一種從包涵體中制備可溶性白介素重組蛋白的方法及試劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從包涵體中制備可溶性白介素重組蛋白的方法及試劑，包括洗滌液、菌體裂解液、包涵體溶解液、蛋白復(fù)性液-I和蛋白復(fù)性液-II。使用本發(fā)明訴述的包涵體溶解液可以顯著提高從包涵體中獲得可溶性白介素重組蛋白的得率，從而解決用大腸桿菌表達(dá)體系生產(chǎn)白介素所存在的問題。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明不含有任何蛋白變性劑，這樣有利于后續(xù)的蛋白復(fù)性；操作簡(jiǎn)單，可提升可溶性白介素蛋白得率達(dá)90％以上，相對(duì)常規(guī)使用蛋白變性劑法只能獲得5-20％具有明顯優(yōu)勢(shì)，具有推廣應(yīng)用的價(jià)值。
【專利說明】一種從包涵體中制備可溶性白介素重組蛋白的方法及試劑

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種重組蛋白技術(shù)，尤其涉及一種從包涵體中制備可溶性白介素重組 蛋白的方法及試劑。

【背景技術(shù)】
[0002] 白細(xì)胞介素，簡(jiǎn)稱：白介素，（英文名：Interleukin，簡(jiǎn)寫：IL)，又稱淋巴細(xì)胞 活化因子是人體免疫系統(tǒng)調(diào)控的最關(guān)鍵蛋白質(zhì)分子，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有35個(gè)白介素。白細(xì) 胞介素在傳遞信息，激活與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞，介導(dǎo)T、B細(xì)胞活化、增殖與分化、炎癥反應(yīng)以及 在腫瘤發(fā)生過程中起著非常重要的調(diào)控作用。白細(xì)胞介素在醫(yī)學(xué)研究、新藥開發(fā)等方面 備受關(guān)注，其應(yīng)用也越來越被重視，比如，白細(xì)胞介素-2(IL-2)已被用作抗腫瘤藥，據(jù) Global InformationInc.報(bào)道去年世界上185家新藥研發(fā)機(jī)構(gòu)的746項(xiàng)腫瘤藥研發(fā)項(xiàng)目中 有258個(gè)目標(biāo)藥物與白介素-2傳遞路徑相關(guān)（IL_2Signaling Pathway in Oncology Drug Pipeline Update2011)，可見白細(xì)胞介素應(yīng)用前景非?？春谩?br> [0003] 目前市場(chǎng)上可獲得的白細(xì)胞介素主要是通過基因工程生產(chǎn)出來的重組白介素蛋 白。重組蛋白可以通過大腸桿菌表達(dá)體系來生產(chǎn)，也可以通過昆蟲病毒表達(dá)體系或動(dòng)物細(xì) 胞表達(dá)體系來生產(chǎn)。大腸桿菌表達(dá)體系是具有蛋白表達(dá)量高、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)也是 上述幾個(gè)表達(dá)體系中最成熟的應(yīng)用最廣的重組蛋白生產(chǎn)體系。然而，研究表明用大腸桿菌 表達(dá)體系生產(chǎn)白介素時(shí)存在一個(gè)大問題：大部分白介素重組蛋白在大腸桿菌表達(dá)體系中以 不可溶的包涵體形式存在。常規(guī)情況下，蛋白包函體可以用高濃度變性劑（如8M尿素）來 溶解，然后經(jīng)過透析復(fù)性來獲得可溶性蛋白?？墒牵捉樗刂亟M蛋白的包涵體，即使用8M尿 素也難完全溶解，得使用更加苛刻6M鹽酸胍來溶解，但通過6M鹽酸胍溶解的蛋白，復(fù)性比 較困難且效果很差。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的就在于為了解決上述問題而提供一種從包涵體中制備可溶性白介 素重組蛋白的方法及試劑。
