專利名稱：甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)蛋白編碼序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種蛋白編碼序列，特別是一種甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)蛋白編碼序列，屬于基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
我國有鹽堿地660萬hm2，在耕地有限的情況下，開發(fā)和利用鹽堿地是十分必要的。而利用鹽堿地種植牧草、飼料作物，在改良土壤、改善環(huán)境的同時，為人們的生活及畜牧業(yè)生產(chǎn)提供了更多的物質(zhì)來源。對植物耐鹽的遺傳基礎(chǔ)進行研究，利用生物技術(shù)進行耐鹽性狀選擇，進而培育出更加耐鹽的新品種，是推進這一過程的最有效且快捷的手段。低溫脅迫是植物栽培中常常遇到的一種災(zāi)害，它不僅會導(dǎo)致植物產(chǎn)量的降低，嚴重時還會造成植株的死亡。研究低溫脅迫對植物的傷害作用及其機理，探索植物抗寒機制及其預(yù)防措施，具有重要的理論和實際意義。利用RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends，cDNA末端迅速擴增)PCR技術(shù)我們從甘藍型油菜中克隆了針對上述逆境有抗性的基因，也就是說冷和鹽相關(guān)蛋白既具有抗冷的功能，又能具有抗鹽的能力。根據(jù)GeneBank的搜索結(jié)果，將該基因命名為冷和鹽相關(guān)基因。
在對現(xiàn)有文獻的分析中，雖然“Plant Science(植物科學(xué))，1999，149167-173”指明菘藍(它和甘藍型油菜的親緣關(guān)系較近，同屬十字花科)的冷誘導(dǎo)基因隨低溫脅迫而增加，但沒有說明它具有抗鹽的特性，至今尚未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明主題有密切聯(lián)系文獻的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)蛋白編碼序列。本發(fā)明公開了與甘藍型油菜冷和鹽脅迫密切相關(guān)的蛋白的氨基酸序列以及甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)基因的核酸序列，及其在利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良植物抗冷和抗鹽等逆境的改良。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的在本發(fā)明所分離出的DNA分子，該分子包括編碼具有甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸第26-247位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在42-58℃條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸第26-247位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸第26-247位的核苷酸序列。
本發(fā)明分離出的甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)蛋白質(zhì)多肽，它包括具有SEQ ID NO.3氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.3序列的多肽。
本發(fā)明所提供的種載體，它包含上述的DNA分子。一種核酸分子，它包含所述的DNA分子中8-100個連續(xù)核苷酸。
本發(fā)明用上述載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞，它是真核細胞。在實例中該宿主細胞是擬南芥。
在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組分分開，而且已經(jīng)與在細胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。
在本發(fā)明中，術(shù)語“甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中第26-247位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的編碼框第26-247位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO.3中第26-247位核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO.3所述的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴緊條件下，更佳的在高度嚴緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸第26-247位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語還包括與SEQID NO.3中從核苷酸第26-247位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
