專利名稱：大白菜提高光合作用效率蛋白編碼序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種蛋白編碼序列，特別是一種大白菜提高光合作用效率蛋白編碼序列，屬于基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
光系統(tǒng)II反應(yīng)中心是一個(gè)鑲嵌在葉綠體類囊體膜中的多亞基的色素-蛋白膜脂復(fù)合物，其特殊之處在于能夠催化水的裂解來釋放氧氣從而維持整個(gè)地球大氣層中氧氣含量的穩(wěn)定。光系統(tǒng)II復(fù)合物包含25個(gè)以上不同亞基，結(jié)合著大約250個(gè)左右的色素分子。高等植物中另有表觀分子量為33、23和17kD的3個(gè)外周蛋白結(jié)合于PSII的囊腔側(cè)，對PSII放氧活力的維持起重要作用，其中33kD蛋白對錳簇具有保護(hù)作用，又被稱為錳穩(wěn)定蛋白(Manganese Stabilizing Protein，MSP)，它是與氧釋放關(guān)系最為密切的外周蛋白，也是和PSII內(nèi)周蛋白的結(jié)合力是3個(gè)外周蛋白中最強(qiáng)的蛋白。在對現(xiàn)有文獻(xiàn)的分析中，雖然“Biochemistry(生物化學(xué))，1998，371565-1574”對33-kDa蛋白的功能已經(jīng)做了充分肯定，指出沒有該蛋白高等植物的光合作用的氧釋放就不能進(jìn)行，但該文沒有明確指明33-kDa蛋白具有提高作物產(chǎn)量的功能，至今尚未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明主題有密切聯(lián)系文獻(xiàn)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種大白菜提高光合作用效率蛋白編碼序列。使其在在利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良植物光合作用上具有明顯的作用，對提高植物的產(chǎn)量有所幫助。我國的農(nóng)作物在很多地區(qū)存在者產(chǎn)量低、不穩(wěn)產(chǎn)的因素，提高農(nóng)作物的光合效率是解決這一問題的有效方法，本發(fā)明的光系統(tǒng)II基因提高光合作用效率正具備這項(xiàng)功能，具有很大的應(yīng)用前景。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的在本發(fā)明所分離出的DNA分子，該分子包括編碼具有大白菜提高光合作用效率蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸第10-708位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在45-50℃條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸第10-708位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸第10-708位的核苷酸序列。
本發(fā)明分離出的大白菜光合作用相關(guān)蛋白質(zhì)多肽，它包括具有SEQ ID NO.3氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.3序列的多肽。
本發(fā)明所提供的載體，它包含上述的DNA分子。一種核酸分子，它包含所述的DNA分子中8-100個(gè)連續(xù)核苷酸。
本發(fā)明用上述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，它是真核細(xì)胞。在實(shí)例中該宿主細(xì)胞是擬南芥。
在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組分分開，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。
在本發(fā)明中，術(shù)語“大白菜光合作用蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有大白菜光合作用蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中第10-708位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的編碼框第10-708位核苷酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO.3中第10-708位核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO.3所述的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳的在高度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸第10-708位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語還包括與SEQ ID NO.3中從核苷酸第10-708位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
