專利名稱：間接法基因芯片線性放大標(biāo)記技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明所引用的技術(shù)文獻(xiàn)Su；Sheng-Hui等人美國(guó)專利No.6,130,323。Non-nucleotide linking reagents。10月10日，2000。
Nelsen，p.S.等人，Nuclear Acids Research.206253，1992。
宋克，中國(guó)專利申請(qǐng)，基因芯片酶法微球放大標(biāo)記。申請(qǐng)?zhí)?31420818。2003年8月6日。ROBIN L.STEARS等人，“A novel，sensitive detection system for high-density microarraysusing dendrimer technology”。Physiological Genomics393-99，2000；1094-8341/00.DeRisi JL等人，Exploring the metabolic and genetic control of gene expression on agenomic scale.Science 278680-686，1997。
Schena M等人，Quantitative monitoring of gene expression patterns with acomplementary DNA microarrays.Science 270，467-470.1995。
Duggan D.等人，Expression profiling using cDNA microarrays.Nature Genetic Supplement2110-14，1999.
Charlie C.Xiang等人。Amine-modified random primers to label probes for DNAmicroarrays.Nature Biotechnology。Vol20，738-742.2002所屬領(lǐng)域本發(fā)明屬于基因芯片應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及到基因芯片的雜交，標(biāo)記，洗脫，及信號(hào)檢測(cè)技術(shù)。
本發(fā)明技術(shù)背景目前基因芯片分析中通常用熒光染料(即CyTM3或CyTM5)作為標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記物可以在cDNA合成時(shí)通過逆轉(zhuǎn)錄[reverse transcription]技術(shù)直接引入，aRNA放大或者后aRNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)[post-aRNA reverse transcription(RT)reaction]，或在任何酶反應(yīng)之后通過化學(xué)偶聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行連接。直接標(biāo)記需要酶反應(yīng)在cDNA，aRNA或RT產(chǎn)物中引入Cy標(biāo)記的dNTP/NTP核苷酸結(jié)構(gòu)類似物。
目前，基因芯片在實(shí)際操作中，來(lái)自實(shí)驗(yàn)樣品和參照樣品的cDNA[代表mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)品]用不同的熒光染料標(biāo)記、混合、并被雜交到芯片上。所測(cè)得的熒光強(qiáng)度無(wú)法與其實(shí)際轉(zhuǎn)錄產(chǎn)品的豐度成正比。
雖然直接標(biāo)記法看上去更方便，但卻存在一些問題。首先，引入的被標(biāo)記的堿基U的數(shù)量將取決于cDNA的堿基組成，即mRNA中堿基A的含量。其次，參入到標(biāo)記分子中的核苷數(shù)量也取決于轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的長(zhǎng)度。很長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或/及含有大量堿基A的模板會(huì)產(chǎn)生被更強(qiáng)的熒光信號(hào)標(biāo)記的cDNA。在此情況下，強(qiáng)的信號(hào)不代表高的表達(dá)豐度，因此，對(duì)雜交上的靶序列的標(biāo)記與實(shí)際雜交的靶序列的量不成正比關(guān)系，這為對(duì)基因芯片檢測(cè)中的精確定量造成困難。第三，Cy5和Cy3在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中引入水平或效率不高，而且各自效率不同，會(huì)產(chǎn)生不同的量子效率以及各種各樣的熒光強(qiáng)度，因此，對(duì)熒光強(qiáng)度的歸一化將十分必要，這是對(duì)下游數(shù)據(jù)分析的影響。第四，采用直接法標(biāo)記進(jìn)行信號(hào)放大受到放大倍數(shù)的限制。目前的大多數(shù)方法需要最少20微克的總RNA樣品，或2微克poly(A)RNA樣品[Schena M等人，Duggan D.等人]，對(duì)于研究一些稀有組織或樣品量比較少的樣品往往顯得無(wú)能為力。第五，過多的參入熒光分子往往導(dǎo)致雜交效率或特異性降低。而且有資料顯示，探針或靶基因中多重被標(biāo)記核苷的參入會(huì)減少它們所形成的雜交雙鏈的穩(wěn)定性。資料顯示，帶有多重?zé)晒馑鼗鶊F(tuán)的合成寡聚核苷酸、帶有多重生物素基的生物來(lái)源的核酸探針、以及兼有生物素基團(tuán)和熒光素基團(tuán)的合成寡聚核苷酸的雜交雙鏈的穩(wěn)定性都下降[Su，Sheng-Hui等人，美國(guó)專利No.6,130,323]。
間接標(biāo)記通常在將要被熒光染料標(biāo)記的核酸分子上引入一個(gè)堿基媒介。這個(gè)堿基媒介可以是氨基修飾[氨基烯丙基-]的堿基，然后，用Cy5或Cy3分子與之結(jié)合。但在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中，間接方法沒有克服直接標(biāo)記中熒光強(qiáng)度取決于cDNA長(zhǎng)度和堿基組成的問題。
本發(fā)明的目的本發(fā)明的目的是為基因芯片產(chǎn)品提供一套利用酶學(xué)或化學(xué)的方法、利用高荷信號(hào)載體大幅度提升檢測(cè)靈敏度，經(jīng)濟(jì)實(shí)用性的信號(hào)放大標(biāo)記技術(shù)及試劑盒。同時(shí)解決直接法標(biāo)記中非線性標(biāo)記而出現(xiàn)的無(wú)法精確定量、靈敏度不足、成本高昂等缺陷，使產(chǎn)生的熒光信號(hào)強(qiáng)度與基因表達(dá)中的實(shí)際豐度成放大了的正比例關(guān)系。本發(fā)明中的技術(shù)方案同時(shí)解決了基因芯片直接標(biāo)記中cDNA的雜交效率對(duì)標(biāo)記過程的影響問題。
本發(fā)明與背景技術(shù)相比所產(chǎn)生的積極效果本發(fā)明中所提供的方法不僅提高了基因芯片檢測(cè)靈敏度，降低成本，而且克服了直接標(biāo)記技術(shù)中存在的無(wú)法準(zhǔn)確定量的各種技術(shù)因素，如在本發(fā)明中可以被視為加尾標(biāo)記的末端轉(zhuǎn)移酶方法和捕獲序列方法所表示的方法。
歸納起來(lái)，本發(fā)明所帶來(lái)的有益效果有如下幾個(gè)方面1、為一般的基因芯片技術(shù)產(chǎn)品提供了超靈敏檢測(cè)的技術(shù)基礎(chǔ)，技術(shù)比現(xiàn)有的體外轉(zhuǎn)錄[IVT]標(biāo)記、Cy系列熒光分子標(biāo)記技術(shù)有著更強(qiáng)大的信號(hào)放大效果，可以根據(jù)需要選擇不同規(guī)格的高荷信號(hào)載體將信號(hào)放大倍數(shù)提高到102-107不等。
2、為降低基因芯片處理系統(tǒng)的成本及運(yùn)行成本提供了技術(shù)支持，有利于基因芯片的普及應(yīng)用；3、克服了PCR等基因擴(kuò)增技術(shù)中的假陽(yáng)性問題；4、克服了利用逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中Cy3/Cy5熒光分子參入法直接標(biāo)記技術(shù)所產(chǎn)生的熒光信號(hào)強(qiáng)度還取決于cDNA長(zhǎng)度和堿基組成所造成的不確定性，本發(fā)明中的標(biāo)記方法所產(chǎn)生的熒光信號(hào)強(qiáng)度則僅取決于cDNA的分子數(shù)目，因此可以線性定量檢測(cè)。因此，本發(fā)明所述的技術(shù)方案所產(chǎn)生的熒光信號(hào)強(qiáng)度與基因表達(dá)的實(shí)際豐度成正比例線性關(guān)系。
5、間接標(biāo)記中的末端標(biāo)記技術(shù)的雜交過程在標(biāo)記反應(yīng)之前，而且雜交分子的堿基在雜交之前沒有被修飾，克服了直接標(biāo)記中雜交效率低下或錯(cuò)配雜交的問題，提高了雜交分子的穩(wěn)定性，同時(shí)也有利于探針和靶基因的嚴(yán)謹(jǐn)雜交。
專用名詞注解模板[Template，T]各種酶[如DNA/RNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶等]的核酸分子底物，在生物樣品中是待檢測(cè)的核酸分子。模板經(jīng)過加工引物[Primer]位于待合成或轉(zhuǎn)錄的DNA或RNA片段的某個(gè)特定序列并與該序列序列互補(bǔ)的一段核酸片段，可引導(dǎo)相應(yīng)的DNA或RNA合成酶等啟動(dòng)DNA活RNA的合成或轉(zhuǎn)錄。
探針[Probe]含有某一特定核酸或肽核酸堿基序列的被固定在基因芯片基片上的DNA、RNA、寡聚核苷酸或肽核酸[peptide nucleic acid，PNA]片段。
靶序列[Target Sequence，TS]用于與基因芯片上的核酸探針進(jìn)行雜交的互補(bǔ)核酸或肽核酸序列。
報(bào)告基團(tuán)[Reporter Group，Y-]在核酸標(biāo)記反應(yīng)中，本發(fā)明不是直接將信號(hào)標(biāo)記物[如熒光信號(hào)分子等]連接到靶序列上，而是首先將一個(gè)中介基團(tuán)連接到靶序列上，或通過合成的方法在靶序列上產(chǎn)生一個(gè)報(bào)告基團(tuán)。報(bào)告基團(tuán)作為一個(gè)標(biāo)簽、燈塔或接頭，其目的是在下一步標(biāo)記反應(yīng)中，表明在基因芯片某個(gè)位點(diǎn)的某個(gè)探針分子上雜交事件的發(fā)生，同時(shí)準(zhǔn)備與標(biāo)記分子的連接。
報(bào)告引物[Reporter Primer]通過酶學(xué)或化學(xué)方法合成的，連接有報(bào)告基團(tuán)的引物序列。
