66mM)0.25mg甘氨酸(3.34mM)8.87mgNaCl(0.152M)10mM乙酸鹽，pH5.00.25mg乙酸鈉(2.96mM)7.0uL1.0M乙酸(7.04mM)8.60mgNaCl(0.147M)10mM檸檬酸鹽，pH5.00.69mg檸檬酸單水合物(3.3mM)1.97mg檸檬酸鈉二水合物(6.7mM)7.25mgNaCl(0.124M)10mM組氨酸，pH6.01.12mg組氨酸-HCL(5.32mM)0.73mg組氨酸(4.68mM)8.66mgNaCl(0.148M)10mMTris，pH7.51.32mgTris-HCl(8.36mM)0.20mgTris堿(1.64mM)8.52mgNaCl(0.146mM)＊所有配方均為等滲的(0.154μ，加入NaCl補(bǔ)足后的離子強(qiáng)度)。
研究2配方配方每ml組成10mM乙酸，pH5.00.54mg乙酸鈉(3.42mM)3.42μL1.0M乙酸(6.58mM)10mM琥珀酸，pH5.00.51mg琥珀酸(4.25mM)1.55mg琥珀酸二鈉六水合物(5.75mM)10mM檸檬酸，pH5.00.53mg檸檬酸(2.78mM)2.12mg檸檬酸鈉二水合物(7.22mM)所有的三種緩沖液+0.1MNaCl5.84mgNaCl所有的三種緩沖液+0.5MNaCl29.22mgNaCl表Ⅱ用于松弛素穩(wěn)定性研究1的每次測試所需之小瓶中配方的體積(μL)時(shí)間ELISAUVHPLC環(huán)AMP近UVCDUC0天101001010500507天10-1010--14天10-1010--21天10-1010--1個(gè)月101001010500502個(gè)月101001010500503個(gè)月101001010500504個(gè)月101001010500505個(gè)月101001010500506個(gè)月10100101050050將配制的用于7、14及21天ELISA、HPLC及環(huán)AMP測試的配制的蛋白質(zhì)100μl置于滅菌的100μl的微型瓶(3瓶/每次測試×5種配方×3種溫度＝45瓶)中。將1、2及3個(gè)月的樣品按相似方式分組(45瓶)，4、5及6個(gè)月的樣品類似地于另外的45瓶中分組，因而對于這三種測定共用了一百三十五只100μl微型瓶。將剩下的配制成的蛋白質(zhì)分盛于1.5ml小瓶中，使每瓶含有0.9ml，該量對于CD、UV及UC測定是足夠的。這樣，總共為90個(gè)1.5ml小瓶(5種配方×3種溫度×6個(gè)時(shí)間點(diǎn))。
研究3用于測定含有松弛素類似物的配方如下所列1.10mM檸檬酸鹽緩沖液，加NaCl使為等滲。
2.10mM檸檬酸鹽緩沖液，加NaCl使為等滲，并對新配制的等滲檸檬酸鹽緩沖液進(jìn)行透析(將之作為對照)。
3.10mM檸檬酸鹽緩沖液，加甘露糖醇(5.07%)使為等滲，對10mM檸檬酸鹽、5.07%甘露糖醇緩沖液(無NaCl)進(jìn)行透析。
4.10mM檸檬酸鹽緩沖液，加NaCl使為等滲，加入5%無水乙醇。
5.10mM檸檬酸鹽緩沖液，加NaCl使為等滲，加入10%無水乙醇。
6.10mM檸檬酸鹽緩沖液加NaCl使為等滲，加入5%甘油。
7.10mM檸檬酸鹽緩沖液加NaCl使為等滲，加入10%甘油。
8.10mM檸檬酸鹽緩沖液加NaCl使為等滲，加入5%丙二醇。
9.10mM檸檬酸鹽緩沖液加NaCl使為等滲，加入10%丙二醇。
10.10mM檸檬酸鹽緩沖液加NaCl使為等滲，加入0.02%EDTA(二鈉鹽)。
11.10mM檸檬酸鹽緩沖液加NaCl使為等滲，加入5%甘露糖醇。
這些配方一式三份置于5、25及40℃。
此外，將1ml濃度為2mg/ml的原先的松弛素等滲(NaCl)檸檬酸鹽緩沖液注入27只1.5ml小瓶并于-20℃進(jìn)行冷凍。在第0、3天將小瓶融熔并進(jìn)行測定;在以后的天數(shù)中對三個(gè)小瓶進(jìn)行融熔并測定。
測定方法高效液相法(HPLC)測定在應(yīng)用下列柱條件以1毫升/分流量，溶液A0.1%TFA，溶液B0.1%TFA，90%乙腈，以1%/分從20%A至50%B的梯度以一個(gè)VydacTMC4反相柱上得到包譜。
在研究1中，該色譜的總面積在測量誤差范圍內(nèi)保持恒定，即主峰面積的減少副峰面積的增加一起計(jì)算。該HPLC柱的連續(xù)再揭示了大部分松弛素在該梯度條件下被洗脫出來。這性能與在研究2中所觀察到的性能相反，研究2中由HPLC測定所決定的總面積隨時(shí)間而變，當(dāng)該物料被高度純化時(shí)，由HPLC所測量的穩(wěn)定性得到增加。
酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定樣品被稀釋至稀釋用的緩沖液中用于ELISA測定，以致于所希望的濃度將落在該標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性部分的中列數(shù)中。用于ELISA測定的初次抗體(待發(fā)性抗體)相對于合成的人類松弛素肽。其中該人類松弛素A-鏈在該鏈的1號位具有一焦-Glu的為一種親合性-經(jīng)純化的兔的多克隆抗體。
由ELISA所決定的濃度通過與該穩(wěn)定性樣品一起提供的對照樣品而標(biāo)定。由ELISA所測定的值通常比所希望的以UV光譜為基礎(chǔ)的值大，但在標(biāo)定之后，比所希望的值小約20%。在研究1中，提供三份平行操作的樣品，從三個(gè)小(玻璃)瓶的每一個(gè)中取出樣品，釋稀作每一時(shí)間點(diǎn)的測定。
環(huán)腺一磷酸(AMP)測定在一測定細(xì)胞的緩沖液中稀釋樣品，并培養(yǎng)獼猴子宮細(xì)胞。用杜邦德耐摩斯有限公司，威爾明頓，戴爾(dupontdeNemours，Inc.，Wilmington，Del.)的生產(chǎn)廠的測定步驟測定所產(chǎn)生的細(xì)胞懸浮液的環(huán)狀A(yù)MP。一標(biāo)準(zhǔn)曲線用于說明環(huán)狀A(yù)MP濃度與松弛素濃度的關(guān)系。這濃度理論上為一與ELISA相反的“生物活性”濃度，它測定了免疫活性的濃度。與穩(wěn)定性樣品一起提供一已知濃度的對照樣品，并用于標(biāo)定該松弛素的已確定的濃度。
鼠的恥骨聯(lián)合的測定鼠的恥骨聯(lián)合韌帶在體內(nèi)生物測定測量系測定松弛素使在結(jié)締組織上的改型效應(yīng)，參見史蒂耐茨，B.G.等(1960年)內(nèi)分泌學(xué)，67卷102頁(Steinetz，B.G.et al.，(1962)Endoerinology 67102)靠近UV圓二色性(CD)以約1毫克/毫升的松弛素樣品用滲析液1∶1稀釋，且在20℃下在-0.5厘米光通道長度的恒溫圓柱形比色杯中得到在一AvivTM改進(jìn)的Cary60分光偏振計(jì)中的320至240毫微米的光譜。在收集CD數(shù)據(jù)之后，從該CD單元中移去該樣品，并用磷酸鹽-緩沖鹽水稀釋5倍。然后，在用UV吸收光譜法之前確定其濃度。在橢圓度(毫度)中的該CD信號，用阿德勒等，酶的方法，27卷695頁(1973年)(Adler et al.，Meth.Enzym.，27675(1973))所述的方法，用一用于人類松弛素的平均殘余重量112.9克轉(zhuǎn)化為平均殘余重量橢圓度。