該術(shù)語還包括能編碼具有與天然的大白菜光合作用相同功能的蛋白的SEQ IDNO.3中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-90個(gè)，較佳地1-60個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以內(nèi)，較佳地為30個(gè)以內(nèi)，更佳地為10個(gè)以內(nèi)，最佳地為5個(gè)以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，術(shù)語“大白菜光合作用蛋白或多肽”指具有大白菜光合作用蛋白活性的SEQ ID NO.3序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與天然大白菜光合作用相關(guān)相同功能的、SEQ ID NO.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括大白菜光合作用相關(guān)蛋白的活性片段和活性衍生物。
本發(fā)明的大白菜光合作用多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊條件下能與大白菜光合作用相關(guān)DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用大白菜光合作用多肽的血清獲得的多肽或蛋白。
在本發(fā)明中，“大白菜光合作用保守性變異多肽”指與SEQ ID NO.3的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)氨基酸性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行替換而產(chǎn)生。
表1


表291％ identity in 1076 nt overlapQuery49 gtggccatggcagcctctctccaatccgccgccacattcctccagtccgcaaaaatctcc 108|||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||| || || || |||Sbjct1gtggccatggcagcctctctccaatccgccaccacattcctccagtcggcgaagatttcc 60V A M A A S L Q S A A T F L Q S A K I SQuery109 accgctccttctcgcggcagtgctcacctccgttcgactcagaccgtcggcaaatcgttc 168|||||||||||||| ||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||| |||Sbjct61 accgctccttctcgtggcagtgctcacctccggtcgactcagaccgtcggcaaatcattc 120T A P S R G S A H L R S T Q T V G K S FQuery169 ggcctagagacttcttctgcacgcctcacttgttccttccaatctgacatcaaagacttt 228|| ||||| ||||| ||||| |||||||||||||||||||| |||||| |||| |||||Sbjct121 gggctagaaacttcctctgctcgcctcacttgttccttccagtctgacttcaaggacttc 180G L E T S S A R L T C S F Q S D I K D FQuery229 gccggaaaatgctccgacgctgttaaaatcgccggattcgctcttgcaacctctgctctc 288||||| ||||||||||||||||| || ||||||||||| || || |||||||||||||||Sbjct181 gccggcaaatgctccgacgctgtcaagatcgccggatttgcgctagcaacctctgctctc 240A G K C S D A V K I A G F A L A T S A LQuery289 gtcgtctcgggagcaagtgcagagggagctccgaagagactcacttatgacgagatacag 348||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||| | ||||| || |||||||||Sbjct241 gtcgtctcgggagcaagtgcagaaggagctccgaagagattgacttacgatgagatacag 300V V S G A S A E G A P K R L T Y D E I QQuery349 agcaagacatacatggaagtcaaaggaaccggaactgccaaccagtgtccaactattgac 408|||||||||||||||||||| || ||||| ||||| ||||||||||| ||||| ||||||Sbjct301 agcaagacatacatggaagtgaagggaactggaaccgccaaccagtgcccaaccattgac 360S K T Y M E V K G T G T A N Q C P T I DQuery409 ggtggctctgagactttctccttcaaacccggtaagtacgctggcaagaagttctgcttc 468||||||||||||||||||||||||||||| || |||||||| ||||||||||||||||||Sbjct361 ggtggctctgagactttctccttcaaaccgggaaagtacgccggcaagaagttctgcttc 420G G S E T F S F K P G K Y A G K K F C FQuery469 gagcctacttccttcaccgtcaaagccgagagtgttagcaagaacgcacctcctgagttt 528||||||||||||||||||||||| || ||||||||||||||||||||||||||||| ||Sbjct421 