報(bào)告靶序列[Report Target Sequence，RTS]在DNA、RNA、寡聚核苷酸或肽氨酸分子末端或其他部位帶有一個(gè)或若干個(gè)報(bào)告基團(tuán)的靶序列。報(bào)告核苷酸[Reporter Nucleotide]各種帶有報(bào)告基團(tuán)的[脫氧或雙脫氧]核苷酸或核苷酸類似物，如氨基烯丙基脫氧核苷酸[aminoallyl deoxynucleotides，aa-dUTP等]、生物素基雙脫氧核苷酸[biotin-ddUTP]等。在酶或化學(xué)作用下，這些報(bào)告核苷酸被摻入或連接到報(bào)告引物或報(bào)告靶序列中。
接頭基團(tuán)[Y’-]通過共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵力能夠與報(bào)告基團(tuán)可以發(fā)生特異性相互作用并與之結(jié)合的生物或化學(xué)分子或基團(tuán)。
隨機(jī)報(bào)告引物[Random Reporter Primer，RRP]通過DNA合成儀合成的具有所有可能堿基序列的報(bào)告引物的總和。報(bào)告引物的引物部分通常是六聚或八聚核苷酸。
捕獲序列一個(gè)連接到靶序列上的一個(gè)特定堿基序列的核酸或肽核酸片段。捕獲序列起著靶序列報(bào)告基團(tuán)的作用，為下一步與高荷信號(hào)載體[HSC]的標(biāo)記反應(yīng)做好準(zhǔn)備。它可以通過與固定在HSC表面的接頭序列互補(bǔ)雜交而形成一條核酸雙鏈的連接。
接頭序列固定[通過共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵連接]在HSC表面，與捕獲序列堿基互補(bǔ)配對(duì)的一段核酸序列。
本發(fā)明的技術(shù)原理本發(fā)明提出一種間接法基因芯片線性放大標(biāo)記技術(shù)，其原理是，將攜帶報(bào)告基團(tuán)(Reporter Group)[Y-]的報(bào)告核苷酸[Reporter Nucleotides]，以樣品中待測(cè)基因序列為模板，在酶或化學(xué)作用下?lián)饺氲桨行蛄兄校铣蓤?bào)告靶序列[Reporter target sequences]，后者與被固定在基因芯片上的探針陣列雜交，形成報(bào)告靶序列與其互補(bǔ)探針的雜合雙鏈，用表面修飾有報(bào)告基團(tuán)接頭基團(tuán)[Y’-]的高荷信號(hào)載體[HSC]與該雜合雙鏈反應(yīng)并與之結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大標(biāo)記。
這種基因芯片由基底及其表面的鍍層或涂層和固定在基底[縮寫為S]或鍍層[縮寫為C]表面的不少于兩個(gè)陣列式排列的探針組成，用于檢測(cè)樣品中的生物或化學(xué)靶物質(zhì)。基底和/或鍍層或涂層的材料可以由但不限于如下材料中任意一種或一種以上不同材料組合制成·(1)無(wú)機(jī)片狀或平板狀材料類如玻璃、石英、云母，透明導(dǎo)電材料如透明導(dǎo)電氧化物類[TCO]，如氧化銦錫[indium tin oxide，ITO，或?qū)憺镮n2O3Sn]、InAs、SnO2:F、砷化鎵[GaAs]、氧化鎂等鍍層，氧化錫[tin oxide，SnO]，ZnO，CdO，CdIn2O4，Cd2SnO4，Zn2SnO4和In2O3-ZnO等，以及碳/陶復(fù)合導(dǎo)電陶瓷，各種半導(dǎo)體材料等，以及多孔板模式，如微孔板、微滴板，(2)單質(zhì)類鉑、金、銀、鋁、鉻[Au，Ag，Pt，Cu，Rh，Pd，Al，Cr]等金屬以及硅等非金屬，(3)有機(jī)物類各種有機(jī)分子及其由此制成的自組裝單分子膜或自組裝多分子膜，(4)高分子類尼龍膜、塑料、橡膠、樹脂，硝酸纖維素膜。
基底的結(jié)構(gòu)可以是但不限于如下種類(1)薄片/平板式如玻璃片、硅片、尼龍膜、塑料片、(2)多孔板式如微孔板，微滴板式等，(3)電極式在薄片式基因芯片上以一定規(guī)律排列而成的各種電極陣列，如在半導(dǎo)體、絕緣體等基底上制成的鉑電極、金電極等，(4)微管式由毛細(xì)管或有毛細(xì)管管狀內(nèi)腔結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的其它材料，按預(yù)先設(shè)定的位置對(duì)應(yīng)規(guī)則排列而成的各種矩陣式毛細(xì)管基因芯片[二維平面排列]、線形毛細(xì)管基因芯片[一維線形排列]、以及在基片式結(jié)構(gòu)中制作出的各種不少于一個(gè)微管道式空腔結(jié)構(gòu)的矩陣式并行排列[即微流體電泳芯片等]，本發(fā)明所說(shuō)的基因芯片用來(lái)檢測(cè)的探針、靶序列或者模板[T]可以是，但不限于如下種類之一或不同種類的組合或下面種類的某種成分，提取物(1)核糖核酸[RNA]，各種核糖核酸[″ribonucleic acid″and″RNA″]，包括信使RNA[簡(jiǎn)稱mRNA]、轉(zhuǎn)RNA[簡(jiǎn)稱tRNA]、放大核糖核酸[amplified RNA]或反義核糖核酸[anti-sense RNA，簡(jiǎn)稱aRNA]、互補(bǔ)RNA[cRNA]等，(2)脫氧核糖核酸[DNA]如DNA，互補(bǔ)DNA[cDNA]等，(3)寡核苷酸[oligonucleotide]，包括寡聚脫氧核糖核酸[oligodeoxynucleotide，簡(jiǎn)稱ODNs]，寡聚核糖核酸[oligoribonucleotide，ORNs]，多聚核苷酸[polynucleotide]，(4)核酸結(jié)構(gòu)相似物[DNA-DNA，RNA-RNA or RNA-DNA mimic duplexes，triplexes or quadroplexes，等]]如肽核酸[peptide nucleic acids，簡(jiǎn)稱PNA]，(5)脫氧核糖核酸、核糖核酸、肽核酸及其結(jié)構(gòu)相似物的互補(bǔ)雙鏈、三[重]鏈、四[重]鏈等形式的雜交分子如DNA-DNA、RNA-DNA、RNA-RNA、PNA-DNA，PNA-RNA，PNA-RNA-PNA，PNA-DNA-PNA]等。
本發(fā)明在基因芯片處理技術(shù)中采用高荷信號(hào)載體(高分子熒光微球或含有大量熒光染料、半導(dǎo)體納米晶量子點(diǎn)、電致發(fā)光分子等的高分子顆粒，通過合成技術(shù)將大量信號(hào)分子聚合為一體的各種形式的巨型信號(hào)分子，硅氧光學(xué)磁珠[silica beads]，膠體金[或納米金顆粒，colloidal gold nanoparticles]，或通過任何其他手段將熒光染料，非熒光染料，半導(dǎo)體量子點(diǎn)、電致發(fā)光、化學(xué)發(fā)光或生物發(fā)光物質(zhì)信號(hào)分子等固定于微粒的表面或包埋于其內(nèi)部等多種形式的高荷信號(hào)載體)作為標(biāo)記物進(jìn)行分子信號(hào)放大。
本發(fā)明所要介紹的基因芯片信號(hào)放大標(biāo)記技術(shù)，是以各種形式的高荷信號(hào)載體或信號(hào)體應(yīng)用于標(biāo)記各種形式的基因芯片探針、靶或探針-靶雜交體。
這里所說(shuō)的基因芯片包括但不限于如下類型基因芯片[包括各種DNA芯片，如玻璃基因芯片，膜芯片，實(shí)驗(yàn)室芯片，微流體芯片等]、以電化學(xué)原理或生物電子學(xué)原理為基礎(chǔ)的各種生物傳感器等。
本發(fā)明所使用基因芯片的檢測(cè)原理可以是，但不限于如下種類之一或不同原理的結(jié)合(1)通過對(duì)固相表面定位在不同位置的探針-靶特異性親合反應(yīng)結(jié)合體或雜交體進(jìn)行光學(xué)信號(hào)[如熒光分子、化學(xué)發(fā)光等]標(biāo)記，然后經(jīng)激發(fā)產(chǎn)生熒光、化學(xué)或生物發(fā)光并進(jìn)行檢測(cè)。以玻璃、硅片、尼龍膜等為材質(zhì)的基因芯片、蛋白芯片、免疫芯片多采取這種模式；(2)通過對(duì)標(biāo)記的或未標(biāo)記的探針或靶在施加了電壓的液相中的移動(dòng)速度或遷移率進(jìn)行檢測(cè)，即電泳技術(shù)或由電泳技術(shù)與其他技術(shù)結(jié)合而產(chǎn)生的其他技術(shù)，如毛細(xì)管電泳[capillaryelectrophoresis，CE]、毛細(xì)管區(qū)帶電泳[capillary zone electrophoresis，CZE]、毛細(xì)管凝膠電泳[CGE]、高效毛細(xì)管電泳[HPCE]、毛細(xì)管等電聚焦[capillary isoelectric focusing(CIEF)]、等速電泳[isotachophoresis(ITP)]、動(dòng)電色譜[electrokineticchromatography(EKC)]、膠束動(dòng)電毛細(xì)管色譜[micellar electrokinetic capillarychromatography(MECC OR MEKC)]、毛細(xì)管電色譜法[capillaryelectrochromatography(CEC)]、非水相毛細(xì)管電泳[non-aqueous capillaryelectrophoresis(NACE)]等，(3)通過探針、靶或探針-靶絡(luò)合物以及它們的標(biāo)記物不同的親和力，進(jìn)行色譜技術(shù)分析，如親和層析[affinity chromatography]，SEC[size exclusion chromatography]，GPC[gelpermeation chromatography]，MCC[metal chelate chromatography]等，(4)利用具有氧化還原性質(zhì)的分子或分子的部分結(jié)構(gòu)[即化學(xué)基團(tuán)或功能團(tuán)]、金屬絡(luò)合物或(核酸)嵌入劑與被定位并固定在固相表面不同位置或電極上的探針、靶或探針-靶絡(luò)合物結(jié)合并在外加適當(dāng)方式或適當(dāng)大小的電壓(或電勢(shì)差)作用(直流電壓或交變電流或脈沖電場(chǎng)或電壓)下，發(fā)生氧化還原反應(yīng)，致使從還原性分子或基團(tuán)(電子授體，electrondonor)的電子轉(zhuǎn)移到氧化性分子或基團(tuán)(電子受體，electron acceptor)，形成電子流，通過電極傳送到檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)量，所測(cè)得的電流強(qiáng)度大小與雜交并被標(biāo)記的雙鏈核酸的量成正比，(5)利用雙鏈核酸和單鏈核酸的導(dǎo)電性能差異，或利用由序列完全互補(bǔ)配對(duì)的核酸雜交所形成的雙鏈核酸分子與有錯(cuò)配堿基對(duì)(Mismatches)存在的雙鏈核酸(nucleic acids duplexes)分子之間在導(dǎo)電性能差異，通過對(duì)經(jīng)由核酸分子傳導(dǎo)的電子流大小的測(cè)量而對(duì)核酸分子由此所反映的其他方面所進(jìn)行的各種鑒別、檢測(cè)和考察，如在基因突變、基因多態(tài)性、基因測(cè)序、基因表達(dá)譜研究、疾病機(jī)理分析和疾病診斷等方面的應(yīng)用，(6)將發(fā)生在核酸分子上或由具有氧化還原性質(zhì)的物質(zhì)(包括但不限于，具有氧化還原性質(zhì)的金屬絡(luò)合物以及由金屬絡(luò)合物或金屬絡(luò)合物的衍生物為單體聚合而成的聚合物、熒光分子、核酸嵌入劑等)所發(fā)生的電子或電荷轉(zhuǎn)移反應(yīng)或電子流轉(zhuǎn)換成其他可檢測(cè)或可考察形式的檢測(cè)技術(shù)，如通過電致發(fā)光[Electroluminescence]原理，利用電致發(fā)光分子將電子流轉(zhuǎn)換為光信號(hào)所進(jìn)行的檢測(cè)，(7)直接或間接以具有氧化還原性物質(zhì)(如二茂鐵基)對(duì)探針或靶分子標(biāo)記物，通過標(biāo)記后可以使標(biāo)記物接近電極表面而發(fā)生電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)從而實(shí)現(xiàn)對(duì)發(fā)生在電極表面的生物或化學(xué)反應(yīng)的檢測(cè)。如摩托羅拉公司的eSensor Chips。
