重組人干擾素β-1b的高壓復(fù)性和組合層析制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及重組人干擾素β-1b(IFNβ-1b)的高壓復(fù)性和組合層析制備方法，該方法包括破菌；包涵體的洗滌；高壓復(fù)性和純化；其中，高壓復(fù)性采用將洗滌后的包涵體直接重懸到復(fù)性緩沖溶液中，在180-320MPa壓力下作用10-16h完成復(fù)性；純化采用一步SP?FF陽(yáng)離子交換層析和一步Butyl-S疏水層析組合的方法。本發(fā)明的制備方法無(wú)需變性過程，直接完成包涵體復(fù)性，同時(shí)全過程無(wú)需添加SDS，并可以使用層析的方法進(jìn)行純化，適用于大規(guī)模生產(chǎn)。
【專利說明】重組人干擾素 β-1b的高壓復(fù)性和組合層析制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，具體涉及一種重組人干擾素 β-lb的制備方法，尤 其涉及一種先采用高壓復(fù)性重組人干擾素 β-lb包涵體然后使用SP FF陽(yáng)離子交換和 Buty 1-S疏水層析組合的方法進(jìn)行純化的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 人β干擾素是由成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞產(chǎn)生的一類具有廣譜生物活性（包括抗 病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用）的細(xì)胞因子，屬于I型干擾素。目前人β干擾素有兩種，分 別為干擾素 β-la與干擾素 β-lb，其中干擾素 β-lb是將17位的Cys突變?yōu)镾er而成，含 有165aa，分子量為18500Da。
[0003] 國(guó)外采用重組人干擾素 β-lb治療某些疾病，例如性疣、丙型肝炎及相關(guān)肝癌，美 國(guó)FDA已于1993年批準(zhǔn)重組人干擾素 β -lb用于治療多發(fā)性硬化癥，目前市場(chǎng)上的重組人 干擾素 β -lb藥品主要為Bayer公司的Betaferon和諾華公司的Extavia。
[0004] 重組人干擾素 β-lb通過目前最常用的表達(dá)系統(tǒng)一大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)（US 4, 518, 584A1)，并且以包涵體的形式存在。由于干擾素 β-lb具有強(qiáng)烈的疏水性，其包涵體 采用傳統(tǒng)變復(fù)性手段不能夠恢復(fù)蛋白的天然結(jié)構(gòu)。
[0005] Leo S Lin 等人（Methods in Enzymology，986,119:183-192)通過 SDS 溶解包涵 體并結(jié)合有機(jī)相抽提和凝膠過濾的方法進(jìn)行變復(fù)性和純化。該方法需要全過程添加 SDS，致 使后期層析純化只能采用凝膠過濾的方法，操作繁瑣，工作量大，在工業(yè)應(yīng)用中存在困難， 需要尋找一種新的變復(fù)性方法。
[0006] 高壓復(fù)性蛋白質(zhì)是一種新的包涵體復(fù)性技術(shù)。St. John等人（University of Colorado-Boulder. Dept, of Chemical and Biological Engineering Thesis.1995:28)認(rèn) 為不同于傳統(tǒng)變性劑將蛋白結(jié)構(gòu)完全變性伸展開來(lái)，高壓處理是一種溫和的變性過程，它 通過壓力作用擠壓水分子進(jìn)入包涵體疏水界面并破壞其疏水結(jié)構(gòu)從而使包涵體溶解，形成 的是一種部分展開的過渡態(tài)，稱之為折疊中間體結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)高度有序，非常接近蛋白天 然態(tài)，然后在特定壓力下作用一定時(shí)間后逐漸折疊恢復(fù)至蛋白天然狀態(tài)，完成復(fù)性。