該術(shù)語還包括能編碼具有與天然的甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)相同功能的蛋白的SEQ ID NO.3中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(通常為60個以內(nèi)，較佳地為30個以內(nèi)，更佳地為10個以內(nèi)，最佳地為5個以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，術(shù)語“甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)蛋白或多肽”指具有甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)蛋白活性的SEQ ID NO.3序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與天然甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)相同功能的、SEQ ID NO.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)蛋白的活性片段和活性衍生物。
本發(fā)明的甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴緊條件下能與甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)多肽的血清獲得的多肽或蛋白。
在本發(fā)明中，“甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)保守性變異多肽”指與SEQ ID NO.3的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個氨基酸性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進行替換而產(chǎn)生。
表1


表291％ identity in 191 nt overlapQuery21 gaaaaaatggctagcaatatggaagttttctgcgagatcttaatagcgatccttcttcca 80||||||||||| ||||| |||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||Sbjct71 gaaaaaatggcgagcaacatggaagttttctgcgagatcttaatcgcgatccttcttcca 130M A S N M E V F C E I L I A I L L PQuery81 tctcttggagtctgcctcaagcgtggctgttgcactgtagagttcttgatatgcttggtg 140|||||||||| || ||||| ||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||Sbjct131 cctcttggagtttgtctcaaacgtggctgttgcactgtagagttcttgatttgcttggtg 190P L G V C L K R G C C T V E F L I C L VQuery141 ttgactatcttaggctacatcccagggataatctatgcgctttacgtgatcgtgttccag 200|||| |||||||| ||||||||||||||||| ||||| || |||||||||||||| ||Sbjct191 ctgacaatcttaggatacatcccagggataatttatgcactatacgtgatcgtgtttcaa 250L T I L G Y I P G I I Y A L Y V I V F QQuery201 aaccgtgaagg 211|||||||||||
Sbjct251 aaccgtgaagg 261N R E GQuery甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)蛋白冷和鹽相關(guān)的核酸序列Sbjct擬南芥低溫和鹽反應(yīng)蛋白基因核酸序列(NM_119211)表2為本發(fā)明的甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)蛋白(冷和鹽相關(guān))與擬南芥低溫和鹽反應(yīng)蛋白基因核酸序列(NM_119211)的同源比較(GAP)表。
表3Query1 MASNMEVFCEILIAILLPSLGVCLKRGCCTVEFLICLVLTILGYIPGIIYALYVIVFQNR 60MASNMEVFCEILIAILLP LGVCLKRGCCTVEFLICLVLTILGYIPGIIYALYVIVFQNRSbjct1 MASNMEVFCEILIAILLPPLGVCLKRGCCTVEFLICLVLTILGYIPGIIYALYVIVFQNR 60Query61 EGETQDYSAPLNSA 74EG T + APLNSASbjct61 EGST-ELGAPLNSA 73Query甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)蛋白冷和鹽相關(guān)的氨基酸序列Sbjet擬南芥擬南芥低溫和鹽反應(yīng)蛋白蛋白氨基酸序列(NP_194795)表3為本發(fā)明的甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)蛋白(冷和鹽相關(guān))與冷和鹽相關(guān)的氨基酸序列的同源比較(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在兩個序列之間用氨基酸單字符標出。
發(fā)明還包括甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然低溫和鹽相關(guān)多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒，粘粒等。在生產(chǎn)本發(fā)明的甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)多肽時，可以將甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)編碼序列可操作地連于表達調(diào)控序列，從而形成甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)蛋白表達載體。