(8)通過探針、靶或探針-靶絡(luò)合物以及它們的標(biāo)記物不同的親和力，進(jìn)行色譜技術(shù)分析，如親和層析[affinity chromatography]，SEC[size exclusion chromatography]，GPC[gelpermeation chromatography]，MCC[metal chelate chromatography]、動(dòng)電色譜[electrokinetic chromatography(EKC)]、膠束動(dòng)電毛細(xì)管色譜[micellarelectrokinetic capillary chromatography(MECC OR MEKC)]、毛細(xì)管電色譜法[capillary electrochromatography(CEC)]等。
這里所說(shuō)基因芯片的高荷信號(hào)載體[HSC]是指通過任何方式將信號(hào)分子濃縮在微小顆粒內(nèi)部、表面、掛載在表面上或三者兼而有之。這些HSC包括但不限于如下類型，以各種微小顆粒形式存在的高負(fù)荷光學(xué)、磁性、電子學(xué)或電化學(xué)信號(hào)載體，它可以是量子點(diǎn)微球[QD-tagged Microbeads]、高聚物熒光微球或高分子熒光微球[polymer microspheres]或膠體微珠[latex beads]，在顆粒表面、內(nèi)部通過固定、包埋、化學(xué)共價(jià)鍵結(jié)合等方式將信號(hào)分子如熒光染料分子、化學(xué)發(fā)光分子、發(fā)色分子等濃集起來(lái)的[磁性]硅氧微珠[silica beads]、膠體發(fā)光半導(dǎo)體納米晶量子點(diǎn)[colloidal fluorescent semiconductornanocrystal quantum dots]、樹枝狀高聚物納米球[dendrimers]、星形樹枝狀高分子或樹形分子[stardendrimers，dendrimeric stars or dendrimers]、蛋白質(zhì)包裹的半導(dǎo)體納米顆?；蛭⑿☆w粒或量子點(diǎn)[如Chaperonin mediated semiconductor nanoparticles.Chaperonin中以Chaperonin GroEL蛋白和T.th cpn蛋白包裹效果最佳]、膠束[micelles]、分子磁體[molecular magnets]、膠囊式微球[encapsulated spheres]、膠體納米金[colloidal gold nanoparticles]、電致發(fā)光分子[electroluminescent molecules]、二茂金屬基共聚物微球[polymetalcene block copolymers，如二茂鐵基聚合物[polyferrocene block copolymers，PFC，或polyferrocenylsilanes，PFS]微球，多聚二茂鋯[polyzirconocene，PZC]、多聚二茂金屬基修飾或接枝的樹枝狀高分子[包括但不限于，聚二茂鐵基接枝的樹枝狀高分子(polyferrocenyl-brancheddendrimers)]、二茂金屬基或多聚二茂金屬基修飾或接枝的納米金膠體[包括但不限于，胺基二茂鐵基功能化的納米金膠體(Gold colloids functionalized with amidoferrocenyl structures)等]、共聚物微球或納米球、含有富勒烯結(jié)構(gòu)的或以富勒烯為單體之一的高聚物或共聚物、其它含熒光染料或化學(xué)發(fā)光[chemiluminescence]、生物發(fā)光[bioluminescence]材料的載體，藻膽蛋白類[phycobiliproteins]及其各種衍生物或生物或化學(xué)修飾物，以及上述每一種載體中不同參數(shù)[如大小、光學(xué)發(fā)射光波長(zhǎng)、電磁學(xué)性質(zhì)、表面生物或化學(xué)功能團(tuán)修飾等物理或化學(xué)性質(zhì)]載體的組合，或各種不同載體之間的相互組合。
本發(fā)明所要介紹的信號(hào)放大技術(shù)情景之一，是一種末端轉(zhuǎn)移酶[Terminal DeoxyribonucleotidylTransferase，簡(jiǎn)寫為TdT]介導(dǎo)的基因芯片信號(hào)放大標(biāo)記技術(shù)，其特征是，將修飾了的核苷[modifiednucleotides]和未經(jīng)修飾的核苷在該酶的作用下，利用樣品中的待測(cè)基因(DNA、RNA或寡聚核苷酸)為模板，合成修飾了的靶序列。用此新合成的靶序列與固定在基因芯片表面的基因探針進(jìn)行雜交。之后，經(jīng)洗脫過程，再用表面修飾有可與該靶序列上的報(bào)告基團(tuán)發(fā)生特異性反應(yīng)的生物或化學(xué)基團(tuán)的高荷信號(hào)載體與基因芯片上具有靶序列的雜交雙鏈進(jìn)行化學(xué)共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵偶聯(lián)，實(shí)現(xiàn)對(duì)雜交分子的特異性信號(hào)放大標(biāo)記。
TdT是一個(gè)作用與模板序列無(wú)關(guān)的的DNA聚合酶，可以在3’-末端的羥基上加一個(gè)脫氧核苷，雙鏈或單鏈上突出的、縮入的和平頭的3’-末端都可以成為TdT的底物。
本發(fā)明所要介紹的信號(hào)放大技術(shù)情景之二，是一種隨機(jī)報(bào)告引物法[Random Reporter Primer，簡(jiǎn)寫為RRP]標(biāo)記。這種方法是以隨機(jī)引物法為基礎(chǔ)的。即，由DNA聚合酶中具有5’→3’DNA合成活性的Klenow酶介導(dǎo)的基因芯片隨機(jī)引物放大標(biāo)記技術(shù)，其特征是，將修飾了的核苷[modified nucleotides]和未經(jīng)修飾的核苷在該酶的作用下，以所有可能序列的寡聚核苷酸的混合物為引物，利用樣品中的待測(cè)基因(DNA或RNA)為模板，合成修飾了的新核酸序列作為靶序列[Target Sequence，簡(jiǎn)寫為TS]。在這種報(bào)告引物合成時(shí)，我們摻入氨基烯丙基脫氧核糖核苷[aminoallyl deoxynucleotide triphosphate，簡(jiǎn)寫為aa-dNTPs]，生成帶有一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基修飾的引物。我們稱之為報(bào)告引物[Reporter Primer]。所以，以此為引物合成的TS，在5’-末端帶有一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基。稱之為報(bào)告靶序列[Reporter Target Sequence，簡(jiǎn)寫為RTS]。報(bào)告引物中的氨基數(shù)目可以在DNA合成儀合成時(shí)進(jìn)行控制，最佳數(shù)目為一個(gè)。其實(shí)即使不是一個(gè)，由于報(bào)告引物的長(zhǎng)度有限，合成的RTS在后續(xù)的標(biāo)記中會(huì)因?yàn)榭臻g位阻，達(dá)到僅有一個(gè)HSC被共價(jià)鍵偶聯(lián)標(biāo)記。
用此新合成RTS與固定在基因芯片表面的基因探針進(jìn)行雜交。之后，經(jīng)洗脫過程，再用表面修飾有可與該新模板上的功能團(tuán)發(fā)生特異性反應(yīng)的生物或化學(xué)基團(tuán)的高荷信號(hào)載體與基因芯片上具有RTS的雜交雙鏈進(jìn)行化學(xué)共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵偶聯(lián)，實(shí)現(xiàn)對(duì)雜交分子的特異性線性放大標(biāo)記。
合成的所有可能序列的隨機(jī)報(bào)告引物[RRP]混合物對(duì)樣品溶液中的模板進(jìn)行DNA或RNA合成、逆轉(zhuǎn)錄或體外轉(zhuǎn)錄等反應(yīng)，從而合成相應(yīng)的可用于雜交的報(bào)告靶序列[RTS]。在這樣的RTS在互補(bǔ)雜交到基因芯片探針上之后，與表面固定了可與報(bào)告分子反應(yīng)并發(fā)生共價(jià)偶聯(lián)的HSC反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)信號(hào)線性放大標(biāo)記。
本發(fā)明所要介紹的技術(shù)情景之三，是一種通過捕獲序列為逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)進(jìn)行定量。利用此方法，未修飾或未標(biāo)記的dNTP被分別加到試驗(yàn)cDNA和參照cDNA中，而oligo(dT)引物被加到RNA溶液中。所不同的是，這里的oligo(dT)引物含有一個(gè)捕獲序列。比如，TTTTT------表示加到試驗(yàn)RNA溶液中、而TTTTT+++++++表示加到參照RNA溶液中的捕獲序列。連接到上述引物上的兩種不同的捕獲序列分別用------和++++++表示。接著，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成的試驗(yàn)cDNA和參照cDNA混合并與基因芯片雜交。雜交和洗脫之后與高荷信號(hào)載體[HSC]標(biāo)記物一起溫浴。每個(gè)高荷信號(hào)載體[HSC]的表面分別固定有與上述捕獲序列互補(bǔ)配對(duì)的核酸序列，稱為接頭序列，用于與基因芯片表面被雜交固定的捕獲序列進(jìn)行雜交。
這樣，每一個(gè)cDNA分子只會(huì)產(chǎn)生一個(gè)信號(hào)強(qiáng)度。而且，合成的cDNA并不是一開始就被信號(hào)標(biāo)記，而是先在引物上加上一個(gè)捕獲序列，只是在溫育階段才被信號(hào)標(biāo)記。
