專利名稱：大白菜冷相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子蛋白編碼序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種蛋白編碼序列，特別是一種大白菜冷相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子蛋白編碼序列，屬于基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
低溫是限制我國(guó)作物地理分布和產(chǎn)量的重要因素，在生理上造成根系對(duì)葉片水分供應(yīng)的減少，導(dǎo)致作物的生長(zhǎng)延遲，嚴(yán)重地影響了作物的品質(zhì)和產(chǎn)量。當(dāng)植物受到低溫脅迫后，植物體內(nèi)的一些內(nèi)源激素會(huì)發(fā)生顯著的變化，從而進(jìn)一步引發(fā)細(xì)胞骨架排列的改變，以便提高作物的抗低溫的能力。當(dāng)前，一些低溫轉(zhuǎn)錄因子在提高作物抗低溫脅迫方面起著重要作用，而且在試驗(yàn)中取得了良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。為此，我們選定克隆低溫轉(zhuǎn)錄因子作為提高作物抗低溫脅迫的主攻方向。轉(zhuǎn)錄因子是一些能夠與特定基因的轉(zhuǎn)錄區(qū)域結(jié)合并能誘導(dǎo)這些基因表達(dá)的特異蛋白，它往往調(diào)控的是很多基因或者是基因家族。甘藍(lán)型油菜中的Bn26轉(zhuǎn)錄因子就是一個(gè)低溫脅迫的轉(zhuǎn)錄因子，它能夠明顯地提高植物的抗低溫能力。利用RACE(Rapid Amplificationof cDNA Ends，cDNA末端迅速擴(kuò)增)PCR技術(shù)我們從大白菜中克隆了該基因，根據(jù)GeneBank的搜索結(jié)果，將該基因命名為冷相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子。
在對(duì)現(xiàn)有文獻(xiàn)的分析中，雖然“Plant Physiol(植物生理學(xué))，1993，101171-177”對(duì)甘藍(lán)型油菜的低溫轉(zhuǎn)錄蛋白的功能已經(jīng)做了充分肯定，指出該基因在低溫脅迫下能夠增強(qiáng)表達(dá)，但沒有轉(zhuǎn)基因植株的抗冷性鑒定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，至今尚未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明主題有密切聯(lián)系文獻(xiàn)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種大白菜冷相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子蛋白編碼序列。本發(fā)明公開了與大白菜低溫轉(zhuǎn)錄因子密切相關(guān)的蛋白的氨基酸序列以及大白菜冷相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因的核酸序列，及其在利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良植物抗低溫的應(yīng)用。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的在本發(fā)明所分離出的DNA分子，該分子包括編碼具有大白菜冷相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸第70-456位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在45-55℃條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸第70-456位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸第70-456位的核苷酸序列。
本發(fā)明分離出的大白菜低溫轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)蛋白質(zhì)多肽，它包括具有SEQ ID NO.3氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.3序列的多肽。
本發(fā)明所提供的載體，它包含上述的DNA分子。一種核酸分子，它包含所述的DNA分子中8-100個(gè)連續(xù)核苷酸。
本發(fā)明用上述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，它是真核細(xì)胞。在實(shí)例中該宿主細(xì)胞是擬南芥。
在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組分分開，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。
在本發(fā)明中，術(shù)語“大白菜低溫轉(zhuǎn)錄因子蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有大白菜低溫轉(zhuǎn)錄因子蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中第70-456位核苷酸序列及其簡(jiǎn)并序列。該簡(jiǎn)并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的編碼框第70-456位核苷酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，所以與SEQ ID NO.3中第70-456位核苷酸序列同源性低至約70％的簡(jiǎn)并序列也能編碼出SEQ ID NO.3所述的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳的在高度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸第70-456位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語還包括與SEQ ID NO.3中從核苷酸第70-456位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