分析用超離心法松弛素穩(wěn)定性測試用的樣品用合適的滲析液稀釋4倍，并裝至雙扇形面超速離心杯中，該杯被放至一An-F4孔分析離心管中。超速離心法是在一貝克曼模型E(Beckman Model E)分析型超速離心機(jī)中，以32，000轉(zhuǎn)/分(轉(zhuǎn)速)，在200℃下進(jìn)行18小時(shí)。在分離實(shí)驗(yàn)中，確定了18小時(shí)是以得到沉降平衡的時(shí)間。在該離心杯中的濃度梯度是由UV吸收的，在280毫微米下，用一光電的光學(xué)描掃器來確定。該曲線軌跡用一MacintizerTM顯跡墊板輸入一Macintosh計(jì)算機(jī)中。該對應(yīng)于離心杯中的濃度梯度和重量平均分子量可用(下列)等式表示(泰勒，酶的方法，27卷346頁(1972年)(Teller，Meth.Enzym.，27346(1972))Mw＝2RT/[W2(1-vp)]dlnc/dr2，
其中Mw為重量平均分子量。T為溫度，R為氣體常數(shù)，W為以弧度表示的角速度，v為蛋白質(zhì)的微分比容，p為溶液密度，c為蛋白質(zhì)濃度，及r為從旋轉(zhuǎn)中心至離心物的半徑長度。該等式假設(shè)一理想溶液，并在選擇的緩沖條件下顯示出對松弛素沉積將是合適的。Inc對r的最小二乘方回歸分析得到在該單元中作為一在該濃度范圍的平均值的重量平均分子量。該數(shù)據(jù)也可用一三階多項(xiàng)式來修正，且在該離心杯中測得的各濃度下得到用于dlnc/dr2的值。該用于松弛素的微分比容0.731毫升/克是根據(jù)科恩和愛德松，“為離子和偶極離子的蛋白質(zhì)、氨基酸和肽“(海富納紐約，1965年)，第157-175頁(Cohn and Edsall，“Porteins，Amino Acids and Peptides as Ions and Dipolar Ions”(HafnerNew York，1965)，pp.157-175)，應(yīng)用用于各氨基酸殘余物的值，從該氨基酸組成來計(jì)算的。
結(jié)果研究1作為隨時(shí)間而變的松弛素的降解率可用反相HPLC來監(jiān)測，當(dāng)全部HPLC主峰的總面積不隨時(shí)間變化時(shí)，該總面積的百分比可被用于研究松弛素的降解動(dòng)力學(xué)。保持的主峰的百分率從三份樣品(有效的)來計(jì)算，且確定了用于如表Ⅰ(范圍從3.0克至7.5)中所示的組配方的主要的HPLC峰的降解動(dòng)力學(xué)的一級降解曲線。接著該動(dòng)力學(xué)通過用反相HPLC來測量松弛素主峰的消失速率來研究。圖1a-1e為在這三個(gè)溫度下對于5組配方的主要的HPLC峰的百分率對時(shí)間變化的圖，表示降解的速率。圖1a為在10毫摩爾/升甘氨酸(pH值為3.0)中的松弛素，圖1b為在10毫摩爾/升檸檬酸鹽(pH值為5.0)中的松弛素，圖1c為在10毫摩爾/升組氨酸(pH值為6.0)中的松弛素，圖1d為在10毫摩爾/升乙酸鹽(pH值為5.0)中的松弛素及圖1e為在10毫摩爾/升Tris(pH值為7.5)中的松弛素。在各圖中，三角表示5℃，圓圈表示25℃，及方塊表示40℃。這些圖顯示了松弛素降解可通過一一級降解速率動(dòng)力學(xué)來分析。圖2顯示在5°(空心方塊)、25°(菱形)及40℃(實(shí)心方塊)下，對5組配方的用于主峰的降解的確定的一級降解速率常數(shù)對pH值變化的曲線。在圖2中的該數(shù)據(jù)顯示出人類松弛素在一pH值約4至6，且最好是pH值為5時(shí)最合適。
研究2在琥珀酸鹽、乙酸鹽及檸檬酸鹽配方中，由RP-HPLC和ELISA所測得的松弛素的穩(wěn)定性不是大大地受離子強(qiáng)度的變化而影響，如通過應(yīng)用0.01摩爾/升、0.1摩爾/升和0.5摩爾/升氯化鈉而得到的影響。該蛋白質(zhì)被配制為約0.15微克離子強(qiáng)度，重量分子滲透濃度約250毫摩爾/千克，為了可將該配方用于靜脈內(nèi)的以及肌肉的注射。
研究3表Ⅲ和Ⅳ分別顯示有關(guān)檸檬酸鹽配方在pH值為5.0下，在5℃下貯藏1年(以1毫克/毫升松弛素的濃度)和在-20℃下60天(以2毫克/毫升松弛素的濃度)的反相HPLC數(shù)據(jù)。在表Ⅲ中的數(shù)據(jù)可用外推法推斷以估計(jì)在5℃下至少2年的穩(wěn)定性(即，不大于約10%降解)，假設(shè)一級降解動(dòng)力學(xué)。所有兩表表示該配方在各溫度下是穩(wěn)定的。
表Ⅲ反相HPLC在5℃下貯藏的檸檬酸鹽配方的穩(wěn)定性時(shí)間保留時(shí)間面積總面積×10主峰(天)(分)(主峰)×10百分率020.952.842.84.998019.852.962.98.995020.882.892.94.985平均值20.6±0.62.90±.062.92±.07.993±.0071419.782.682.75.9771419.722.512.52.997平均值19.8±.032.60±.092.64±.01.987±.013020.22.572.68.9593021.82.362.47.955平均值21.0±.82.47±.12.58±.1.957±.0029720.22.622.69.9749720.22.572.61.984平均值20.22.60±.032.65±.04.979±.00515020.72.842.98.95715020.72.812.92.96115020.72.822.96.955平均值20.72.82±.022.95±.03.958±.003在5℃下1年以后，用于人類松弛素的主要的RP-HPLC峰的一級解降速率常數(shù)。在各時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)在三份(樣品)(有效的)中平均化，且適合下式In(主峰百分率)＝A-kt
截距k(天)Rt.9t1/2(年)-0.027±0.007-0.00008±0.00004.746＞2年＞2表Ⅳ反相HPLC在-20℃下貯藏的檸檬酸鹽配方的穩(wěn)定性時(shí)間保留時(shí)間面積總面積×10主峰(天)(分)(主峰)×10百分率019.704.254.29.990019.704.224.24.995019.724.194.21.993平均值19.71±.014.22±.034.25±.04.993±.0033020.224.314.35.9893020.204.294.32.994平均值20.21±.014.30±.014.34±.02.989±.0056019.824.764.86.9796019.874.614.67.9916019.854.594.63.992平均值19.85±.034.65±.094.72±.12.987±.007關(guān)于松弛素的穩(wěn)定性和生物活力的關(guān)系可通過應(yīng)用一種測定法，測量通過松弛素與獼猴子宮細(xì)胞的相互作用引起的環(huán)狀A(yù)MP的產(chǎn)品，來研究。該環(huán)狀A(yù)MP生物的濃度對時(shí)間的生物測定曲線在圖3a-3e中示出，其中圖3a為在甘氨酸-鹽酸(pH值為3.0)中的松弛素，圖3b為在檸檬酸鹽(pH值為5.0)中的松弛素，圖3c為在乙酸鹽(pH值為5.0)中的松弛素，圖3d為在組氨酸(pH值為6.0)中的松弛素及圖3e為在Tris緩沖液(pH值為7.5)中的松弛素。在各圖中，空心方塊為5℃，實(shí)心圓圈為25℃，及空心三角為40℃，且直線為所希望的值。在該實(shí)驗(yàn)的誤差范圍內(nèi)，顯示出全部樣品(pH值從3至7.5)在貯藏40天之后均具有相同的生物活性。