如本發(fā)明所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細胞”為真核細胞。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞、煙草細胞和其它植物細胞。
還可用Northern印跡法技術(shù)分析甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)基因產(chǎn)物的表達，即分析甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)的RNA轉(zhuǎn)錄物在細胞中的存在與否和數(shù)量。
此外，本發(fā)明中可用作探針的核酸分子，該分子通常具有甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)核苷酸編碼序列的8-100個連續(xù)核苷酸，較佳地具有15-50個連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)的核酸分子。
本發(fā)明涉及檢測樣品中是否存在甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴增后的產(chǎn)物，其中PCR擴增引物對應(yīng)于甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)核苷酸編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長度一般為15-50個核苷酸。
此外，根據(jù)本發(fā)明的甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表達蛋白質(zhì)的同源性基礎(chǔ)上，篩選甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)同源基因或同源蛋白。
為了得到與甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)基因相關(guān)的油菜cDNAs的點陣，可以用DNA探針篩選油菜cDNA文庫，這些探針是在低嚴緊條件下，用32P對甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)的全部或部分做放射活性標記而得的。最適合于篩選的cDNA文庫是來自油菜的文庫。構(gòu)建來自感興趣的細胞或者組織的cDNA文庫的方法是分子生物學(xué)領(lǐng)域眾所周知的。另外，許多這樣的cDNA文庫也可以購買到，例如購自Clontech，Stratagene，Palo Alto，Cal.。這種篩選方法可以識別與甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)的基因家族的核苷酸序列。
本發(fā)明的甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關(guān)序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
除了用重組法產(chǎn)生之外，本發(fā)明蛋白的片段還可用固相技術(shù)，通過直接合成肽而加以生產(chǎn)(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WHFreeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 852149-2154)。在體外合成蛋白質(zhì)可以用手工或自動進行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成儀(Foster City，CA)來自動合成肽?？梢苑謩e化學(xué)合成本發(fā)明蛋白的各片段，然后用化學(xué)方法加以連接以產(chǎn)生全長的分子。
利用本發(fā)明的甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)發(fā)生相互作用的物質(zhì)，或者受體、抑制劑或拮劑等。
本發(fā)明中，低溫和鹽在ABA合成中起關(guān)鍵作用，能夠明顯體地提高作物的抗逆性。植物在生長的過程中會遇到干旱、水淹、冷害等逆境，本發(fā)明的抗低溫和耐鹽基因冷和鹽相關(guān)正具備這項功能，它能在逆境下增強植物抗低溫和鹽脅迫能力。因此，本發(fā)明具有很大的應(yīng)用價值。
具體實施例方式
下面結(jié)合實驗室具體的試驗數(shù)據(jù)和結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)基因的克隆1.組織分離(isolation)甘藍型油菜(品種為“滬油15”)從市場上購得，將油菜置于28℃發(fā)芽24小時，然后播種于溫室中，待甘藍型油菜葉片為4-5片時，準備抽取DNA或RNA。
2.RNA的分離(RNA isolation)取部分組織，用研缽研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP管，充分振蕩后，再移入玻璃勻漿器內(nèi)。勻漿后移至1.5mL EP管中，抽提總RNA(TRIzol Reagents，GIBCO BRL，USA)。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量，然后在分光光度計上測定RNA含量。
3.基因的全長克隆(Cloning of Full-length cDNA)根據(jù)擬南芥低溫和鹽反應(yīng)基因的氨基酸保守序列，利用同源性基因克隆原理，采用RACE方法(GibcoBRL試劑盒)進行cDNA全長克隆，分三個階段進行(1)RT-PCRPCR[BP001(SEQ ID NO.1)+BP002(SEQ ID NO.2)]得到2002BP(約0.25kb)，回收，連接到pGEMT-Easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，采用終止物熒光標記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進行測序。測序結(jié)果用GCG軟件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數(shù)據(jù)庫(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及編碼蛋白與已知十字花科植物如擬南芥(Arabidopsis thaliana)擬南芥低溫和鹽基因的同源性很高，故初步認為它是一個與低溫和鹽相關(guān)的基因。