[0007] 高壓復(fù)性相較于常規(guī)復(fù)性方法（稀釋復(fù)性、透析復(fù)性、柱上復(fù)性）不僅可以用于許 多特殊蛋白的復(fù)性，而且還可以在更高初始濃度條件下完成復(fù)性，可以很大程度上降低生 產(chǎn)成本，減少工作量，易于工業(yè)放大。Theodore W. Randolph等人（Proc. Natl. Acad. Sci， 1999,96:13029-13033)通過一系列研究表明：使用一定的壓力（150-350Mpa)可以復(fù)性蛋 白質(zhì)包涵體，獲得活性蛋白。
[0008] Leo. S. Lin 等人（Methods enzymology，1986. 119:183-192)，Rao. D. V 等人 (Biochemistry and Biotechnology, 2009. 158 (1):140-154)在制備重組人干擾素 β-lb 的時(shí)候都使用了 SDS溶解包涵體，對(duì)后期層析過程造成很大困難，只能采用凝膠過濾的 方法進(jìn)一步純化° Dean Russell. Harde 等人（Journal of Interferon and Cytokine Research, 1995. 15:31-37)雖然沒有用到SDS溶解包涵體，但是使用了極端pH，這容易誘發(fā) 脫酰胺反應(yīng)使蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。Cleland. Jeffrery. L等人（US 8, 273, 561B2)嘗試使用 了高壓處理的手段，但是仍然使用了 SDS溶解包涵體然后有機(jī)相抽提的方法，并且有三步 組合層析純化，步驟繁瑣而且收率低。因此尋找一種無(wú)需變性，直接完成包涵體復(fù)性并全程 無(wú)添加 SDS的重組人干擾β -lb制備工藝是目前亟待解決的問題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于提供一種重組人干擾素 β _lb的制備方法，特別是一種先采用 高壓復(fù)性重組人干擾素 β lb包涵體然后使用SP FF陽(yáng)離子交換和Butyl-S疏水層析組合 的方法進(jìn)行純化的制備方法。
[0010] 為達(dá)到此發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0011] 本發(fā)明提供了一種重組人干擾素 β _lb的高壓復(fù)性和組合層析制備方法，包括破 菌；包涵體的洗滌；高壓復(fù)性和純化。
[0012] 優(yōu)選地，所述破菌采用高壓勻漿的方法進(jìn)行。
[0013] 優(yōu)選地，所述包涵體的洗滌包括以下步驟：
[0014] (1)將所述包涵體用緩沖液進(jìn)行清洗，離心棄上清獲得粗制包涵體；
[0015] (2)在所述粗制包涵體中按1:10 (m/v)加入8M Urea變性劑，0.5% β-巰基乙醇， 洗滌過夜，離心棄上清；
[0016] (3)將步驟（2)得到的沉淀用去離子水洗滌后，按1:10 (m/v)加入2%十四烷基二 甲基（3-磺丙基）氫氧化銨內(nèi)鹽（Zwittergent)溶液洗滌，離心棄上清，然后將所得沉淀用 去離子水洗滌后獲得精制包涵體。
[0017] 本發(fā)明在進(jìn)行包涵體的洗滌時(shí)，步驟（1)所用到的緩沖液可以是現(xiàn)有技術(shù)中常 用的緩沖液，例如可以是：20mM Tris-HCl，lmM EDTA，l%Triton-100，pH 8. 0 或 20mM Tris-HCl，ImM EDTA，1M NaCl，pH 8· 0 或 20mM Tris-HCl，ImM EDTA，2M Urea，pH 8· 0,本發(fā) 明優(yōu)選采用上述3種緩沖液分別進(jìn)行包涵體的洗滌，通過該步驟（1)的洗滌可以去除大部 分雜蛋白，獲得粗制包涵體。
[0018] 本發(fā)明在步驟（1)的基礎(chǔ)上，通過將8Μ Urea變性劑，0. 5% β-巰基乙醇以及2% Zwittergent溶液分別對(duì)粗制包涵體作進(jìn)一步洗漆，可以顯著去除特殊雜蛋白，從而獲得精 制包涵體。
[0019] 優(yōu)選地，所述高壓復(fù)性采用將所述包涵體超聲重懸后直接進(jìn)行復(fù)性。
[0020] 優(yōu)選地，將所述包涵體的重懸液加到復(fù)性緩沖溶液中，混勻后在180-320MPa壓力 下作用l〇_16h。