關(guān)于松弛素的生物活性的穩(wěn)定性也可用鼠的恥骨聯(lián)合測定來確定。在pH值為5的檸檬酸鹽緩沖液中的未降解的松弛素與在pH值為7.5的Tris緩沖液中的一高度降解的樣品的生物活性的比較揭示了在該測定的誤差范圍內(nèi)不存在生物活性的差異。
一ELISA和一圓二色性測定被用于確定該配方的蛋白質(zhì)構(gòu)象。該數(shù)據(jù)表明該松弛素的三維結(jié)構(gòu)在貯藏1或2個(gè)月之后是不變的。
在蛋白質(zhì)自身結(jié)合中可能性的變化可用沉降平衡分析型超離心法技術(shù)來研究。在10毫摩爾/升乙酸鹽、pH值為5的0.1摩爾/升氯化鈉中的松弛素通過載荷濃度0.1、0.2和0.4毫克/毫升下通過分析超離心法來分析。在全部三個(gè)載荷濃度下的該重量平均分子量為約10，000，表明在這些條件下松弛素形成二聚物。
將各種藥物學(xué)上可接受的賦形劑加至10毫摩爾/升檸檬酸鹽、pH值為5的配方中以研究它們對該配方的穩(wěn)定性的影響。圖4為一顯示在該三種溫度下對于各配方的主要的反相HPLC松弛素峰的降解速率的圖。從左到右，經(jīng)超濾的(實(shí)心的)和滲析的(密的影線)樣品與具有如下加入的賦形劑的樣品比較一等滲量(交叉的影線)或5%(中度密度的影線)重量的甘露糖醇，5%(空心的)或10%(實(shí)心的)重量的丙三醇，5%(平線的)或10%(點(diǎn)狀的)重量的乙醇，5%(稀的影線)或10%(空心的)重量的丙二醇，及0.02%(實(shí)心的)重量的EDTA。每一樣品均在5、25或40℃下貯藏。可見，與經(jīng)超過濾和滲析的對照物相比，該賦形劑在穩(wěn)定性方面只有可以忽略的影響是在實(shí)驗(yàn)誤差以內(nèi)。該經(jīng)超過濾程滲析的樣品也顯示出相互之間無區(qū)別。
另外，可制備凍干的配方，其中松弛素可作為一酸性溶液而重新組成。更具體地講，長松弛素在最初在檸檬酸鹽配方緩沖液中存在以后被滲析至10毫摩爾/升檸檬酸鹽、0.507%甘露糖醇，pH值為5.0中。然后，經(jīng)無菌過濾這預(yù)制物至9個(gè)3毫升管形瓶中，每瓶體積1毫升。將這些管形瓶放在一個(gè)在一LyovacGT20凍干器中的盤上。冷卻該松弛素樣品至-50℃，且然后在0℃下經(jīng)歷第一個(gè)干燥周期25小時(shí)。這通過在25℃下第二個(gè)干燥周期17.5小時(shí)來研究。在該干凍終止時(shí)，1個(gè)管形瓶用1毫升(Milli-Q)水重新組成，且顯示出非常澄清，無混濁，表明一成功的重行組成。因此，殘余的管形瓶在5℃和25℃下穩(wěn)定放置。
先于凍干轉(zhuǎn)化至凍干緩沖液中的長(鏈)松弛素被用作為預(yù)凍干對照物。除了零時(shí)間重組樣品之外，樣品在5℃和25℃下貯藏了2周、1個(gè)月和3個(gè)月之后重組。全部樣品通過前面所述的RP-HPLC用于分析降解產(chǎn)品。只要可能計(jì)算三份注射液的平均值。對于全部樣品，不管貯藏的凍干的時(shí)間的長度，主峰百分率是不變的(見表Ⅳa)，表明在25℃下3個(gè)月之后不失去穩(wěn)定性。而且，全部樣品的分光光度分析表明在25℃下凍干貯藏多至3個(gè)月的條件下，在光擴(kuò)散百分?jǐn)?shù)方面無增加。
表Ⅳa樣品主峰百分率每個(gè)預(yù)凍干對照物97.3%時(shí)間無重建97.8±0.7%2周，5℃98.3±0.3%2周，25℃98.1±0.4%1個(gè)月，5℃97.8%1個(gè)月，25℃97.6%3個(gè)月，5℃98.0±0.5%3個(gè)月，25℃98.8±0.4%最初的冰凍-融化研究表明該蛋白質(zhì)可在-20和-60℃下，以一pH值為5的2毫克/毫升的濃度，在一液態(tài)配方中冰凍而在HPLC測定中無任何可觀察到的變化。而且，表Ⅴ提供了用于檸檬酸鹽，pH值為5.0，冰凍的配方的RP-HPLC穩(wěn)定性數(shù)據(jù)，然后用一所用的樣品融化，再立即冰凍并保持冰凍30天，最后在室溫下融化5小時(shí)。直至融化未觀察到HPLC數(shù)據(jù)的變化。
表Ⅴ反相HPLC(冰凍-融化)在-20℃下貯藏的檸檬酸鹽配方的穩(wěn)定性時(shí)間保留時(shí)間面積總面積×10主峰(天)(分)(主峰)×10百分率零時(shí)間樣品再冰凍3020.184.504.54.9893020.184.514.56.9893020.204.484.53.987平均值20.19±.014.50±.024.54±.02.988±.001
在室溫下5小時(shí)＊019.824.764.86.979019.874.614.67.991019.854.594.63.992平均值19.85±.034.65±.094.72±.12.987±.0075小時(shí)19.884.604.65.989＊在-20℃冰凍狀態(tài)下放置60天的樣品在室溫下貯藏5小時(shí)，并再測定。
結(jié)果，由RP-HPLC所測得的人類松弛素的結(jié)構(gòu)的完整性受配制時(shí)的pH值的影響，在pH值為7及再高一些的值時(shí)出現(xiàn)降解。該HPLC測定揭示了在被研究的5組配方中，松弛素在一pH值為5的乙酸鹽或檸檬酸鹽緩沖液中比在其它緩沖液中穩(wěn)定，且該pH值為5的檸檬酸鹽緩沖液在5和-20℃下多至5個(gè)月最穩(wěn)定。生物活性是不受影響的。
實(shí)施例Ⅱ在豬的和人類的H2松弛素比較中，重量平均分子量數(shù)據(jù)顯示出人類松弛素比豬的松弛素在pH值為5的溶液中的結(jié)合程度大得多。在不同的載荷濃度下所得到的用于人類松弛素的數(shù)據(jù)是相似的，提示了該聚合為一可逆的自身結(jié)合。該數(shù)據(jù)還是顯示出用于人類松弛素的自身結(jié)合在pH值為3時(shí)的范圍比pH值為5時(shí)的范圍為小。
實(shí)施例Ⅲ已發(fā)現(xiàn)松弛素的天然形式為具有一含有29個(gè)氨基酸(短松弛素)而不是33個(gè)氨基酸(長松弛素)的B鏈的形式。該研究的目的在于確定該短松弛素與長松弛素比較是否具有相似的穩(wěn)定性和吸收性。而且，用遠(yuǎn)程UVCD比較松弛素的該兩種形式在280毫微米時(shí)的消光系數(shù)和二維結(jié)構(gòu)。
在這些實(shí)驗(yàn)中所應(yīng)用的短松弛素是通過限制性長松弛素(在實(shí)施例1中合成的)的蛋白水解作用以致于在B鏈中得到29個(gè)氨基酸。在將長松弛素合成之后，將它應(yīng)用于一個(gè)用一TFA梯度的HPLC柱，且然后應(yīng)用于一個(gè)單S離子交換柱。然后，將該含有松弛素的片段通過滲析過濾至一緩沖液配方中。向該緩沖液(含200毫克松弛素)中加入胰蛋白酶[其比例為1份胰蛋白酶對2000份(重量份)松弛素]，并進(jìn)行蛋白水解作用約40分鐘。然后，將50微升-16.9毫克/毫升羧(基)肽酶B(70u/毫克)的溶液加至該水解液中。所產(chǎn)生的溶液在室溫下放置1小時(shí)，然后用檸檬酸酸化，并用HPLC和單S柱純化。將這樣純化的松弛素經(jīng)滲析過濾至pH值為5，用氯化鈉等滲的10毫摩爾/升檸檬酸鹽中，直至1.0毫克/毫升，并在-60℃下冰凍貯藏(1毫升，在3毫升的型號為Ⅰ的玻璃管形瓶中)。這組的一部分也以液態(tài)提供，且指定為一非冰凍樣品。