本發(fā)明所要介紹的技術(shù)情景之四，是通過化學(xué)法在作為靶基因的DNA、RNA、PNA或寡聚核苷酸或寡聚PNA的5’-端或3’-端合成一個(gè)可以特異性地發(fā)生化學(xué)偶聯(lián)反應(yīng)并形成共價(jià)鍵連接的基團(tuán)，如氨基[-NH2]、巰基[-SH]等。在該靶基因與基因芯片上的探針雜交之后，該基團(tuán)作為報(bào)告分子可以進(jìn)一步與標(biāo)記分子[HSC]上的對(duì)應(yīng)的特異性反應(yīng)基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)，從而形成牢固的共價(jià)鍵標(biāo)記。這里的合成可以是在生物來(lái)源的DNA、RNA、PNA或寡聚核苷酸或寡聚PNA上進(jìn)行的合成一個(gè)化學(xué)功能基團(tuán)。
本發(fā)明所要介紹的技術(shù)情景之五，是直接在DNA、RNA或寡聚核苷酸酸分子合成時(shí)，在其末端加上一個(gè)這樣的特異性化學(xué)功能團(tuán)，作為后續(xù)標(biāo)記過程的報(bào)告分子。只是這樣的核酸或寡聚核苷酸酸序列根據(jù)不同的分子生物學(xué)過程，可以分別有不同的序列和功能要求。
如果靶基因是mRNA，那么可以通過合成與之5’-末端的poly(A)序列互補(bǔ)的oligo(dT)。同時(shí)，在oligo(dT)的5’-末端加上氨基或者巰基等基團(tuán)，形成5’-H2N-Oligo(dT)-3’或5’-HS-Oligo(dT)-3’等。之后，通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，在新合成的引物上，以靶基因mRNA為模板合成序列互補(bǔ)的5’-H2N-Oligo(dT)-cDNA-3’，或5’-HS-Olig(dT)-cDNA-3’新的靶基因序列。該序列將被用于與基因芯片上的基因探針直接雜交。并與后續(xù)表面固定有可與上述特異性化學(xué)功能團(tuán)[氨基、巰基等]反應(yīng)并形成共價(jià)鍵連接的基團(tuán)的高荷信號(hào)載體進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)標(biāo)記反應(yīng)。
通過酶學(xué)方法[如末端轉(zhuǎn)移酶[terminal transferase，縮寫為TT]、逆轉(zhuǎn)錄酶、(Taq)DNA聚合酶、Klenow酶[統(tǒng)稱為酶，并用字母E表示]]合成的、或化學(xué)方法合成的標(biāo)記反應(yīng)可以用如下通式表示，樣品制備、雜交和標(biāo)記過程的程式可以表示如下，1.模板(T，可以是各種單鏈或雙鏈的DNA、RNA、寡聚核苷酸或肽核酸)在酶(E)或化學(xué)作用下，形成靶序列ZNA(Y)n[ZNA可以是DNA、RNA、寡聚核苷酸或核酸類似物序列]，T→ZNA(Y)n [I]2.靶序列ZNA(Y)n與基因芯片上的核酸探針雜交，ZNA(Y)n+_XNA→_XNA:ZNA(Y)n[II]3.表面修飾有可與Y-報(bào)告基團(tuán)特異性反應(yīng)的生物或化學(xué)接頭基團(tuán)Y’-的高荷信號(hào)載體與基因芯片上的XNA:ZNA(Y)n進(jìn)行化學(xué)共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵偶聯(lián)，_XNA:ZNA(Y)n+HSC(Y’)m→_XNA:ZNA(Y)n-p[-Y-Y’-]p-HSC(Y’)m-p[III]上述n，m，p為從0到無(wú)窮大的任一自然數(shù)數(shù)值1，2，3...。但對(duì)上述技術(shù)情景之一、之三，p＝1時(shí)為最佳值。
XNA為基因芯片上的核酸探針或肽核酸探針序列，HSC為高荷信號(hào)載體。
Y-可以是但不限于地高辛-，抗地高辛抗體-、氨基[如氨基烯丙基-，aa-，N-羥基琥珀酰亞胺基]等[見下表]。
由模板制備靶序列的酶[E]和酶學(xué)作用可以是，但不限于如下方式之一或不同方式之組合，1.末端轉(zhuǎn)移酶，[Terminal Deoxyribonucleotidyl Transferase，簡(jiǎn)稱TdT]及在DNA的3’-末端加上一個(gè)[雙脫氧核苷(dideoxynucleotides，如2’，3’-雙脫氧腺嘌呤-5’-三磷酸(2′，3′-Dideoxy-adenosine 5′triphosphate，ddATP)，ddUTP，ddTTP，ddCTP)]或多個(gè)[脫氧核苷(deoxynucleotides，如(dUTP，dTTP，dCTP等)]堿基的末端轉(zhuǎn)移反應(yīng)，2.逆轉(zhuǎn)錄酶，包括但不限于Superscript II RT、禽白血病毒(Avian MyoblastosisVirus，AMV)逆轉(zhuǎn)錄酶和小鼠反轉(zhuǎn)錄病毒(MMLV)逆轉(zhuǎn)錄酶，或者StrataScript逆轉(zhuǎn)錄酶、PowerScript逆轉(zhuǎn)錄酶，可用于逆轉(zhuǎn)錄過程中摻入媒介核苷，如Taq酶，3.DNA聚合酶，如Taq酶，大腸埃希菌或大腸桿菌DNA聚合酶I，4.具有5’→3’DNA合成活性的DNA聚合酶的Klenow片段，5.RNA聚合酶，如SP6，T7和T3噬菌體RNA聚合酶[phage RNA polymerases]，可用于體外轉(zhuǎn)錄[in vitro transcription]法標(biāo)記，Superscript II RT，6.DNA聚合酶I[polymerase I]。
Y-功能團(tuán)修飾核苷[modified nucleotides]可以是，但不限于1.氨基烯丙基-核苷，如氨基烯丙基-dUTP[aa-dUTP]，2.生物素化的雙脫氧核苷，如生物素化的雙脫氧尿嘧啶[biotin-16-ddUTP]、3. 地高辛修飾的雙脫氧核苷，如DIG-11-ddUTP，雙脫氧尿嘧啶三磷酸[djdeoxyuridine-triphosphate]，如(e.g-，IG-ddUTP)，其中的Y-和Y’-可以分別是，但不限于如下表所示的反應(yīng)對(duì)之一或它們的組合；
這些修飾核苷的特點(diǎn)是，可以在核酸合成、轉(zhuǎn)錄或逆轉(zhuǎn)錄過程中，能夠在酶的作用下，被摻入到合成后的靶基因序列中去。
本發(fā)明的間接標(biāo)記反應(yīng)，可以是，但不限于如下過程之一或不同過程之組合，(1)末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Terminal Deoxyribonucleotidyl Transferase，縮寫為TdT)作用下將三磷酸脫氧核苷酸中的單磷酸核苷轉(zhuǎn)移到DNA分子的3′-端羥基上的反應(yīng)。末端脫氧核苷酸[TdT]轉(zhuǎn)移過程。
(2)用Klenow酶的5’→3’DNA合成活性、以所有可能的堿基序列的寡聚核苷酸酸之混合物為引物的DNA合成過程，隨機(jī)引物標(biāo)記反應(yīng)，(3)在逆轉(zhuǎn)錄酶[Reverse transcriptase]作用下對(duì)mRNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，(4)用捕獲序列連接的寡聚核苷酸酸引物進(jìn)行的雜交標(biāo)記反應(yīng)。
HSC表示以各種微小顆粒形式存在的高負(fù)荷光學(xué)、磁性、電子學(xué)或電化學(xué)信號(hào)載體，它可以是高聚物或共聚物熒光微球、表面或內(nèi)部固定有熒光染料或其他信號(hào)分子的硅氧[或者二氧化硅]微小顆粒[silicabeads]、半導(dǎo)體等無(wú)機(jī)物的量子點(diǎn)[quantum dots]、半導(dǎo)體等無(wú)機(jī)物納米晶[nanocrystal particles]、樹枝狀高聚物納米球[dendrimers]、星形樹枝狀高聚物納米球[dendrimeric stars]、膠束[micelles]、分子磁體[molecular magnets]、膠囊式微球[encapsulated spheres]、膠體納米金[colloidal gold nanoparticles]、電致發(fā)光分子[electroluminescent molecules]、多聚二茂金屬共聚物微球[polymetalcene block copolymers，如多聚二茂鐵共聚物[polyferrocene block copolymers，PFC]微球，多聚二茂鋯[polyzirconocene，PZC]共聚物微球或納米球、含有富勒烯結(jié)構(gòu)的或以富勒烯為單體之一的高聚物或共聚物、其它含熒光染料或化學(xué)發(fā)光[chemiluminescence]、生物發(fā)光[bioluminescence]材料的載體，以及上述每一種載體中不同參數(shù)[如大小、光學(xué)發(fā)射光波長(zhǎng)、電磁學(xué)性質(zhì)、表面生物或化學(xué)功能團(tuán)修飾等物理或化學(xué)性質(zhì)]載體的組合，或各種不同載體之間的相互組合，其表面修飾有可以與通式(I)，(II)，(III)化合物中的探針分子接頭Y’-特異性反應(yīng)的功能團(tuán)或作用對(duì)Y-。
實(shí)例一用生物素或地高辛修飾的雙脫氧核苷的末端標(biāo)記該種方法的特點(diǎn)是只在每個(gè)被標(biāo)記模板基因或靶基因的末端僅定量標(biāo)記一個(gè)特異性功能團(tuán)Y-，從而可以保障信號(hào)線性比例放大。當(dāng)Y-為生物素基-、或地高辛基時(shí)，技術(shù)過程如下一、樣品制備用地高辛修飾的雙脫氧尿嘧啶三磷酸[簡(jiǎn)寫為DIG-ddUTP]或生物素化的雙脫氧尿嘧啶三磷酸[簡(jiǎn)寫為Biotin-ddUTP]核苷進(jìn)行寡核苷酸的3’-末端標(biāo)記。
末端轉(zhuǎn)移酶[Terminal Transferase]可用來(lái)在單鏈[ssDNA]、雙鏈[dsDNA]以及寡聚核苷酸[oligonucleotides]的3’-末端加上單個(gè)經(jīng)修飾的雙脫氧尿嘧啶三磷酸[dideoxyuridine triphosphate]，如(e.g ，DIG-ddUTP)。過程如下1.將純化的試驗(yàn)組寡聚核苷酸溶解在無(wú)菌的雙蒸水中，2.在雙蒸水中，制備1mM的X-ddUTP[X＝DIG-，Biotin-，氨基烯丙基(aminoallyl-)或氨基己基(aminocaproyl-)等]，3.將下述成分在冰浴中加入到微離心管1)4μl的5×反應(yīng)緩沖溶液[1M鉀，0.125M Tris-HCl，1.25mg/mlBSA；pH6.6，25℃](試管1)。2)4μl的25mM CoCl2(試管2)。3)100pmole寡聚核苷酸[模板或靶基因，或cDNA]。4)1μl 1mM DIG-ddUTP(試管3)，或1μl 1mM Biotin-ddUTP。5)1μl(50U)末端轉(zhuǎn)移酶(200mM甲次砷酸鉀[potassium cacodylate]，1mM EDTA，200mM KCl，0.2mg/ml，小牛血清蛋白[BSA])，50％丙三醇[glycerol]，pH6.5[25℃](試管4).6)加入雙蒸水直至中容量20μl.
