專利名稱：人工單鋅指蛋白、二鋅指蛋白和四鋅指蛋白的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種人工蛋白質，具體地，本發(fā)明涉及一種人工單鋅指蛋白，及人 工二鋅指禾曬鋅指蛋白。
背景技術：
鋅指蛋白(zinc finger protein, ZFP)是真核細胞中普通存在的一種DNA結合蛋 白，這類蛋白的鋅指結構是其與DNA序列結合的結構域。根據(jù)鋅指結構的特征可 以分為C2H2 (Cys (2) Ms (2))、 C3H3和C4H4型。其中<^12類構成了一大類轉 錄因子家族。每個"C2H2"型鋅指的氨基酸序列通式為"X2-CyS-X(2， 4)-CyS-X12-His -X(3~5)-HiS"，其中X代表任何氨基酸， 一個鋅離子(Zn+2)將2個半胱氨酸和2個組氨 酸結合在一起，使其二級結構呈現(xiàn)為(3折疊一p折疊一a螺旋。a螺旋肽鏈上第-l 位至+6位的氨基酸，尤其是4個位點上的氨基酸(第-l，2,3,6位)的種類決定了它 在識別核苷酸序列上的特異性(每個氨基酸結合一個堿基)。每個鋅指可識別3個核 苷酸。2 ^H辛指之間由一接頭肽相連，眾多的鋅指串聯(lián)在一起，使得鋅指蛋白與DNA 的結合具有序列特異性。
許多轉錄因子都是天然鋅指蛋白。每個天然鋅指蛋白的鋅指數(shù)目一般在3 5 個之間。天然鋅指蛋白能夠結合不同基因上相同的識別序列(9 15bp)，發(fā)揮群掛 組調功能。然而，盡管這種蛋白質-DNA結合有識別序列選擇性，由于其鋅指數(shù)目 不長，沒有基因特異性。如果DNA中的堿基是隨機分布，則16bp的序列在每43 億bp核苷酸中只會出現(xiàn)一次。因此，會,識別18bp核苷酸片段的六鋅指蛋白理論 上即可特異性識別人類基因組中的單一序列。為了獲得基因特異性DNA結合蛋白， 必須進一步將這種蛋白鋅指的數(shù)目延長(>6個)，以使其識別序列的長度達到18bp 以上。
近10年來，DNA與蛋白質相互識另啲機制研究獲得了長足進展，鋅指中氨基 酸與核苷酸結合的規(guī)律已基本揭示(Biochemistry 2002, 4l:7074)。配合計算機輔助
8模擬設計軟件，人們已能夠根據(jù)目的核苷,列來設計能與之特異性結合的鋅指蛋
白，建立了各種單鋅指噬菌體文庫("GNN"、 "ANN"、 "CNN"庫)，發(fā)展出了多 種篩選目的鋅指蛋白的策略，合成了眾多的人工轉錄因子，用于激活或阻斷目的基 因的轉錄(如人Epo、 erbB2、 erbB3基因等)(PNAS 2000, 97:1495)。也有人用這 種人工轉錄因子來活化或滅活異常印跡基因(如H19和IGF2基因)(GeneTlier. 2003: 10:513)。將具有DNA序列特異性的人工鋅指蛋白與各種功能域融合能夠獲得眾多 不同的用途(Nat Rev Drug Discov 2003， 2:361)。
已有的人工鋅指蛋白均為特定目的基因特異性而設計的專一性人工設計蛋白， 沒有特異性結合其它基因的功能。所以，針對不同的目的基因需要設計特定的人工 鋅指蛋白。
人類基因組中的轉錄因子大部分是"CysrHis2"型鋅指。Spl轉錄因子是一種 含有鋅指結構、序列特異性的DNA結合蛋白。大約3000個人類基因啟動子含 轉錄因子Spl的識別序列(Cell 2004,116: 499)。因此，構建針對Spl轉錄因子的 識別序列具有特異性的人工鋅指蛋白，具有普遍意義。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種人工單鋅指蛋白，它們可以與天然和/或人工鋅指蛋白 連接形成基因特異性的人工多鋅指蛋白，用于特異性識別目的基因，調控相關基因。
本發(fā)明的另一目的是提供一種人工二鋅指蛋白，它們可以與天然和/或人工鋅指 蛋白連接形成基因特異性的人工多鋅指蛋白，用于特異性識別目的基因，調控相關 基因。
本發(fā)明的另一目的是提供一種人工四鋅指蛋白，它們可以與天然和/或人工鋅指 蛋白連接成基因特異性的人工多鋅指蛋白，用于識另腫寺異性目的基因，調控相關基 因。
為了達到上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術方案
本發(fā)明提供了一種人工單鋅指蛋白，其特征在于用下列氨基酸序列之一取代天 然單鋅指蛋白ot螺旋肽鏈上第-l位至+6位的氨基酸SEQIDNO.:14、SEQIDNO.: 17、 SEQIDNO,:21、 SEQIDNO.:23或SEQIDNO.:24。
本發(fā)明提供了一種人工單鋅指蛋白，其氨基酸序列如下列之一所示SEQ IDNO.: 1 、 SEQ ID NO.: 2、 SEQ ID NO.: 3、 SEQ ID NO.: 4、 SEQ ID NO.: 5 、 SEQ ID NO.: 6、 SEQ ID NO.: 7、 SEQ ID NO.: 8、 SEQIDNO.:9、 SEQ ID NO.: 10或SEQ ID NO.: 11。
本發(fā)明提供了一種人工二鋅指蛋白，其氨基酸序列如下列之一所示
SEQ ID NO. :4+接頭肽+SEQ ID NO.: 1;或 SEQIDNO.:4+接頭肽+SEQIDNO.:2;或 SEQIDNO.:4+接頭肽+SEQIDNO.:3;或
SEQE)NO.:5+接頭肽+SEQIDNO.:l;或 SEQIDNO.:5+接頭肽+SEQIDNO.:2;或 SEQIDNO.:5+接頭肽+SEQIDNO.:3;或
SEQIDNO.:6+接頭肽+SEQIDNO.:l;或 SEQ ID NO. :6+接頭肽+SEQ ID NO. :2;或 SEQIDNO.:6+接頭肽+SEQIDNO.:3;或
SEQIDNO.:9+接頭肽+SEQIDNO.:7;或 SEQIDNO.:10+接頭肽+SEQIDNO.:7;或 SEQIDNO.:ll+接頭肽+SEQIDNO.:7;或
SEQJDNO.:9+接頭肽+SEQIDNO.:8;或 SEQIDNO.:10+接頭肽+SEQIDNO.:8;或 SEQ ID NO.: 1 l+接頭肽+SEQ E) NO.:8。
本發(fā)明提供了一種人工四鋅指蛋白，其氨基酸序列如下列之一所示
SEQ ID NO.:9+接頭肽+SEQ ID NO.:7+接頭肽+SEQ ID NO.:4+接頭肽+SEQ ID NO.:l;或
SEQ ID NO.:9+接頭肽+SEQ ID NO.:7+接頭肽+SEQ ID NO.:5+接頭肽+SEQ ID NO.:l;或
SEQ ID NO.:9+接頭肽+SEQ ID NO.:7+接頭肽+SEQ ID NO.:6+接頭肽+SEQ ID NO.:l;或
10SEQ ID NO.:軒接頭肽+SEQ ID NO.:7+接頭肽+SEQ ID NO.:4+接頭肽+SEQ IDNO. :2;或
SEQ ID NO.:9+接頭肽+SEQ ID NO.:7+接頭肽+SEQ ID NO.:5+接頭肽+SEQ IDNO.:2;或
SEQ ID NO.:9+接頭肽+SEQ ID NO.:7+接頭肽+SEQ ID NO.:6+接頭肽+SEQ IDNO.:2;或
SEQ ID NO.:9+接頭肽+SEQ ID NO.:7+接頭肽+SEQ ID NO.:4+接頭肽+SEQ IDNO.:3;或
SEQ ID NO.:9+接頭肽+SEQ ID NO.:7+接頭肽+SEQ ID NO.:5+接頭肽+SEQ IDNO.:3;或
SEQ ID NO.:9+接頭肽+SEQ ID NO.:7+接頭肽+SEQ ID NO.:6+接頭肽+SEQ IDNO.:3;或
SEQ ID NO.: 10+接頭肽+SEQ ID NO.:7+接頭肽+SEQ ID NO.:4+接頭肽+SEQ IDNO.:l;或
SEQ ID NO.: 10+接頭肽+SEQ ID NO.:7+接頭肽+SEQ ID NO.:5+接頭肽+SEQ IDNO.:l;或
