類松弛素-2的合成
[0090] I、B鏈衍生物B-I與PySSPy反應(yīng)獲得B鏈衍生物B-2
[0091] 將實(shí)施例2中獲得的B鏈衍生物B-1，用2. 8L0.1 M NH4HCO3溶解，加入PySSPy (2, 2' -二吡啶二硫）（4. 2g，20mmol)，攪拌1小時，獲得B鏈衍生物B-2溶液，即：
[0092]
[0093] 2、B鏈衍生物B-2與A鏈衍生物A-2反應(yīng)，獲得A-B
[0094] 將步驟1中獲得的B鏈衍生物B-2溶液加入到實(shí)施例1中 制備的A鏈衍生物A-2水溶液中，室溫?cái)嚢?小時，獲得A-B，即：
[0095] 3、碘氧化A-B，獲得人類松弛素 -2粗品
[0096] 將碘（10. 2g，40mmol)用IL甲醇溶解后，加入到步驟2制備的溶液中，室溫?cái)嚢? 小時，得到人類松弛素-2的粗品溶液，即：
[0097]
[0098] 4、RP-HPLC純化，獲得人類松弛素-2精肽
[0099] 將步驟3中制備的人類松弛素-2粗品，旋干甲醇，過濾，采用Waters600RP_HPLC 系統(tǒng)，波長230nm，色譜柱為50 X 250mm反相C18柱，常規(guī)0. 2%TFA/乙腈流動相純化，收集目 的峰餾分，得到純度大于98. 5%的精肽。將精肽溶液采用Waters600RP-HPLC系統(tǒng)，色譜柱 為50 X 250mm反相C18柱，0. 2%醋酸溶液/乙腈流動相轉(zhuǎn)鹽，收集目的峰餾分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃 縮，凍干得到人類松弛素-2精肽36g，HPLC大于純度98. 5%，總收率為30% (以起始20mmol 計(jì)算)。
[0100] 實(shí)施例4 :人類松弛素-2的合成
[0101 ] I、A鏈衍生物A-2與PySSPy反應(yīng)獲得A鏈衍生物A-3
[0102] 將實(shí)施例1獲得的A鏈衍生物A-2，加入PySSPy (2, 2' -二吡啶二硫）（4. 2g， 20mmol )，攪拌1小時，獲得A鏈衍生物A-3溶液，即：
[0103]
[0104] 2、A鏈衍生物A-3與B鏈衍生物B-I反應(yīng)，獲得A-B
[0105] 將實(shí)施例2中制備的70g B鏈衍生物B-I用2. 5L水溶解，將步驟1中制備的A鏈 衍生物A-3溶液加入到B鏈衍生物B-I溶液中，室溫?cái)嚢?小時，獲得A-B，即：
[0106]
[0107] 3、碘氧化A-B，獲得人類松弛素-2粗品
[0108] 將碘（10. 2g，40mmol)用IL甲醇溶解后，加入到步驟2制備的溶液中，室溫?cái)嚢? 小時，得到人類松弛素-2的粗品溶液，即：
[0109]
[0110] 4、RP-HPLC純化，獲得人類松弛素-2精肽
[0111] 將步驟3中制備的人類松弛素-2粗品，旋干甲醇，過濾，采用Waters600RP-HPLC 系統(tǒng)，波長230nm，色譜柱為50 X 250mm反相C18柱，常規(guī)0. 2%TFA/乙腈流動相純化，收集目 的峰餾分，得到純度大于98. 5%的精肽。將精肽溶液采用Waters600RP-HPLC系統(tǒng)，色譜柱 為50 X 250mm反相C18柱，0. 2%醋酸溶液/乙腈流動相轉(zhuǎn)鹽，收集目的峰餾分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃 縮，凍干得到人類松弛素-2精肽40g，HPLC大于純度98. 5%，總收率為33% (以起始20mmol 計(jì)算)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 人類松弛素-2的A鏈衍生物A-1，其具有如下所示的結(jié)構(gòu)， pGlu-Leu-Tyr-Ser-Ala-Leu-Ala-Asn-Lys-Cys-Cys(Acm)-His-Val-Gly-Cys-Thr-Lys -Arg-Ser-Leu-Ala-Arg-Phe-Cys-OH02. 