4.將上述反應(yīng)成分充分混合并簡(jiǎn)單離心，5.在37℃下溫育15分鐘，然后放置到冰上。
6.用下述方法之一終止反應(yīng)1)將200μl 0.2M EDTA(pH8.0)和1μl的糖原質(zhì)溶液混合[濃度為20mg/ml的雙蒸水]。
2)在反應(yīng)混合物加2μl的糖原質(zhì)-EDTA混合液。
7.用下述步驟沉淀標(biāo)記了的寡聚核苷酸[可選步驟][1]在反應(yīng)試管中，加入2.5μl 4M的LiCl和75μl預(yù)先在-15℃到-25℃冰鎮(zhèn)的絕對(duì)乙醇。充分混勻[2]在-70℃沉淀30分鐘；[3]在13,000×g和2-8℃條件下離心15分鐘；[4]棄上清液；[5]用50μl冰鎮(zhèn)的70％(v/v)洗滌沉淀小粒；[6]在2-8℃條件下離心5分鐘；[7]棄上清液；[8]在真空下干燥沉淀小粒。
8.將沉淀小粒溶解在微量無(wú)菌、雙蒸水中，然后在雜交緩沖溶液中稀釋等量的探針溶液以適合直接使用。
9.用上述與步驟1-8同樣方法制備一個(gè)參照組報(bào)告分子標(biāo)記的cDNA或寡聚核苷酸溶液。
生物素化的雙脫氧尿嘧啶三磷酸[Biotin-16-ddUTP]、地高辛修飾的雙脫氧尿嘧啶三磷酸[Digoxigenin-11-ddUTP]、重組末端轉(zhuǎn)移酶[自E.Coli]等購(gòu)自Roche Applied Science公司。其它常規(guī)試劑有市售。
二、雜交下述過程介紹將兩種樣品[標(biāo)記了的參照組cDNA和試驗(yàn)組cDNA]雜交到一個(gè)寡聚核苷酸微點(diǎn)陣上去。
材料總?cè)莘e為42ul試驗(yàn)組和對(duì)照組報(bào)告分子標(biāo)記了的cDNA或寡聚核苷酸溶液[各21ul]20×，SSC(Ambion Cat#9765)，10％SDS，雜交室，寡聚核苷酸微點(diǎn)陣；98℃ heating block；42℃水??；2X雜交緩沖溶液50％甲醛，10x SSC，0.2％SDS技術(shù)流程1.加入12ul競(jìng)爭(zhēng)性DNA mix；2.確定樣品體積，并加水直到總體積為54微升，3.將樣品在98℃加熱3分鐘，4.將2x雜交緩沖溶液和上述cDNA或寡聚核苷酸報(bào)告分子標(biāo)記溶液在42℃下溫育20分鐘，5.將玻片微點(diǎn)陣在100℃的dH2O中加熱10min，再用輕緩空氣流干燥，6.將蓋玻片洗凈、干燥并放置在玻片微點(diǎn)陣上，7.將60ul(1x體積)的2X雜交緩沖液加入到上述cDNA或寡聚核苷酸報(bào)告分子標(biāo)記溶液并充分混合，8.將雜交溶液加載到蓋玻片下面；通過毛細(xì)管作用讓雜交溶液緩慢從微點(diǎn)陣的一端被吸向另一端，并覆蓋微點(diǎn)陣的全部面積。
9.將2個(gè)各5ul的2X SSC加注到雜交溶液未覆蓋的部位。
10.封閉雜交室并沉浸在42℃的水浴中過夜。
11.將玻片微點(diǎn)陣從雜交室中移走。
12.將其浸入一個(gè)50ml的裝有45ml 2X SSC/0.1％SDS的試管中，并使蓋玻片通過重力作用自然與玻片微點(diǎn)陣分離。
13.將微點(diǎn)陣轉(zhuǎn)移到一個(gè)新裝有45ml 2X SSC/0.1％SDS的試管中，并在室溫下輕輕振動(dòng)5分鐘。
14.重復(fù)步驟13。
15.將微點(diǎn)陣轉(zhuǎn)移到一個(gè)新裝有45ml 2X SSC的試管中，并在室溫下輕輕振動(dòng)5分鐘。
16.重復(fù)步驟15。
17.將微點(diǎn)陣轉(zhuǎn)移到一個(gè)新裝有45ml 2X SSC的試管中，并在室溫下輕輕振動(dòng)5分鐘。
18.重復(fù)步驟17。
19.將微點(diǎn)陣浸入到0.06X SSC的溶液中并轉(zhuǎn)移到一個(gè)離心管中。
20.將玻片微點(diǎn)陣從0.06X SSC溶液中那走，并放入一個(gè)空試管中，并立即在800rpm離心2-3min。
要確保微點(diǎn)陣在離心前處于濕潤(rùn)狀態(tài)。
三、標(biāo)記標(biāo)記過程即是使高荷信號(hào)載體[HSC]表面固定的可與靶基因上連接的報(bào)告分子特異性反應(yīng)的基團(tuán)或分子與之反應(yīng)并形成共價(jià)鍵偶聯(lián)的過程。為此，需首先合成這種HSC。以本實(shí)施例中作為報(bào)告分子的生物素而言，應(yīng)該合成表面固定有親和素的HSC。[合成過程參見本人的中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)基因芯片酶法微球放大標(biāo)記。申請(qǐng)?zhí)枺?31420818]。
四、洗脫洗脫緩沖溶液ASDS 2％，2X SSC。洗脫緩沖溶液BSDS 1％，0.06X SSC。
洗脫緩沖溶液CddH2O。
1.將cDNA或寡聚核苷酸微點(diǎn)陣從經(jīng)過標(biāo)記處理過程的反應(yīng)室中取出，2.轉(zhuǎn)移到裝有400ml 1X洗脫緩沖溶液A的Wash Station。
3.在20-25℃下強(qiáng)力洗滌5min。
4.轉(zhuǎn)移到裝有400ml 1X洗脫緩沖溶液B的Wash Station.
5.在20-25℃下強(qiáng)力洗滌5min.
6.轉(zhuǎn)移到裝有400ml 1X洗脫緩沖溶液C的Wash Station.
7.在20-25℃下強(qiáng)力洗滌2min。
8.用實(shí)驗(yàn)用擦紙將微點(diǎn)陣上的剩余緩沖溶液瀝干。
9.在500×g條件下離心。
10.在掃描上對(duì)微點(diǎn)陣進(jìn)行掃描，獲取熒光圖像。
實(shí)例二用氨基修飾的雙脫氧腺嘌呤的末端標(biāo)記該種方法的原理和過程與實(shí)例一相同。其中，Y-為氨基-[-NH2]。而Y’-為NHS酯。
胺基修飾的雙脫氧核苷三磷酸為3’-氨基-2’，3’-雙脫氧腺嘌呤-5’-三磷酸(3′-amino-2′，3’-dideoxyadenosine-5′-triphosphate)，簡(jiǎn)寫為3’-amino-ddATP，或AddATP。(TriLinkBiotechnologies Inc，San Diego，CA)]。
實(shí)例三用氨基修飾的雙脫氧胞嘧啶的末端標(biāo)記該種方法的原理和過程與實(shí)例一相同。其中，Y-為氨基-[-NH2]。而Y’-為NHS酯。
胺基修飾的雙脫氧核苷三磷酸為3’-氨基-2’，3’-雙脫氧胞嘧啶-5’-三磷酸(3’-amino-2’，3’-dideoxycytidine-5’-triphosphate)，簡(jiǎn)寫為3’-amino-ddCTP，或AddCTP.(TriLinkBiotechnologies Inc，San Diego，CA)]。
實(shí)例四用氨基修飾的雙脫氧鳥嘌呤的末端標(biāo)記該種方法的原理和過程與實(shí)例一相同。其中，Y-為氨基-[-NH2]。而Y’-為NHS酯。
胺基修飾的雙脫氧核苷三磷酸為3’-氨基-2’，3’-雙脫氧鳥嘌呤-5’-三磷酸(3’-amino-2’，3’-dideoxyguanosine-5’-triphosphate)，簡(jiǎn)寫為3’-amino-ddGTP，或AddGTP。(TriLinkBiotechnologies Inc，San Diego，CA)]。
實(shí)例五用氨基修飾的雙脫氧鳥嘌呤的末端標(biāo)記該種方法的原理和過程與實(shí)例一相同。其中，Y-為氨基-[-NH2]。而Y’-為NHS酯。
胺基修飾的雙脫氧核苷三磷酸為3’-氨基-2’，3’-雙脫氧尿嘧啶-5’-三磷酸(3’-amino-2′，3’-dideoxyuridine-5’-triphosphate)，簡(jiǎn)寫為3’-amino-ddUTP，或AddUTP。(TriLinkBiotechnologies Inc，San Diego，CA)]。
實(shí)例六通過捕獲序列和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行定量Stears，Robin L.等人利用樹狀分子[Dendrimer]通過捕獲序列對(duì)微點(diǎn)陣進(jìn)行信號(hào)放大可以將RNA樣品需求量減少16倍。本實(shí)施例使用熒光微球等為HSC。本方法允許在單個(gè)基因芯片上進(jìn)行多通道檢測(cè)。和樹狀分子一樣，由于熒光微球等在信號(hào)放大能力上優(yōu)于前者，所以會(huì)產(chǎn)生更高的信噪比，并更容易對(duì)雜交在基因芯片上的cDNA單個(gè)計(jì)數(shù)，從而確立較之于樹狀分子更好的計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)。
另外，本實(shí)施例所使用的方法比DNA樹狀分子方法更簡(jiǎn)單、快捷。
在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中，目前通用的將熒光分子修飾核苷酸摻入進(jìn)去的Cy3/Cy5方法需要大量的起始樣品，多達(dá)50μg的總RNA或1μg的mRNA。
本實(shí)施例以高分子熒光微球或二氧化硅熒光微球?yàn)镠SC。
1.HSC結(jié)合探針的合成經(jīng)修飾的逆轉(zhuǎn)錄(Modified RT，簡(jiǎn)稱mRT)引物序列合成如下(由Integrated DNA Technologies公司)(5’to 3’)cap3D1，g gCg ggA CAg AAg ACg CgC AgT gAgTCg gCC，oligo d(T)，cap3D2，A CCg gAg Cgg CAC ggg AAA ATg AgC AAC Agg，oligo dT。1皮摩爾的mRT引物可用于40μg的總RNA分析。
2.HSC含有下列接頭序列用于RT反應(yīng)cpl3D1(與cap3D1互補(bǔ))，ggC CgA CTC ACT gCg CgTCTT CTg TCC CgC C；cpl3D2(與cap3D2互補(bǔ))，CCT gTT gCT CTA TTT CCC gTg CCgCTC Cgg T(Genisphere)。
3.RT反應(yīng)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的GIBCO，SuperScript RT II技術(shù)流程進(jìn)行。反應(yīng)進(jìn)行完成之后，加入3.5μl的0.5M NaOH/50mM EDTA，并且被加熱到65℃ 10min以使DNA/RNA雜交雙鏈變性解鏈。
4.用5μl的1M Tris，pH 7.5溶液中和該反應(yīng)。對(duì)于雙重標(biāo)記(雙色標(biāo)記)的檢測(cè)，用直接摻入法Cy3/Cy5RT反應(yīng)技術(shù)流程見Stears R.L.等人和DeRisi JL等人的所介紹的高密度DNA微點(diǎn)陣直接標(biāo)記法進(jìn)行。
5.對(duì)于HSC檢測(cè)，2.0μl兩種各自不同激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)[分別為543nm/570nm和640nm/675nm]的二氧化硅熒光微球[激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)接近Cy3-和Cy5-標(biāo)記系統(tǒng)](上海邁克沃生物科技公司)被重新懸浮于15μl的4×SSC-2％SDS并被施加到微點(diǎn)陣玻璃片上。微點(diǎn)陣用蓋玻片蓋好，在基因芯片雜交室(Telechem International)中和65℃條件下溫育6-8h。按Stears R.L.等人和DeRisiJL等人的所介紹的方法雜交、洗脫并在ScanArray 3000激光共聚焦掃描儀(GSI Lumonics)上進(jìn)行檢測(cè)。
6.信號(hào)和本底噪音用Imagene的定量軟件進(jìn)行定量分析。以微點(diǎn)陣網(wǎng)格中每個(gè)圓圈中的平均像素光強(qiáng)度信號(hào)作為信號(hào)測(cè)定值。以微點(diǎn)陣中沒有cDNA的空白點(diǎn)的平均像素光強(qiáng)度為平均本底噪音[背景]并被作為網(wǎng)格圓圈外部平均像素的光強(qiáng)度，用于計(jì)算特定的信號(hào)值。