gagcctacttccttcaccgtcaaggctgagagtgttagcaagaacgcacctcctgacttc 480E P T S F T V K A E S V S K N A P P E FQuery529 cagaataccaagctcatgacccgtctcacctacacccttgacgaaatcgaaggccccttt 588||||| ||||||||||||||||||||||||||||| |||||||| ||||||||||||||Sbjct481 cagaacaccaagctcatgacccgtctcacctacactcttgacgagatcgaaggccccttc 540Q N T K L M T R L T Y T L D E I E G P FQuery589 gaggtttcttcagacggaaagcgtgaacttcaagaaagaagacggaatcgactacgctgc 648||||||||||| ||||||| |||||| |||||| |||||||||||||||||||||||||Sbjct541 gaggtttcttctgacggaagccgtgaagttcaaggaagaagacggaatcgactacgctgc 600E V S S D G K R E L Q E R R R N R L R CQuery649 agtcactgttcagcttccaggaggcgagcgtgtgccgttcctcttcacagccaagcagct 708|||||| || ||||||||||||||| | ||||||| |||||||||| | |||||||||Sbjct601 agtcaccgtccagcttccaggaggccaacgtgtgc--gtcctcttcacggtcaagcagct 658S H C S A S R R R A C A S H C S A S R R
Query709 tgacgcctcgggcaaaccagacaacttcac-tggc-aaattcttggtcccgtggtaccgt 766||||||||| ||||||||||||||||||| |||| |||||||| ||||| | |||||||Sbjct659 tgacgcctc-agcaaaccagacaacttcacttggcaaaattcttagtcccttcgtaccgt 717R A C AQuery767 ggctcgtccttcttggacccaaagggtcgtggtggatcctcaggatatgacaacgccgtt 826||||| |||||||||||||||||||| |||||||||||| |||||||||| |||||||||Sbjct718 ggctcctccttcttggacccaaagggccgtggtggatccccaggatatga-aacgccgtt 776Query827 gcattgccagctggaggcagaggagacgaagaggagctttcgaaggagaacgtgaagaac 886||||||||||||| |||||||||||||||||||||||| || ||||||||||||||||||Sbjct777 gcattgccagctgaaggcagaggagacgaagaggagctctcaaaggagaacgtgaagaac 836Query887 acggcagcttcggtgggagagatcactttgaaagtgaccaagagcaaaccggagacagga 946||||||||||||||||| |||||| || |||||||||| |||||||||||||||||||||Sbjct837 acggcagcttcggtgggtgagatccctctgaaagtgacaaagagcaaaccggagacagga 896Query947 gaagtgatcggagtgttcgagagtcttcacccgtcggatactgacttgggtgccaaggta 1006|||||||| ||||||||||||||||| || ||||| ||||||||||||||||||||||||Sbjct897 gaagtgattggagtgttcgagagtctccagccgtctgatactgacttgggtgccaaggta 956Query1007 ccaaaggatgtgaagatccaaggggtgtggtatggtcaacttgag---tgatcatgttat 1063||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||Sbjct957 ccaaaggatgtgaagatccaaggggtgtggtatggtcaacttgagtgatgatcatgttat 1016Query1064 -tatatcaaaacattttcttctgttaattgtatttgatgataatgagaacatcttttcat 1122|||||||||||| |||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||| ||Sbjct1017 ctatatcaaaaca---tcttctgttaattgtattcgatgataatgagaacatcttttgat 1073Query1123 gct 1125|||Sbjct1074 gct 1076Query大白菜光合作用相關(guān)蛋白提高光合作用效率的核酸序列Sbjct甘藍(lán)型油菜光系統(tǒng)II 33kDa氧釋放蛋白基因核酸序列(AF139818)
表2為本發(fā)明的大白菜光合作用蛋白(提高光合作用效率)與甘藍(lán)型油菜光系統(tǒng)II氧釋放蛋白(AF139818)的核苷酸序列的同源比較(GAP)表。