[0021] 本發(fā)明中高壓復(fù)性的壓力還可以選自180MPa、190MPa、200MPa、210MPa、220MPa、 230MPa、250MPa、280MPa、300MPa 或 320MPa，優(yōu)選為 320MPa。
[0022] 本發(fā)明中高壓復(fù)性的時(shí)間還可以選自10h、llh、12h、13h、14h、15h或16h，優(yōu)選為 16h〇
[0023] 優(yōu)選地，所述復(fù)性緩沖溶液包括20mM Tris-HCLO. 5M精氨酸，pH 8. 0和0. 5% Zwittergent，GSH:GSSG = 1. OmM :0· 2mM。
[0024] 本發(fā)明采用高壓復(fù)性技術(shù)，不僅省略了有機(jī)相抽提和凝膠過濾步驟，而且全過程 無(wú)需添加 SDS，從而克服了現(xiàn)有技術(shù)中后期層析純化只能用凝膠過濾方法的缺陷，具有操作 簡(jiǎn)便、工作量小等優(yōu)點(diǎn)。
[0025] 優(yōu)選地，所述純化方法包括SP FF陽(yáng)離子交換和Butyl-S疏水層析。
[0026] 優(yōu)選地，所述SP FF陽(yáng)離子交換層析方法包括將高壓復(fù)性獲得的樣品稀釋10倍后 上樣，上樣結(jié)束后先用5%洗脫緩沖液淋洗，然后用5-40%洗脫2-3柱體積。
[0027] 優(yōu)選地，所述SP FF陽(yáng)離子交換層析方法用到的平衡緩沖溶液為20mM PB，pH 7.0， 所述洗脫緩沖液為20mM PB，1M NaCl，pH 7. 0。
[0028] 優(yōu)選地，所述Butyl-S疏水層析方法包括將SP FF陽(yáng)離子交換層析獲得的樣品中 添加 AS至終濃度為0. 4M,然后用Butyl-S柱進(jìn)行純化；
[0029] 優(yōu)選地，所述Butyl-S疏水層析方法中用到的平衡緩沖液為20mM ΡΒ，0. 4M AS，pH 7. 0,洗脫緩沖液為20mM PB，pH 7. 0,直接以100%洗脫緩沖溶液進(jìn)行洗脫。
[0030] 本發(fā)明采用一步SP FF陽(yáng)離子交換層析和Butyl-S疏水層析的方法進(jìn)行純化，純 化后的重組人干擾素 β -lb純度能夠達(dá)到95%以上。
[0031] 作為優(yōu)選技術(shù)方案，本發(fā)明的重組人干擾素 β-lb的高壓復(fù)性和組合層析制備方 法包括以下步驟：
[0032] (1)破菌：采用高壓勻漿的方法進(jìn)行破菌；
[0033] (2)包涵體的洗滌：先將所述包涵體用緩沖液進(jìn)行清洗，離心棄上清后獲得粗制 包涵體；然后在所述粗制包涵體中按1:10 (m/v)的比例加入8M Urea變性劑，添加0. 5% β -巰基乙醇，洗滌過夜，離心棄上清；再將得到的沉淀用去離子水洗滌后，按1:10 (m/v)的 比例加入2% Zwittergent溶液洗滌，離心棄上清，然后將所得沉淀用去離子水洗滌后獲得 精制包涵體；
[0034] (3)高壓復(fù)性：將步驟⑵得到的精制包涵體用去離子水超聲重懸，并將包涵體重 懸液加入到復(fù)性緩沖溶液中，混勻后在180_320MPa壓力下作用10-16h，其中復(fù)性緩沖溶液 為 20mM Tris-HCl，0. 5M 精氨酸，pH 8. 0,0· 5% Zwittergent，GSH:GSSG = 1. OmM :0· 2mM ;
[0035] (4)純化：先采用SP FF陽(yáng)離子交換層析再利用Butyl-S疏水層析方法進(jìn)行純化；
[0036] 其中，所述SP FF陽(yáng)離子交換層析方法包括將高壓復(fù)性獲得的樣品稀釋10倍后上 樣，上樣結(jié)束后先用5%洗脫緩沖液淋洗，然后用5-40%洗脫2-3柱體積，所述SP FF陽(yáng)離 子交換層析方法用到的平衡緩沖溶液為20mM PB，pH 7.0,所述洗脫緩沖液為20mM PB，1M NaCl, pH 7. 0 ；
[0037] 其中，所述Butyl-S疏水層析方法包括將SP FF陽(yáng)離子交換層析獲得的樣品中添 加 AS至終濃度為0. 4M，然后用Butyl-S柱進(jìn)行純化；所述Butyl-S疏水層析方法中用到的 平衡緩沖液為20禮？8,0.41^5，？!17.0，洗脫緩沖液為201111?8，？!17.0，直接以100%洗 脫緩沖溶液進(jìn)行洗脫。
[0038] (5)對(duì)純化后的蛋白進(jìn)行純度及結(jié)構(gòu)檢測(cè)。