SEQ ID NO.:10+接頭肽+SEQ ID NO.:7+接頭肽+SEQ ID NO.:6+接頭肽+SEQ IDNO.:l;或
SEQ ID NO.: 10+接頭肽+SEQ ID NO.:7+接頭肽+SEQ ID NO.:4+接頭肽+SEQ IDNO.:2;或
SEQ IDNO.:l(H接頭肽+SEQ ID NO.:7+接頭肽+SEQ ED NO.:5+接頭肽+SEQ IDNO.:2;或
SEQ ID NO.:10+接頭肽+SEQ ID NO.:7+接頭肽+SEQ ED NO.:6+接頭肽+SEQ IDNO.:2;或
SEQ ID NO.:l(H接頭肽+SEQ ID NO.:7+接頭肽+SEQ ID NO.:4+接頭肽+SEQ E)NO.:3;或
SEQ ID NO.:10+接頭肽+SEQ ID NO.:7+接頭肽+SEQ ID NO.:5+接頭肽+SEQ IDNO.:3;或
SEQ ID NO.:10+接頭肽+SEQ ID NO.:7+接頭肽+SEQ ID NO.:6+接頭肽+SEQ IDNO.:3;或
SEQ ID NO.:l l+接頭肽+SEQ ID NO.:7+接頭肽+SEQ ID NO.:4+接頭肽+SEQ IDNO.:l;或
SEQ ID NO.:ll+接頭肽+SEQ ID NO.:7+接頭肽+SEQ ID NO.:5+接頭肽+SEQ IDNO.:l;或
SEQ ID NO.:ll+接頭肽+SEQ ID NO.:7+接頭肽+SEQ ID NO.:6+接頭肽+SEQ IDNO.:l;或
SEQ ID NO.:ll+接頭肽+SEQ ID NO.:7+接頭肽+SEQ ID NO.:4+接頭肽+SEQ IDNO.:2;或
SEQ ID NO.:ll+接頭肽+SEQ ID NO.:7+接頭肽+SEQ ID NO.:5+接頭肽+SEQ IDNO. :2;或
SEQ ID NO.:ll+接頭肽+SEQ ID NO.:7+接頭肽+SEQ ID NO.:6+接頭肽+SEQ IDNO.:2;或
SEQ ID NO.:ll+接頭肽+SEQ ID NO.:7+接頭肽+SEQ ID NO.:4+接頭肽+SEQ IDNO.:3;或
SEQ ID NO.:l l+接頭肽+SEQ ID NO.:7+接頭肽+SEQ ID NO.:5+接頭肽+SEQ IDNO.:3;或
SEQ ID NO.:ll+接頭肽+SEQ ID NO.:7+接頭肽+SEQ ID NO.:6+接頭肽+SEQ IDNO.:3;或
SEQ ID NO.:9+接頭肽+SEQ ID NO.:8+接頭肽+SEQ ID NO.:4+接頭肽+SEQ IDNO.:l;或
SEQ ID NO.:9+接頭肽+SEQ ID NO.:8+接頭肽+SEQ ID NO.:5+接頭肽+SEQ ID
12NO.:l;或
SEQ ID NO.:9+接頭肽+SEQ ID NO.:8+接頭肽+SEQ ID NO.:6+接頭肽+SEQ IDNO.:l;或
SEQ ID NO.:9+接頭肽+SEQ ID NO.:8+接頭肽+SEQ ID NO.:4+接頭肽+SEQ IDNO.:2;或
SEQ ID NO.:9+接頭肽+SEQ ID NO.:8+接頭肽+SEQ ID NO.:5+接頭肽+SEQ IDNO. :2;或
SEQ ID NO.:9+接頭肽+SEQ ID NO.:8+接頭肽+SEQ ID NO.:6+接頭肽+SEQ IDNO.:2;或
SEQ ID NO.:9+接頭肽+SEQ ID NO.:8+接頭肽+SEQ ID NO.:4+接頭肽+SEQ IDNO.:3;或
SEQ ID NO.:9+接頭肽+SEQ ID NO.:8+接頭肽+SEQ ID NO.:5+接頭肽+SEQ IDNO.:3;或
SEQ ID NO.:9+接頭肽+SEQ ID NO.:8+接頭肽+SEQ ID NO.:6+接頭肽+SEQ IDNO.:3;或
SEQ ED NO.:10+接頭肽+SEQ ID NO.:8+接頭肽+SEQ ID NO.:4+接頭肽+SEQ IDNO.:l;或
SEQ ID NO.:l(H接頭肽+SEQ ID NO.:8+接頭肽+SEQ ID NO.:5+接頭肽+SEQ IDNO.:l;或
SEQ ID NO.:10+接頭肽+SEQ ID NO.:8+接頭肽+SEQ ID NO.:6+接頭肽+SEQ IDNO.:l;或
SEQ ID NO.:10+接頭肽+SEQ ID NO.:8+接頭肽+SEQ ID NO.:4+接頭肽+SEQ IDNO. :2;或
SEQ ID NO.: 1(H接頭肽+SEQ ID NO.:8+接頭肽+SEQ ID NO.:5+接頭肽+SEQ EDNO.:2;或
SEQ ID NO.:l(H接頭肽+SEQ ID NO.:8+接頭肽+SEQ ID NO.:6+接頭肽+SEQ ID
13NO.:2;或
SEQ ID NO.: 10+接頭肽+SEQ ID NO.:8+接頭肽+SEQ ID NO.:4+接頭肽+SEQ IDNO.:3;或
SEQ ID NO.:10+接頭肽+SEQ ID NO.:8+接頭肽+SEQ ID NO.:5+接頭肽+SEQ IDNO.:3;或
SEQ ID NO.: 10+接頭肽+SEQ ID NO.:8+接頭肽+SEQ ID NO.:6+接頭肽+SEQ IDNO.:3;或
SEQ ID NO.:ll+接頭肽+SEQ ID NO.:8+接頭肽+SEQ ID NO.:4+接頭肽+SEQ IDNO,:l;或
SEQ ID NO.:ll+接頭肽+SEQ ID NO.:8+接頭肽+SEQ ID NO.:5+接頭肽+SEQ IDNO.:l;或
SEQ ID NO.:ll+接頭肽+SEQ ID NO.:8+接頭肽+SEQ ID NO.:6+接頭肽+SEQ IDNO.:l;或
SEQ ID NO.:ll+接頭肽+SEQ ID NO.:8+接頭肽+SEQ ID NO.:4+接頭肽+SEQ IDNO.:2;或
SEQ ID NO.:ll+接頭肽+SEQ ID NO.:8+接頭肽+SEQ ID NO.:5+接頭肽+SEQ IDNO.:2;或
SEQ ED NO.:ll+接頭肽+SEQ ID NO.:8+接頭肽+SEQ ID NO.:6+接頭肽+SEQ IDNO. :2;或
SEQ ID NO.:ll+接頭肽+SEQ IDNO.:8+接頭肽+SEQ ID NO.:4+接頭肽+SEQ IDNO.:3;或
SEQ ID NO.:ll+接頭肽+SEQ ID NO.:8+接頭S太+SEQ ID NO.:5+接頭肽+SEQ IDNO. :3;或
SEQ ID NO.: 1 l+接頭肽+SEQ ID NO.:8+接頭肽+SEQ ID NO.:6+接頭肽+SEQ IDNO.:3。
本發(fā)明的二鋅指和四鋅指蛋白中所述接頭肽如氨基酸序列SEQ ID NO.: 25或
14SEQEDNO.:26所示。
本發(fā)明的單鋅指蛋白、二鋅指蛋白和四鋅指蛋白可以連接天然和/^AX鋅指蛋 白，組合形成基因特異性的AX多鋅指蛋白，用于識別特異性目的基因，調控相關 基因。
為了更好地理解本發(fā)明，現(xiàn)在結合附圖和實施例對本發(fā)明做進一步說明。
圖1A到圖1F是54種七鋅指蛋白pET-28a皿載，轉染細菌超聲裂解后的
敏情況；其中未未誘導菌對照；全誘導菌全菌；S:誘導菌上清；P:誘導菌沉淀。
圖2A和圖2B是Western Blot法檢測54種七鋅指蛋白；字母S和P分別表示 細菌超聲裂解后的上清和沉淀，(-)表示未誘導菌上清陰性對照。
圖3A到圖3H影 ^移實驗檢測54種鋅指蛋白結合的目的DNA序列的能
力
具體實施例方式
我們以天然Spl的識別序列(如5'-GGGGCGGGG-3，)為基礎，以辦列5， 側翼12bp的核苷,列為，列，以天然Spl鋅指區(qū)的氨基,列為骨架，禾, AX合戯n突變PCR以及DNA重組等技術，設計和合成了一組編碼AX單鋅指蛋 白(AZF)、 二鋅指蛋白(2-AZF)和四鋅指蛋白(4-AZF)的Al DNA序列，構 建了其原核表達載體。在將這些人工四鋅指蛋白與轉錄因子Spl的三鋅指區(qū) (SplZF)融合后，可力AM尋的七鋅指蛋白庫中篩選到具有特異性結合含Spl的識 別序列的、目的基因特異性的人工DNA結合蛋白。