表387％ identity in 233aa overlap，89％ similarity in 233aa overlapQuery16 MAASLQSAATFLQSAKISTAPSRGSAHLRSTQTVGKSFGLETSSARLTCSFQSDIKDFAG 75MAASLQS ATFLQSAKI+TAPSRGS+HLRSTQ VGKSFGLETSSARLTCSFQSD KDF GSbjct1 MAASLQSTATFLQSAKIATAPSRGSSHLRSTQAVGKSFGLETSSARLTCSFQSDFKDFTG 60Query76 KCSDAVKIAGFALATSALVVSGASAEGAPKRLTYDEIQSKTYMEVKGTGTANQCPTIDGG 135KCSDAVKIAGFALATSALVVSGASAEGAPKRLTYDEIQSKTYMEVKGTGTANQCPTIDGGSbjct61 KCSDAVKIAGFALATSALVVSGASAEGAPKRLTYDEIQSKTYMEVKGTGTANQCPTIDGG 120Query136 SETFSFKPGKYAGKKFCFEPTSFTVKAESV---------------RLTYTLDEIEGPFEV 180SETFSFKPGKYAGKKFCFEPTSFTVKA+SV RLTYTLDEIEGPFEVSbjct121 SETFSFKPGKYAGKKFCFEPTSFTVKADSVSKNAPPEFQNTKLMTRLTYTLDEIEGPFEV 180Query181 SSDG 184+SDGSbjct181 ASDG 184Query大白菜光合作用相關(guān)蛋白提高光合作用效率的氨基酸序列Sbjct甘藍(lán)型油菜光系統(tǒng)II 33kDa氧釋放蛋白氨基酸序列(AAK96774)表3為本發(fā)明的大白菜光合作用蛋白(提高光合作用效率)與甘藍(lán)型油菜光系統(tǒng)II氧釋放蛋白的氨基酸序列的同源比較(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在兩個(gè)序列之間用氨基酸單字符標(biāo)出。
發(fā)明還包括大白菜光合作用蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然光合作用相關(guān)多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然Ｐ揎椷€包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒，粘粒等。在生產(chǎn)本發(fā)明的大白菜光合作用多肽時(shí)，可以將大白菜光合作用編碼序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，從而形成大白菜光合作用蛋白表達(dá)載體。
如本發(fā)明所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時(shí)，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細(xì)胞”為真核細(xì)胞。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、煙草細(xì)胞和其它植物細(xì)胞。
還可用Northern印跡法技術(shù)分析大白菜光合作用基因產(chǎn)物的表達(dá)，即分析大白菜光合作用的RNA轉(zhuǎn)錄物在細(xì)胞中的存在與否和數(shù)量。
此外，本發(fā)明中可用作探針的核酸分子，該分子通常具有大白菜光合作用核苷酸編碼序列的8-100個(gè)連續(xù)核苷酸，較佳地具有15-50個(gè)連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼大白菜光合作用相關(guān)的核酸分子。
本發(fā)明涉及檢測樣品中是否存在大白菜光合作用相關(guān)核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對應(yīng)于大白菜光合作用相關(guān)核苷酸編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長度一般為15-50個(gè)核苷酸。
此外，根據(jù)本發(fā)明的大白菜光合作用核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表達(dá)蛋白質(zhì)的同源性基礎(chǔ)上，篩選大白菜光合作用相關(guān)同源基因或同源蛋白。
為了得到與大白菜光合作用相關(guān)基因相關(guān)的大白菜cDNAs的點(diǎn)陣，可以用DNA探針篩選大白菜cDNA文庫，這些探針是在低嚴(yán)緊條件下，用32P對大白菜光合作用相關(guān)的全部或部分做放射活性標(biāo)記而得的。最適合于篩選的cDNA文庫是來自大白菜的文庫。構(gòu)建來自感興趣的細(xì)胞或者組織的cDNA文庫的方法是分子生物學(xué)領(lǐng)域眾所周知的。另外，許多這樣的cDNA文庫也可以購買到，例如購自Clontech，Stratagene，Palo Alto，Cal.。這種篩選方法可以識別與大白菜光合作用相關(guān)的基因家族的核苷酸序列。
本發(fā)明的大白菜光合作用相關(guān)核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
除了用重組法產(chǎn)生之外，本發(fā)明蛋白的片段還可用固相技術(shù)，通過直接合成肽而加以生產(chǎn)(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WHFreeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 852149-2154)。在體外合成蛋白質(zhì)可以用手工或自動進(jìn)行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成儀(Foster City，CA)來自動合成肽?？梢苑謩e化學(xué)合成本發(fā)明蛋白的各片段，然后用化學(xué)方法加以連接以產(chǎn)生全長的分子。