[0005] 本發(fā)明通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)上述目的：
[0006] 本發(fā)明一種從包涵體中制備可溶性白介素重組蛋白的試劑，包括洗滌液、菌體裂 解液、包涵體溶解液、蛋白復(fù)性液-I和蛋白復(fù)性液-II，所述包涵體溶解液由pH值10-12的 Tris-NaOH緩沖液、NaCl、Glycerol、EDTA、2-巰基乙醇和N-十二烷基肌氨酸鈉組成。
[0007] 具體地，所述包涵體溶解液由pH值10-12的10-300mM Tris-NaOH緩沖液、 50-300mM NaCl、5-30% Glycerol、2-20mM EDTA、l-30mM2-巰基乙醇和 0? 05-0. 5% N-十二 烷基肌氨酸鈉組成。
[0008] 進(jìn)一步，所述洗滌液由 50mM Tris-HCl pH8、50mM NaCL、5% Glycerol、5mM EDTA、 3_2-巰基乙醇和0. 5 % Tween-20組成；所述菌體裂解液由50mM Tri s-HCl pH8、50mM NaCL、5mM EDTA、3mm2-巰基乙醇和0. 5 % Tween-20組成；所述蛋白復(fù)性液-I由50mM Tris-NaOH pHll、50mM NaCL、5%Glycerol、6mM EDTA 和 5mM2-巰基乙醇組成；所述蛋白復(fù) 性液-II 由 50mM Tris-HCl pH8、50mM NaCL、5%Glycerol、5mM EDTA、3mM2-巰基乙醇組成。
[0009] 作為一種改進(jìn)，所述包涵體溶解液中的20mM2-巰基乙醇可采用5mM DTT替代；所 述包涵體溶解液中的0. 5 % N-十二烷基肌氨酸鈉可采用0. 05 % SDS替代；所述包涵體溶解 液中的Tris-NaOH緩沖液可采用等pH值的碳酸鹽緩沖液替代或磷酸鹽緩沖液中的其中一 種替代。
[0010] 本發(fā)明一種從包涵體中制備可溶性白介素重組蛋白的方法，其特征在于，包括以 下步驟：
[0011] (1)離心收集經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)白介素的大腸桿菌；
[0012] (2)加入洗滌液，混勻，重懸菌體，離心除去上清；
[0013] (3)加入菌體裂解液，混勻，重懸菌體，在冰上用超聲波裂解菌體1-10秒，間歇進(jìn) 行1-5次（每次間歇1-10秒），離心除去上清；
[0014] (4)加入洗滌液，混勻，重懸蛋白包涵體（可用超聲波協(xié)助重懸），離心除去上清 (本洗滌步驟可重復(fù)2-3次）；
[0015] (5)加入包涵體溶解液,混勻，重懸蛋白包涵體（可用超聲波協(xié)助重懸），離心收集 上清，將該上清裝入透析袋；
[0016] (6)將透析袋放入蛋白復(fù)性液-I中透析；
[0017] (7)進(jìn)一步將透析袋轉(zhuǎn)入蛋白復(fù)性液-II中繼續(xù)透析；
[0018] (8)收集透析袋中蛋白液，便得可溶性白介素重組蛋白；
[0019] (9)檢測(cè)復(fù)性后蛋白含量和純度。
[0020] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0021] 本發(fā)明是一種從包涵體中制備可溶性白介素重組蛋白的方法及試劑，與現(xiàn)有技術(shù) 相比，本發(fā)明不含有任何蛋白變性劑，這樣有利于后續(xù)的蛋白復(fù)性；操作簡(jiǎn)單，可提升可溶 性白介素蛋白得率達(dá)90%以上，相對(duì)常規(guī)使用蛋白變性劑法只能獲得5-20%具有明顯優(yōu) 勢(shì)，具有推廣應(yīng)用的價(jià)值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022] 圖1是尿素變性劑處理包涵體后的各組分SDS-PAGE電泳圖；
[0023] 圖2是鹽酸胍變性劑處理包涵體后的各組分SDS-PAGE電泳圖；