盡管本發(fā)明中所i頓的是Spl的鋅指骨架，但是本發(fā)明不應該魏限制，本領 域技術人員應該知道，《if可天然和人工的鋅指蛋白骨架都可以用在本發(fā)明中，具有 本發(fā)明所述的功能。
本申請中所^頓的實驗技術如無特別說明，為分子生物學技術領域常用的技術， 如《分子克隆實驗指南》，美J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾著，第3版，科學 出版社2002。實施例1
制備具有氨基,列如SEQ ID NO.:l至SEQ ID NO.:ll所示的單鋅指蛋白的DNA 編碼序列
1. 確定pl6基因啟動子中設計人工鋅指蛋白的靶序列該基因轉錄起始點附近的 啟動子序列中含Spl識別序列5'-GGG GCG ，其5'側翼的序列為5,-GAG GAAGGAAAC-3,。生物信息學分析表明，該21bp的序列(5:GAGGAAGGA AAC(7GGGCG(7a -3，)僅存在于pl6基因啟動子中，具有pl6基因特異性。 故以該12bp的側翼序列為靶序列，設計人工單鋅指蛋白；
2. 人工單鋅指蛋白的設計以天然Spl蛋白的第二和第三鋅指氨基酸為骨架(SEQ IDNO.:12和SEQIDNO.:13)，根據(jù)鋅指結構上a螺旋4個位點上的氨基酸(第 -1，2，3,6位)的種類決定了它在識別核苷酸序列上的特異性(每個氨基酸結合 一個堿基)的規(guī)律，參考各種單個天然鋅指的識別序列和DNA-蛋白識別密碼表 及計算機模擬輔助設計等信息，禾擁弓嫩重疊突變PCR基因重組技術，用表l 中的11種氨基酸序列SEQIDNO.: 14至24替換掉Spl第二或第三鋅指上a螺旋 肽鏈上的第-1位至+6位的關鍵性氨基酸，得到各種Spl第二或第三鋅指的突變 體(簡稱類Spl鋅指)；
表l
替換單鋅指a螺旋肽鏈上第-l位至+6位的關鍵性氨基酸識別GAG的關鍵氮基酸識別GAA的關鍵氨基酸
SEQ ID NO.: 14SEQ ID NO.: 17
SEQ ID NO.: 15SEQ ID NO.: 18
SEQ ID NO,: 16SEQ ID NO.: 19
識別GGA的關鍵氨基酸識別AAC的關鍵氨基酸
SEQ ID NO.: 20SEQ ID NO. :22
SEQ ID NO.: 21SEQ ID NO. :23
16____SEQIDNO.:24_
3. 為了與第三鋅指相連，模擬第二鋅指構建的類Spl鋅指包括原有的天然接頭肽,
(SEQIDNO.:25)，當然也可以使用其它接頭肽；由于天然Spl第三鋅指無接 頭肽，為了便于進一步與其它鋅指融合，在模擬第三鋅指構建的類Spl鋅指C 端連接上另外一個接頭肽(SEQIDNO.:26);
4. 制備SEQIDNO.:l單鋅指蛋白的DNA編碼序列根據(jù)SEQIDNO.: 1的氨基酸 序列和所使用的接頭肽序列SEQ ID NO.: 25，合成寡核苷酸SEQ ID NO.: 27和 SEQIDNO.:28，依次取SEQ ID NO.: 27 (10pM)和SEQIDNO.:28 (lOpM) 各2 (il， 4種dNTP混合液(25 mM) 0.5 ^1， //w高保真酶1 U至200 |il的PCR 擴增管，補水至20(11，混勻，利用兩者3'側15bp的粘性末端開展5個循環(huán)的 延伸反應[95。Clmin— (95°C30s—30°C30s—72。C30s)]即得；
5. 使用上述制備SEQIDNO.:l的DNA編碼序列相同方法，制備了從SEQIDNO.:2 到SEQIDNO.:ll的DNA編碼序列；
實施例2
制備SEQ ID NO.:4+SEQ ID NO.:25+SEQ ID NO.:l+SEQ ID NO.:26 二鋅指蛋白的
DNA編碼序列
制備過程如下
1. 取上述SEQIDNO.:4和SEQIDNO.:l兩種蛋白編碼序列的PCR反應產(chǎn)物各3 |il 至200 pil的PCR擴增管，加入25mM的4種dNTP混合液0.5 和p>高保真 酶1U，補滅菌去離子水至20^，利用兩者3，側或5'側15bp設計的互補末端開 展5個循環(huán)的延伸反應[95。Clmin— (95。C30s—30。C30s—72。C30s)];
2. 取延伸反應產(chǎn)物連接至pCF-T載體；挑單克隆菌，LB培養(yǎng)基37'C振搖擴 增2h， PCR驗證，目的片段成功插入者進一步須,驗證。
用上述制備SEQ ID NO.:4+SEQ ID NO.:25+SEQ ID NO.:l+SEQ ID NO.:26的相
同方法制備了下列二鋅指蛋白的DNA編碼序列SEQ IDNO.:4+SEQ IDNO.:25+SEQ IDNO.:2+SEQ ID NO.:26;或 SEQ IDNO.:4+SEQ IDNO.:25+SEQ IDNO.:3+SEQ ID NO.:26;或
SEQ IDNO.:5+SEQ IDNO.:25+SEQ ID NO.: 1+SEQ ID NO.:26;或 SEQ ID NO.:5+SEQ ID NO.:25+SEQ ID NO.:2+SEQ ID NO.:26;或 SEQ IDNO.:5+SEQ ID NO.:25+SEQ ID NO.:3+SEQ ID NO.:26;或
SEQ IDNO.:6+SEQ IDNO.:25+SEQ IDNO.:l+SEQ ID NO.:26;或 SEQ ID NO.:6+SEQ ID NO.:25+SEQ ID NO.:2+SEQ ID NO.:26;或 SEQ ID NO. :6+SEQ ID NO. :25+SEQ ID NO. :3+SEQ ID NO. :26;或
SEQ ID NO.:9+SEQ IDNO.:25+SEQ ID NO.:7+SEQ ID NO.:26;或 SEQIDNO.:10+SEQIDNO.:25+SEQIDNO.:7+SEQ IDNO.:26;或 SEQ ID NO.:l 1+SEQ ID NO.:25+SEQ ID NO.:7+SEQ ID NO.:26;或
SEQ ID NO. :9+SEQ ID NO. :25+SEQ ID NO. :8+SEQ ID NO.:26;或 SEQ IDNO,:10+SEQ ID NO.:25+SEQ ID NO.:8+SEQ ID NO.:26;或 SEQ ID NO.: 11+SEQ ID NO.:25+SEQ ID NO.:8+SEQ ID NO.:26。
實施例3
構建截斷型Spl蛋白三鋅指區(qū)表達載體pcDNA3.1-Spl
1. 提取人正常組織mRNA，反轉錄合成cDNA;
2. 以SEQIDNO.:29和SEQIDNO.:30為引物，以上述cDNA為模板，PCR擴增 Spl-3ZF (Spl的三鋅指)編碼序列，在序列5'末端引入了^"/酶切位點，在3' 末端引入了 J取/和/酶切位點；
3. 酶切PCR產(chǎn)物，將之連接至pcDNA3.1-His載體的^ "/和lo/之間，測序驗 證正確者的克隆命名為pcDNA3.1-Spl 。
實施例4
利用實施例2制備的AX二鋅指蛋白的DNA編碼序列組合制備人工四鋅指蛋白的
18DNA編碼序列
制備SEQ ID NO.:9+SEQ ID NO.:25+SEQ ID NO.:7+SEQ ID NO.:26+SEQ ID NO.:4+SEQ ID NO.:25+SEQ ID NO.:l+SEQ ID NO.:26 (其與Spl三鋅指蛋白氨基酸 序列簡稱1A)的DNA編碼序列；
四鋅指蛋白的制備過程是先將第一個二鋅指蛋白編碼序列與Spl三鋅指蛋白表 達載體pcDNA3.1-Spl通過酶切連接融合，再將第二個二鋅指蛋白酶切連接在第一 個二鋅指蛋白上。由此制備的四鋅帝隨白編碼序列與Spl三鋅指蛋白編碼序列連接 在了一起，所以也是七鋅指蛋白編碼序列。制備方法如下