7.HSC試劑制備選取 表面修飾有伯胺基的上述兩種光學(xué)特性的二氧化硅熒光微球[上海邁克沃生物科技公司]為HSC。通過DNA合成儀合成5′-末端為巰基的5′-SH-mRT引物序列。進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)時(shí)，通過離心沉淀將HSC沉淀為固態(tài)小粒，溶解在絕對(duì)乙醇中。在室溫條件下，在試管內(nèi)加入上述HSC、5′-SH-mRT引物序列以及雙異功能基的聚乙烯醇[PEG]連接臂[NHS-PEG-MAL]的絕對(duì)乙醇溶液，經(jīng)化學(xué)偶聯(lián)反應(yīng)合成表面固定有接頭序列的HSC-(NH-CO-PEG-MAL-S-5′-mRT-3′)n，簡(jiǎn)寫為HSC-(mRT)n。反應(yīng)混合物再經(jīng)離心沉淀、棄去上清液、再次將沉淀溶解在絕對(duì)乙醇中、用絕對(duì)乙醇洗滌沉淀小粒。在避光、-20℃存儲(chǔ)。使用時(shí)，用無(wú)菌雙蒸水制備的1％SDS溶液溶解沉淀小粒至固體物濃度為1-5％。
8.半導(dǎo)體量子點(diǎn)作為HSC 因?yàn)槊總€(gè)半導(dǎo)體量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度一致性比較強(qiáng)，標(biāo)準(zhǔn)誤差較小，一般可以控制在4-5％，所以，作為標(biāo)記試劑的標(biāo)準(zhǔn)問題參見Stears Robin L.等人的方法確定。
9.高分子或二氧化硅熒光微球作為HSC試劑的標(biāo)準(zhǔn)化 對(duì)這兩種光學(xué)微球，雖然它們的標(biāo)準(zhǔn)誤差較樹狀分子大，一般隨著體積增大，直徑標(biāo)準(zhǔn)誤差變小。比如Duke Scientific公司的高分子熒光微球的CV[coefficient of variation]一般直徑在0.90um時(shí)，CV＜3％；0.03微米時(shí)，直徑的CV＜-20％。由于基因芯片的標(biāo)記實(shí)驗(yàn)通常是大量分子的標(biāo)記，所以，比較可行的方法是對(duì)這種標(biāo)記進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析。首先，用體式熒光顯微鏡[Nikon或Olympus]對(duì)散布在空白玻片上限定區(qū)域內(nèi)的熒光微球進(jìn)行人工計(jì)數(shù)。然后，在基因芯片激光共聚焦掃描儀上，對(duì)該限定區(qū)域上在激發(fā)光激發(fā)下發(fā)生的熒光信號(hào)總強(qiáng)度進(jìn)行積分。這樣就可以求得平均每個(gè)HSC的信號(hào)強(qiáng)度。獲得這個(gè)平均值之后，可以根據(jù)基因芯片的檢測(cè)中測(cè)得的某個(gè)基因點(diǎn)的熒光總強(qiáng)度求的其統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的固定在該點(diǎn)上的雜交基因的個(gè)數(shù)。
實(shí)例七通過報(bào)告分子和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行定量本實(shí)施例與實(shí)例六相近。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件和過程與實(shí)例六相同或相近。它是直接在DNA、RNA或寡聚核苷酸酸分子合成時(shí)，在其末端加上一個(gè)特異性生物或化學(xué)功能團(tuán)，作為后續(xù)標(biāo)記過程的報(bào)告分子。通式I、II、III中，XNA為mRNA，ZNA為5’-Oligo(dT)-引物序列-cDNA-3’，ZNA(Y)n為5’-H2N-Oligo(dT)-引物序列-cDNA-3’或5’-HS-Oligo(dT)-引物序列-cDNA-3’等，HSC-Y′n中的Y′-為琥珀酰亞胺酯或馬來(lái)酰亞胺酯，E為逆轉(zhuǎn)錄酶[Reverse Transcriptase，RT]，化學(xué)偶聯(lián)標(biāo)記反應(yīng)過程同實(shí)例六。
實(shí)例八隨機(jī)報(bào)告引物法(Random Reporter Primer Method，簡(jiǎn)稱RRP方法)使用TriLink Biotechnologies公司生產(chǎn)的5’-末端帶有C12連接臂的氨基修飾的寡聚核苷酸。合成帶有5′-C12-NH2各種可能序列的六聚核苷酸[Hexamers]或八聚核苷酸[Octomers][3′-oligonucleotide-5′-OPO3--(CH2)n-NH2，n為自然數(shù)。產(chǎn)品號(hào)0-0003、0-0004、0-0005等]作為RT反應(yīng)引物，即RRP。用Charlie C.Xiang等人的RNA純化、逆轉(zhuǎn)錄、雜交、洗脫及檢測(cè)條件，進(jìn)行試驗(yàn)。
HSC可以選取Duke Scientific，Molecular Probes等公司的表面修飾氨基的熒光聚苯乙烯微球。HSC標(biāo)記反應(yīng)過程—化學(xué)偶聯(lián)參見實(shí)例六。
實(shí)例九用氨基烯丙基核苷酸合成RRP在合成cDNA時(shí)，以氨基烯丙基核苷酸，如氨基烯丙基dUTP[5-Aminoallyl—2′-deoxyuridine-5′-Triphosphate(TriLink Biotechnologies，Inc)]為RRP，通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成用于與基因芯片雜交的cDNA。其他反應(yīng)過程及條件可參見實(shí)例六。
實(shí)例十用氨基烯丙基核苷酸合成RRP在合成cDNA時(shí)，以氨基烯丙基核苷酸，如氨基烯丙基dCTP[5-Aminoallyl-2′-deoxycytidine-5′-Triphosphate，TriLink Biotechnologies，Inc]為RRP，通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成用于與基因芯片雜交的cDNA。其他反應(yīng)過程及條件可參見實(shí)例九。
實(shí)例十一5’-氨基-Oligo-dT報(bào)告引物法(5’-amino-Oligo-dT Reporter Primer Method，簡(jiǎn)稱5’-H2N-OT-RP)在cDNA合成中，用5’-NH2修飾過的Oligo-dT合成5’-NH2-Linker-Oligo(dT)-OH-3’為報(bào)告引物，通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成5’-NH2-Linker-Oligo(dT)-cDNA-OH-3’。其他反應(yīng)過程及條件可參見實(shí)例九。
實(shí)例十二5′-巰基-Ollgo-dT-3’報(bào)告引物法(簡(jiǎn)稱5’-HS-OT-RP)在cDNA合成中，用5’-末端C6巰基連接臂修飾過的Oligo-dT合成5’-HS-C6-Oligo(dT)-OH-3’[TriLink Biotechnologies，Inc]]為報(bào)告引物，通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成5’-HS-C6-Oligo(dT)-cDNA-OH-3’。HSC(Y’)中的Y’為氨基，雙異功能團(tuán)連接臂仍然選用NHS-PEG-MAL或NHS-PEG-VS[琥珀酰亞胺基-聚乙二醇(連接臂)-乙烯基砜]。偶聯(lián)反應(yīng)過程見實(shí)例六。其他反應(yīng)過程及條件見實(shí)例九。
實(shí)例十三5′-巰基-RP-3’報(bào)告引物法(簡(jiǎn)稱5’-HS-RRP-3’)在cDNA合成中，用客戶訂做的方法合成各種可能序列的5’-末端-C6-巰基連接臂修飾過的六聚核苷酸或八聚核苷酸5’-HS-C6-RP-OH-3’，作為5’-巰基隨機(jī)報(bào)告引物(5′-HS-RRP-3)[TriLinkBiotechnologies，Inc提供此業(yè)務(wù)。產(chǎn)品編號(hào)O-0016]，通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成5’-HS-cDNA-OH-3’。HSC(Y’)中的Y’為氨基，雙異功能團(tuán)連接臂仍然選用NHS-PEG-MAL或NHS-PEG-VS[琥珀酰亞胺基-聚乙二醇(連接臂)-乙烯基砜]。偶聯(lián)反應(yīng)過程見實(shí)例六。其他反應(yīng)過程及條件見實(shí)例九。
實(shí)例十四 5′-羧基-RP-3′報(bào)告引物法(簡(jiǎn)稱5’-HOOC-RRP-3′)在cDNA合成中，用客戶訂做的方法合成各種可能序列的5’-末端-羧基-DADE連接臂修飾過的六聚核苷酸或八聚核苷酸5’-HOOC-DADE-RP-OH-3’，作為5’-巰基隨機(jī)報(bào)告引物(5′-HOOC-RRP-3)[TriLink Biotechnologies，Inc提供此業(yè)務(wù)。產(chǎn)品編號(hào)O-0015]，通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成5’-HOOC-cDNA-OH-3’。RP為六聚核苷酸或八聚核苷酸。
HSC(Y’)中的Y’為氨基。偶聯(lián)反應(yīng)過程無(wú)須使用雙異功能團(tuán)連接臂。選用水溶性碳二亞胺[1-ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)carbodiimide，EDAC]為偶聯(lián)劑。其他反應(yīng)過程及條件見實(shí)例九。共價(jià)偶聯(lián)反應(yīng)如下熒光微球，10％固體濃度，250μl。EDAC，40mg。
緩沖液ANaH2PO4-10mM，pH 6.0。
偶聯(lián)方法1.將所有可能序列的5′-HOOC-RRP-3′混合物溶解在緩沖溶液A中。
2.在5毫升的玻璃試管中，將1000μl的緩沖溶液A與250微升10％的HSC混合。
3.將EDAC溶解在緩沖溶液A中，至最終濃度為20mg/ml。
4.將125μl的溶解的EDAC加入到稀釋的HSC懸浮液中，混合。
5.將上述混合物在室溫下輕微振蕩溫育2小時(shí)，或在4℃下過夜。
6.用緩沖溶液A洗滌兩次并重新懸浮于下述雜交緩沖溶液中。
實(shí)例十五氯甲基化的HSC與氨基烯丙基-RRP在合成cDNA時(shí)，以氨基烯丙基核苷酸，如氨基烯內(nèi)基dCTP[5-Aminoallyl-2′-deoxycytidine-5′-Triphosphate，TriLink Biotechnologies，Inc]合成RRP，再通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成用于與基因芯片雜交的cDNA。
HSC(Y’)n選用Merck Eurolab France公司的表面修飾了氯甲基的熒光微球。Y’-為氯甲基[CH2Clgroup]。HSC-[CH2Cl]n與氨基的共價(jià)偶聯(lián)方法如下1.將10％(100mg/ml)的ESTAPOR_微球用洗滌/偶聯(lián)緩沖溶液(1ml/10ml)洗滌兩次。緩沖溶液為PBS，pH7.5。
2.在5毫升的洗滌/偶聯(lián)緩沖溶液中重新懸浮[超聲波或搖擺法振蕩]。
3.將RRP溶解在5毫升的洗滌/偶聯(lián)緩沖溶液中。
4.在室溫和不斷振蕩下，反應(yīng)3-4小時(shí)。洗滌，并將之重新懸浮在10毫升的反應(yīng)終止溶液中，室溫下輕度振搖混合30分鐘。反應(yīng)終止溶液的伯胺基來(lái)源30-40mM羥胺[hydroxylamine]，乙醇胺[ethanolamine]或甘氨酸[glycine]等，含有0.05-1％(w/v)封閉分子[Blocking molecules](BSA，Casein，Pepticase，Tween 20，Triton X-100，PE G，Sera，或者IgG).