溫度穩(wěn)定性在10毫摩爾/升pH值為5的等滲的檸檬酸鹽中的松弛素的穩(wěn)定性可通過研究主要的反相HPLC峰的降低的一級降解速率動(dòng)力學(xué)來測定。在應(yīng)用下列條件1毫升/分流量，在30分鐘內(nèi)20%溶液A至50%溶液B的梯度(溶液A為0.1%三氟乙酸，及溶液B為0.1%三氟乙酸，90%乙腈)的一個(gè)Syn ChropakTMC4反相柱上得到高效液相色譜。
表Ⅵ表示長松弛素和短松弛素之間的動(dòng)力學(xué)的比較。長松弛素的一級降解速率常數(shù)從上年的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)中來確定，且短松弛素的一級降解速率常數(shù)從冰凍-融化樣品的6個(gè)月數(shù)據(jù)和非冰凍樣品的二個(gè)月數(shù)據(jù)中來確定。所包括的經(jīng)確定的一級降解速率常數(shù)為t.9和t1/2時(shí)的值。短松弛素的穩(wěn)定性至少與長松弛素的穩(wěn)定性一樣好，且可能更好，因?yàn)樵摫鶅?融化樣品在25℃下有比2年穩(wěn)定性更大的穩(wěn)定性。如以前對于長松弛素所觀察到的，冰凍和融化不影響短松弛素的穩(wěn)定性。
表Ⅵ對長松弛素和短松弛素的主要的RP-HPLC峰的降解的一級降解速率常數(shù)三份的平均值用于以符合In(主峰百分率)＝A-kt緩沖液截距 k(天1) t.9(天) t1/2(天)長松弛素5℃-0.027±0.007-0.000082±0.000037＞2年＞2年25℃-0.028±0.010-0.000591±0.000055178.2＞2年40℃-0.028±0.024-0.002603±0.00013240.5266.3短松弛素(非冰凍)5℃-0.007±0.005-0.000116±0.000132＞2年＞2年25℃+0.002±0.004-0.000516±0.000106204.1＞2年40℃-0.001±0.008-0.003988±0.00019426.4173.8短松弛素(冰凍-融化)5℃-0.005±0.003-0.000037±0.000032＞2年＞2年25℃-0.005±0.006-0.000478±0.000220＞2年＞2年40℃-0.001±0.007-0.002773±0.00024752.4345.0光穩(wěn)定性將2個(gè)短松弛素的管形瓶放在一個(gè)具有強(qiáng)度1600英尺燭光的光盒中7天。一個(gè)管形瓶用鋁箔與光隔開，并用作為一對照物。將長松弛素的主要的松弛素峰的保留時(shí)間標(biāo)定至短松弛素的保留時(shí)間，并在表Ⅶ中示出。那么，降解峰的各保留時(shí)間與這經(jīng)標(biāo)定的值有關(guān)系。如可見的，短松弛素和長松弛素的該經(jīng)標(biāo)定的保留時(shí)間非常一致，暗示在兩種蛋白質(zhì)中發(fā)生相似途徑的降解。但是，長松弛素的降解的速率顯示出要與比短松弛素的多少要大一些。
表Ⅶ短松弛素和長松弛素的光穩(wěn)定性長松弛素短松弛素暴露在1600英尺燭光的光中7天Rt＊保留主峰百分率＊Rt＊保留主峰百分率＊19.34±0.0164.70±0.5319.34±0.0178.56±0.6417.62±0.087.38±0.2017.67±0.028.56±0.1617.20±0.0811.26±0.1917.38±0.014.90±0.02215.49±0.034.68±0.13對照物Rt＊保留主峰百分率＊Rt＊保留主峰百分率＊19.33±0.0297.16±0.3719.33±0.0297.09±0.2619.33±0.021.88±0.1519.02±0.022.03±0.16＊該主峰的保留時(shí)間被標(biāo)準(zhǔn)化至短松弛素的，且降解峰的保留時(shí)間與該經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的值有關(guān)。
＊具有面積小于總面積2%的峰為清楚起見而省略。
對攪動(dòng)的穩(wěn)定性在室溫下，在一Glas-Col型號S-500攪拌器上調(diào)正在2.5單元處攪拌盛有短松弛素的一個(gè)管形瓶7天。一個(gè)對照物管形瓶在室溫下保持不受攪動(dòng)。松弛素的穩(wěn)定性通過上述用于溫度穩(wěn)定測定的反相HPLC來測定。
表Ⅷ表示在攪拌7天之后保留的主要的松弛素峰的百分率。這些數(shù)據(jù)表明，在長松弛素或短松弛素中，當(dāng)與未攪動(dòng)對照物比較時(shí)，通過在該經(jīng)攪動(dòng)的樣品中的反相HPLC檢測的重大變化是不存在的。
表Ⅷ短松弛素和長松弛素的攪動(dòng)穩(wěn)定性長松弛素短松弛素Rt保留主峰百分率Rt保留主峰百分率對照物19.97±0.0297.84±0.1719.26±0.0498.50±0.28經(jīng)攪拌的19.97±0.0298.53±0.4319.17±0.0398.45±0.23吸附研究將松弛素稀釋至約10微克/毫升，在一般的鹽水中通過UV分光光度測定法來確家。將硅橡膠R管0.02英寸內(nèi)徑×0.037英寸外徑的二端與一裝有一個(gè)5毫升玻璃注射器和一根22G針的Harvard輸注泵相連接。松弛素以100微升/分的速率通過管子，在開始10分鐘內(nèi)每分鐘收集到100微升樣品，接著每5分鐘直至第30分鐘收集到100微升樣品，至900微升ELISA測定緩沖液(EAB)中。這1∶10的稀釋液通過在ELISA測定用的緩沖液EAB中的二次連續(xù)稀釋至被稀釋到1∶4000。該1∶4000稀釋液通過ELISA測定了蛋白質(zhì)的濃度。
該松弛素被吸附到該管子上。但是，在通過該管子輸注5分鐘之后，該松弛素的濃度接近于如由ELISA所確定的所希望的濃度。在該曲線下的面積的積分顯示出由于吸附至在該管子的表面上，蛋白質(zhì)的總量損失約5%。顯示長松弛素和短松弛素之間在吸收至硅橡膠管子方面沒有發(fā)現(xiàn)很大的區(qū)別。
消光系數(shù)的確定長松弛素和短松弛素的消光系數(shù)通過從兩個(gè)分別確定的定量的氨基酸分析來計(jì)算，對長松弛素來講為2.04或2.14平方厘米/毫克，及對短松弛素來講為2.25或2.30平方厘米/毫克。經(jīng)計(jì)算的長松弛素和短松弛素的摩爾消光系數(shù)為13，000±200(摩爾/升)-1厘米-1。這結(jié)果暗示從C-末端除去4個(gè)氨基酸對兩色氨酸和一酪氨酸的瞬間環(huán)境方面的影響極小。這也昱示了松弛素的這兩種形式的構(gòu)象是相似的。