該術(shù)語還包括能編碼具有與天然的大白菜低溫轉(zhuǎn)錄因子相同功能的蛋白的SEQ ID NO.3中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-90個(gè)，較佳地1-60個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以內(nèi)，較佳地為30個(gè)以內(nèi)，更佳地為10個(gè)以內(nèi)，最佳地為5個(gè)以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，術(shù)語“大白菜低溫轉(zhuǎn)錄因子”指具有大白菜低溫轉(zhuǎn)錄因子蛋白活性的SEQ ID NO.3序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與天然大白菜低溫轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)相同功能的、SEQ ID NO.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括大白菜低溫轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)蛋白的活性片段和活性衍生物。
本發(fā)明的大白菜低溫轉(zhuǎn)錄因子多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊條件下能與大白菜低溫轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用大白菜低溫轉(zhuǎn)錄因子多肽的血清獲得的多肽或蛋白。
在本發(fā)明中，“大白菜低溫轉(zhuǎn)錄因子保守性變異多肽”指與SEQ ID NO.3的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)氨基酸性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行替換而產(chǎn)生。
表1


表299％ identity in 339 nt overlapQuery124 agcggcgtagccaagcagagcggcgttggcgccgtcagatttggccggaaaactgagctc 183||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct107 agcggcgtagccaagcagagcggcgttggcgccgtcagatttggccggaaaactgagctc 166S G V A K Q S G V G A V R F G R K T E LQuery184 gttgtcgtcgctcagcgcaagaagtcgttgatctacgccgagaaaggtgatggaaacatt 243||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct167 gttgtcgtcgctcagcgcaagaagtcgttgatctacgccgagaaaggtgatggaaacatt 226V V V A Q R K K S L I Y A E K G D G N IQuery244 ctcgatgacatcaatgaggccacaaagagagcttcagattacgtgacagacaagacaaag 303||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct227 ctcgatgacatcaatgaggccacaaagagagcttcagattacgtgacagacaagacaaag 286L D D I N E A T K R A S D Y V T D K T KQuery304 gaggcgttgaaagatggagagaaagcaaaagactacgttgatgagaaaaacgttgaagcc 363||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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表394％ identity in 128aa overlap，94％ similarity in 632aa overlapQuery1 MAMSFSGAVLSGINSSFPSGVAK------QSGVGAVRFGRKTELVVVAQRKKSLIYAEKG 54MAMSFSGAVLSGINSSFPSGVAK QSGVGAVRFGRKTELVVVAQRKKSLIYAEKGSbjct1 MMAMSFSGAVLSGINSSFPSGVAKKSGVAKQSGVGAVRFGRKTELVWAQRKKSLIYAEKG 60Query55 DGNILDDINEATKRASDYVTDKTKEALKDGEKAKDYVDEKNVEAKDTTLDEAQKVLDYVK 114DGNILDDINEATKRASDYVTDKTKEALKDGEKAKDYVDEKNVEAKDT LDEAQKVLDYVKSbjct61 DGNILDDINEATKRASDYVTDKTKEALKDGEKAKDYVDEKNVEAKDTALDEAQKVLDYVK 120Query115 EKGNEAGEDKDTTKA 129EKGNEAGEDKDTTKASbjct121 EKGNEAGEDKDTTKA 135Query大白菜大白菜低溫轉(zhuǎn)錄因子蛋白冷相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列Sbjct甘藍(lán)型油菜低溫調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因蛋白氨基酸序列(JQ2281)