制備權(quán)利要求1所述的A鏈衍生物A-I的方法，包括如下步驟： 1. Fmoc-Cys (Trt) -OH和樹脂反應(yīng)，獲得Fmoc-Cys (Trt)-樹脂，其中樹脂優(yōu)選為2-CTC 樹脂； 2. Fmoc-Cys (Trt)-樹脂采用逐一偶聯(lián)的方式偶聯(lián)Fmoc保護(hù)基團(tuán)的其他氨基酸，獲得 A鏈肽樹脂； 3. A鏈肽樹脂經(jīng)裂解反應(yīng)，獲得A鏈衍生物A-I。3. 人類松弛素-2的A鏈衍生物A-2,其具有如下所示的結(jié)構(gòu)，4. 制備權(quán)利要求3所述的A鏈衍生物A-2的方法，包括如下步驟： 1) 按照權(quán)利要求2所述的方法制備A鏈衍生物A-I; 2. A鏈衍生物A-I經(jīng)氧化獲得A鏈衍生物A-2。5. 人類松弛素-2的A鏈衍生物A-3,其具有如下所示的結(jié)構(gòu)，6. 制備權(quán)利要求5所述的A鏈衍生物A-3的方法，包括如下步驟： 1) 按照權(quán)利要求4所述的方法制備A鏈衍生物A-2 ; 2. A鏈衍生物A-2與2, 2' -二吡啶二硫PySSPy反應(yīng)，獲得A鏈衍生物A-3。7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中步驟2)所述的Fmoc保護(hù)基團(tuán)的其他氨基酸分 別為 Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Arg (pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser (tbu)-OH、 Fmoc-Arg (pbf)-OH、Fmoc-Lys(boc)-OH、Fmoc-Thr(tbu)-OH、Fmoc-Cys (Trt)-OH、 Fmoc-Gly-〇H、Fmoc-Val-OH、Fmoc-His (trt)-OH、Fmoc-Cys (Acm)-OH、Fmoc-Cys (Trt)-OH、 Fmoc-Lys (boc)-OH、Fmoc-Asn (trt)-OH、Fmoc-Ala-〇H、Fmoc-Leu-〇H、Fmoc-Ala-〇H、 Fmoc-Ser(tbu) -OH、Fmoc-Tyr(tbu)-OH、Fmoc-Leu-OH 和 pGlu-OH。8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中步驟3)中采用的裂解液為TFA:PHOH:PHSME:EDT: H20=80:5:5:2.5:5 (v:v)〇9. 人類松弛素-2的B鏈衍生物B-1，其具有如下所示的結(jié)構(gòu)， H-Asp-Ser-Trp-Met-Glu-Glu-Val-Ile-Lys-Leu-Cys(Acm)-Gly-Arg-Glu-Leu-Val-Ar g-Ala-Gln-IIe-Ala-IIe-Cys-Gly-Met-Ser-Thr-Trp-Ser-OH10. 制備權(quán)利要求9所述的B鏈衍生物B-I的方法，包括如下步驟： 1. Fmoc-Ser (tbu)-OH和樹脂反應(yīng)，獲得Fmoc-Ser (tbu)-樹脂，其中樹脂優(yōu)選為wang 樹脂； 2. Fmoc-Ser (tbu)-樹脂采用逐一偶聯(lián)的方式偶聯(lián)Fmoc保護(hù)基團(tuán)的其他氨基酸，獲得 B鏈肽樹脂； 3. B鏈肽樹脂經(jīng)裂解反應(yīng)，獲得B鏈衍生物B-I。11. 人類松弛素-2的B鏈衍生物B-2,其具有如下所示的結(jié)構(gòu)，12. 制備權(quán)利要求11所述的B鏈衍生物B-2的方法，包括如下步驟： 1) 按照權(quán)利要求10所述的方法制備B鏈衍生物B-I; 2. B鏈衍生物B-I與2, 2' -二吡啶二硫PySSPy反應(yīng)，獲得B鏈衍生物B-2。13. