專利名稱：一種用于重組tPA衍生物的大規(guī)模包涵體復(fù)性純化技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，更具體地涉及對組織纖溶酶原激活劑的包涵體的復(fù)性純化技術(shù)。
背景技術(shù)：
大腸桿菌表達(dá)的組織纖溶酶原激活劑的包涵體變性及復(fù)性研究是蛋白質(zhì)包涵體復(fù)性及純化研究的難點(diǎn)問題。由于蛋白質(zhì)分子中大量二硫鍵的存在，使得其復(fù)性及純化工藝較為復(fù)雜，且成本較高。純化工藝的成本直接導(dǎo)致了藥品價(jià)位的居高不下。
對于大腸桿菌表達(dá)的以無活性的包涵體形式存在的重組蛋白質(zhì)，常用的復(fù)性方法是首先用高濃度的鹽酸胍或尿素將其變性溶解，之后通過變性劑的去除得到復(fù)性的重組蛋白質(zhì)。
在蛋白質(zhì)的復(fù)性過程中，同時(shí)存在兩種反應(yīng)蛋白質(zhì)的復(fù)性及無活性的聚合體的生成。為了獲得較好的復(fù)性效果，復(fù)性過程常常需要在較低的蛋白質(zhì)濃度條件下進(jìn)行。這樣蛋白質(zhì)復(fù)性時(shí)的溶液體積一般較大。有研究表明，重組tPA的復(fù)性常常需要在20ug/ml左右的濃度以下方能達(dá)到較高的復(fù)性效果。
另外，多數(shù)重組蛋白質(zhì)均含有二硫鍵，二硫鍵的正確配對對于重組蛋白質(zhì)的復(fù)性至關(guān)重要。二硫鍵的正確配對有助于整個(gè)蛋白質(zhì)分子的正確折疊，另一方面，蛋白質(zhì)分子多肽鏈的部分折疊也有助于相應(yīng)半胱氨酸殘基間的結(jié)合與二硫鍵的正確配對。為了提高二硫鍵的正確配對，常常需要加入氧化還原對(如一定配比的氧化型及還原型谷胱甘肽)。
目前常用的復(fù)性工藝中，重組tPA的濃度需要稀釋至較低濃度(如約10-100ug/ml)才能達(dá)到較好的復(fù)性結(jié)果，由于tPA或其衍生物分子中含有大量的二硫鍵(tPA含17對，tPA衍生物含9對)，在復(fù)性過程中需要添加氧化還原對以保證二硫鍵的正確配對。然而，由于氧化型及還原型谷胱甘肽價(jià)格很高(其中氧化型幾十美金/克)，如果在復(fù)性反應(yīng)的整個(gè)過程中均加入氧化還原試劑，將大大增加蛋白質(zhì)復(fù)性及純化過程的成本。
tPA是一種具有顯著療效和巨大應(yīng)用潛力的重組藥物，九十年代初開發(fā)成功的tPA衍生物也已投入市場。迄今為止，大多數(shù)基因工程藥物已在我國仿制成功，作為具有巨大商業(yè)價(jià)值的tPA，至今始終未能仿制成功，一個(gè)十分重要的因素在于生產(chǎn)工藝技術(shù)研究的不足和缺乏。由于tPA或其衍生物使用劑量很大，同時(shí)蛋白質(zhì)復(fù)性純化工藝十分復(fù)雜，因此，大規(guī)模、低成本的制備工藝，是tPA或其衍生物形成產(chǎn)品無法回避的必要條件。如何能夠降低純化與生產(chǎn)成本，成為這一重組蛋白質(zhì)能否投入應(yīng)用的十分重要的課題。
因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)低成本的tPA衍生物的復(fù)性純化技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種低成本的、使tPA衍生物等重組蛋白的復(fù)性的技術(shù)。