表3為本發(fā)明的大白菜低溫轉(zhuǎn)錄因子蛋白(冷相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子)與冷相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列的同源比較(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在兩個(gè)序列之間用氨基酸單字符標(biāo)出。
發(fā)明還包括大白菜低溫轉(zhuǎn)錄因子蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然低溫轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒，粘粒等。在生產(chǎn)本發(fā)明的大白菜低溫轉(zhuǎn)錄因子多肽時(shí)，可以將大白菜低溫轉(zhuǎn)錄因子編碼序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，從而形成大白菜低溫轉(zhuǎn)錄因子蛋白表達(dá)載體。
如本發(fā)明所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號(hào)肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號(hào)肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動(dòng)子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時(shí)，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對(duì)于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細(xì)胞”為真核細(xì)胞。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、煙草細(xì)胞和其它植物細(xì)胞。
還可用Northern印跡法技術(shù)分析大白菜低溫轉(zhuǎn)錄因子基因產(chǎn)物的表達(dá)，即分析大白菜低溫轉(zhuǎn)錄因子的RNA轉(zhuǎn)錄物在細(xì)胞中的存在與否和數(shù)量。
此外，本發(fā)明中可用作探針的核酸分子，該分子通常具有大白菜低溫轉(zhuǎn)錄因子核苷酸編碼序列的8-100個(gè)連續(xù)核苷酸，較佳地具有15-50個(gè)連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測(cè)樣品中是否存在編碼大白菜低溫轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的核酸分子。
本發(fā)明涉及檢測(cè)樣品中是否存在大白菜低溫轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測(cè)探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對(duì)應(yīng)于大白菜低溫轉(zhuǎn)錄因子關(guān)核苷酸編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長(zhǎng)度一般為15-50個(gè)核苷酸。
此外，根據(jù)本發(fā)明的大白菜低溫轉(zhuǎn)錄因子核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表達(dá)蛋白質(zhì)的同源性基礎(chǔ)上，篩選大白菜低溫轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)同源基因或同源蛋白。
為了得到與大白菜低溫轉(zhuǎn)錄因子基因相關(guān)的大白菜cDNAs的點(diǎn)陣，可以用DNA探針篩選大白菜cDNA文庫，這些探針是在低嚴(yán)緊條件下，用32P對(duì)大白菜低溫轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的全部或部分做放射活性標(biāo)記而得的。最適合于篩選的cDNA文庫是來自大白菜的文庫。構(gòu)建來自感興趣的細(xì)胞或者組織的cDNA文庫的方法是分子生物學(xué)領(lǐng)域眾所周知的。另外，許多這樣的cDNA文庫也可以購(gòu)買到，例如購(gòu)自Clontech，Stratagene，Palo Alto，Cal.。這種篩選方法可以識(shí)別與大白菜低溫轉(zhuǎn)錄因子基因家族的核苷酸序列。
本發(fā)明的大白菜低溫轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
除了用重組法產(chǎn)生之外，本發(fā)明蛋白的片段還可用固相技術(shù)，通過直接合成肽而加以生產(chǎn)(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WHFreeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 852149-2154)。在體外合成蛋白質(zhì)可以用手工或自動(dòng)進(jìn)行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成儀(Foster City，CA)來自動(dòng)合成肽?？梢苑謩e化學(xué)合成本發(fā)明蛋白的各片段，然后用化學(xué)方法加以連接以產(chǎn)生全長(zhǎng)的分子。
利用本發(fā)明的大白菜低溫轉(zhuǎn)錄因子蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與大白菜低溫轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)發(fā)生相互作用的物質(zhì)，或者受體、抑制劑或拮劑等。