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中步驟2)所述的Fmoc保護(hù)基團(tuán)的其他氨基 酸分別為 Fmoc-Trp (Boc)-OH、Fmoc-Thr (tbu)-OH、Fmoc-Ser (tbu)-〇H、Fmoc_Met-〇H、 Fmoc-Gly--OH、 Fmoc-Cys(Trt)-OH、 Fmoc-Ile_OH、 Fmoc-Ala-OH、 Fmoc-IIe_OH、 Fmoc-Gln (trt) -OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg (Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Glu(OtBu) --OH> Fmoc-Arg(Pbf) -OH、Fmoc-Gly - OH、Fmoc-Cys(Acm) - OH、 Fmoc-Leu - OH、Fmoc-Lys (boc) - OH、Fmoc-Ile - OH、Fmoc-Val - OH、Fmoc-Glu(OtBu)- OH、Fmoc-Glu (OtBu) - OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Trp (Boc) -OH、Fmoc-Ser (tbu) -OH、 Fmoc-Asp(OtBu)-OH。14. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中步驟3)中采用的裂解液為TFA:PHOH:PHSME:ED T:H20=80:5:5:2. 5:5 (v:v)〇15. -種制備人類松弛素-2的方法，包括如下步驟： 1) 按照權(quán)利要求12所述的方法制備人類松弛素-2的B鏈衍生物B-2 ; 2) 按照權(quán)利要求4所述的方法制備人類松弛素-2的A鏈衍生物A-2 ; 3) 將步驟1)制備的B鏈衍生物B-2與步驟2)制備的A鏈衍生物A-2反應(yīng)，獲得具有 如下所示的A-B:4) 步驟3)獲得的A-B經(jīng)氧化獲得人類松弛素-2粗品； 5) 步驟4)獲得的人類松弛素-2粗品經(jīng)純化、轉(zhuǎn)鹽和凍干后獲得人類松弛素-2純品。16. -種制備人類松弛素-2的方法，包括如下步驟： 1) 按照權(quán)利要求6所述的方法制備人類松弛素-2的A鏈衍生物A-3 ; 2) 按照權(quán)利要求10所述的方法制備人類松弛素_2的B鏈衍生物B-I ; 3) 將步驟1)制備的A鏈衍生物A-3與步驟2)制備的B鏈衍生物B-I反應(yīng)，獲得具有 如下所示的A-B:4) 步驟3)獲得的A-B經(jīng)氧化獲得人類松弛素-2粗品； 5) 步驟4)獲得的人類松弛素-2粗品經(jīng)純化、轉(zhuǎn)鹽和凍干后獲得人類松弛素-2純品。17.根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的方法，其中步驟4)所述的氧化采用碘作為氧化劑。
【專利摘要】本發(fā)明屬于藥物合成技術(shù)領(lǐng)域，公開了人類松弛素-2的A鏈衍生物和B鏈衍生物以及由上述衍生物制備人類松弛素-2的方法，其中A鏈衍生物中的一對二硫鍵采用自然氧化法，并且采用PySSPy活化巰基，便于形成第二對二硫鍵，最后采用碘氧化形成第三對二硫鍵，成功避免了一步自然氧化法易產(chǎn)生錯位的二硫鍵。此外，本發(fā)明采用簡單、常用的巰基保護(hù)基，避免了采用Stbu等需要特殊切割試劑的巰基保護(hù)基，更有利于工業(yè)化生產(chǎn)。
【IPC分類】C07K1/04, C07K14/575, C07K1/06
【公開號】CN104892748
【申請?zhí)枴緾N201410076755
【發(fā)明人】肖慶, 潘俊鋒, 馬亞平, 袁建成
【申請人】深圳翰宇藥業(yè)股份有限公司
【公開日】2015年9月9日
【申請日】2014年3月4日