(2)3’-RACEPCR[AP+BP003(5’-TATGGAACCACTCAATAAAG-3’)]得到2002BP3’(300bp左右)，回收，連接到T-Easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，采用終止物熒光標記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進行測序。測序結(jié)果用GCG軟件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數(shù)據(jù)庫(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及編碼蛋白與已知十字花科植物如擬南芥(Arabidopsis thaliana)擬南芥低溫和鹽基因的同源性很高，故初步認為它是一個與低溫和鹽相關(guān)基因。
(3).5’-RACE第一輪PCR[AAP+BP004(5’-CAAGCTGAGTTGAGTGGAGT--3’)]第二輪PCR[(AUAP+BPR005(5’-GTCGGTACATGAAATTACCAT-3’))得到2001BP 5’(約300bp)(過程同(1))將測序結(jié)果的重疊區(qū)拼接，發(fā)現(xiàn)過程(1)得到的片段既是該基因的完整編碼區(qū)。
BLAST的結(jié)果證明從油菜中新得到的基因確為一個與植物低溫和鹽相關(guān)的基因。
通過組合使用上述3種方法，獲得了候選的甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)蛋白的全長編碼序列(SEQ ID NO.3)。
實施例2甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)基因的序列信息與同源性分析本發(fā)明新的甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)全長cDNA的長度為504bp，詳細序列見SEQID NO.3，其中開放讀框位于26-247位核苷酸(74個核苷酸)。根據(jù)全長cDNA推導(dǎo)出甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)的氨基酸序列，共74個氨基酸殘基，分子量為42.83kDa，等電點(pI)為5.06。詳細序列見SEQ ID NO.3。
將甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)的全長cDNA序列及其編碼蛋白質(zhì)用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫中進行核苷酸和蛋白質(zhì)同源性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與擬南芥低溫和鹽基因(NM_119211)在核苷酸水平上具有91％的相同性，(附表2)；在氨基酸水平上，它與擬南芥抑制低溫和鹽蛋白(NP_194795)也有91％的相同性(附表3)。由此可見，甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)基因冷和鹽相關(guān)與擬南芥低溫和鹽II氧釋放蛋白無論從核酸還是蛋白水平上都存在較高的同源性。擬南芥擬南芥低溫和鹽反應(yīng)蛋白已經(jīng)被證明抗低溫和鹽中具有明顯的作用，故可以認為冷和鹽相關(guān)在低溫和鹽的抗性上也具有相似的作用。
實施例3甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)蛋白或多肽在擬南芥中進行真核細胞表達及轉(zhuǎn)基因植株的抗逆性鑒定含目的基因(甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)基因)的表達載體的構(gòu)建，根據(jù)甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)的全長序列(SEQ ID NO.3)，設(shè)計擴增出完整編碼閱讀框的引物，并在上游和下游引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(這可視選用的載體而定)，以便構(gòu)建表達載體。以實施例1中獲得的擴增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴增后，將甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)基因cDNA克隆至中間載體(如pBluescript)，進一步克隆到雙元表達載體(如pBI121和改進的pCAMBIA2300)，在保證閱讀框架正確的前提下鑒定好的表達載體，再將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，利用葉盤法技術(shù)轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥。
1.發(fā)苗種子用無菌水漂洗15-20分鐘，再用70％的乙醇消毒1分鐘，然后用0.1％升汞消毒10-12分鐘。最后再用無菌水沖洗5遍。將洗好的種子用吸水紙吸干，放入MS培養(yǎng)基。光照培養(yǎng)5天，待苗長到4-5厘米便可以剪苗。
2.剪苗剪取0.5-1厘米的下胚軸小片段放入預(yù)培養(yǎng)基，培養(yǎng)2天。