利用本發(fā)明的大白菜光合作用蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與大白菜光合作用相關(guān)發(fā)生相互作用的物質(zhì)，或者受體、抑制劑或拮劑等。
本發(fā)明在光合作用中具有明顯的作用，對提高植物的產(chǎn)量有所幫助。我國的農(nóng)作物在很多地區(qū)存在者產(chǎn)量低、不穩(wěn)產(chǎn)的因素，提高農(nóng)作物的光合效率是解決這一問題的有效方法，本發(fā)明的光系統(tǒng)II基因提高光合作用效率正具備這項(xiàng)功能。因此，具有很大的應(yīng)用價(jià)值。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)室具體的試驗(yàn)數(shù)據(jù)和結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或者也可以按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1大白菜光合作用基因的克隆1.組織分離(isolation)大白菜(品種為“日喀則一號”)，將大白菜置于28℃發(fā)芽24小時(shí)，然后播種于溫室中，待大白菜葉片為4-5片時(shí)，準(zhǔn)備抽取DNA或RNA。
2.RNA的分離(RNA isolation)取部分組織，用研缽研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP管，充分振蕩后，再移入玻璃勻漿器內(nèi)。勻漿后移至1.5mL EP管中，抽提總RNA(TRIzol Reagents，GIBCO BRL，USA)。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量，然后在分光光度計(jì)上測定RNA含量。
3.基因的全長克隆(Cloning of Full-length cDNA)根據(jù)擬南芥光系統(tǒng)II基因的氨基酸保守序列，利用同源性基因克隆原理，采用RACE方法(GibcoBRL試劑盒)進(jìn)行cDNA全長克隆，分三個(gè)階段進(jìn)行(1)RT-PCRPCR[BP001(SEQ ID NO.1)+BP002(SEQ ID NO.2)]得到2002BP(782bp)，回收，連接到pGEMT-Easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，采用終止物熒光標(biāo)記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進(jìn)行測序。測序結(jié)果用GCG軟件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數(shù)據(jù)庫(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及編碼蛋白與已知十字花科植物如擬南芥(Arabidopsis thaliana)光合氧釋放基因的同源性很高，故初步認(rèn)為它是一個(gè)光合作用基因。
(2)3’-RACEPCR[AP+BP003(5’-GACGGAAAGCGTGAACTTCAAG-3’)] 得到2002BP3’(356bp)，回收，連接到T-Easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，采用終止物熒光標(biāo)記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進(jìn)行測序。測序結(jié)果用GCG軟件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數(shù)據(jù)庫(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及編碼蛋白與已知十字花科植物如擬南芥(Arabidopsis thaliana)光合氧釋放基因的同源性很高，故初步認(rèn)為它是一個(gè)與光合作用相關(guān)基因。
(3).5’-RACE第一輪PCR [AAP+BP004(5’-TGAAGAAACCTCAAAGGGGCCT--3’)]第二輪PCR[(AUAP+BPR005(5’-TCGGAGCTCCCTCTGCACTTGC-3’))得到2001BP 5’(約500bp)(過程同(1))將測序結(jié)果的重疊區(qū)拼接，發(fā)現(xiàn)過程(1)得到的片段既是該基因的完整編碼區(qū)。
BLAST的結(jié)果證明從大白菜中新得到的基因確為一個(gè)與植物光合作用相關(guān)的基因。
通過組合使用上述3種方法，獲得了候選的大白菜光合作用相關(guān)蛋白的全長編碼序列(SEQ ID NO.3)。
實(shí)施例2大白菜光合作用相關(guān)基因的序列信息與同源性分析本發(fā)明新的大白菜光合作用全長cDNA的長度為1151bp，詳細(xì)序列見SEQ ID NO.3，其中開放讀框位于10-708位核苷酸(699個(gè)核苷酸)。根據(jù)全長cDNA推導(dǎo)出大白菜光合作用的氨基酸序列，共233個(gè)氨基酸殘基，分子量為25.11kDa，等電點(diǎn)(pI)為9.53。詳細(xì)序列見SEQ ID NO.3。