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種蛋白質(zhì)復(fù)性方法，包括步驟(a)將目標(biāo)蛋白質(zhì)的包涵體溶解，離心獲得溶解有包涵體蛋白質(zhì)的上清液；(b)用第一復(fù)性液稀釋上清液，形成目標(biāo)蛋白質(zhì)的濃度為100-1000微克/毫升的第一稀釋溶液，其中，第一復(fù)性液含3-7M選自尿素或鹽酸胍的變性劑和緩沖液，pH7.5-9.0，并且第一復(fù)性液中所含的氧化型谷胱甘肽及還原型谷胱甘肽與目標(biāo)蛋白質(zhì)之比為4-10mmol谷胱甘肽0.1-1mg目標(biāo)蛋白，且還原型谷胱甘肽與氧化型谷胱甘肽的摩爾比為4-6∶0.8-1.2；(c)在20-28℃下，放置第一稀釋溶液16-24小時(shí)；(d)用第二復(fù)性液稀釋第一稀釋溶液，形成目標(biāo)蛋白質(zhì)的濃度為10-100微克/毫升的第二稀釋溶液，其中，第二復(fù)性液含0.1-2.5M尿素和緩沖液，pH7.5-9.0；(e)在20-28℃下，放置第二稀釋溶液16-24小時(shí)；(f)過濾第二稀釋溶液，將濾液體積超濾濃縮為原體積的1/8-1/40，獲得第一濃縮濾液；(g)過濾第一濃縮濾液，然后將濾液稀釋于3-7倍體積的pH調(diào)節(jié)緩沖液中，所述的pH調(diào)節(jié)緩沖液含有10-100mM醋酸堿土金屬鹽或醋酸銨，pH4.0-5.5；(h)過濾步驟(g)的稀釋溶液，將溶液體積超濾濃縮為原體積的1/3-1/10，獲得含有復(fù)性的目標(biāo)蛋白的第二濃縮濾液。
在另一優(yōu)選例中，第一復(fù)性液還含有0.5-1M精氨酸，第二復(fù)性液含有0.3-1M精氨酸。
在另一優(yōu)選例中，第一復(fù)性液中氧化型谷胱甘肽及還原型谷胱甘肽與目標(biāo)蛋白質(zhì)之比為4-6mmol谷胱甘肽0.2-0.8mg目標(biāo)蛋白。
在另一優(yōu)選例中，第一復(fù)性液中還原型谷胱甘肽與氧化型谷胱甘肽的摩爾比為4-6∶1。
在另一優(yōu)選例中，步驟(f)中使用孔徑為0.22-0.45um的濾膜或截留分子量為10Kd超濾膜；步驟(g)中使用的孔徑為0.22-0.45um的濾膜；且步驟(h)中使用截留分子量為10Kd的超濾膜。
在另一優(yōu)選例中，該方法還包括步驟(i)對第二濃縮液進(jìn)行離子交換柱層析純化，從而獲得純化的目標(biāo)蛋白。較佳地，所述的離子交換柱層析的條件是用洗脫溶液進(jìn)行兩次洗脫，即用含有0-1M精氨酸，0.1-1M NaCl的50mM醋酸銨，pH4.5-6.0的洗脫溶液及含有0.1-1M精氨酸，0.1-1M NaCl的50mM醋酸銨，pH5.5-7.0的洗脫溶液進(jìn)行洗脫。
在另一優(yōu)選例中，第一復(fù)性液的pH為8.0-9.0，所述變性劑的濃度為3-5M。
在另一優(yōu)選例中，步驟(g)中pH調(diào)節(jié)緩沖液中所述的pH為4.0-5.5。
在另一優(yōu)選例中，所述的目標(biāo)蛋白選自下組組織纖溶酶原激活劑、組織纖溶酶原激活劑衍生物、尿激酶、尿激酶原。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種對大腸桿菌表達(dá)的重組包涵體蛋白質(zhì)進(jìn)行分離的方法，它包括本發(fā)明上述的復(fù)性步驟和常規(guī)的純化步驟。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，意外地發(fā)現(xiàn)，在復(fù)性過程中，可以采用分段稀釋的方法，并且僅需第一次復(fù)性的條件中，即在tPA較高濃度(100-1000微克/升)以及較小溶液體積的情況下添加氧化還原對就可使保證二硫鍵的正確配對，并且使tPA蛋白質(zhì)分子正確折疊，沒有必要在更低濃度下添加氧化還原對，從而大幅縮減了氧化型及還原型谷胱甘肽使用量(減少90％)，在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