5.洗滌，并以10mg/ml濃度重新懸浮于存儲(chǔ)緩沖溶液[存儲(chǔ)緩沖溶液pH 7-7.5有0.01-0.1％(w/v)封閉分子和NaN3(0.09％).]。
6.存儲(chǔ)到4℃直到應(yīng)用。
其他反應(yīng)過程及條件可參見實(shí)例九。
權(quán)利要求
1.一種間接法基因芯片線性放大標(biāo)記技術(shù)，其特征是，以各種核酸分子、核酸分子結(jié)構(gòu)類似物或其分子的某個(gè)片段為模板，在通過生物或化學(xué)作用下制備成可直接與基因芯片上的探針分子進(jìn)行雜交的靶序列，在該靶序列的末端連接有報(bào)告基團(tuán)[Y-]，該報(bào)告基團(tuán)用來(lái)與雜交后通過特異性分子識(shí)別作用與其進(jìn)行連接、并被固定在高荷信號(hào)載體[HSC]表面的映象基團(tuán)[Y’-]進(jìn)行化學(xué)或生物偶聯(lián)，從而形成針對(duì)雜交事件的特異性的信號(hào)放大標(biāo)記。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因芯片，是由基底及其表面的鍍層或涂層和固定在基底[縮寫為S]或鍍層[縮寫為C]表面的不少于兩個(gè)陣列式排列的捕獲探針組成，用于檢測(cè)樣品中的基因靶基因，基底和/或鍍層或涂層的材料可以由但不限于如下材料中任意一種或一種以上不同材料組合制成(1)無(wú)機(jī)物片狀材料類如玻璃、石英、云母，透明導(dǎo)電材料如透明導(dǎo)電氧化物類[TCO]，如氧化銦錫[indium tin oxide，ITO，或?qū)憺镮n2O3:Sn]、SnO2:F、砷化鎵[GaAs]、氧化鎂等鍍層，氧化錫[tin oxide，SnO]，ZnO，CdO，CdIn2O4，Cd2SnO4，Zn2SnO4和In2O3-ZnO等，以及碳/陶復(fù)合導(dǎo)電陶瓷，各種半導(dǎo)體材料等，(2)單質(zhì)類鉑、金、銀、鋁、鉻[Au，Ag，Pt，Cu，Rh，Pd，Al，Cr]等金屬以及硅非金屬等，(3)有機(jī)物類各種有機(jī)分子及其由此制成的自組裝單分子膜或自組裝多分子膜，(4)高分子類尼龍膜、醋酸纖維素膜、各種塑料、橡膠、樹脂，基底的結(jié)構(gòu)可以是但不限于如下種類(1)薄片式如玻璃片、硅片、尼龍膜、塑料片、微孔板，微滴板式等，(2)電極式在薄片式基因芯片上以一定規(guī)律排列而成的各種電極陣列，如在半導(dǎo)體、絕緣體等基底上制成的鉑電極、金電極等，(3)微管式由毛細(xì)管或有毛細(xì)管管狀內(nèi)腔結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的其它材料，按預(yù)先設(shè)定的位置對(duì)應(yīng)規(guī)則排列而成的各種矩陣式毛細(xì)管基因芯片[二維平面排列]、線形毛細(xì)管基因芯片[一維線形排列]、以及在基片式結(jié)構(gòu)中制作出的各種不少于一個(gè)微管道式空腔結(jié)構(gòu)的矩陣式并行排列[即微流體電泳芯片等]，(4)微粒式以微小顆粒為固相載體，生物分子或化學(xué)分子被固定在其表面，通過微小顆粒的大小、[發(fā)光]顏色、表面電勢(shì)、表面電荷密度等性質(zhì)元素進(jìn)行分類組合從而產(chǎn)生出大量不同組合的微粒，分別用某一特定組參數(shù)的組合[某一尺寸和某發(fā)光波長(zhǎng)等的特殊組合---編碼]的微小顆粒作為某生物或化學(xué)分子的載體，從而可以用大量不同且特殊編碼微小顆粒制成基因芯片。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的模板[T]、探針[P]和靶序列[TS]可以是，但不限于如下種類之一或不同種類的組合(1)核糖核酸[RNA]，各種核糖核酸[″ribonucleic acid″ and″RNA]，包括信使RNA[簡(jiǎn)稱mRNA]、轉(zhuǎn)錄RNA[簡(jiǎn)稱tRNA]、反義核糖核酸[aRNA]、互補(bǔ)RNA[cRNA]等，(2)脫氧核糖核酸[DNA]如DNA，互補(bǔ)DNA[cDNA]等，(3)寡核苷酸[oligonucleotide]，包括寡聚脫氧核糖核酸[oligodeoxynucleotide，簡(jiǎn)稱ODNs]，寡聚核糖核酸[oligoribonucleotide，ORNs]，多聚核苷酸[polynucleotide]，(4)核酸結(jié)構(gòu)相似物[DNA-DNA，RNA-RNA or RNA-DNA mimic duplexes，triplexes or quadroplexes，等]]如肽核酸[pcptide nucleic acids，簡(jiǎn)稱PNA]，(5)脫氧核糖核酸、核糖核酸及其結(jié)構(gòu)相似物的互補(bǔ)雙鏈、三[重]鏈、四[重]鏈等形式的雜交分子如DNA-DNA、RNA-DNA、RNA-RNA、PNA-DNA，PNA-RNA，PNA-RNA-PNA，PNA-DNA-PNA]等，基因芯片的檢測(cè)原理可以是，但不限于如下種類之一或不同原理的結(jié)合(1) 通過對(duì)固相表面定位在不同位置的探針-靶特異性雜交反應(yīng)進(jìn)行光學(xué)信號(hào)[如熒光分子、化學(xué)發(fā)光等]標(biāo)記，然后經(jīng)激發(fā)產(chǎn)生熒光、化學(xué)或生物發(fā)光并進(jìn)行檢測(cè)，(2)通過對(duì)標(biāo)記的或未標(biāo)記的探針或靶在施加了電壓的液相中的移動(dòng)速度或遷移率進(jìn)行檢測(cè)，即電泳技術(shù)或由電泳技術(shù)與其他技術(shù)結(jié)合而產(chǎn)生的其他技術(shù)，如毛細(xì)管電泳[capillary electrophoresis，CE]、毛細(xì)管區(qū)帶電泳[capillary zone electrophoresis，CZE]、毛細(xì)管凝膠電泳[CGE]、高效毛細(xì)管電泳[HPCE]、毛細(xì)管等電聚焦[capillary isoelectric focusing(CIEF)]、等速電泳[isotachophoresis(ITP)]、動(dòng)電色譜[electrokinetic chromatography(EKC)]、膠束動(dòng)電毛細(xì)管色譜[micellar electrokinetic capillary chromatography(MECC OR MEKC)]、毛細(xì)管電色譜法[capillary electrochromatography(CEC)]、非水相毛細(xì)管電泳[non-aqueous capillary electrophoresis(NACE)]等，(3)通過探針、靶或探針-靶絡(luò)合物以及它們的標(biāo)記物不同的親和力，進(jìn)行色譜技術(shù)分析，如親和層析[affinity chromatography]，SEC[size exclusion chromatography]，GPC[gel permeationchromatography]，MCC[metal chelate chromatography]等，(4)利用具有氧化還原性質(zhì)的分子或分子的部分結(jié)構(gòu)[即化學(xué)基團(tuán)或功能團(tuán)]、金屬絡(luò)合物或(核酸)嵌入劑與被定位并固定在固相表面不同位置或電極上的探針、靶或探針-靶絡(luò)合物結(jié)合并在外加適當(dāng)方式或適當(dāng)大小的電壓(或電勢(shì)差)作用(直流電壓或交變電流或脈沖電場(chǎng)或電壓)下，發(fā)生氧化還原反應(yīng)，致使從還原性分子或基團(tuán)(電子授體，electron donor)的電子轉(zhuǎn)移到氧化性分子或基團(tuán)(電子受體，electron acceptor)，形成電子流，通過電極傳送到檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)量，所測(cè)得的電流強(qiáng)度大小與雜交并被標(biāo)記的雙鏈核酸的量成正比，(5)利用雙鏈核酸和單鏈核酸的導(dǎo)電性能差異，或利用由序列完全互補(bǔ)配對(duì)的核酸雜交所形成的雙鏈核酸分子與有錯(cuò)配堿基對(duì)(Mismatches)存在的雙鏈核酸(nucleic acids duplexes)分子之間在導(dǎo)電性能差異，通過對(duì)經(jīng)由核酸分子傳導(dǎo)的電子流大小的測(cè)量而對(duì)核酸分子由此所反映的其他方面所進(jìn)行的各種鑒別、檢測(cè)和考察，如在基因突變、基因多態(tài)性、基因測(cè)序、基因表達(dá)譜研究、疾病機(jī)理分析和疾病診斷等方面的應(yīng)用，(6)將發(fā)生在核酸分子上或由具有氧化還原性質(zhì)的物質(zhì)(包括但不限于，具有氧化還原性質(zhì)的金屬絡(luò)合物以及由金屬絡(luò)合物或金屬絡(luò)合物的衍生物為單體聚合而成的聚合物、熒光分子、核酸嵌入劑等)所發(fā)生的電子或電荷轉(zhuǎn)移反應(yīng)或電子流轉(zhuǎn)換成其他可檢測(cè)或可考察形式的檢測(cè)技術(shù)，如通過電致發(fā)光[Electroluminescence]原理，利用電致發(fā)光分子將電子流轉(zhuǎn)換為光信號(hào)所進(jìn)行的檢測(cè)，(7)直接或間接以具有氧化還原性物質(zhì)(如二茂鐵基)對(duì)探針或靶分子標(biāo)記物，通過標(biāo)記后可以使標(biāo)記物接近電極表面而發(fā)生電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)從而實(shí)現(xiàn)對(duì)發(fā)生在電極表面的生物或化學(xué)反應(yīng)的檢測(cè)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因芯片線性放大標(biāo)記技術(shù)，其樣品制備、雜交、標(biāo)記反應(yīng)模式可以是，但不限于如下通式所描述的情景之一或不同情景之組合，樣品制備、雜交和標(biāo)記過程的程式可以表示如下，a)模板(T，可以是各種單鏈或雙鏈的DNA、RNA、寡聚核苷酸或肽核酸)在酶(E)學(xué)作用、化學(xué)作用或酶學(xué)作用和化學(xué)作用共同作用下，形成靶序列ZNA(Y)n[ZNA可以是DNA、RNA、寡聚核苷酸或核酸類似物序列]，T→ZNA(Y)n [I]b)靶序列ZNA(Y)n與基因芯片上的核酸探針雜交，ZNA(Y)n+_XNA→_XNA:ZNA(Y)n [II]c)表面修飾有可與Y-報(bào)告基團(tuán)特異性反應(yīng)的生物或化學(xué)映象基團(tuán)Y’-的高荷信號(hào)載體與基因芯片上的XNA:ZNA(Y)n進(jìn)行化學(xué)共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵偶聯(lián)，_XNA:ZNA(Y)n+HSC(Y’)m→_XNA:ZNA(Y)n-p[-Y-Y’-]p-HSC(Y’)m-p[III]上述n，m，p為從0到無(wú)窮大的任一自然數(shù)數(shù)值1，2，3...