1. 分別利用pCF-T載體特異性引物PCR擴增pCF-T載體上完整的SEQ ID NO.:9+SEQ ID NO.:25+SEQ ID NO.:7+SEQ ID NO.:26和SEQ ID NO.:4+SEQ ID NO.:25+SEQ ID NO.:l+SEQ ID NO.:26編碼序列，利用進行編碼序列上已有的 Zwa/酶切位點[5'-C—CCGGG-3，]和A7w /酶切位點[5'-C—TCGAG-3 ']分別進行酶 切；
2. 利用已有的Jge /酶切位點[5，-A—CCGGT-3，]和^72( /酶切位點對pcDNA3.1-Spl 表達載體分別進行酶切，將上述SEQ ID NO.:9+SEQ ID NO.:25+SEQ ID NO.:7+SEQIDNO.:26二鋅指編碼序列酶切產(chǎn)物定向連接至pcDNA3.1-Spl載體， 得載體pcDNA3.1-Spl-09/07;
3. 利用已有的j取/和Io /酶切位點對pcDNA3.1-Spl-09/07表達載體分別進行酶 切，將上述SEQ ID NO.:4+SEQ ID NO.:25+SEQ ID NO.: 1+SEQ ID NO.:26 二鋅指 編碼序列酶切產(chǎn)物定向連接至pcDNA3.1-Spl-09/07載體，測序驗證正確者稱為表 達載體pcDNA3.1-Spl- 09/07-04/01 。
用上述制備SEQ ID NO.:9f SEQ ID NO.:25+SEQ ID NO,:7+SEQ ED NO.:26+SEQ IDNO.:4+SEQ IDNO.:25+SEQIDNO.:l+SEQIDNO.:26的DNA編碼序列的相同方 法制備了下面53種四鋅指蛋白的DNA編碼序列
SEQ ID NO.:9+SEQ ID NO.:25+SEQ ID NO.:7+SEQ ID NO.:26+SEQ ID NO.:5+SEQIDNO.:25+SEQIDNO.:l+SEQIDNO.:26 (其與Spl三鋅指蛋白氨
基酸序列簡稱1B);或
SEQ ID NO.:9+SEQ ID NO.:25+SEQ ID NO.:7+SEQ ID NO,:26+SEQ ID NO.:5+SEQIDNO.:25+SEQIDNO.:l+SEQIDNO.:26 (其與Spl三鋅指蛋白氨
19基酸序列簡稱1C);或
SEQ ID NO.:9+SEQ ID NO.:25+SEQ ID NO,:7+SEQ ID NO.:26+SEQ ID NO.:4+SEQIDNO.:25+SEQIDNO.:2+SEQIDNO.:26 (其與Spl三鋅指蛋白氨
基酸序列簡稱1D);或
SEQ ID NO.:9+SEQ ID NO.:25+SEQ ID NO.:7+SEQ ID NO.:26+SEQ ID NO.:5+SEQ ID NO.:25+SEQ ID NO.:2+SEQ ID NO.:26 (其與Spl三鋅指蛋白氨
基酸序列簡稱1E);或
SEQ ID NO.:9+SEQ ID NO.:25+SEQ ID NO.:7+SEQ ID NO.:26+SEQ ID NO.:5+SEQIDNO.:25+SEQIDNO.:2+SEQIDNO.:26 (其與Spl三鋅指蛋白氨
基酸序列簡稱1F);或
SEQ ID NO.:9+SEQ ID NO.:25+SEQ ID NO.:7+SEQ ID NO.:26+SEQ ID NO.:4+SEQIDNO.:25+SEQK)NO.:3+SEQIDNO.:26 (其與Spl三鋅指蛋白氨
基酸序列簡稱1G);或
SEQ ID NO.:9+SEQ ID NO.:25+SEQ ID NO.:7+SEQ ID NO,:26+SEQ ID NO.:5+SEQIDNO.:25+SEQIDNO.:3+SEQIDNO.:26 (其與Spl三鋅指蛋白氨
基酸序列簡稱1H);或
SEQ ID NO.:9+SEQ ID NO.:25+SEQ ID NO.:7+SEQ ID NO.:26+SEQ ID NO.:5+SEQIDNO.:25+SEQIDNO.:3+SEQIDNO.:26 (其與Spl三鋅指蛋白氨
基酸序列簡稱1I);或
SEQ ID NO.:10+SEQ ID NO.:25+SEQ ID NO.:7+SEQ ID NO.:26+SEQ ID NO.:4+SEQIDNO.:25+SEQIDNO.:l+SEQIDNO.:26 (其與Spl三鋅指蛋白氨
基酸序列簡稱2A);或
SEQ ID NO.:10+SEQ ID NO.:25+SEQ ID NO.:7+SEQ ID NO.:26+SEQ ID NO.:5+SEQIDNO.:25+SEQIDNO.:l+SEQIDNO.:26 (其與Spl三鋅指蛋白氨
基酸序列簡稱2B);或
SEQ ID NO.:10+SEQ ID NO.:25+SEQ ID NO.:7+SEQ ID NO.:26+SEQ ID NO.:5+SEQIDNO.:25+SEQIDNO.:l+SEQIDNO.:26 (其與Spl三鋅指蛋白氨
20200710161032.X
基酸序列簡稱2C);或
SEQ ID NO.:10+SEQ ID NO.:25+SEQ ID NO.:7+SEQ ID NO.:26+SEQ ID NO.:4+SEQIDNO.:25+SEQIDNO.:2+SEQIDNO.:26 (其與Spl三鋅指蛋白氨
基酸序列簡稱2D);或
SEQ ID NO.:10+SEQ ID NO.:25+SEQ ID NO.:7+SEQ ID NO.:26+SEQ ID NO.:5+SEQIDNO.:25+SEQIDNO.:2+SEQIDNO.:26 (其與Spl三鋅指蛋白氨
基酸序列簡稱2E);或
SEQ ID NO.:10+SEQ ID NO.:25+SEQ ID NO.:7+SEQ ID NO.:26+SEQ ID NO.:5+SEQIDNO.:25+SEQIDNO.:2+SEQIDNO.:26 (其與Spl三鋅指蛋白氨
基酸序列簡稱2F);或
SEQ ID NO.:10+SEQ ID NO.:25+SEQ ID NO.:7+SEQ ID NO.:26+SEQ ID NO.:4+SEQIDNO.:25+SEQIDNO.:3+SEQIDNO.:26 (其與Spl三鋅指蛋白氨
基酸序列簡稱2G);或
SEQ ID NO.:10+SEQ ID NO.:25+SEQ ID NO.:7+SEQ ID NO.:26+SEQ ID NO.:5+SEQIDNO.:25+SEQIDNO.:3+SEQIDNO.:26 (其與Spl三鋅指蛋白氨
基酸序列簡稱2H);或
SEQ ID NO.參SEQ ID NO.:25+SEQ ID NO.:7+SEQ ID NO.:26+SEQ ID NO.:5+SEQIDNO.:25+SEQIDNO.:3+SEQIDNO.:26 (其與Spl三鋅指蛋白氨
基酸序列簡稱2I);或
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21基酸序列簡稱3C);或
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基酸序列簡稱4E);或
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基酸序列簡稱4F);或
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基酸序列簡稱4G);或
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基酸序列簡稱5A);或
SEQ ID NO,:10+SEQ ID NO.:25+SEQ ID NO.:7+SEQ ID NO.:26+SEQ ID NO.:5+SEQIDNO.:25+SEQIDNO.:l+SEQIDNO.:26 (其與Spl三鋅指蛋白氨
基酸序列簡稱5B);或