將大白菜光合作用相關(guān)的全長cDNA序列及其編碼蛋白質(zhì)用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行核苷酸和蛋白質(zhì)同源性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與甘藍(lán)型油菜光系統(tǒng)II氧釋放基因(AF139818)在核苷酸水平上具有91％的相同性，(附表2)；在氨基酸水平上，它與甘藍(lán)型油菜抑制光系統(tǒng)II氧釋放蛋白(AAK96774)也有87％的相同性(附表3)。由此可見，大白菜光合作用基因提高光合作用效率與甘藍(lán)型油菜光系統(tǒng)II氧釋放蛋白無論從核酸還是蛋白水平上都存在較高的同源性。甘藍(lán)型油菜光系統(tǒng)II氧釋放蛋白已經(jīng)被證明與光合作用中氧釋放具有明顯的作用，故可以認(rèn)為提高光合作用效率在促進(jìn)光合作用上也具有相似的作用。
實(shí)施例3大白菜光合作用相關(guān)蛋白或多肽在擬南芥中進(jìn)行真核細(xì)胞表達(dá)及轉(zhuǎn)基因植株的光合作用性鑒定含目的基因(大白菜提高光合作用效率基因)的表達(dá)載體的構(gòu)建，根據(jù)大白菜光合作用相關(guān)的全長序列(SEQ ID NO.3)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整編碼閱讀框的引物，并在上游和下游引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(這可視選用的載體而定)，以便構(gòu)建表達(dá)載體。以實(shí)施例1中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將大白菜光合作用基因cDNA克隆至中間載體(如pB1uescript)，進(jìn)一步克隆到雙元表達(dá)載體(如pBI121和改進(jìn)的pCAMBIA2300)，在保證閱讀框架正確的前提下鑒定好的表達(dá)載體，再將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，利用葉盤法技術(shù)轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥。
1.發(fā)苗種子用無菌水漂洗15-20分鐘，再用70％的乙醇消毒1分鐘，然后用0.1％升汞消毒10-12分鐘。最后再用無菌水沖洗5遍。將洗好的種子用吸水紙吸干，放入MS培養(yǎng)基。光照培養(yǎng)5天，待苗長到4-5厘米便可以剪苗。
2.剪苗剪取0.5-1厘米的下胚軸小片段放入預(yù)培養(yǎng)基，培養(yǎng)2天。預(yù)培養(yǎng)基MS+6BA(0.2mg/l)+2.4D(1.2mg/l)3.轉(zhuǎn)化共培養(yǎng)將預(yù)培養(yǎng)2天的下胚軸放入事先培養(yǎng)好的菌液中(OD值0.4-0.6)侵染3-5分鐘。接著取出放入預(yù)培養(yǎng)基暗培養(yǎng)2天。
4.篩選培養(yǎng)共培養(yǎng)結(jié)束后，將外植體放入篩選培養(yǎng)基。2周繼代一次。2-4周有愈傷組織形成和芽的分化。待綠芽長到2厘米后，切下生根。
篩選培養(yǎng)基MS+6BA(4.5mg/l)+NAA(0.1mg/l)+AgNO3(6mg/l)+cb(250mg/l)+Kan(20mg/l)生根培養(yǎng)基MS+NAA(0.5mg/l)+cb(250mg/l)+Kan(5mg/l)5.轉(zhuǎn)化植株培養(yǎng)；待根系發(fā)達(dá)后，將植株取出，用無菌水洗凈附著的固體培養(yǎng)基，移入土壤中，剛開始用玻璃罩罩幾天，待植株健壯后再取下玻璃罩，溫室中培養(yǎng)。
含大白菜提高光合作用效率基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的光合作用鑒定鑒于編碼提高光合作用效率，如擬南芥的psbO的基因已被證明是光系統(tǒng)II基因，而大白菜提高光合作用效率轉(zhuǎn)錄水平與擬南芥的psbO具有較高的同源性，在進(jìn)一步對含大白菜提高光合作用效率的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株進(jìn)行光合作用性鑒定。用黑暗(室溫)處理轉(zhuǎn)基因植株3天，以正常光照的轉(zhuǎn)基因植株為對照，以便研究提高光合作用效率基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)情況。Northern blot分析結(jié)果證明，轉(zhuǎn)基因植株的提高光合作用效率轉(zhuǎn)錄水平基因在黑暗3天處理后其表達(dá)量顯著降低，而正常植株提高光合作用效率轉(zhuǎn)錄水平較高。在正常光照的情況下，采用相同的管理方式，含大白菜提高光合作用效率的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株比沒有轉(zhuǎn)基因的擬南芥的生長速度明顯加快，突出表現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因植株明顯比為轉(zhuǎn)基因植株高大。證明提高光合作用效率基因?qū)夂献饔镁哂写_切的性，大白菜提高光合作用效率基因?qū)⒖捎糜诶棉D(zhuǎn)基因技術(shù)改良植物光合作用的研究和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中。