，XNA為基因芯片上的核酸探針或肽核酸探針序列，HSC為高荷信號(hào)載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的由模板制備靶序列的酶和酶學(xué)作用可以是，但不限于如下方式之一或不同方式之組合，a)末端轉(zhuǎn)移酶[Terminal Deoxyribonucleotidyl Transferase，簡(jiǎn)稱TdT]，及在DNA的3’-末端加上一個(gè)[雙脫氧核苷酸(dideoxynucleotides，如2’，3’-雙脫氧腺嘌呤-5’-三磷酸(2′，3′-Dideoxy-adenosine 5′-triphosphate，ddATP)，ddUTP，ddTTP，ddCTP)]或多個(gè)[脫氧核苷酸(deoxynucleotides，如(dUTP，dTTP，dCTP等))帶有報(bào)告基團(tuán)的堿基的末端轉(zhuǎn)移反應(yīng)，從而生成報(bào)告靶序列，b)具有5’→3’DNA合成活性的DNA聚合酶的Klenow片段[酶]，通過隨機(jī)報(bào)告引物法[Random Reporter Primer，簡(jiǎn)寫為RRP]在該酶的作用和由一個(gè)報(bào)告基團(tuán)和一個(gè)核酸或肽核酸引物兩部分通過共價(jià)鍵連接而成的報(bào)告引物[Reporter Primer]的驅(qū)動(dòng)下，合成報(bào)告靶序列[Reporter Target Sequence，RTS]，c)逆轉(zhuǎn)錄酶，包括但不限于Superscript II RT、禽白血病毒(AvianMyoblastosis Virus，AMV)逆轉(zhuǎn)錄酶和小鼠反轉(zhuǎn)錄病毒(MMLV)逆轉(zhuǎn)錄酶，或者StrataScript逆轉(zhuǎn)錄酶、PowerScript逆轉(zhuǎn)錄酶，可用于逆轉(zhuǎn)錄過程中摻入媒介核苷，如Taq酶，d)DNA聚合酶，如Taq酶，大腸埃希菌或大腸桿菌DNA聚合酶I，，DNA聚合酶I[polymerase I]，e)RNA聚合酶，如SP6，T7和T3噬菌體RNA聚合酶[phage RNA polymerases]，可用于體外轉(zhuǎn)錄[in vitro transcription]法標(biāo)記，Superscript II RT。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的由模板制備靶序列的化學(xué)作用可以是，但不限于如下方式之一或不同方式之組合，a)隨機(jī)報(bào)告引物法[Random Reporter Primer，簡(jiǎn)寫為RRP]標(biāo)記，通過合成所有可能序列的報(bào)告引物[Reporter Primer]為從模板合成報(bào)告靶序列做好準(zhǔn)備，b)合成修飾了的脫氧核苷酸或雙脫氧核苷酸，為末端轉(zhuǎn)移法合成靶序列提供帶有報(bào)告基團(tuán)的核苷酸結(jié)構(gòu)類似物，c)合成帶報(bào)告基團(tuán)的寡聚核苷酸作為報(bào)告引物，如合成帶有5’-氨基報(bào)告基團(tuán)的寡聚胸腺嘧啶[5’-氨基-Oligo-dT]，為合成帶有5’-氨基報(bào)告基團(tuán)的cDNA靶序列做好準(zhǔn)備，所帶的報(bào)告基團(tuán)[Y-]還可以是，但不限于巰基、羧基、羥基、氯甲基、生物素和地高辛。
7.根據(jù)權(quán)利要求1、權(quán)利要求4和權(quán)利要求6所述的Y-和Y’-可以分別是，但不限于如下表所示的反應(yīng)對(duì)之一或它們的組合
8.據(jù)權(quán)利要求1中所述的高荷信號(hào)載體[HSC]可以是，但不限于，以各種微小顆粒形式存在的高負(fù)荷光學(xué)、磁性、電子學(xué)或電化學(xué)信號(hào)載體，它可以是量子點(diǎn)微球[QD-tagged Microbeads]、高聚物熒光微球或高分子熒光微球[polymer microspheres]或膠體微珠[latex beads]，在顆粒表面、內(nèi)部通過固定、包埋、化學(xué)共價(jià)鍵結(jié)合等方式將信號(hào)分子如熒光染料分子、化學(xué)發(fā)光分子、發(fā)色分子等濃集起來(lái)的[磁性]硅氧微珠[silica beads]、膠體發(fā)光半導(dǎo)體納米晶量子點(diǎn)[colloidal fluorescent semiconductor nanocrystal quantumdots]、樹枝狀高聚物納米球[dendrimers]、星形樹枝狀高分子或樹形分子[stardendrimers，dendrimeric starsor dendrimers]、蛋白質(zhì)包裹的半導(dǎo)體納米顆?；蛭⑿☆w粒或量子點(diǎn)[如Chaperonin mediatedsemiconductor nanoparticles.Chaperonin中以Chaperonin GroEL蛋白和T.th cpn蛋白包裹效果最佳]、膠束[micelles]、分子磁體[molecular magnets]、膠囊式微球[encapsulated spheres]、膠體納米金[colloidal goldnanoparticles]、電致發(fā)光分子[electroluminescent molecules]、二茂金屬基共聚物微球[polymetalcene blockcopolymers，如二茂鐵基聚合物[polyferrocene block copolymers，PFC，或polyferrocenylsilanes，PFS]微球，多聚二茂鋯[polyzirconocene，PZC]、多聚二茂金屬基修飾或接枝的樹枝狀高分子[包括但不限于，聚二茂鐵基接枝的樹枝狀高分子(polyferrocenyl-branched dendrimers)]、二茂金屬基或多聚二茂金屬基修飾或接枝的納米金膠體[包括但不限于，胺基二茂鐵基功能化的納米金膠體(Gold colloidsfunctionalized with amidoferrocenyl structures)等]、共聚物微球或納米球、含有富勒烯結(jié)構(gòu)的或以富勒烯為單體之一的高聚物或共聚物、其它含熒光染料或化學(xué)發(fā)光[chemiluminescence]、生物發(fā)光[bioluminescence]材料的載體，藻膽蛋白類[phycobiliproteins]及其各種衍生物或生物或化學(xué)修飾物，以及上述每一種載體中不同參數(shù)[如大小、光學(xué)發(fā)射光波長(zhǎng)、電磁學(xué)性質(zhì)、表面生物或化學(xué)功能團(tuán)修飾等物理或化學(xué)性質(zhì)]載體的組合，或各種不同載體之間的相互組合。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的酶法標(biāo)記反應(yīng)，可以是，但不限于如下過程之一或不同過程之組合，(2)反轉(zhuǎn)錄或逆轉(zhuǎn)錄過程[Reverse Transcription]，(3)體外轉(zhuǎn)錄過程，[in vitro transcription](4)缺口翻譯過程或缺口轉(zhuǎn)移過程或缺口平移過程[Nick Translation]，(5)末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移過程，(6)末端核苷酸轉(zhuǎn)移過程，(7)DNA合成反應(yīng)過程或RNA合成反應(yīng)過程，(8)DNA連接反應(yīng)，(9)DNA[限制性內(nèi)切酶作用下的]酶切反應(yīng)，(10)磷酶酶作用下將DNA末端中的5’-端磷酸基除去，使其5’-端變成了OH基的反應(yīng)，(11)T4多聚核苷酸激酶(T4 polynucleotide kinase)作用下將ATP中γ位上的磷酸基轉(zhuǎn)移到具有5′-端羥基的DNA或RNA分子上的反應(yīng)，(12)末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Terminal Deoxyribonucleotidyl Transferase，縮寫為TdT)作用下將三磷酸脫氧核苷酸中的單磷酸核苷轉(zhuǎn)移到DNA分子的3′-端羥基上的反應(yīng)，(13)牛胰腺脫氧核糖核酸酶I(DNaseI)作用下降解雙鏈DNA為5′-磷酸低聚核苷酸的反應(yīng)，(14)核酸酶RNaseA作用下特異性地作用于嘧啶核苷酸的反應(yīng)，(15)核酸酶RNaseH作用下，專一性地分解DNA/RNA雜交分子中的RNA分子，從而在cDNA合成過程中除去eDNA-RNA中的RNA鏈的反應(yīng)。
10.一種根據(jù)權(quán)利要求1制作的間接法基因芯片線性放大標(biāo)記[iLAL]試劑盒，即iLAL試劑盒，包含了基因芯片處理各過程所需要的全部生化試劑，其特征是，含有但不限于權(quán)利要求4的如下通式中所涉及的核心組分通式(I)、通式(II)、通式(III)。
全文摘要
本發(fā)明的目的是為基因芯片產(chǎn)品提供一套利用酶學(xué)或化學(xué)的方法和熒光、生物化學(xué)發(fā)光等各種納米微球作為高荷信號(hào)載體大幅度提升檢測(cè)靈敏度，經(jīng)濟(jì)實(shí)用性的信號(hào)放大標(biāo)記技術(shù)及試劑盒。同時(shí)解決直接法標(biāo)記中非線性標(biāo)記而出現(xiàn)的無(wú)法精確定量、靈敏度不足、成本高昂等缺陷，使產(chǎn)生的熒光信號(hào)強(qiáng)度與基因表達(dá)中或?qū)嶋H雜交到基因芯片上的實(shí)際豐度成放大的正比例關(guān)系。本發(fā)明中的技術(shù)方案同時(shí)解決了基因芯片直接標(biāo)記中cDNA的雜交效率對(duì)標(biāo)記過程的影響問題。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1607258SQ20031010791
公開日2005年4月20日 申請(qǐng)日期2003年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月15日
發(fā)明者宋克 申請(qǐng)人:宋克