SEQ ID NO.:10+SEQ ID NO.:25+SEQ ID NO.:7+SEQ ID NO.:26+SEQ ID NO.:6+SEQIDNO.:25+SEQIDNO.:l+SEQIDNO.:26 (其與Spl三鋅指蛋白氨SEQ ID NO.:10+SEQ ID NO.:25+SEQ ID NO.:7+SEQ ID NO.:26+SEQ ID NO.:4+SEQIDNO.:25+SEQIDNO.:2+SEQIDNO.:26 (其與Spl三鋅指蛋白氨
基酸序列簡稱5D);或
SEQ ID NO.:10+SEQ ID NO.:25+SEQ ID NO.:7+SEQ ID NO.:26+SEQ ID NO.:5+SEQ ID NO.:25+SEQ IDNO.:2+SEQ IDNO.:26 (其與Spl三鋅指蛋白氨
基,列簡稱5E);或
SEQ ID NO.:10+SEQ ID NO.:25+SEQ ID NO.:7+SEQ ID NO.:26+SEQ ID NO.:6+SEQIDNO,:25+SEQIDNO.:2+SEQIDNO.:26 (其與Spl三鋅指蛋白氨
基酸序列簡稱5F);或
SEQ ID NO.:10+SEQ ID NO.:25+SEQ ID NO.:7+SEQ ID NO.:26+SEQ ID NO.:4+SEQ IDNO.:25+SEQ IDNO.:3+SEQ IDNO.:26 (其與Spl三鋅指蛋白氨 基酸序列簡稱5G);或
SEQ ID NO.:10+SEQ ID NO.:25+SEQ ID NO.:7+SEQ ID NO.:26+SEQ ID NO.:5+SEQIDNO.:25+SEQIDNO.:3+SEQIDNO.:26 (其與Spl三鋅指蛋白氨
基酸序列簡稱5H);或
SEQ ID NO.:10+SEQ ID NO.:25+SEQ ID NO.:7+SEQ ID NO.:26+SEQ ID NO.:6+SEQIDNO.:25+SEQIDNO.:3+SEQIDNO.:26 (其與Spl三鋅指蛋白氨
基^列簡稱5I);或
SEQ ID NO.:ll+SEQ ID NO.:25+SEQ ID NO.:7+SEQ ID NO.:26+SEQ ID NO.:4+SEQ IDNO.:25+SEQIDNO.:l+SEQIDNO.:26 (其與Spl三鋅指蛋白氨 基酸序列簡稱6A);或
SEQ ID NO.:ll+SEQ ID NO.:25+SEQ ID NO.:7+SEQ ID NO.:26+SEQ ID NO.:5+SEQIDNO.:25+SEQIDNO.:l+SEQIDNO.:26 (其與Spl三鋅指蛋白氨
基,列簡稱6B);或
SEQ ED NO.:ll+SEQ ID NO.:25+SEQ ID NO.:7+SEQ ID NO.:26+SEQ ID NO.:5+SEQIDNO.:25+SEQIDNO.:l+SEQIDNO.:26 (其與Spl三鋅指蛋白氨
24基酸序列簡稱6C);或
SEQ ID NO.:ll+SEQ ID NO.:25+SEQ K) NO.:7+SEQ ID NO.:26+SEQ ID NO.:4+SEQIDNO.:25+SEQIDNO.:2+SEQIDNO.:26 (其與Spl三鋅指蛋白氨
基酸序列簡稱6D);或
SEQ ID NO.:ll+SEQ ID NO.:25+SEQ ED NO.:7+SEQ ID NO.:26+SEQ ID NO.:5+SEQIDNO.:25+SEQIDNO.:2+SEQIDNO.:26 (其與Spl三鋅指蛋白氨
基酸序列簡稱6E);或
SEQ ID NO.:ll+SEQ ID NO.:25+SEQ ID NO.:7+SEQ ID NO.:26+SEQ ID NO.:6+SEQIDNO.:25+SEQIDNO,:2+SEQIDNO.:26 (其與Spl三鋅指蛋白氨
基酸序列簡稱6F);或
SEQ ID NO.:ll+SEQ ID NO.:25+SEQ ID NO.:7+SEQ ID NO.:26+SEQ ID NO.:4+SEQIDNO.:25+SEQIDNO.:3+SEQIDNO.:26 (其與Spl三鋅指蛋白氨
基酸序列簡稱6G);或
SEQ ID NO.:ll+SEQ ID NO.:25+SEQ ID NO.:7+SEQ ID NO.:26+SEQ ID NO.:5+SEQIDNO.:25+SEQIDNO.:3+SEQIDNO.:26 (其與Spl三鋅指蛋白氨 基,列簡稱6H);或
SEQ ID NO.:ll SEQ ID NO.:26+SEQ ID NO.:8+SEQ ID NO.:26+SEQ ID NO.:5+SEQIDNO.:25+SEQ IDNO.:3+SEQIDNO.:26 (其與Spl三鋅指蛋白氨
基酸序列簡稱61)。
實施例5
實施例4戶賴幌的人工四鋅指蛋白的DNA編碼序列在原核表達載體中的篩選和表 達
為了得到可溶性的人工鋅指蛋白，我們利用iVco /和屈o /酶切法，將 pcDNA3.1-Spl- 09/07-05/01載體中編碼SEQ ID NO.:9+SEQ ID NO.:25+SEQ ID NO.:7+SEQ ID NO.:26+SEQ ID NO.:4+SEQ ID NO.:25+SEQ ID NO.:l+SEQ ID NO.:26人工四鋅指蛋白和Spl三鋅指蛋白的DNA編碼序列，即七鋅指蛋白的DNA 編碼序列定向整合到pET-28a、 pET-30a、 pET-32a和pQE-Trisystem等六種不同類型的原核敏載體中，發(fā)現(xiàn)在pET-28a鋭載體中17°C ^f牛下培養(yǎng)24小時肯g夠得到 可溶性目的蛋白。遂將其余53種人工四鋅指蛋白和Spl三鋅指蛋白的DNA編碼序 列分別定向整合到pET-28a表達載體中并進行誘導表達。具體過程如下
1. 將編碼SEQ ID NO.:9+SEQ ID NO.:25+SEQ ID NO.:7+SEQ ID NO.:26+SEQ ID NO.:4+SEQ ID NO.:25+SEQ ID NO.:l+SEQ ID NO.:26人工四鋅指蛋白和Spl三 鋅指蛋白的6種表達載體轉化相應的表達菌株，鋪板，挑單克隆，搖菌并IPTG 誘導。在10。C24h、 10。C48h、 17°C 12h、 17°C 24h、 25°C 6h和25。C 12h六 種不同的培養(yǎng)條件培養(yǎng)；
2. 將誘導及未誘導菌分別倒入EP管中，12000xg離心30sec棄上清。沉淀用含O.l VTritonX-100的PBS200nl懸浮，冰上20kHz超聲，10s/次，共5次。對于誘 導后細菌的超聲破碎物進行離心，得上清和沉淀；三個 L分別上樣，觀察蛋白在 細菌中的表達的可溶性；12% SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色2h，脫色液脫 色2h后觀察重組蛋白的表達情況；表明本發(fā)明的七鋅指蛋白包含在誘導菌上清 中；
3. 選擇表達的目的蛋白可溶性好的表達載體，優(yōu)化誘導時間和溫度。以此載體構建 其余53種原核表達的人工鋅指蛋白，進行大規(guī)模表達實驗；
4. 超聲破碎，離心，取得含可溶性蛋白的上清液(如圖1A到圖1F)。
實施例6
用抗His抗體Western blot法證實七鋅指目的蛋白的存在 [操作步驟]
1. 樣品準備誘導的細菌裂解后分別取上清(S)和沉淀(P)，力口5pl5xSDS上樣 緩沖液煮沸5min，加入上樣緩沖液后煮沸上樣；
2. 12% SDS-PAGE膠電泳，用濃縮膠時的電壓為80 V，進入分離膠后電壓升至120 V，至溴酚藍距膠的最下緣時停止；
3. 切去^M膠，按分離膠大小剪4塊3mm濾紙和一塊PVDF膜，浸泡于轉移緩沖 液中；安裝轉移裝置時先將2層與膜等大的濾紙放在海綿墊上，依次放置凝膠、 硝酸纖維素膜及另兩層濾紙及海綿墊，用玻璃棒趕出氣泡，夾緊塑料支架放入電 泳槽內(nèi)，使硝酸纖維素膜一側靠正極，膠對陰極；接通電源，電壓設定為80V，
26冰浴條件下電轉移2h;
4. 轉膜結束后，取出PVDF膜，用麗春紅染色1~2 min，水洗至清晰條帶出現(xiàn)，用 圓珠筆作好標記，再用自來水洗凈染料；