大白菜光合作用基因提高光合作用效率在大白菜中的拷貝數(shù)分析采用常規(guī)方法從大白菜葉片中提取DNA(參考《分子克隆》，Sambrook等，1989)，分別用SnaBI，KpnI和HindIII酶切DNA[13μg(微克)/樣品]后，將DNA轉(zhuǎn)至雜交膜(尼龍膜)上后。使用Amersham Pharmacia公司Gene ImagesTMContents CDP-StarTMlabelling module(PRN3540)，將BcpFLC基因編碼區(qū)標(biāo)記為探針，然后進(jìn)行雜交(于60℃雜交16小時(shí))。取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，1％SDS)中，于60℃漂洗3次，每次15分鐘。轉(zhuǎn)入洗膜液II(0.1*SSC，1％SDS)中于60℃漂洗3次，每次同樣15分鐘。用X光片壓片60-90分鐘，然后顯影、定影(方法參照Roche DIG labeled試劑盒說明書)。結(jié)果(Southern blot)發(fā)現(xiàn)在雜交膜上出現(xiàn)2-3雜交條帶，說明提高光合作用效率基因在大白菜中屬于低拷貝基因。
大白菜光合作用相關(guān)基因提高光合作用效率在大白菜中的表達(dá)譜分析1.RNA的提取將大白菜“日喀則一號”，播在溫室(溫度設(shè)置為25-26℃，光照時(shí)間為16小時(shí))。待葉片長到2-3片葉時(shí)抽取大白菜根、莖、葉的RNA。以正常光照的植株作為對照，黑暗3天的植株為處理材料，利用TRIzol試劑盒(GIBCO BRL，USA)提取并參考《分子克隆》有關(guān)RNA的制備章節(jié)(Sambrook等，1989)。
2.RNA的定量參考《分子克隆》(Sambrook等，1989)，分光光度計(jì)測OD260；RNA含量計(jì)算1 OD260＝40μg/ml。
3總RNA瓊脂糖凝膠電泳分離1)取6ml 25*(倍)電泳緩沖液，加入117ml無菌水，混勻。2)稱取1.5g瓊脂糖，加入到上述溶液中，于微波爐里加熱融化，轉(zhuǎn)入55℃水浴中。3)于通風(fēng)櫥中取26.8ml甲醛，加入到55℃的凝膠溶液中，混勻。4)迅速倒入制膠板中，室溫水平放置30分鐘，待膠凝固。5)將提取的RNA(20μg)溶解于RNA變性溶液中，在65℃下加熱10分鐘，然后立即放在冰上。6)在樣品中加入2ul 10*上樣緩沖液，混勻。7)在電泳液未蓋過膠的條件下點(diǎn)樣，5V/cm電壓電泳5小時(shí)左右。
4.RNA尼龍膜上轉(zhuǎn)移1)轉(zhuǎn)移之前，將尼龍膜用10*SSC浸泡。2)將濕潤的膜準(zhǔn)確地蓋在膜上，將兩張與膜大小相同的濾紙置2*SSC溶液中濕潤，蓋在膜上，排除氣泡。3)濾紙上放一疊與膜大小相同的吸水紙，在吸水紙上放一玻璃板和一重物，水平放置，轉(zhuǎn)移12-20小時(shí)。4)轉(zhuǎn)移后，將膜于80℃烘烤2小時(shí)。
5.膜上雜交信號的檢出1)將膜浸在5×Dendart’s，0.1％SDS，0.1mg/ml鮭魚精DNA]，65℃下預(yù)雜交2小時(shí)。2)將用Gene ImagesTMContents CDP-StarTMlabelling module標(biāo)記的探針在沸水中變性5分鐘，直接加入1)的雜交液中，于65℃雜交16-24小時(shí)。3)取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，1％SDS)中，于65℃漂洗3次，每次15分鐘。轉(zhuǎn)入洗膜液II(0.1*SSC，1％SDS)中于65℃漂洗3次，每次15分鐘。4)用X光片壓片60-90分鐘，然后顯影、定影(方法參照Roche DIGlabeled試劑盒說明書)。Northern雜交表明；正常光照的大白菜的植株提高光合作用效率轉(zhuǎn)錄水平比黑暗處理的植株高得多，然而黑暗處理的大白菜品種的提高光合作用效率轉(zhuǎn)錄水平明顯并強(qiáng)烈地減少，甚至幾乎看不到，但其轉(zhuǎn)錄水平還是有一定的保留。正常光照的轉(zhuǎn)基因植株的提高光合作用效率轉(zhuǎn)錄水平比未轉(zhuǎn)基因植株的水平高，這說明提高光合作用效率轉(zhuǎn)錄水平與光合作用極顯著相關(guān)。
本發(fā)明涉及的序列及記號分列如下(1)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)長度21bp(B)類型核苷酸
(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii).分子類型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.1ATGGCAGCCTCTCTCCAATCC(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)長度20bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii).分子類型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.2CCCTTTGGGTCCAAGAAGGA(2)SEQ ID NO.3的信息
<110>上海交通大學(xué)<120>大白菜提高光合作用效率蛋白編碼序列<140>
<141>