如本文所用，術(shù)語“tPA”或“組織纖溶酶原激活劑”指一種具有溶解血栓作用的蛋白質(zhì)分子，其蛋白質(zhì)分子的氨基酸序列以及cDNA編碼序列已知(見Pennica et al.，1983；Nature，301，214)。tPA蛋白質(zhì)分子量為67kDa，由指形區(qū)、表皮生長因子區(qū)、兩個(gè)三角區(qū)(K1及K2)以及蛋白酶活性區(qū)組成。
如本文所用，術(shù)語“tPA衍生物”或“組織纖溶酶原激活劑衍生物”指僅保留有tPA分子K2區(qū)及蛋白酶活性區(qū)的蛋白質(zhì)分子。這在眾多文獻(xiàn)和專利申請中有詳細(xì)的描述，例如美國專利5223256。
簡而言之，在本發(fā)明中，首先用8M尿素或7M鹽酸胍溶解重組蛋白質(zhì)包涵體，之后利用梯度稀釋的方法分步降低變性劑的濃度，以盡量減少蛋白質(zhì)分子間的重新聚合。在初次稀釋時(shí)，加入氧化還原對(如氧化型及還原型谷胱甘肽)，以促進(jìn)變性蛋白二硫鍵的正確復(fù)性。而在二次稀釋過程中則省去氧化還原對的加入。由于一定濃度的變性劑的存在，第一次稀釋時(shí)可以在較高蛋白質(zhì)濃度與較小體積的條件下進(jìn)行。在本發(fā)明中，包涵體溶解液與第一次稀釋、第二次稀釋的體積比約為1∶8-10∶60-100。因此，本發(fā)明的復(fù)性純化工藝大大降低了試劑的消耗，降低了成本，同時(shí)對于tPA衍生物重組蛋白質(zhì)的復(fù)性也取得了很好的復(fù)性效果。
具體而言，本發(fā)明的復(fù)性方法通常包括以下步驟(a)將目標(biāo)蛋白質(zhì)的包涵體溶解，離心獲得溶解有包涵體的上清液。
該步驟與本領(lǐng)域的常規(guī)方法相同，因此可以采用本領(lǐng)域常規(guī)方法的反應(yīng)條件。
(b)第一次稀釋。
在該步驟中，用第一復(fù)性液稀釋上清液，形成目標(biāo)蛋白質(zhì)的濃度為100-1000微克/毫升的第一稀釋溶液，其中，第一復(fù)性液含3-7M尿素和緩沖液，pH7.5-9.0，并且第一復(fù)性液中所含的氧化型谷胱甘肽及還原型谷胱甘肽與目標(biāo)蛋白質(zhì)之比為4-10mmol谷胱甘肽0.1-1mg目標(biāo)蛋白，且還原型谷胱甘肽與氧化型谷胱甘肽的摩爾比為4-6∶0.8-1.2。
(c)第一階段復(fù)性通常在室溫(20-28℃)下，緩慢攪拌第一稀釋溶液16-20小時(shí)。該步驟的條件與本領(lǐng)域現(xiàn)有方法基本相同。
(d)第二次稀釋該步驟與本領(lǐng)域的常規(guī)方法相同，因此可以采用本領(lǐng)域常規(guī)方法的反應(yīng)條件。
在一優(yōu)選例中，用第二復(fù)性液稀釋第一稀釋溶液，形成目標(biāo)蛋白質(zhì)的濃度為10-100微克/毫升的第二稀釋溶液，其中，第二復(fù)性液含0.1-2.5M尿素和緩沖液，pH7.5-9.0，但不必含有氧化型谷胱甘肽及還原型谷胱甘肽。
(e)第二階段復(fù)性通常室溫(20-28℃)下，緩慢攪拌第二稀釋溶液15-20小時(shí)。該步驟的條件與本領(lǐng)域現(xiàn)有方法基本相同。
(f)第一次濃縮該步驟與本領(lǐng)域的常規(guī)方法相同，因此可以采用本領(lǐng)域常規(guī)方法的反應(yīng)條件。通常，過濾第二稀釋溶液，將濾液體積超濾濃縮為原體積的1/8-1/40，獲得第一濃縮濾液。其中可用0.45/0.22um濾膜過濾，或選用截留分子量為10Kd超濾膜進(jìn)行超濾濃縮。