本發(fā)明中，低溫轉(zhuǎn)錄因子在抗低溫中起關(guān)鍵作用，能夠明顯體地提高作物的抗寒性。植物在生長(zhǎng)的過程中會(huì)遇到冷害等逆境，本發(fā)明的低溫轉(zhuǎn)錄因子基因冷相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子正具備這項(xiàng)功能，它能在逆境下增強(qiáng)植物對(duì)低溫的抗性。因此，本發(fā)明具有很大的應(yīng)用價(jià)值。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)室具體的試驗(yàn)數(shù)據(jù)和具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1970)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1大白菜低溫轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆1.組織分離(isolation)大白菜(品種為“日喀則一號(hào)”)，將大白菜置于28℃發(fā)芽24小時(shí)，然后播種于溫室中，待大白菜葉片為4-5片時(shí)，準(zhǔn)備抽取DNA或RNA。
2.RNA的分離(RNA isolation)取部分組織，用研缽研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP管，充分振蕩后，再移入玻璃勻漿器內(nèi)。勻漿后移至1.5mL EP管中，抽提總RNA(TRIzol Reagents，GIBCO BRL，USA)。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量，然后在分光光度計(jì)上測(cè)定RNA含量。
3.基因的全長(zhǎng)克隆(Cloning of Full-length cDNA)根據(jù)低溫轉(zhuǎn)錄因子基因的氨基酸保守序列，利用同源性基因克隆原理，采用RACE方法(GibcoBRL試劑盒)進(jìn)行cDNA全長(zhǎng)克隆，分三個(gè)階段進(jìn)行
(1)RT-PCRPCR[BP001(SEQ ID NO.1)+BP002(SEQ ID NO.2)]得到2002BP(約0.5kb)，回收，連接到pGEMT-Easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，采用終止物熒光標(biāo)記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377測(cè)序儀(Perkin-Elmer，USA)上進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用GCG軟件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數(shù)據(jù)庫(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及編碼蛋白與已知十字花科植物如擬南芥(Arabidopsis thaliana)低溫轉(zhuǎn)錄因子基因的同源性很高，故初步認(rèn)為它是一個(gè)與低溫調(diào)節(jié)相關(guān)的基因。
(2)3’-RACEPCR[AP+BP003(5’-GGAGGCGTTGAAAGATGGAG-3’)]得到2002BP3’(300bp左右)，回收，連接到T-Easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，采用終止物熒光標(biāo)記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377測(cè)序儀(Perkin-Elmer，USA)上進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用GCG軟件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數(shù)據(jù)庫(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及編碼蛋白與已知十字花科植物如擬南芥(Arabidopsis thaliana)光合氧釋放基因的同源性很高，故初步認(rèn)為它是一個(gè)與低溫轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)基因。
(3).5’-RACE第一輪PCR[AAP+BP004(5’-TCGGCGTAGA TCAACGACTT C--3’)]第二輪PCR[(AUAP+BPR005(5’-GACGGCGCCA ACGCCGCTCT-3’))得到2001BP 5’(約300bp)(過程同(1))將測(cè)序結(jié)果的重疊區(qū)拼接，發(fā)現(xiàn)過程(1)得到的片段既是該基因的完整編碼區(qū)。
BLAST的結(jié)果證明從大白菜中新得到的基因確為一個(gè)與植物低溫轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的基因。
通過組合使用上述3種方法，獲得了候選的大白菜低溫轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)蛋白的全長(zhǎng)編碼序列(SEQ ID NO.3)。
實(shí)施例2大白菜低溫轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)基因的序列信息與同源性分析本發(fā)明新的大白菜低溫轉(zhuǎn)錄因子全長(zhǎng)cDNA的長(zhǎng)度為572bp，詳細(xì)序列見SEQ IDNO.3，其中開放讀框位于70-456位核苷酸(129個(gè)核苷酸)。根據(jù)全長(zhǎng)cDNA推導(dǎo)出大白菜低溫轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列，共129個(gè)氨基酸殘基，分子量為49.18kDa，等電點(diǎn)(pI)為5.19。詳細(xì)序列見SEQ ID NO.3。