[0024] 圖3是用本發(fā)明包涵體溶解液處理包涵體前后各組分SDS-PAGE電泳圖；
[0025] 圖4是用本發(fā)明所述方法及包涵體溶解液提取包涵體中白介素IL9前后各組分 SDS-PAGE電泳圖。

【具體實(shí)施方式】
[0026] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明：
[0027] 本發(fā)明一種從包涵體中制備可溶性白介素重組蛋白的試劑，包括洗滌液、菌體裂 解液、包涵體溶解液、蛋白復(fù)性液-I和蛋白復(fù)性液-II，所述包涵體溶解液由pH值10-12 的 Tris-NaOH 緩沖液、50-300mM NaCl、5-30% Glycerol、2-20mM EDTA、l-30mM2-巰基乙醇 和0. 05-0. 5% N-十二烷基肌氨酸鈉組成，所述洗滌液由50mM Tris-HCl pH8、50mM NaCL、 5% Glycerol、5mM EDTA、3_2-疏基乙醇和0? 5% Tween-20組成；所述菌體裂解液由50mM Tris-HCl pH8、50mM NaCL、5 % Glycerol、5mM EDTA、3mm2-巰基乙醇和 0? 5 % Tween-20 組成；所述蛋白復(fù)性液-I 由 50mM Tris-NaOH pHll、50mM NaCL、5%Glycerol、6mM EDTA 和5mM2-巰基乙醇組成；所述蛋白復(fù)性液-II由50mM Tris-HCl pH8、50mM NaCL、5 % Glycerol、5mM EDTA、3mM2_ 疏基乙醇組成。
[0028] 所述包涵體溶解液中的20mM2_巰基乙醇可采用5mM DTT替代；所述包涵體溶 解液中的0.5 % N-十二烷基肌氨酸鈉可采用0.05% SDS替代；所述包涵體溶解液中的 Tris-NaOH緩沖液可采用等pH值的碳酸鹽緩沖液或磷酸鹽緩沖液中的其中一種替代。
[0029] 本發(fā)明一種從包涵體中制備可溶性白介素重組蛋白的方法，其特征在于，包括以 下步驟：
[0030] (1)離心收集經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)白介素的大腸桿菌；
[0031] (2)加入洗滌液，混勻，重懸菌體，離心除去上清；
[0032] (3)加入菌體裂解液，混勻，重懸菌體，在冰上用超聲波裂解菌體1-10秒，間歇進(jìn) 行1-5次（每次間歇1-10秒），離心除去上清；
[0033] (4)加入洗滌液，混勻，重懸蛋白包涵體（可用超聲波協(xié)助重懸），離心除去上清 (本洗滌步驟可重復(fù)2-3次）；
[0034] (5)加入包涵體溶解液,混勻，重懸蛋白包涵體（可用超聲波協(xié)助重懸），離心收集 上清，將該上清裝入透析袋；
[0035] (6)將透析袋放入蛋白復(fù)性液-I中透析；
[0036] (7)進(jìn)一步將透析袋轉(zhuǎn)入蛋白復(fù)性液-II中繼續(xù)透析；
[0037] (8)收集透析袋中蛋白液，便得可溶性白介素重組蛋白；
[0038] (9)檢測(cè)復(fù)性后蛋白含量和純度。
[0039] 實(shí)施例一：比較白介素ILlO重組蛋白包涵體在不同溶液中溶解情況：
[0040] A?無變性劑：50mM Tris-HCl (pH8);
[0041] B.本發(fā)明包涵體溶解液：50mM Tris-Na0H(pH12);
[0042] C?尿素變性劑：50mM Tris-HCl (pH8)、8M_Urea ;
[0043] D.鹽酸胍變性劑：50mM Tris-HCl (pH8)、6MGuanidine ;
[0044] 將大腸桿菌表達(dá)的ILlO包涵體洗滌離心后等量分成4份，然后分別加入上述溶 液，充分混勻，重懸蛋白包涵體，用超聲波助懸10秒，離心收集上清，測(cè)定各上清液中溶解 的ILlO蛋白含量。結(jié)果如下表：
[0045]

【權(quán)利要求】