(g)調(diào)節(jié)pH至酸性該步驟與本領(lǐng)域的常規(guī)方法相同，因此可以采用本領(lǐng)域常規(guī)方法的反應(yīng)條件。
在另一優(yōu)選例中，可過濾第一濃縮濾液，然后將濾液稀釋于3-5倍體積的pH調(diào)節(jié)緩沖液中，所述的pH調(diào)節(jié)緩沖液含有10-100mM醋酸堿土金屬鹽或醋酸銨，pH4.0-5.5。
較佳地，步驟(g)中使用0.45/0.22um的濾膜。
(h)第二次濃縮該步驟與本領(lǐng)域的常規(guī)方法相同，因此可以采用本領(lǐng)域常規(guī)方法的反應(yīng)條件。通常，過濾步驟(g)的稀釋溶液，將溶液體積超濾濃縮為原體積的1/3-1/10，這樣，就獲得含有復(fù)性的目標(biāo)蛋白的第二濃縮濾液。
較佳地，步驟(h)中使用截留分子量為10Kd的超濾膜。
該含有復(fù)性的目標(biāo)蛋白的第二濃縮濾液即為本發(fā)明的蛋白質(zhì)復(fù)性產(chǎn)物。當(dāng)然，還可用本領(lǐng)域常規(guī)的純化方法，對復(fù)性產(chǎn)物進(jìn)行純化。這可用本領(lǐng)域常見的試劑和反應(yīng)條件進(jìn)行純化。一種優(yōu)選的方法是離子柱層析方法。
本發(fā)明不僅可用于大腸桿菌表達(dá)的重組組織纖溶酶原激活劑、組織纖溶酶原激活劑衍生物，還適用于重組尿激酶、尿激酶原等。
以tPA為例，本領(lǐng)域現(xiàn)有的各種生產(chǎn)tPA或其衍生物的大腸桿菌工程菌(如ATCC 53227等)都可用于本發(fā)明。在眾多文獻(xiàn)和專利中公開了生產(chǎn)tPA或其衍生物的大腸桿菌，例如美國專利H2,055(申請人ZymoGenetics，Inc.，申請?zhí)朅ppl.No.778203，申請日1985年9月20日)，美國專利6,027,888(申請人BoardofRegents，The University of Texas System，申請?zhí)?34516，申請日1997年4月4日)，美國專利5,106,741(申請人The Upjohn Company，申請?zhí)?14365；申請日1991年6月12日)。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(a)成本低，其中氧化型谷胱甘肽與還原型谷胱甘肽的用量下降了80-90％以上。整個(gè)復(fù)性工藝成本大幅度下降。
(b)復(fù)性效果好，與整個(gè)過程都使用氧化型谷胱甘肽與還原型谷胱甘肽的復(fù)性效果基本無差別。
(c)本發(fā)明的蛋白質(zhì)復(fù)性的工藝的適用面很廣，不僅可用于組織纖溶酶原激活劑、組織纖溶酶原激活劑衍生物，還適用于尿激酶、尿激酶原等。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1組織纖溶酶原激活劑的包涵體的復(fù)性取濕重10克的已純化tPA包涵體，溶解于1000ml變性溶液中(8M尿素或7M鹽酸胍，20mM DDT)，室溫?cái)嚢?-5小時(shí)后，15,000rpm離心50分鐘。
將離心上清液稀釋至8-12升復(fù)性液I中(3-7M尿素，0.5-1M精氨酸，50mMTris·HCl，pH8.2-9.0，1-10mM還原型谷胱甘肽GSH，0.05-5mM氧化型谷胱甘肽GSSG)。室溫?cái)嚢柽^夜后，0.45μm濾膜過濾。