預(yù)培養(yǎng)基MS+6BA(0.2mg/l)+2.4D(1.2mg/l)3.轉(zhuǎn)化共培養(yǎng)將預(yù)培養(yǎng)2天的下胚軸放入事先培養(yǎng)好的菌液中(OD值0.4-0.6)侵染3-5分鐘。接著取出放入預(yù)培養(yǎng)基暗培養(yǎng)2天。
4.篩選培養(yǎng)共培養(yǎng)結(jié)束后，將外植體放入篩選培養(yǎng)基。2周繼代一次。2-4周有愈傷組織形成和芽的分化。待綠芽長到2厘米后，切下生根。
篩選培養(yǎng)基MS+6BA(4.5mg/l)+NAA(0.1mg/l)+AgNO3(6mg/l)+cb(250mg/l)+Kan(20mg/l)生根培養(yǎng)基MS+NAA(0.5mg/l)+cb(250mg/l)+Kan(5mg/l)5.轉(zhuǎn)化植株培養(yǎng)；待根系發(fā)達后，將植株取出，用無菌水洗凈附著的固體培養(yǎng)基，移入土壤中，剛開始用玻璃罩罩幾天，待植株健壯后再取下玻璃罩，溫室中培養(yǎng)。
含甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的抗逆性鑒定，甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)蛋白與擬南芥的低溫和鹽反應(yīng)蛋白具有較高的同源性，在進一步對含甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株進行性鑒定。我們利用RT-PCR和Northern blot對轉(zhuǎn)基因植株進行了檢測，兩種方法均證明目的基因已經(jīng)整合到擬南芥的基因組中。我們以正常的擬南芥為對照，對轉(zhuǎn)低溫和鹽基因的擬南芥植株進行低溫以及氯化鈉脅迫處理，處理條件為分別4℃處理48小時和NaCL 200Mm 5小時。以上所處理的植株部位都是植株的幼嫩葉片。以未轉(zhuǎn)基因的擬南芥植株為對照，結(jié)果證明轉(zhuǎn)冷和鹽相關(guān)基因植株在抗上述逆境方面上均強于未轉(zhuǎn)該基因的植株，在低溫和鹽脅迫后，轉(zhuǎn)基因的植株恢復(fù)生長的時間明顯比未轉(zhuǎn)基因的植株短。這證明冷和鹽相關(guān)基因低溫和鹽逆境具有抗性，甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)基因?qū)⒖捎糜诶棉D(zhuǎn)基因技術(shù)改良植物抗低溫和鹽的研究和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中。
甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)基因冷和鹽相關(guān)在油菜中的拷貝數(shù)分析采用常規(guī)方法從油菜葉片中提取DNA(參考《分子克隆》，Sambrook等，1989)，分別用BamH I，EcoRI，Xba I和HindIII酶切DNA[13μg(微克)/樣品]后，將DNA轉(zhuǎn)至雜交膜(尼龍膜)上后。使用Amersham Pharmacia公司Gene ImagesTMContents CDP-StarTMlabelling module(PRN3540)，我們將BcpFLC基因編碼區(qū)標記為探針，然后進行雜交(于60℃雜交16小時)。取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，1％SDS)中，于60℃漂洗3次，每次15分鐘。轉(zhuǎn)入洗膜液II(0.1*SSC，1％SDS)中于60℃漂洗3次，每次同樣15分鐘。用X光片壓片60-90分鐘，然后顯影、定影(方法參照Roche DIG labeled試劑盒說明書)。結(jié)果(Southern blot)發(fā)現(xiàn)在雜交膜上出現(xiàn)2-5雜交條帶，說明冷和鹽相關(guān)基因在油菜中屬于低拷貝基因。
甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)基因在甘藍型油菜中的表達譜分析1.RNA的提取將油菜“滬油15”(溫室播利，溫度設(shè)置為25-26℃，光照時間為16小時)。待葉片長到2-3片葉時抽取油菜嫩葉的RNA。以正常生長的植株作為對照，4℃處理48小時及氯化鈉(NaCL 200Mm)5小時脅迫處理的植株為分析對象，利用TRIzol試劑盒(GIBCO BRL，USA)提取并參考《分子克隆》有關(guān)RNA的制備章節(jié)(Sambrook等，1989)。
2.RNA的定量參考《分子克隆》(Sambrook等，1989)，分光光度計測OD260；RNA含量計算1 OD260＝40μg/ml。
3總RNA瓊脂糖凝膠電泳分離1)取6ml 25*(倍)電泳緩沖液，加入117ml無菌水，混勻。2)稱取1.5g瓊脂糖，加入到上述溶液中，于微波爐里加熱融化，轉(zhuǎn)入55℃水浴中。3)于通風(fēng)櫥中取26.8ml甲醛，加入到55℃的凝膠溶液中，混勻。4)迅速倒入制膠板中，室溫水平放置30分鐘，待膠凝固。5)將提取的RNA(20μg)溶解于RNA變性溶液中，在65℃下加熱10分鐘，然后立即放在冰上。6)在樣品中加入2ul 10*上樣緩沖液，混勻。7)在電泳液未蓋過膠的條件下點樣，5V/cm電壓電泳5小時左右。
4.RNA尼龍膜上轉(zhuǎn)移1)轉(zhuǎn)移之前，將尼龍膜用10*SSC浸泡。2)將濕潤的膜準確地蓋在膜上，將兩張與膜大小相同的濾紙置2*SSC溶液中濕潤，蓋在膜上，排除氣泡。3)濾紙上放一疊與膜大小相同的吸水紙，在吸水紙上放一玻璃板和一重物，水平放置，轉(zhuǎn)移12-20小時。4)轉(zhuǎn)移后，將膜于80℃烘烤2小時。
5.膜上雜交信號的檢出1)將膜浸在5×Dendart’s，0.1％SDS，0.1mg/ml鮭魚精DNA]，65℃下預(yù)雜交2小時。2)將用Gene ImagesTMContents CDP-StarTMlabelling module標記的探針在沸水中變性5分鐘，直接加入1)的雜交液中，于65℃雜交16-24小時。3)取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，1％SDS)中，于65℃漂洗3次，每次15分鐘。轉(zhuǎn)入洗膜液II(0.1*SSC，1％SDS)中于65℃漂洗3次，每次15分鐘。4)用X光片壓片60-90分鐘，然后顯影、定影(方法參照Roche DIGlabeled試劑盒說明書)。Northern雜交表明；正常生長的油菜的植株冷和鹽相關(guān)轉(zhuǎn)錄水平比上述低溫和鹽處理的植株明顯偏低，這說明冷和鹽相關(guān)轉(zhuǎn)錄水平與低溫和鹽脅迫極顯著相關(guān)。