<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1156<212>DNA<213>大白菜(Brassica Campestris ssp.Pekinensis)CGCTCTAGAA TGGGAAGAAA AAAACTAGAA CTATCTGAGA GACACTCTGT GGCCATGGCA 60GCCTCTCTCC AATCCGCCGC CACATTCCTC CAGTCCGCAA AAATCTCCAC CGCTCCTTCT 120CGCGGCAGTG CTCACCTCCG TTCGACTCAG ACCGTCGGCA AATCGTTCGG CCTAGAGACT 180TCTTCTGCAC GCCTCACTTG TTCCTTCCAA TCTGACATCA AAGACTTTGC CGGAAAATGC 240TCCGACGCTG TTAAAATCGC CGGATTCGCT CTTGCAACCT CTGCTCTCGT CGTCTCGGGA 300GCAAGTGCAG AGGGAGCTCC GAAGAGACTC ACTTATGACG AGATACAGAG CAAGACATAC 360ATGGAAGTCA AAGGAACCGG AACTGCCAAC CAGTGTCCAA CTATTGACGG TGGCTCTGAG 420ACTTTCTCCT TCAAACCCGG TAAGTACGCT GGCAAGAAGT TCTGCTTCGA GCCTACTTCC 480TTCACCGTCA AAGCCGAGAG TGTTAGCAAG AACGCACCTC CTGAGTTTCA GAATACCAAG 540CTCATGACCC GTCTCACCTA CACCCTTGAC GAAATCGAAG GCCCCTTTGA GGTTTCTTCA 600GACGGAAAGC GTGAACTTCA AGAAAGAAGA CGGAATCGAC TACGCTGCAG TCACTGTTCA 660GCTTCCAGGA GGCGAGCGTG TGCCGTTCCT CTTCACAGCC AAGCAGCTTG ACGCCTCGGG 720CAAACCAGAC AACTTCACTG GCAAATTCTT GGTCCCGTGG TACCGTGGCT CGTCCTTCTT 780GGACCCAAAG GGTCGTGGTG GATCCTCAGG ATATGACAAC GCCGTTGCAT TGCCAGCTGG 840AGGCAGAGGA GACGAAGAGG AGCTTTCGAA GGAGAACGTG AAGAACACGG CAGCTTCGGT 900GGGAGAGATC ACTTTGAAAG TGACCAAGAG CAAACCGGAG ACAGGAGAAG TGATCGGAGT 960GTTCGAGAGT CTTCACCCGT CGGATACTGA CTTGGGTGCC AAGGTACCAA AGGATGTGAA 1020GATCCAAGGG GTGTGGTATG GTCAACTTGA GTGATCATGT TATTATATCA AAACATTTTC 1080TTCTGTTAAT TGTATTTGAT GATAATGAGA ACATCTTTTC ATGCTTCAAA AAAAAAAAAA 1140AAAAAAAAAA AAAAAA 1156<210>2<211>233
<212>PRT<213>大白菜(Brassica Campestris ssp.Pekinensis)<400>2MGRKKLELSE RHSVAMAASL QSAATFLQSA KISTAPSRGS AHLRSTQTVG KSFGLETSSA 60RLTCSFQSDI KDFAGKCSDA VKIAGFALAT SALVVSGASA EGAPKRLTYD EIQSKTYMEV 120KGTGTANQCP TIDGGSETFS FKPGKYAGKK FCFEPTSFTV KAESVRLTYT LDEIEGPFEV 180SSDGKRELQE RRRNRLRCSH CSASRRRACA VPLHSQAA 23權(quán)利要求
1.一種大白菜提高光合作用效率蛋白編碼序列，其特征在于，包括編碼具有大白菜提高光合作用效率蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸第10-708位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在45-50℃條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸第10-708位的核苷酸序列雜交。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大白菜提高光合作用效率蛋白編碼序列，其特征是，所述的序列編碼具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的大白菜提高光合作用效率蛋白編碼序列，其特征是，該序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸第10-708位的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大白菜提高光合作用效率蛋白編碼序列，其特征是，包含DNA分子中8-100個(gè)連續(xù)核苷酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的大白菜提高光合作用效率蛋白編碼序列，其特征是，DNA分子轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，它是真核細(xì)胞。
全文摘要
一種大白菜提高光合作用效率蛋白編碼序列，屬于基因工程領(lǐng)域。包括編碼具有大白菜提高光合作用效率蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸第10－708位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸第10－708位的核苷酸序列雜交。本發(fā)明在提高光合效率中具有明顯的作用，能夠有效地提高作物的產(chǎn)量，本發(fā)明具有很大的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號C12N15/79GK1528899SQ20031010797
公開日2004年9月15日 申請日期2003年10月16日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月16日
發(fā)明者唐克軒, 李柱剛, 趙凌俠, 孫小芬, 龔一富 申請人:上海交通大學(xué)