5. 5%脫脂奶粉(TBST配制)封閉硝酸纖維素膜，4。C過夜或室溫3h;
6. 抗6XHis抗體(1:1000)作為一抗，室溫孵育1 h， TBST洗5遍，每次8min; 然后加入酶標羊抗鼠-HP(l: 20000)為二抗，室溫1 h， TBST洗5遍，每次10min; 使用"f七學發(fā)光法(Enhanced Chemiluminescence)進今亍發(fā)光檢測。
1. 酉己制8o/。的PAGE膠(5ml): H202.7ml， 5xTBE0.5ml， 40% Acr-Bis 1 ml， 50% 甘油0.25ml， 10%Aps 50^il， TEMED7(i;凝膠20min;
2. 準備樣本按水、5倍結合緩沖液、待檢測蛋白(細菌上清)、生物素標記探針
順序依次加樣，冰上孵育30min，然后用于上樣；
3. 上樣，兩邊用染料4pl，中間各孔加入樣品15^ll;電泳100 V， lh;
4. 轉膜按(陰極)海綿-濾纟R"膠-尼龍膜-濾紙-海綿(陽極)飾'l鵬放置，轉膜40
V3h或60V1.5h;
5. 交聯(lián)將膜的正面朝上，置于紫外交聯(lián)儀內(nèi)12000 J/cn^交聯(lián)lmin;
6. 洗膜(1)終止緩沖液5 ml勻速搖動l5 min; (2) 5 ml終止緩沖液+16 Stabilized Streptavidin-HRP conjugate,勻速搖動15 min; (3) 3 ml 4x漂洗緩沖液+9mlH20，分兩次^各10min，勻速搖動；(4) Substrate Equilibrim 5 ml洗膜 5min，勻速搖動；
7. 顯影和定影準^f七學發(fā)光液，壓片、顯影和定影；
8. 結果分析。:如圖3A到3H所示，分析發(fā)現(xiàn)在53種分t做的目的蛋白中，1B、 1F、 1G、 1H、 2D、 2F、 2G、 2H、 21、 3F、 3H、 31、 4F、 4G、 4H、 41、 5B、 5F、 5G、 5H、 51、 6F、 6I等23種蛋白與攜帶耙DNA序列的標記探針有結合能力。
，的實驗證明了本發(fā)明的AX單鋅指蛋白可以與人工和/或天然的單鋅指、二
鋅指或多鋅指蛋白組合，魏，并^tef特定的基因具有特異性結合，可以用于對特
定基因進行調控。
另外，本案申請人需要說明的是，在給出本發(fā)明蛋白質氨基,列的情況下， 通過本領域常規(guī)技術，獲得戶，的氨基,列屬于本領域已知技術，申請人雜合出 的只是示例性的實施方式，并不應該構自本發(fā)明的限制，本領域可以M本領域 己知的常規(guī)技術，獲得戶脫的氨基,列，并且進行表達。
28序歹據(jù)
<110>北京市腫瘤防治研究所
<120>人工單鋅指蛋白、二鋅指蛋白和四鋅指蛋白
<130> CNC1F070134943
<160> 30
<210> 1
<211〉 23
<212〉 PRT
<213〉人工序列
<220〉
<223>單鋅指蛋白 <400〉 1
Phe Ala Cys Pro Glu Cys Pro Lys Arg Phe Met Arg Ser Asp Ala Leu 15 10 15
Gin Aig His He Lys Thr His 20
<210〉 2 <211> 23 <212> PRT <213>人工序列 <220>
<223>單鋅指蛋白 <400> 2
Phe Ala Cys Pro Glu Cys Pro Lys Arg Phe Met Arg Ser Asp Asn Leu 15 10 15
Ak Arg His Ik Lys Thr His 20
29<210> 3 <211> 23 <212> PRT <213>人工序列 <220>
<223>單鋅指蛋白 <400> 3
Phe Ala Cys Pro Glu Cys Pro Lys Arg Phe Met Arg Ser Asp Asn Leu 15 10 15
Thr Arg His He Lys Thr His 20
<210> 4 <211> 25 <212> PRT <213〉人工序列 <220>
<223>單鋅指蛋白 <400> 4
Phe Met Cys Thr Trp Ser Tyr Cys Gly Lys Arg Phe Thr Gin Ser Arg 15 10 15
Asn Leu Val Arg His Lys Arg Thr His 20 25
<210〉 5 <211> 25 <212> PRT <213>人工序列 <220〉<223>單鋅指蛋白
<400> 5
Phe Met Cys Thr Tip Ser Tyr Cys Gly Lys Arg Phe Thr Gin Ser Ser 15 10 15
Asn Leu Val Arg His Lys Agr Thr His 20 25
<210> 6 <211> 25 <212> PRT <213>人工序列 <220>
<223>單鋅指蛋白 <400〉 6
Phe Met Cys Thr Tip Ser Tyr Cys Gly Lys Arg Phe Thr Gin Ser Ser 15 10 15
Asn Leu Gin Arg His Lys Arg Thr His 20 25
<210> 7 <211> 23 <212> PRT <213>人工序列 <220>
<223>單鋅指蛋白 <400> 7
Phe Ala Cys Pro Glu Cys Pro Lys Arg Phe Met Gin Ser Gly His Leu 15 10 15
Gin Arg His lie Lys Thr His 20
31<210> 8 <211> 23 <212> PRT <213>人工序列 <220>
<223>單鋅指蛋白 <400> 8
Phe Ala Cys Pro Glu Cys Pro Lys Arg Phe Met Gin Ser Thr His Leu 15 10 15
Gin Arg His lie Lys Thr His 20
<210> 9 <211> 25 <212> PRT <213>人工序列 <220>
<223〉單鋅指蛋白 <400> 9
Phe Met Cys Thr Tip Ser Tyr Cys Gly Lys Arg Phe Thr Asp Ser Gly 15 10 15
Asn Leu Arg Val His Lys Arg Thr His 20 25
<210> 10 <211〉 25 <212> PRT <213>人工序列<220>
<223>單鋅指蛋白 <■> 10
Phe Met Cys Thr Trp Ser Tyr Cys Gly Lys Arg Phe Thr Asp Ser Gly 15 10 15
Asn Leu Arg Arg His Lys Arg Thr His 20 25
<210> 11 <211> 25 <212> PRT <213>人工序列 <220>
<223>單鋅指蛋白 <400> 11
Phe Met Cys Thr Trp Ser Tyr Cys Gly Lys Arg Phe Hir Glu Ser Asp 15 10 15
Asn Leu Ser Gin His Lys Arg Thr His 20 25
<210> 12 <211> 25 <212> PRT
<213>人類 (Homo sapiens) <400> 12
Phe Met Cys Thr Trp Ser Tyr Cys Gly Lys Arg Phe Thr Arg Ser Asp 15 10 15
Glu Leu Gin Arg His Lys Arg Thr His 20 25
33<210> 13 <211〉 23 <212〉 PRT
<213〉人類 (Homo sapiens) <400〉 13
Phe Ala Cys Pro Glu Cys Pro Lys Arg Phe Met Arg Ser Asp His Leu 15 10 15