圓二色性(CD)以在pH值為5的10毫摩爾/升等滲的檸檬酸鹽中的長松弛素(0.8毫克/毫升)和短松弛素(以1毫克/毫升)的樣品，在從240至190毫微米的圓二色性光譜用一ArivCary60分光偏振計(jì)來測定。該樣品在0.01厘米光程長度的圓柱形石英比色杯中恒溫。將CD輸出的毫度用一平均殘余重量113和在228.4毫微米下用UV吸收所得到的松弛素濃度轉(zhuǎn)化為平均殘余重量橢圓度。松弛素的該濃度用對長松弛素和短松弛素分別為2.04和2.25平方厘米/毫克的消光系數(shù)來確定。二維結(jié)構(gòu)的估計(jì)量通過常等，生物化分析，91卷第13-31頁(1978年)(Changetal.，Anal.Biochem.，9113-31(1978)的方法來確定。
通過常(chang)等supra，的方法的遠(yuǎn)程UVCD光譜的分析得出此松弛素的50%為α螺旋線形，40%為β片形和3%無規(guī)線團(tuán)形，短形松弛素的50%為α螺旋線形和50%β片形。短松弛素和長松弛素在光譜中的不同是在實(shí)驗(yàn)誤差范圍之內(nèi)，且明顯地暗示短松弛素和長馳素的二維結(jié)構(gòu)是非常相似的。結(jié)論在液態(tài)配方中，短松弛素的熱穩(wěn)定性與長松弛素的熱穩(wěn)定性不相上下，且可能超過它。進(jìn)一步講，光暴露和攪動(dòng)穩(wěn)定性在該兩蛋白質(zhì)中也是相似的。物理性質(zhì)如摩爾消光值、二維結(jié)構(gòu)及表面吸收也顯示出是相同的。
實(shí)施例Ⅳ這實(shí)施例說明松弛素膠凝配方的制備和性質(zhì)。
液態(tài)松弛素的制備如在實(shí)施例Ⅲ中所述的經(jīng)制備和配制的短松弛素(含有29個(gè)氨基酸β鏈)用于這實(shí)驗(yàn)。因此，該松弛素為一濃度1.0毫克/毫升，在pH值為5.0，用氯化鈉的10毫摩爾/升等滲的檸檬酸鹽中1毫升。這配方在管形瓶中，于-60℃下冰凍貯藏一直到剛要用時(shí)才取出。來自這些管形瓶中的松弛素通過在一個(gè)2毫升的AmiconCentricon10微型濃縮器中以4000轉(zhuǎn)/分離心濃縮1至2小時(shí)而濃縮至大于2.4毫克/毫升(如通過UV光譜學(xué)，假設(shè)e＝2.04毫升/毫克·厘米來確定)。(精確的時(shí)間取決于需濃縮的松弛素的最初的體積。)4%甲基纖維素凝膠制備根據(jù)下列方案，一4%甲基纖維素凝膠從甲基纖維素A4摩爾/升的甲基纖維素粉末(道氏化學(xué)(DonChemical)中再生(a)在一有攪拌棒存在的40毫升燒杯中，將10毫升檸檬酸鹽配方緩沖液(如在實(shí)施例Ⅰ中所述)加熱至接近沸點(diǎn)(-90℃)，然后從熱源上移開。
(b)將0.8克甲基纖維素粉末加至該燒杯中，回蕩幾分鐘以分散該顆粒。
(c)然后，在5℃的較冷的房間里，將該燒杯放在一磁性攪拌器上。在該液體開始變厚之前立即加入一附加的10毫升冷的檸檬酸鹽配方緩沖液，沖洗該燒杯壁上的干顆粒。
(d)在連續(xù)攪拌20分鐘之后，該液體的粘度增加直至一均相的4%甲基纖維素凝膠形成。
(e)最后兩個(gè)穩(wěn)定性研究，該4%甲基纖維素凝膠高壓滅菌，不僅消毒該凝膠，而且除去在該凝膠中存在的任何已溶解的氧。從高壓滅菌器中移開后，在液面上為氮?dú)饪臻g下攪拌該凝膠以再均化該凝膠而不導(dǎo)入任何新的氧氣。
用于局部松弛素的制備按下列方案可得到一600微克/毫升松弛素的均相的3%甲基纖維素凝膠(a)將2個(gè)無菌的10毫升注射器放在天平上稱皮重，向一個(gè)注射器中加入3克該4%甲基纖維素凝膠。向另一個(gè)注射器中加入該凝膠的1/3體積(1毫升)2.4毫克/毫升液態(tài)松弛素配方。
(b)將活塞放回該二個(gè)注射器中，將該二個(gè)注射器和一無菌的Rainin47-FLU連接器相連，將接速器擰在該二個(gè)注射器的尾端。
(c)該松弛素溶液通過推動(dòng)一個(gè)注射器，然后將另一個(gè)注射器中推進(jìn)20-25次使分散至甲基纖維素中，使形成一均相凝膠。(但是，在最后二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，為了易于貯藏和樣品移開，可將該凝膠轉(zhuǎn)移至1.5毫升埃本道夫(eppendorf)管中。)在該凝膠中的松弛素的最終濃度為600微克/毫升。該凝膠也含有3%甲基纖維素，10毫摩爾/升檸檬酸鹽，pH值為5，且用氯化鈉等滲。
ELISA測定在該凝膠中的松弛素的樣品連續(xù)10次用同在實(shí)施例1中所用的ELISA稀釋劑按順序地稀釋以達(dá)到一濃度為6毫微克/毫升的松弛素。顯示出對高至0.25%甲基纖維素凝膠，如由ELISA所確定的該松弛素濃度無影響。該ELISA測定，如上所述，揭示了以UV光譜為基礎(chǔ)，在該凝膠中的松弛素濃度比所希望的低25%(假設(shè)一消光系數(shù)為2.04)。這結(jié)果是由于該測定用標(biāo)準(zhǔn)是全長的β-鏈松弛素及所提供的樣品是縮短了β-鏈的松弛素。
局部用的松弛素的RP-HPLC分析用于分析液態(tài)松弛素配方的，在實(shí)施例Ⅰ中所述的方法經(jīng)改進(jìn)后用于局部用的松弛素樣品。由于該凝膠的高粘度，用水稀釋樣品10倍，旋轉(zhuǎn)5分鐘以均化該凝膠，并保持靜止以讓氣泡上升。這些樣品的分析通過在室溫下注射250微升至-C4-300 Synchropak(4.6×250毫米)柱上而完成。最初的平衡緩沖液為18%乙腈，0.1%三氟乙酸。洗脫以1%分速率進(jìn)行，增加線性乙腈梯度，在30分鐘后達(dá)到一最終濃度為45%乙腈。流量保持恒定，在1.0毫升/分，且在214毫米處監(jiān)測吸光度?！皽p速”步驟(系指該粘的凝膠抽到計(jì)量裝置所用的時(shí)間)從36分鐘增加至270分鐘。已發(fā)現(xiàn)在增加該“減速”步驟之前，由于其高粘度，實(shí)際上注射入大大少于250微升的凝膠。
在這些實(shí)驗(yàn)的過程中，該Synchropak柱開始失去其分離出峰的能力。因此，最后幾次注射是在-C4-300 Vydac柱上進(jìn)行。
在局部松弛素配方上進(jìn)行三個(gè)重要的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。第一個(gè)測量這些制劑在室溫下放置5周后的穩(wěn)定性。在溫度和光的波動(dòng)的條件下，將該樣品留在原注射器中。
RP-HPLC分析揭示了該主要的、未降解的松弛素峰易于隨時(shí)間而增加降解的量，如由主峰的面積的百分率的減少和早期洗脫降解峰的面積的百分率的增加所證明。
關(guān)于主峰面積的百分率，在時(shí)間零(在將該松弛素推入該凝膠之前)時(shí)，主峰的面積的百分率的減少被定量化和得到標(biāo)定。經(jīng)標(biāo)定化的主峰百分率對時(shí)間的對數(shù)曲線揭示該局部松弛素經(jīng)受了一級降解動(dòng)力學(xué)降解。
從HPLC流出液分別收集主要的松弛素峰和最大的降解峰并在真空下在Savant Speed-vac中凍干～1小時(shí)。然后，這些樣品在硫甘油和乙酸中重組，并在探針上還原以分離A鏈和B鏈，且通過質(zhì)譜來分析。二個(gè)樣品的質(zhì)譜分析揭示了二個(gè)樣品的A-鏈的摩爾離子是一樣的，且與預(yù)見的~2657相一致。但是，B-鏈的摩爾離子是不同的。主峰樣品的摩爾離子與理論值~3314相一致。來自降解峰的B-鏈的摩爾離子為~3330。這16的增加數(shù)精確地說明相當(dāng)于當(dāng)在B-鏈中的殘基被氧化時(shí)所預(yù)期的值。