本發(fā)明涉及的序列及記號分列如下(1)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)長度20bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii).分子類型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.1CAATCCTTCTTCCGCCTCTT(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)長度21bp
(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii).分子類型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.2GTGATGCCAATAGTGAAAAAG(2)SEQ ID NO.3的信息
<110>上海交通大學(xué)<120>甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)蛋白編碼序列<140>
<141>2003-09-15<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>504<212>DNA<213>甘藍型油菜(Brassica napus)TCGCTCTAGA TCATCTCTGA GAAAAAATGG CTAGCAATAT GGAAGTTTTC TGCGAGATCT 1TAATAGCGAT CCTTCTTCCA TCTCTTGGAG TCTGCCTCAA GCGTGGCTGT TGCACTGTAG 61AGTTCTTGAT ATGCTTGGTG TTGACTATCT TAGGCTACAT CCCAGGGATA ATCTATGCGC 121TTTACGTGAT CGTGTTCCAG AACCGTGAAG GGGAAACTCA GGATTACAGT GCTCCACTCA 181ACTCAGCTTG AGATTATCTG TCGGTCCATA CAACATGTCT TTCACTTGAA ACTGTTTACT 241TATGGAACCA CTCAATAAAG TTGCAATCTA TCTGATTCCT TCTTATATGT AATTCAAGTA 301TGGCAATTTC ATGTACTGAT CATTTTTTTC ACTATTGGCA CGCACCGACG CACGCACGGA 361GATGCATCAC AGATCTCTCA TCACATGTAT AATCTTTTGT AATCAAAGTC CAGATTTTCC 421CTTAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAA 504<210>2<211>74<212>PRT<213>甘藍型油菜(Brassica napus)<400>2MASNMEVFCE ILIAILLPPL GVCLKRGCCT VEFLICLVLT ILGYIPGIIY ALYVIVFQNR 1EGETQDYSAP LNSA 7權(quán)利要求
1.一種甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)蛋白編碼序列，其特征在于，包括編碼具有甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸第26-247位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在42-58℃條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸第26-247位的核苷酸序列雜交。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)蛋白編碼序列，其特征是，所述的序列編碼具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)蛋白編碼序列，其特征是，該序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸第26-247位的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)蛋白編碼序列，其特征是，包含DNA分子中8-100個連續(xù)核苷酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)蛋白編碼序列，其特征是，DNA分子轉(zhuǎn)化的宿主細胞，它是真核細胞。
全文摘要
一種甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)蛋白編碼序列，屬于基因工程領(lǐng)域。包括編碼具有甘藍型油菜冷和鹽相關(guān)蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸第26－247位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在42－58℃條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸第26－247位的核苷酸序列雜交。本發(fā)明中冷和鹽相關(guān)基因提高植物的低溫和鹽的抗性作用明顯，本發(fā)明具有很大的應(yīng)用價值。
文檔編號C12N15/29GK1528897SQ200310107969
公開日2004年9月15日 申請日期2003年10月16日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月16日
發(fā)明者李柱剛, 唐克軒, 趙凌俠, 孫小芬, 張屹東 申請人:上海交通大學(xué)