將大白菜低溫轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的全長(zhǎng)cDNA序列及其編碼蛋白質(zhì)用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行核苷酸和蛋白質(zhì)同源性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與甘藍(lán)型油菜低溫調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子124-464bp，(S68727)在核苷酸水平上具有99％的相同性，(附表2)；在氨基酸水平上，它與甘藍(lán)型油菜低溫調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因蛋白(S68727)也有94％的相同性(附表3)。由此可見，大白菜低溫轉(zhuǎn)錄因子基因冷相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子與甘藍(lán)型油菜低溫調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因蛋白無論從核酸還是蛋白水平上都存在較高的同源性。甘藍(lán)型油菜低溫調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因蛋白已經(jīng)初步被證明與低溫轉(zhuǎn)錄因子中低溫調(diào)節(jié)作用，故可以認(rèn)為冷相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)低溫上也具有相似的作用。
實(shí)施例3大白菜低溫轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)蛋白或多肽在擬南芥中進(jìn)行真核細(xì)胞表達(dá)及轉(zhuǎn)基因植株的抗逆性鑒定含目的基因(大白菜冷相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因)的表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)大白菜低溫轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的全長(zhǎng)序列(SEQ ID NO.3)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整編碼閱讀框的引物，并在上游和下游引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(這可視選用的載體而定)，以便構(gòu)建表達(dá)載體。以實(shí)施例1中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將大白菜低溫轉(zhuǎn)錄因子基因cDNA克隆至中間載體(如pBluescript)，進(jìn)一步克隆到雙元表達(dá)載體(如pBI121和改進(jìn)的pCAMBIA2300)，在保證閱讀框架正確的前提下鑒定好的表達(dá)載體，再將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，利用葉盤法技術(shù)轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥。
1.發(fā)苗種子用無菌水漂洗15-20分鐘，再用70％的乙醇消毒1分鐘，然后用0.1％升汞消毒10-12分鐘。最后再用無菌水沖洗5遍。將洗好的種子用吸水紙吸干，放入MS培養(yǎng)基。光照培養(yǎng)5天，待苗長(zhǎng)到4-5厘米便可以剪苗。
2.剪苗剪取0.5-1厘米的下胚軸小片段放入預(yù)培養(yǎng)基，培養(yǎng)2天。
預(yù)培養(yǎng)基MS+6BA(0.2mg/l)+2.4D(1.2mg/l)
3.轉(zhuǎn)化共培養(yǎng)將預(yù)培養(yǎng)2天的下胚軸放入事先培養(yǎng)好的菌液中(OD值0.4-0.6)侵染3-5分鐘。接著取出放入預(yù)培養(yǎng)基暗培養(yǎng)2天。
4.篩選培養(yǎng)共培養(yǎng)結(jié)束后，將外植體放入篩選培養(yǎng)基。2周繼代一次。2-4周有愈傷組織形成和芽的分化。待綠芽長(zhǎng)到2厘米后，切下生根。
篩選培養(yǎng)基MS+6BA(4.5mg/l)+NAA(0.1mg/l)+AgNO3(6mg/l)+cb(250mg/l)+Kan(20mg/l)生根培養(yǎng)基MS+NAA(0.5mg/l)+cb(250mg/l)+Kan(5mg/l)5.轉(zhuǎn)化植株培養(yǎng)；待根系發(fā)達(dá)后，將植株取出，用無菌水洗凈附著的固體培養(yǎng)基，移入土壤中，剛開始用玻璃罩罩幾天，待植株健壯后再取下玻璃罩，溫室中培養(yǎng)。
含大白菜冷相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的抗逆性鑒定鑒于編碼冷相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子抗低溫的作用，在進(jìn)一步對(duì)含大白菜冷相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株進(jìn)行性鑒定。我們利用RT-PCR和Northern blot對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了檢測(cè)，兩種方法均證明目的基因已經(jīng)整合到擬南芥的基因組中。我們以正常的擬南芥為對(duì)照，對(duì)轉(zhuǎn)低溫轉(zhuǎn)錄因子基因的擬南芥植株進(jìn)行冷凍及低溫脅迫實(shí)驗(yàn)。冷凍實(shí)驗(yàn)是將正常植株和轉(zhuǎn)冷相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因的擬南芥植株在-5℃處理1小時(shí)，然后觀察它們恢復(fù)正常生長(zhǎng)的情況。