66毫克來自豬的卵巢的豬的松弛素，被重組至檸檬酸鹽酸配方緩沖液中，經(jīng)旋轉(zhuǎn)約～3分鐘以使某些顆粒成凝成丸狀，并以3.19毫克/毫升在0.248毫升檸檬酸鹽配方緩沖液中與如上所述的4%甲基纖維素混合以產(chǎn)生一具有600微克/毫升豬的松弛素的3%凝膠。與經(jīng)縮短的B-人類松弛素相反，當(dāng)經(jīng)受如上所述的HPLC分析時(shí)，豬的松馳素配方的降解非常小。
第二次研究是一在5℃和25℃下，在較好的控制條件下，局部用松弛素的穩(wěn)定性的測量。而且，用于該研究的甲基纖維素凝膠用高壓滅菌以消毒它并從可能引起氧化的該凝膠中除去任何已溶解的氧氣。將該局部用的松弛素的樣品轉(zhuǎn)移至4根埃本道夫管中，2根在5℃下貯藏，2根在25℃下貯藏。144小時(shí)之后，該局部用的松弛素在5℃下開始降解，同時(shí)該物料在25℃下相對來講則未降解，如由HPLC分析確定。連續(xù)的分析揭示了當(dāng)25℃的盒完全與各光源隔絕時(shí)，在5℃下較冷的房間中的光常常能照在上面。
為確定這光是否導(dǎo)致在5℃下該降解峰的形成，將2個(gè)樣品中的一個(gè)包裹在鋁箔中以與該光隔絕，在5℃下，附加360小時(shí)之后，曝光的松弛素已完全降解，而該經(jīng)隔絕的松弛素以一非常低的速率續(xù)降解，如由HPCL確定。因此，光的存在顯示出影響穩(wěn)定性，與光隔絕完全保護(hù)了該局部用的松弛素，但暴露至光下再遮蓋導(dǎo)致以一非常低的速率繼續(xù)降解。在貯藏了672小時(shí)的該局部用的松弛素(遮蓋再暴露至光下)中的寬峰的收集物的質(zhì)譜揭示了A-鏈?zhǔn)遣皇苡绊懙?，但B-鏈顯示出經(jīng)受了第一次，然后第二次的氧化。
第3個(gè)實(shí)驗(yàn)是直接比較該局部用松弛素與配制的液態(tài)松弛素的穩(wěn)定性，兩者均暴露至光下再與光隔絕。在5℃下貯藏816小時(shí)之后，RP-HPLC譜指出當(dāng)該局部用松弛素與光隔絕時(shí)，它就與配制的液態(tài)松弛素一樣穩(wěn)定，兩者均具有96%主峰。但是，當(dāng)該局部用松馳素暴露至光下時(shí)，對降解它明顯比配制的液態(tài)松弛素要驚人地敏感得多。
功效的研究該研究的目的在于確定短松弛素對兔子宮頸成熟方面的功效。選擇兔子，因?yàn)榻?jīng)研究已提出這種動(dòng)物的子宮頸的機(jī)械行為的一個(gè)相當(dāng)好的模型，且因?yàn)樵撏米訉m頸顯示出在其生理學(xué)反應(yīng)方面與人類的子宮頸是類似的。
用重4，5至6.0千克的成熟的懷孕的雌的新西蘭兔進(jìn)行研究。在懷孕26-27天時(shí)，該兔(每組4個(gè))用在-3%甲基纖維素凝膠中的如上所述的短的人類松弛素凝膠或豬的松弛素凝膠處理。短的人類松馳素和豬的松弛素以每個(gè)動(dòng)物100，200，300，600和1000微克/毫升松馳素的劑量來配制。該二種激素通過一注射器和一導(dǎo)管以0.5毫升的體積注入陰道內(nèi)應(yīng)用。對照動(dòng)物僅接受載體。在16-18小時(shí)之后，用-戊巴比妥的致死量處死該動(dòng)物。該子宮，較下面的一段，及子宮頸被除去，在10%NB福爾馬林中固定并用于組織學(xué)考察。切下石蠟切片，并用蘇木紫/曙紅和紫生草藍(lán)PAS染色。用一般形態(tài)學(xué)測定截面切面，特別上在黏膜下層中的肌肉組織和膠原(蛋白)原纖維的分離程度，及特有的PAS陽性的巨大的細(xì)胞的存在，該細(xì)胞是在巨噬細(xì)胞源的多核細(xì)胞在生育時(shí)滲入子宮頸，該巨大的細(xì)胞的測量是用MacLemnan等在AmJ.Obstet.Gyncecol.，152卷第691-696頁(1985年)中所述的方法進(jìn)行的。
一個(gè)初步研究，其中將一濃度為300微克/毫升的人類的或豬的松弛素用于一局部用的配方中，提出在這劑量下，可使激素誘導(dǎo)形態(tài)的變化及并使在懷孕的子宮頸成熟。在應(yīng)用該藥至子宮頸18小時(shí)之后，可觀察到顯著的擴(kuò)張和子宮頸的熟化。經(jīng)染色的頸的截面切片的組織學(xué)測定顯示出在插入空間中肌肉粘膜與少量累積的富有蛋白質(zhì)物料明顯分離，膠原(蛋白)纖維素(膠原(蛋白)密度減少)，在基層物質(zhì)中增加，及粘膜下層與淋巴管脈管腫脹。同樣，特有的DAS陽性的巨大的細(xì)胞，它在對照動(dòng)物中是稀有的，在該經(jīng)處理的松弛素組中大量存在。這樣細(xì)胞通?？沙霈F(xiàn)在血管的周圍，并在上皮的下層中，雖然在該子宮頸的整個(gè)濃度都可找到。繼續(xù)研究，其中希望能決定最低的，及若可能，最高的松弛素的有效劑量，是與早期的結(jié)果相反的，在300或600微克/毫升時(shí)無有效性可見，且僅具有1毫克/毫升劑量時(shí)可見有明顯的有效性。
藥物動(dòng)力學(xué)研究該研究的目的在于確定在懷孕的兔中，短松弛素在單獨(dú)地靜脈注射施用、皮下注射施用和陰道內(nèi)施用之后的生物有效性。
所用的兔為4-5千克的、16個(gè)定期懷孕的多胎產(chǎn)的雌新西蘭白種兔(Elkhorn)。在懷孕26天時(shí)，4個(gè)動(dòng)物(第Ⅰ組)通過在用AbbocathT導(dǎo)管經(jīng)耳靜脈注射濃縮藥團(tuán)(iv)接受100微克/千克的劑量的短松弛素。3個(gè)動(dòng)物(第Ⅱ組)在股部接受-100微(克)/千克在消毒鹽水中的短松弛素的皮下注射的(sc)劑量。3個(gè)動(dòng)物(第5組)接受100微克/千克在1%苯并紅紫中的短松弛素的皮下注射劑量。4個(gè)動(dòng)物(第3組)接受-100微克/千克在3-甲基纖維中的短松弛素的陰道內(nèi)給藥的劑量。靜脈注射及皮下注射的劑量濃度為在1mg/ml松弛素內(nèi)有500微克/毫升的短松弛素的澄清液體，在鹽水中，用無菌等滲鹽水或1%苯并紅紫進(jìn)行稀釋。劑量體積近似于1毫升，并分別根據(jù)下列等式計(jì)算劑量體積＝(100微克/千克)(千克)/(500微克/毫升)對于陰道內(nèi)給藥，根據(jù)上述方案，全部的3毫克甲基纖維素凝膠(4%)與0.487毫升短松弛素(如上所述)和0.513毫升檸檬酸鹽配方緩沖混合，以產(chǎn)生-600微克/毫升短松弛素，3%甲基纖維素。陰道內(nèi)給藥劑量為體積為0.5毫升。
血樣(1毫升)用＝ Viggo Secalon導(dǎo)管從耳動(dòng)脈中抽出。血的取樣時(shí)間為(iv)0，1，2，3，4，5，7，10，20，40，60，80，120，180，240，300，360，420，480，540，600，660和720分鐘;(皮下注射和陰道內(nèi)的)0，1，2，3，5，7，10，15，20，30，40，50，60，75，90，120，180，240，300，420，\\480，540，600，660和720分鐘。血樣經(jīng)凝結(jié)，通過離心而獲得血清。樣品在干冰上冰凍，并在-70℃下貯藏直至用ELISA測定。該測定范圍為20至1280微微克/毫升。