1. 一種從包涵體中制備可溶性白介素重組蛋白的試劑，其特征在于：包括洗滌液、菌 體裂解液、包涵體溶解液、蛋白復(fù)性液-I和蛋白復(fù)性液-II，所述包涵體溶解液由pH值 10-12的Tris-NaOH緩沖液、NaCl、Glycerol、EDTA、2-巰基乙醇和N-十二烷基肌氨酸鈉組 成。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從包涵體中制備可溶性白介素重組蛋白的試劑，其特征 在于：所述包涵體溶解液由pH值10-12的10-300mM Tris-NaOH緩沖液、50-300mM NaCl、 5-30% Glycerol、2-20mM EDTA、l-30mM2-巰基乙醇和 0· 05-0. 5% N-十二烷基肌氨酸鈉組 成。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從包涵體中制備可溶性白介素重組蛋白的試劑，其特征 在于：所述洗滌液由 50mM Tris-HCl pH8、50mM NaCL、5 % Glycerol、5mM EDTA、3mm2-巰基乙 醇和 0. 5% Tween-20 組成；所述菌體裂解液由 50mM Tris-HCl pH8、50mM NaCL、5mM EDTA、 3_2-疏基乙醇和0.5% Tween-20組成；所述蛋白復(fù)性液-I由50mM Tris-NaOH pHll、 50mM NaCL、5% Glycerol、6mM EDTA和5mM2-巰基乙醇組成；所述蛋白復(fù)性液-II由50mM Tris-HCl pH8、50mM NaCL、5%Glycerol、5mM EDTA、3mM2-巰基乙醇組成。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種從包涵體中制備可溶性白介素重組蛋白的試劑，其特征 在于：所述包涵體溶解液中的20mM2-巰基乙醇可采用5mM DTT替代。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種從包涵體中制備可溶性白介素重組蛋白的試劑，其特征 在于：所述包涵體溶解液中的〇. 5% N-十二烷基肌氨酸鈉可采用0. 05% SDS替代。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種從包涵體中制備可溶性白介素重組蛋白的試劑，其 特征在于：所述包涵體溶解液中的Tris-NaOH緩沖液可采用等pH值的碳酸鹽緩沖液或磷酸 鹽緩沖液中的其中一種替代。
7. -種從包涵體中制備可溶性白介素重組蛋白的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 離心收集經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)白介素的大腸桿菌； (2) 加入洗滌液，混勻，重懸菌體，離心除去上清； (3) 加入菌體裂解液，混勻，重懸菌體，在冰上用超聲波裂解菌體1-10秒，間歇進(jìn)行1-5 次（每次間歇1-10秒），離心除去上清； (4) 加入洗滌液，混勻，重懸蛋白包涵體（可用超聲波協(xié)助重懸），離心除去上清（本洗 滌步驟可重復(fù)2-3次）； (5) 加入包涵體溶解液，混勻，重懸蛋白包涵體（可用超聲波協(xié)助重懸），離心收集上 清，將該上清裝入透析袋； (6) 將透析袋放入蛋白復(fù)性液-I中透析； (7) 進(jìn)一步將透析袋轉(zhuǎn)入蛋白復(fù)性液-II中繼續(xù)透析； (8) 收集透析袋中蛋白液，便得可溶性白介素重組蛋白； (9) 檢測(cè)復(fù)性后蛋白含量和純度。
【文檔編號(hào)】C07K14/54GK104292325SQ201410363398
【公開日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2014年7月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月28日
【發(fā)明者】鄒潮 申請(qǐng)人:哈德遜（天津）生物技術(shù)有限責(zé)任公司