低溫脅迫實(shí)驗(yàn)也是將上述兩種類型的植株置于4℃(光照/黑暗為16小時(shí)/8小時(shí))的環(huán)境中，觀察它們的生長(zhǎng)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明轉(zhuǎn)冷相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因植株在抗上述逆境方面上均強(qiáng)于未轉(zhuǎn)該基因的植株。這證明冷相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因?qū)σ话愕睦浜暗蜏孛{迫具有抗性，大白菜冷相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因?qū)⒖捎糜诶棉D(zhuǎn)基因技術(shù)改良植物抗低溫的研究和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中。
大白菜低溫轉(zhuǎn)錄因子基因冷相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子在大白菜中的拷貝數(shù)分析采用常規(guī)方法從大白菜葉片中提取DNA(參考《分子克隆》，Sambrook等，1970)，分別用BamH I，EcoRI，Xba I和HindIII酶切DNA[13μg(微克)/樣品]后，將DNA轉(zhuǎn)至雜交膜(尼龍膜)上后。使用Amersham Pharmacia公司Gene ImagesTMContents CDP-StarTMlabelling module(PRN3540)，我們將BcpFLC基因編碼區(qū)標(biāo)記為探針，然后進(jìn)行雜交(于60℃雜交16小時(shí))。取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，1％SDS)中，于60℃漂洗3次，每次15分鐘。轉(zhuǎn)入洗膜液II(0.1*SSC，1％SDS)中于60℃漂洗3次，每次同樣15分鐘。用X光片壓片60-90分鐘，然后顯影、定影(方法參照Roche DIG labeled試劑盒說明書)。結(jié)果(Southern blot)發(fā)現(xiàn)在雜交膜上出現(xiàn)2-4雜交條帶，說明冷相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因在大白菜中屬于低拷貝基因。
大白菜低溫轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)基因冷相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子在大白菜中的表達(dá)譜分析1.RNA的提取將大白菜“日喀則一號(hào)”(溫室播種，溫度設(shè)置為25-26℃，光照時(shí)間為16小時(shí))。待葉片長(zhǎng)到2-3片葉時(shí)抽取大白菜嫩葉的RNA。以正常生長(zhǎng)的植株作為對(duì)照，以4℃處理8、16、24和48小時(shí)的植株為分析對(duì)象，利用TRIzol試劑盒(GIBCO BRL，USA)提取并參考《分子克隆》有關(guān)RNA的制備章節(jié)(Sambrook等，1970)。
2.RNA的定量參考《分子克隆》(Sambrook等，1970)，分光光度計(jì)測(cè)OD260；RNA含量計(jì)算1 OD260＝40μg/ml。
3總RNA瓊脂糖凝膠電泳分離1)取6ml 25*(倍)電泳緩沖液，加入117ml無菌水，混勻。2)稱取1.5g瓊脂糖，加入到上述溶液中，于微波爐里加熱融化，轉(zhuǎn)入55℃水浴中。3)于通風(fēng)櫥中取26.8ml甲醛，加入到55℃的凝膠溶液中，混勻。4)迅速倒入制膠板中，室溫水平放置30分鐘，待膠凝固。5)將提取的RNA(20μg)溶解于RNA變性溶液中，在65℃下加熱10分鐘，然后立即放在冰上。6)在樣品中加入2ul 10*上樣緩沖液，混勻。7)在電泳液未蓋過膠的條件下點(diǎn)樣，5V/cm電壓電泳5小時(shí)左右。
4.RNA尼龍膜上轉(zhuǎn)移1)轉(zhuǎn)移之前，將尼龍膜用10*SSC浸泡。2)將濕潤(rùn)的膜準(zhǔn)確地蓋在膜上，將兩張與膜大小相同的濾紙置2*SSC溶液中濕潤(rùn)，蓋在膜上，排除氣泡。3)濾紙上放一疊與膜大小相同的吸水紙，在吸水紙上放一玻璃板和一重物，水平放置，轉(zhuǎn)移12-20小時(shí)。4)轉(zhuǎn)移后，將膜于80℃烘烤2小時(shí)。
5.膜上雜交信號(hào)的檢出1)將膜浸在5×Dendart’s，0.1％SDS，0.1mg/ml鮭魚精DNA]，65℃下預(yù)雜交2小時(shí)。2)將用Gene ImagesTMContents CDP-StarTMlabellingmodule標(biāo)記的探針在沸水中變性5分鐘，直接加入1)的雜交液中，于65℃雜交16-24小時(shí)。3)取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，1％SDS)中，于65℃漂洗3次，每次15分鐘。轉(zhuǎn)入洗膜液II(0.1*SSC，1％SDS)中于65℃漂洗3次，每次15分鐘。4)用X光片壓片60-90分鐘，然后顯影、定影(方法參照Roche DIGlabeled試劑盒說明書)。Northern雜交表明；正常生長(zhǎng)的大白菜的植株冷相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄水平比上述逆境處理的植株明顯偏低，而且其轉(zhuǎn)錄水平隨著處理的時(shí)間的增加而增加，但在24小時(shí)和48小時(shí)的4℃的處理卻沒有明顯的差別。
本發(fā)明涉及的序列及記號(hào)分列如下(1)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度19bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii).分子類型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.1ATGGCGATGTCATTCTCAG(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii).分子類型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.2TGCCTTTGTAGTGTCCTTAT(2)SEQ ID NO.3的信息