對于用一供給程序的非線性曲線的三指數(shù)模型，各iv藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)是通過提供各免疫反應(yīng)的血清濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)來計(jì)算的(NONLIN84，統(tǒng)計(jì)咨詢有限公司;萊克辛頓，肯塔基(Stati stical Consutants，Inc;Lexington，KY))。用RS-1程序(鮑爾特，伯耐克和紐曼，劍橋，馬薩諸塞(Bolt，Berrak & Newman，Cambridge，MA))計(jì)算從血管外途徑用的數(shù)據(jù)。在該血清濃度-時(shí)間曲線(AUC)下的面積用梯形方法，從t+0至最后可測量的血清濃度(Ct)來計(jì)算。通過外推法計(jì)算AUC，從Ct至無窮大時(shí)間Ct除以終端消去率常數(shù)分。血清清除率(Ct)通過等式CL＝劑量/AUC(iv)來計(jì)算。分布的初始體積(Vc)從Vc＝劑量/C(O)來計(jì)算，其中C(O)為描述血清濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)的三指數(shù)方程的系數(shù)的總和。在穩(wěn)定態(tài)的分布體積(Vdss)如CL＊AUMC/AUC來計(jì)算，其中AUMC為在瞬間曲線，即，(血清濃度)＊(時(shí)間)對時(shí)間曲線下的面積。血清半衰期通過將0.693除以相應(yīng)的處理速率常數(shù)來計(jì)算。生物有效性通過面積比例的方法(AUC(血管外的)AUC(iv))＊100來確定。
100微克/千克在懷孕的兔中的短松弛素在靜脈注射，皮下注射和陰道內(nèi)施用之后的血清濃度＝時(shí)間分布圖可在圖5中示出，其中實(shí)心圓圈為靜脈注射，空心方塊的皮下注射，及空心圓圈為陰道內(nèi)施用。圖6表示的100微克/千克短松弛素，用(實(shí)心圓圈)和不用BPP皮下施用于懷孕的兔子，(空心方塊)的血清濃度-時(shí)間分布的比較。表Ⅹ列出了經(jīng)計(jì)算的各途徑施用的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)。在靜脈注射施用后的血清清除率為2.95±0.88毫升/分/千克。分布的初始體積(Vc)和穩(wěn)態(tài)體積分別(Vdss)相應(yīng)為89±22和209±30毫克/千克。三指數(shù)須用于描述iv血清濃度＝時(shí)間數(shù)據(jù)，因此其半衰期(t1/2)分別為8.4±2.7，59.1±8.7及279±128分。人類的松弛素的皮下施用產(chǎn)生一平均峰值血清濃度，在180分鐘時(shí)為76.20±17.80毫微克/毫升，及一生物有效性76.0±20.6%(用具有100%生物有效性的靜脈注射松弛素)。用BPPsc皮下施用的人類松弛素產(chǎn)生一平均峰值血清濃度，比單獨(dú)皮下施用的人類松弛素所觀察到的要低(41.67±16.32毫微克/毫升)和晚(420分鐘)。用BPP的生物有效性為59.4±6.7%。
人類松弛素在陰道內(nèi)施用顯示出很差的有全身性吸收。全身的血清濃度非常低(0.34±0.16毫微克/毫升，在98分鐘時(shí))且結(jié)果產(chǎn)生的生物有效性僅為1.0±0.8%。
表Ⅹ100微克/千克在懷孕的兔子中的的hRlx在iv，sc和陰道內(nèi)施用之后的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)。
途徑1)AUC2)CL3)Vc4)Vdss毫微克-毫升/分/毫升/千克毫升/千克分/毫升千克iv1a55.211.81801791b31.773.10691881c25.233.961202281d34.192.9385241平均值36.602.9589209SD12.970.882230
sc2a24.252b21.672c36.47平均值27.46SD7.91top3a0.203b0.803c0.333d0.14平均值0.37SD0.30sc+BPP5a19.015b23.605c23.76平均值22.12SD2.70SD＝標(biāo)準(zhǔn)誤差top＝局部施用的表Ⅹ(續(xù))途徑5)t1/2(1) 6)t1/2(2) 7)t1/2(3) 8)t1/2(Absp)(分) (分) (分) (分)iv la 10.1 69.3439ib5.851.1168
lc 11.3 52.7184ld 6.563.3325平均值 8.459.1279SD 2.78.7 128sc 2a 45.62b57.12c85.9平均值62.9SD20.8top 3a55.83b119.03c37.13d21.3平均值58.3SD42.9sc+BPP5a 75.25b76.95c131.0平均值94.4SD31.7SD=標(biāo)準(zhǔn)化誤差top=局部使用的表Ⅹ(續(xù))途徑 9)t1/2(項(xiàng))Q10)C峰 11)T峰 12)BA＃(分)毫微克/毫升(分)(%)
iv1a1b1c1d平均值SDsc2a7395.3012066.42b7259.9018062.02c17673.4024099.7平均值10776.2018076.0SD6017.8020.6top3a4790.262400.63b14840.55752.23c5040.381200.93d5820.18750.4平均值7620.34981.0SD4830.160.8sc+BPP5a22940.8024051.95b26658.4042061.55c49025.8042064.9平均值32841.6742059.4SD14116.326.7
平均峰值血清濃度＊平均峰值血清濃度的平均時(shí)間＃生物有效性;
血管外劑量的表現(xiàn)終端t1/2SD＝標(biāo)準(zhǔn)化誤差top＝局部施用的在完成該藥物動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)(12小時(shí))之后，殺死該動(dòng)物，除去其生殖系統(tǒng)，并作組織學(xué)考察。將該組織固定在10%NBF中，包埋在石蠟中，并用H&E和PAS/愛爾新藍(lán)染料染色。兔子宮頸組織切片對于給藥組的觀察是沒有了解。為了該研究的目的，所計(jì)算的主要的判別標(biāo)準(zhǔn)為(1)該自身的薄層和肌層的相對緊密度，(2)巨大細(xì)胞的存在，及(1)該子宮頸部區(qū)域的定位。該子宮頸被分為三種類型正的，松散地排列的自身薄層，以及在肌層下面，巨大的細(xì)胞中明顯增加;有問題的，有些變化存在，但以很不明顯的程度或不在子宮頸部，及負(fù)結(jié)果的，子宮頸無變化。