Ser Lys His lie Lys Thr His 20
<210> 14 <211〉 7 <212〉 PRT <213>人工序列 <220>
<223〉鋅指蛋白的oc螺旋肽鏈上第-l位至+6位的氨基酸 <400〉 14
Arg Ser Asp Ala Leu Gin Arg
<210> 15 <211〉 7 <212> PRT <213〉人工序列 <220>
<223>鋅指蛋白的a螺旋肽鏈上第-l位至+6位的氨基酸 <400> 15
Arg Ser Asp Asn Leu Ala Arg<210> 16 <211> 7 <212> PRT <213〉人工序列 <220>
<223〉鋅指蛋白的a螺旋肽鏈上第-l位至+6位的氨基酸 <400> 16
Arg Ser Asp Asn Leu Thr Arg
<210> 17 <2U> 7 <212> PRT <213>人工序列 <220>
<223>鋅指蛋白的a螺旋肽鏈上第-l位至+6位的氨基酸 <400> 17
Gln Ser Arg Asn Leu Val Arg
<210> 18 <211> 7 <212〉 PRT <213>人工序列 <220>
<223>鋅指蛋白的a螺旋肽鏈上第-l位至+6位的氨基酸 <400> 18
Gin Ser Ser Asn Leu Val Arg <210〉 19
35<211〉 7 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220>
<223〉鋅指蛋白的a螺旋肽鏈上第-l位至+6位的氨基酸 <400〉 19
Gln Ser Ser Asn Leu Gln Arg
<210〉 20 <211〉 7 <212> PRT <213>人工序列 <220〉
<223>鋅指蛋白的a螺旋肽鏈上第-l位至+6位的氨基酸 <400〉 20
Gln Ser Gly His Leu Gln Arg
<210> 21 <211〉 7 <212> PRT <213>人工序列 <220>
<223〉鋅指蛋白的a螺旋月太鏈上第-l位至+6位的氨基酸 <400> 21
Gln Ser Thr His Leu Gln Arg<210> 22<211〉 7<212〉 PRT<213〉人工序列<220〉
<223〉鋅指蛋白的a螺旋肽鏈上第-l位至+6位的氨基酸<400> 22
Asp Ser Gly Asn Leu Arg Val
<210〉 23<211> 7<212> PRT<213〉人工序列<220>
<223>鋅指蛋白的a螺旋肽鏈上第-l位至+6位的氨基酸<400> 23
Asp Ser Gly Asn Leu Arg Arg
<210> 24<211> 7<212〉 PRT<213〉人工序列<220〉
<223〉鋅指蛋白的oc螺旋肽鏈上第-l位至+6位的氨基酸<400> 24
Glu Ser Asp Asn Leu Ser Gin<210> 25
37<211〉 5<212> PRT<213>人工序列<220〉
<223>用作鋅指蛋白連接的接頭肽<400> 25Thr Gly Glu Lys Lys5
<210> 26<211〉 5<212〉 PRT<213>人工序列<220>
<223>用作鋅指蛋白連接的接頭肽<400> 26ThrGlyGluLysPro5
<210> 27<211> 63<212> DNA<213>人工序列<220>
<223>用作引物<400> 27
cacaaacgta cacacacagg tgagaag^ tttgcctgcc ctgagtgtcc taagcgcttc 60atg63
<210〉 28
38<211〉 72<212> DNA<213〉人工序列<220>
<223〉用作引物<400〉 28
ctcgagaggc ttctcaccgg t鵬gtctt gatatgtctt tgcagggcgt cactcctcat 60gaagcgctta gg 72
<210> 29<211〉 31<212> DNA<213>人工序列<220>
<223>用作引物<400> 29
cggtaccgcc accatggatc ctggcaaaaa g 31
<210> 30<211> 29<212> DNA<213>人工序列<220>
<223〉用作引物<400〉 30
ggctegagac cggtgtgggt cttgatatg 29
39
權利要求
1、一種人工單鋅指蛋白，其特征在于用下列氨基酸序列之一取代天然單鋅指蛋白的α螺旋肽鏈上第-1位至+6位的氨基酸SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.17、SEQID NO.21、SEQ ID NO.23或SEQ ID NO.24。
2、 一種AI單鋅指蛋白，其氨基酸序列如下列之一所示SEQIDNO.: 1、 SEQ ID NO.: 2、 SEQIDNO.: 3、 SEQIDNO.: 4、 SEQIDNO.: 5、 SEQ ID NO.: 6、 SEQ ID NO.: 7、 SEQIDNO.: 8、 SEQIDNO.: 9、 SEQIDNO.: 10或SEQIDNO.: 11。
3、 一種人工二鋅指蛋白，其氨基酸序列如下列之一所示SEQIDNO.:4+接頭肽+SEQIDNO.:l;或 SEQIDNO.:4+接頭月太+SEQIDNO.:2;或 SEQIDNO.:4+接頭肽+SEQIDNO.:3;或SEQ ID NO. :5+接頭肽+SEQ ID NO.: 1;或 SEQ ID NO.:5+接頭肽+SEQ ID NO. :2;或 SEQIDNO.:5+接頭肽+SEQIDNO.:3;或SEQ ID NO.:6+接頭肽+SEQ ID NO.: 1;或 SEQIDNO.:6+接頭肽+SEQIDNO.:2;或 SEQIDNO.:6+接頭肽+SEQIDNO.:3;或SEQIDNO.:9+接頭肽+SEQIDNO.:7;或 SEQIDNO.:10+接頭肽+SEQIDNO.:7;或 SEQIDNO.:ll+接頭肽+SEQIDNO.:7;或SEQE)NO.:9+接頭肽+SEQIDNO.:8;或 SEQIDNO.:10+接頭肽+SEQIDNO.:8;或 SEQ ID NO.: 1 l+接頭肽+SEQ ID NO.:8 。
4、 根據(jù)權利要求3所述的人工二鋅指蛋白，其中所述的接頭肽如氨基酸序列SEQ ID NO.: 25或SEQ ID NO.: 26所示。
5、 一種人工四鋅指蛋白，其氨基酸序列如下列之一所示.-SEQ ID NO.:9+接頭肽+SEQ ID NO.:7+接頭肽+SEQ ID NO.:4+接頭肽+SEQ IDNO.:l;或SEQ ID NO.:9+接頭肽+SEQ ID NO.:7+接頭肽+SEQ ID NO.:5+接頭肽+SEQ ID NO.:l;或SEQ ID NO.:9+接頭肽+SEQ ID NO.:7+接頭肽+SEQ ID NO.:6+接頭肽+SEQ ID NO.:l;或SEQ ID NO.:9+接頭肽+SEQ ID NO.:7+接頭肽+SEQ ID NO.:4+接頭肽+SEQ ID NO.:2;或SEQ ID NO.:9+接頭肽+SEQ ID NO.:7+接頭肽+SEQ ID NO.:5+接頭肽+SEQ ID NO.:2;或SEQ ID NO.:9+接頭肽+SEQ ID NO.:7+接頭肽+SEQ ID NO,:6+接頭肽+SEQ ID NO.:2;或SEQ ID NO.:9+接頭肽+SEQ ID NO.:7+接頭肽+SEQ ID NO.:4+接頭肽+SEQ ID NO.:3;或SEQ ID NO.:9+接頭肽+SEQ ID NO.:7+接頭肽+SEQ ID NO.:5+接頭肽+SEQ ID NO.:3;或SEQ ID NO.:9+接頭肽+SEQ ID NO.:7+接頭肽+SEQ ID NO.:6+接頭肽+SEQ ID NO.:3;或SEQ ID NO.:10+接頭肽+SEQ ID