<110>上海交通大學(xué)<120>大白菜冷相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子蛋白編碼序列<140>
<141>
<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>572<212>DNA<213>大白菜(Brassica Campestris ssp.Pekinensis)GCTCTAGAAT TACTCATCTC ACTCTTGTTC CTCTTAAAAC TCGTCCTTTG ATTTCTCTAG 60TTCTCTTCAA TGGCGATGTC ATTCTCAGGA GCTGTTCTCA GTGGGATTAA TTCTTCTTTC 120CCCAGCGGCG TAGCCAAGCA GAGCGGCGTT GGCGCCGTCA GATTTGGCCG GAAAACTGAG 180CTCGTTGTCG TCGCTCAGCG CAAGAAGTCG TTGATCTACG CCGAGAAAGG TGATGGAAAC 240ATTCTCGATG ACATCAATGA GGCCACAAAG AGAGCTTCAG ATTACGTGAC AGACAAGACA 300AAGGAGGCGT TGAAAGATGG AGAGAAAGCA AAAGACTACG TTGATGAGAA AAACGTTGAA 360GCCAAAGACA CTACATTGGA TGAAGCTCAG AAAGTTTTGG ATTATGTGAA GGAAAAAGGA 420AACGAAGCAG GAGAGGATAA GGACACTACA AAGGCATGAT GATTCAACGA CTTAACTAGT 480ATATATATAT ATATATATGT ATCAATCCTT CATGTTTCAT GTTTAATATT ATACAATAAG 540ATCAGTTTGT TTTAAAAAAA AAAAAAAAAA AA572<210>2<211>129<212>PRT<213>大白菜(Brassica Campestris ssp.Pekinensis)<400>2MAMSFSGAVL SGINSSFPSG VAKQSGVGAV RFGRKTELVV VAQRKKSLIY AEKGDGNILD 60DINEATKRAS DYVTDKTKEA LKDGEKAKDY VDEKNVEAKD TTLDEAQKVL DYVKEKGNEA 120GEDKDTTKA 129
權(quán)利要求
1.一種大白菜冷相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子蛋白編碼序列，其特征在于，包括編碼具有大白菜冷相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸第70-456位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在45-55℃條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸第70-456位的核苷酸序列雜交。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大白菜冷相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子蛋白編碼序列，其特征是，所述的序列編碼具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的大白菜冷相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子蛋白編碼序列，其特征是，該序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸第70-456位的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大白菜冷相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子蛋白編碼序列，其特征是，包含DNA分子中8-100個(gè)連續(xù)核苷酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的大白菜冷相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子蛋白編碼序列，其特征是，DNA分子轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，它是真核細(xì)胞。
全文摘要
一種大白菜冷相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子蛋白編碼序列，屬于基因工程領(lǐng)域。包括編碼具有大白菜冷相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸第70－456位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在45－55℃條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸第70－456位的核苷酸序列雜交。本發(fā)明低溫轉(zhuǎn)錄因子基因?qū)Φ蜏氐目剐宰饔?，本發(fā)明具有很大的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/29GK1528901SQ20031010797
公開日2004年9月15日 申請(qǐng)日期2003年10月16日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月16日
發(fā)明者李柱剛, 唐克軒, 趙凌俠, 孫小芬, 邱承祥 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)