組織學(xué)研究的結(jié)果是在治療(或處理)和組織學(xué)變化之間無明顯的聯(lián)系?？寡鮿┖凸踩軇┑挠绊懺O(shè)計(jì)該研究以測定各種配方輔劑在甲基纖維素凝膠中穩(wěn)定松弛素的能力。由可通過光氧化發(fā)生降解，因此研究使用抗氧劑如抗壞血酸和焦亞酸鈉。而且，因?yàn)橐豢赡艿挠坞x基來源為在甲基纖維素上的過氧化物，所以，采用共溶劑，如丙三醇和乙醇，采用通過減少甲基纖維素和松弛素之間的相互作用來研究，以確定它們是否能穩(wěn)定該配方。最后，在將凝膠用以制備配方之前先將凝膠曝光氧化，以觀察凝膠活化對松弛素氧化的影響凝膠制備4%(重量/體積)甲基纖維素凝膠通過將4克甲基纖維素粉末(道爾化學(xué)(DowChemical)加至100毫升10毫摩爾/升檸檬酸鹽，pH值為5的緩沖液(用氯化鈉等滲)中來制備。在85℃下，將該粉末分散至該緩沖液中之后，該溶液在121.5℃高壓滅菌30分鐘。完成之后，將氮?dú)庵迷撃z之上，并讓它在5℃地恒溫箱中放置過夜以得到水合。對含有丙三醇和乙醇的配方，將該共溶劑直接加至該配方緩沖液中。該“經(jīng)活化的”凝膠通過在與松弛素混合之前，在34℃下，將該經(jīng)消毒的4%凝膠放至熒光盒中24小時(shí)來制備。
研究方案表Ⅺ列出各種的配方中的條件、成分和組成。
表Ⅺ在該研究中所用的松弛素配方的組分配方甲基纖維素其它成分暴露至光下13%…-23%…+33%…+43%0.5%抗壞血酸+抗壞血酸(原)料(奧爾德里奇化學(xué)公司)53%0.2焦亞硫酸鹽+(費(fèi)希爾科學(xué)公司)63%20%丙三醇(馬林克羅特)73%20%乙醇(馬林克羅特)83%(經(jīng)活化的)…該松弛素溶液以1毫克/毫升提供，并通過-Amicon超過濾單元的濃縮至2毫克/毫升。該樣品通過根據(jù)體積比1∶4混合該2毫克/毫升在pH值為5的10毫摩爾/升檸檬酸鹽緩沖液中的松弛素濃縮液和4%甲基纖維素凝膠制備。將該溶液和4%凝膠分別分配至2個(gè)注射器中，且通過推動(dòng)該注射器前后20次通過一碰撞連接器，如上所述來進(jìn)行。在與該凝膠混合之前將抗壞血酸和焦亞硫酸鹽放在該松弛素溶液中混合。將最后凝膠制劑以近于0.25毫升部分分配至經(jīng)消毒的1.5毫升玻璃HPLC管形瓶中。將該管形瓶蓋頂密封，并在熒光下豎直放進(jìn)在5℃下的冷的房間內(nèi)。在配方＃1和＃8中的樣品用箔遮蓋，同時(shí)將在配方＃3中的樣品略微真空化，并再充滿氮。
在該凝膠中的松弛素的降解通過RP-HPLC來定量。由于該凝膠的粘度阻止了該樣品直接應(yīng)用HPLC，因此它在注射前用配方緩沖液稀釋5倍。該色譜方法的條件如下測試儀HP1090L柱Vydac C4-300，4.6×150毫米流量1毫升/分波長214毫微米注射體積200微升溫度室溫流動(dòng)相(A)0.1%TFA(B)90%乙腈，0.1%TFA梯度速率在30分鐘內(nèi)從20%B增加至50%B結(jié)果表Ⅻ列出顯示在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)檢測的主峰百分率的初始結(jié)果。
表Ⅻ在各凝膠配方中的松弛素穩(wěn)定性在各時(shí)間點(diǎn)的主峰百分率配方主峰百分率T＝0T＝5T＝11(天)對照物-光1009795.9對照放+光98.733.30對照物+光及N2壓頭空間 99.1 38.6 0
對照物+光+抗壞血酸1007354.4對照物+光+20%丙三醇10095.589.4對照物+光+20%乙醇1008559.7經(jīng)活化凝膠-光10095.890.9在11天之后，當(dāng)暴露至光下的對照物已完全降解時(shí)，避光的對照物保持96%其主峰面積。氮壓頭空間沒有減慢降解。0.5%抗壞血酸和20%乙醇顯示出穩(wěn)定松弛素接近同樣的程度。在11天時(shí)，保留的松弛素的百分率在55和60%之間。得到最好的結(jié)果為具有20%丙三醇配方在11天暴露至光下之后，得到90%主峰，該“經(jīng)活化的”凝膠樣品顯示甚至在受保護(hù)避光時(shí)，活性蛋白質(zhì)損失9%。與反的對照物(簡單的受保護(hù)免于光干擾的凝膠配方)比較，證明凝膠“活化”加速了蛋白質(zhì)的降解。這意味著在制備該凝膠本身時(shí)，不要過多暴露在光下。來自含有焦亞硫酸鹽的結(jié)果未顯示出，因?yàn)樵谶@些樣品中不能檢測該松弛素峰，且它從研究開始連續(xù)下降。焦亞硫酸鹽與松弛素反應(yīng)，導(dǎo)致失去全部蛋白質(zhì)是可能的。
暴露至光下含有在引發(fā)降解過程中重要作用在這些實(shí)驗(yàn)中是明顯的。在該配方中20%丙三醇非常有效地保護(hù)松弛素免于誘導(dǎo)的氧化。在一較小的程度，抗壞血酸和乙醇也穩(wěn)定該配方。在該分析中的乙醇的效果可能被低估，因?yàn)樵诩谆w維素粉末分散時(shí)，所加入的很大部分可能已蒸去。丙三醇、乙醇和抗壞血酸的合用可提供附加的穩(wěn)定性。
上面結(jié)果顯示出在甲基纖維素凝膠中的松弛素的光氧化通過其中的丙三醇、乙醇或抗壞血酸的混合可有效地阻止。一具有可接受的貨架壽命的最終配方可通過利用這些輔劑的優(yōu)點(diǎn)及保護(hù)該產(chǎn)品免于過多暴露至光下來設(shè)計(jì)。
權(quán)利要求
1.一種具有生物學(xué)活性的藥物組合物，其特征在于，該組合物包括于可將該組合物的pH值維持于4至7左右的緩沖劑之中存在有效數(shù)量的人類松弛類。
2.如權(quán)利要求1所述之組合物，其特征在于，其中pH范圍為自4左右至6左右。
3.如權(quán)利要求1或2所述之組合物，其特征在于，所述緩沖劑為檸檬酸鹽或乙酸鹽緩沖劑。
4.如權(quán)利要求1、2或3所述之組合物，其特征在于，該組合物進(jìn)一步包括堿金屬或堿土金屬或糖醇。
5.如權(quán)利要求1至4所述之組合物，其特征在于，該組合物進(jìn)一步包括多羥糖醇、乙醇或聚丙二醇(prelypropylene glycol)。
6.如權(quán)利要求1至5所述之組合物，其特征在于，該組合物為凝膠態(tài)的。
7.如權(quán)利要求6所述之組合物，其特征在于，該組合物進(jìn)一步包括一種水溶性的多糖或聚1，2-亞乙基二醇。
8.如權(quán)利要求7所述之組合物，其特征在于，該組合物中所述之多糖為甲基纖維素，含量為2-5%左右，而松弛素的含量為100-1000μg/每ml凝膠左右。
9.如權(quán)利要求6至8所述之組合物，其特征在于，該組合物進(jìn)一步包括抗氧劑或助溶劑或兩者之混合物。
10.如權(quán)利要求9所述之組合物，其特征在于，所述之抗氧劑及/或助溶劑為抗壞血酸、乙醇或甘油或它們的混合物。
全文摘要
本發(fā)明提供一種人類松弛素的藥物組合物，其特征為該組合物的酸度為pH4左右至7左右的范圍。用于引產(chǎn)或阻止早產(chǎn)的該組合物包括可將該組合物維持于所需pH范圍的緩沖劑及可使該組成物成為等滲的藥劑，必要時(shí)還可加入穩(wěn)定劑。作為一個(gè)特例，本發(fā)明提供了一種溶于檸檬酸鹽的緩沖液(pH5.0左右)的人類松弛素配方，其中存在氯化鈉，離子強(qiáng)度大約為0.15μ。
文檔編號A61K47/00GK1035619SQ8910094
公開日1989年9月20日 申請日期1989年2月25日 優(yōu)先權(quán)日1988年2月26日
發(fā)明者大衛(wèi)·C·西普拉, 吐·H·古揚(yáng), 斯蒂芬·J·喜兒 申請人:基因技術(shù)公司