NO.:7+接頭肽+SEQ ID NO.:4+接頭肽+SEQ ID NO.:l;或SEQ ID NO.:10+接頭肽+SEQ ID NO.:7+接頭肽+SEQ ID NO.:5+接頭肽+SEQ ID NO.:l;或SEQ ID NO.:10+接頭肽+SEQ ID NO.:7+接頭肽+SEQ ID NO,:6+接頭肽+SEQ ID NO.:l;或SEQ ID NO.: 10+接頭肽+SEQ ID NO.:7+接頭肽+SEQ ID NO.:4+接頭肽+SEQ ID NO.:2;或SEQ ID NO」Of接頭肽+SEQ ID NO.:7+接頭肽+SEQ ID NO.:5+接頭肽+SEQ ID NO.:2;或SEQ ID NO.:10+接頭肽+SEQ ID NO.:7+接頭肽+SEQ ID NO.:6+接頭肽+SEQ ID NO.:2;或SEQ ID NO.: 10f接頭肽+SEQ ID NO.:7+接頭肽+SEQ ID NO.:4+接頭肽+SEQ ID NO.:3;或SEQ ID NO.: 10+接頭肽+SEQ ID NO.:7+接頭肽+SEQ ID NO.:5+接頭肽+SEQ ID NO.:3;或SEQ ID NO.: 10^接頭肽+SEQ ID NO.:7+接頭肽+SEQ ID NO.:6+接頭肽+SEQ ID NO.:3;或SEQ IDNO.:ll+接頭肽+SEQ ID NO.:7+接頭肽+SEQ ID NO.:4+接頭肽+SEQ ID NO.:l;或SEQ ED NO.:ll+接頭肽+SEQ ID NO.:7+接頭肽+SEQ ID NO.:5+接頭肽+SEQ ID NO.:l;或SEQ ID NO.: 1 l+接頭肽+SEQ ID NO.:7+接頭肽+SEQ ID NO.:6+接頭肽+SEQ ID NO.:l;或SEQ IDNO.:ll+接頭肽+SEQ ID NO.:7+接頭肽+SEQ ID NO.:4+接頭肽+SEQ ID NO.:2;或SEQ IDNO.:ll+接頭肽+SEQ ID NO.:7+接頭肽+SEQ ID NO.:5+接頭肽+SEQ ID NO.:2;或SEQ ID NO.: 1 l+接頭肽+SEQ ID NO.:7+接頭肽+SEQ ID NO.:6+接頭肽+SEQ ID NO.:2;或SEQ ID NO.: 1 l+接頭肽+SEQ ID NO.:7+接頭肽+SEQ ID NO.:4+接頭肽+SEQ ID NO.:3;或SEQ ID NO.:l l+接頭肽+SEQ ID NO.:7+接頭肽+SEQ ID NO.:5+接頭肽+SEQ ID NO.:3;或SEQ ID NO.:ll+接頭肽+SEQ ID NO.:7+接頭肽+SEQ ID NO.:6+接頭肽+SEQ ID NO.:3;或SEQ ID NO.:9+接頭肽+SEQ ID NO.:8+接頭肽+SEQ ID NO.:4+接頭肽+SEQ ID NO,:l;或SEQ ID NO.:9+接頭肽+SEQ ID NO.:8+接頭肽+SEQ ID NO.:5+接頭肽+SEQ ID NO.:l;或SEQ ID NO.:軒接頭肽+SEQ ID NO.:8+接頭肽+SEQ ID NO.:6+接頭肽+SEQ ID NO.:l;或SEQ ID NO.:9+接頭肽+SEQ ID NO.:8+接頭肽+SEQ ID NO.:4+接頭肽+SEQ ID NO.:2;或SEQ ID NO.:9+接頭肽+SEQ ID NO.:8+接頭肽+SEQ ID NO.:5+接頭肽+SEQ ID NO. :2;或SEQ ID NO.:9+接頭肽+SEQ ID NO,:8+接頭肽+SEQ ID NO.:6+接頭肽+SEQ ID NO. :2;或SEQ ID NO.:9+接頭肽+SEQ ID NO.:8+接頭肽+SEQ ID NO.:4+接頭肽+SEQ ID NO.:3;或SEQ ID NO.:9+接頭肽+SEQ ID NO.:S+接頭肽+SEQ ID NO.:5+接頭肽+SEQ ID NO. :3;或SEQ ID NO.:9+接頭肽+SEQ ID NO.:8+接頭肽+SEQ ID NO.:6+接頭肽+SEQ ID NO.:3;或SEQ ID NO.:10+接頭肽+SEQ ID NO.:8+接頭肽+SEQ ID NO.:4+接頭肽+SEQ ID NO.:l;或SEQ ID NO.:10+接頭肽+SEQ IDNO.:8+接頭肽+SEQ ID NO,:5+接頭肽+SEQ ID NO.:l;或SEQ ID NO.:10+接頭肽+SEQ ID NO.:8+接頭肽+SEQ ID NO.:6+接頭肽+SEQ ID NO.:l;或SEQ ID NO.:10+接頭肽+SEQ ID NO.:8+接頭肽+SEQ ID NO,:4+接頭肽+SEQ ID NO.:2;或SEQ ID NO.:10+接頭肽+SEQ ID NO.:8+接頭肽+SEQ ID NO.:5+接頭肽+SEQ IDNO.:2;或SEQ ID NO.: 10+接頭肽+SEQ ID NO.:8+接頭肽+SEQ ID NO.:6+接頭肽+SEQ ID NO,:2;或SEQ ID NO.:10f接頭肽+SEQ ID NO.:8+接頭肽+SEQ ID NO.:4+接頭肽+SEQ ID NO. :3;或SEQ ID NO.: 1(H接頭肽+SEQ ID NO.:8+接頭肽+SEQ ID NO.:5+接頭肽+SEQ ID NO, :3;或SEQ ID NO.:10+接頭肽+SEQ ID NO.:8+接頭肽+SEQ ID NO.:6+接頭肽+SEQ ID NO.:3;或SEQ ID NO.: 1 l+接頭肽+SEQ ID NO.:8+接頭肽+SEQ ID NO.:4+接頭肽+SEQ ID NO,:l;或SEQ ID NO.:l H接頭肽+SEQ ID NO.:8+接頭肽+SEQ ID NO.:5+接頭肽+SEQ ID NO.:l;或SEQ ID NO.:l l+接頭肽+SEQ ID NO.:8+接頭肽+SEQ ID NO.:6+接頭肽+SEQ ID NO.:l;或SEQ ID NO.:ll+接頭肽+SEQ ID NO.:8+接頭肽+SEQ ID NO.:4+接頭肽+SEQ ID NO.:2;或SEQ ID NO.:ll+接頭肽+SEQ ID NO.:8+接頭肽+SEQ ID NO.:5+接頭肽+SEQ ID NO.:2;或SEQ ID NO二ll+接頭肽+SEQ LD NO.:8+接頭肽+SEQ ID NO.:6+接頭肽+SEQ ID NO.:2;或SEQ IDNO.:ll+接頭肽+SEQ ID NO.:8+接頭肽+SEQ ID NO.:4+接頭肽+SEQ ID NO.:3;或SEQ IDNO.:ll+接頭肽+SEQ ID NO.:8+接頭肽+SEQ ID NO.:5+接頭肽+SEQ ID NO.:3;或SEQ ID NO.:ll+接頭肽+SEQ ID NO.:8+接頭肽+SEQ ID NO.:6+接頭肽+SEQ ID NO.:3。
6、根據(jù)權禾腰求5所述的人工四鋅指蛋白，其中所述的接頭肽如氨基酸序列SEQ ID NO.: 25或SEQ ID NO.: 26所示。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人工單鋅指蛋白，其特征在于用下列氨基酸序列之一取代天然單鋅指蛋白的α螺旋肽鏈上第-1位至+6位的氨基酸SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23或SEQ ID NO.24。本發(fā)明也具體地公開了11種人工單鋅指蛋白、15種人工二鋅指蛋白和54種人工多鋅指蛋白，它們可以與天然和/或人工鋅指蛋白連接成基因特異性的人工多鋅指蛋白，用于識別特異性目的基因，調控相關基因。
文檔編號C07K14/00GK101463077SQ20071016103
公開日2009年6月24日 申請日期2007年12月19日 優(yōu)先權日2007年12月19日
發(fā)明者向生焱, 張寶珍, 殷艷茹, 谷連坤, 鄧大君 申請人:北京市腫瘤防治研究所