將濾液稀釋到80-120立升復(fù)性液II中(0.1-2.5M尿素，0.3-1M精氨酸，50mMTris·HCl，pH8.2-9.0)。在室溫復(fù)性16-20小時(shí)。
過濾(濾膜規(guī)格0.22um)，濾液用10K-Millipore超濾膜超濾濃縮至3-10立升，獲得第一濃縮液。
用0.45μm濾膜過濾第一濃縮液，濾液稀釋到15-30立升pH調(diào)節(jié)緩沖液中(10-100mM醋酸銨pH4.0-5.5)。
0.22μm濾膜過濾，用10K-Millipore超濾膜超濾濃縮至3-10立升，獲得含組織纖溶酶原激活劑的第二濃縮液。全部用于實(shí)施例2。
實(shí)施例2組織纖溶酶原激活劑的包涵體的純化在本實(shí)施例中，用常規(guī)的離子柱層析方法對實(shí)施例1制備的含組織纖溶酶原激活劑的第二濃縮液進(jìn)行純化。
方法將實(shí)施例1獲得的復(fù)性樣品上Pharmacia SP-Sepharose Fast Flow柱，上樣后用洗脫溶液I(含有0-1M NaCl的50mM醋酸銨pH4.0-5.0)洗脫，之后再用洗脫溶液II(含有0-1M精氨酸，0.1-1M NaCl的50mM醋酸銨pH4.5-6.0)及洗脫溶液III(含有0.1-1M精氨酸，0.1-1M NaCl的50mM醋酸銨pH5.5-7.0)洗脫，得到純化的重組tPA衍生物。
結(jié)果最終獲得150-200mg左右比活為40,000-200,000IU/mg蛋白質(zhì)的純化重組tPA衍生物。復(fù)性工藝中谷胱甘肽的使用量下降了90％，成本下降了一半以上。目標(biāo)蛋白質(zhì)回收率5-10％左右，與常規(guī)方法相同。
實(shí)施例3-5組織纖溶酶原激活劑的包涵體的復(fù)性重復(fù)實(shí)施例1，不同點(diǎn)在于改變實(shí)施例1中部分復(fù)性條件，如表1所示。
表1 復(fù)性條件

結(jié)果同樣最終獲得80-220mg左右比活為40,000-200,000IU/mg蛋白質(zhì)的純化重組tPA衍生物。復(fù)性工藝中谷胱甘肽的使用量下降了80-90％，成本下降了一半以上。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)復(fù)性方法，其特征在于，包括步驟(a)將目標(biāo)蛋白質(zhì)的包涵體溶解，離心獲得溶解有包涵體蛋白質(zhì)的上清液；(b)用第一復(fù)性液稀釋上清液，形成目標(biāo)蛋白質(zhì)的濃度為100-1000微克/毫升的第一稀釋溶液，其中，第一復(fù)性液含3-7M選自尿素或鹽酸胍的變性劑和緩沖液，pH7.5-9.0，并且第一復(fù)性液中所含的氧化型谷胱甘肽及還原型谷胱甘肽與目標(biāo)蛋白質(zhì)之比為4-10mmol谷胱甘肽∶0.1-1mg目標(biāo)蛋白，且還原型谷胱甘肽與氧化型谷胱甘肽的摩爾比為4-6∶0.8-1.2；(c)在20-28℃下，放置第一稀釋溶液16-24小時(shí)；(d)用第二復(fù)性液稀釋第一稀釋溶液，形成目標(biāo)蛋白質(zhì)的濃度為10-100微克/毫升的第二稀釋溶液，其中，第二復(fù)性液含0.1-2.5M尿素和緩沖液，pH7.5-9.0；(e)在20-28℃下，放置第二稀釋溶液16-24小時(shí)；(f)過濾第二稀釋溶液，將濾液體積超濾濃縮為原體積的1/8-1/40，獲得第一濃縮濾液；(g)過濾第一濃縮濾液，然后將濾液稀釋于3-7倍體積的pH調(diào)節(jié)緩沖液中，所述的pH調(diào)節(jié)緩沖液含有10-100mM醋酸堿土金屬鹽或醋酸銨，pH4.0-5.5；(h)過濾步驟(g)的稀釋溶液，將溶液體積超濾濃縮為原體積的1/3-1/10，獲得含有復(fù)性的目標(biāo)蛋白的第二濃縮濾液。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，第一復(fù)性液還含有0.5-1M精氨酸，第二復(fù)性液含有0.3-1M精氨酸。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，第一復(fù)性液中氧化型谷胱甘肽及還原型谷胱甘肽與目標(biāo)蛋白質(zhì)之比為4-6mmol谷胱甘肽∶0.2-0.8mg目標(biāo)蛋白。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，第一復(fù)性液中還原型谷胱甘肽與氧化型谷胱甘肽的摩爾比為4-6∶1。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(f)中使用孔徑為0.22-0.45um的濾膜或截留分子量為10Kd超濾膜；步驟(g)中使用的孔徑為0.22-0.45um的濾膜；且步驟(h)中使用截留分子量為10Kd的超濾膜。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還包括步驟(i)對第二濃縮液進(jìn)行離子交換柱層析純化，從而獲得純化的目標(biāo)蛋白。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的離子交換柱層析的條件是用洗脫溶液進(jìn)行兩次洗脫，即用含有0-1M精氨酸，0.1-1M NaCl的50mM醋酸銨，pH4.5-6.0的洗脫溶液及含有0.1-1M精氨酸，0.1-1M NaCl的50mM醋酸銨，pH5.5-7.0的洗脫溶液進(jìn)行洗脫。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，第一復(fù)性液的pH為8.0-9.0，所述變性劑的濃度為3-5M。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(g)中pH調(diào)節(jié)緩沖液中所述的pH為4.0-5.5。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的目標(biāo)蛋白選自下組組織纖溶酶原激活劑、組織纖溶酶原激活劑衍生物、尿激酶、尿激酶原。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種蛋白質(zhì)復(fù)性方法，包括步驟(a)將目標(biāo)蛋白質(zhì)的包涵體溶解，離心獲得溶解有包涵體蛋白質(zhì)的上清液；(b)用第一復(fù)性液稀釋，其中第一復(fù)性液含氧化還原對；(c)放置一段時(shí)間；(d)用第二復(fù)性液稀釋，第二復(fù)性液不含氧化還原對；(e)放置一段時(shí)間；(f)過濾、濃縮，獲得第一濃縮濾液；(g)過濾，然后將濾液稀釋于pH調(diào)節(jié)緩沖液中，調(diào)節(jié)pH至4.0－5.5；(h)過濾步驟(g)的稀釋溶液，濃縮獲得含有復(fù)性的目標(biāo)蛋白的第二濃縮濾液。本發(fā)明復(fù)性方法成本低，用于大腸桿菌表達(dá)的重組tPA或其衍生物的低成本的重組蛋白質(zhì)。
文檔編號C12N9/72GK1613869SQ20031010842
公開日2005年5月11日 申請日期2003年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月5日
發(fā)明者張毅, 陸堅(jiān)峰, 楊勝利, 褚仲梅, 劉成, 屈賢銘 申請人:上海中科伍佰豪生物工程有限公司