[0039] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明至少具有以下有益效果：
[0040] 本發(fā)明的制備方法無(wú)需變性過程，直接完成包涵體復(fù)性，省略了有機(jī)相抽提和凝 膠過濾步驟，同時(shí)全過程無(wú)需添加 SDS，并可以使用層析的方法進(jìn)行純化，最終獲得的重組 人干擾素 β -lb樣品純度高于95% ;本發(fā)明的制備方法適用于大規(guī)模生產(chǎn)，降低了成本，提 高了生產(chǎn)效率。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0041] 圖1是本發(fā)明包涵體洗滌效果的SDS-PAGE電泳圖；
[0042] 其中Μ為分子量marker，其從小到大依次為14. 3kD，20. lkD，29kD，44. 3kD， 66. 4kD，97. 2kD，l為8M Urea洗滌后上清，2為8M Urea洗滌后沉淀水洗上清，3為2% Zwittergent洗漆后上清，4為2% Zwittergent洗漆后沉淀水洗上清，5為精制包涵體。
[0043] 圖2是本發(fā)明不同復(fù)性緩沖體系下的質(zhì)量收率比較圖；
[0044] 其中，Z G 3. 7 表示 20mM NaAc-HAc，pH 3. 7,0· 5% Zw3-14, GSH :GSSG = 10 :1 ;Z G 3.7 表示 20mM NaAc-HAc，pH 3.7,0.5%Zw3-14,2mM DTT;U Z D 表示 50mM Tris-HC1，4M Urea，pH 8. 0,0.5% Zw3-14,2mM DTT;U Z G 表示 50mM Tris-HC1，4M Urea，pH 8.0,0.5% Zw3-14, GSH :GSSG = 10 :1 ;A Z D 表示 50mM Tris-HCl，0. 5M Arg，pH 8. 0,0· 5% Zw3-14， 2mM DTT ;A Z G表示 50mM Tris-HCl，0. 5M Arg，pH 8. 0,0· 5%Zw 3-14，GSH :GSSG= 10 :2。
[0045] 圖3是本發(fā)明的SP FF純化層析圖。
[0046] 圖4是本發(fā)明的Butyl-S純化層析圖。
[0047] 圖5是本發(fā)明純化獲得的重組人干擾素 β -lb樣品的SDS-PAGE電泳圖；
[0048] 其中，Μ 為分子量marker (從小到大依次為 14. 3kD，20. lkD，29kD，44. 3kD，66. 4kD， 97. 2kD)；
[0049] 其中，圖5-A中1為SP FF純化上樣前樣品，2為SP FF純化穿透峰，3-4為SP FF純 化洗脫峰，5為Butyl-S純化穿透峰，6-7為Butyl-S純化洗脫峰，8-9為非還原型Butyl-S純 化洗脫峰；圖5-B中1-3分別對(duì)應(yīng)還原型不同上樣量條件的本發(fā)明的純化人干擾素 β -lb 樣品，1為10 μ L, 2為20 μ L, 3為30 μ L, 4為空白道,5為非還原型電泳條件下人干擾素 β -lb純化樣品。
[0050] 圖6是本發(fā)明圓二色光譜檢測(cè)分析純化樣品結(jié)構(gòu)圖。

【具體實(shí)施方式】
[0051] 下面通過【具體實(shí)施方式】來(lái)進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明 了，所述實(shí)施例僅僅是幫助理解本發(fā)明，不應(yīng)視為對(duì)本發(fā)明的具體限制。
[0052] 實(shí)施例1
[0053] 菌體發(fā)酵：將帶有目標(biāo)基因的基因工程菌在常規(guī)LB培養(yǎng)基（1%蛋白胨，0.5%酵 母膏，1 % NaCl)中發(fā)酵培養(yǎng)，添加一定濃度抗生素，待0D600值達(dá)到一定程度之后使用IPTG 進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)3-5h，發(fā)酵結(jié)束。
[0054] 破菌：將菌體用 TE (50mmol/LTris-Cl、5mmol/LEDTA)按 1:10 (g/mL)的比例懸浮菌 體，置于高壓勻楽機(jī)中破碎，壓力l〇〇〇bar，循環(huán)3次，破菌后于4°C、8500rpm離心15min，棄 上清，沉淀重懸于TE緩沖液中，重復(fù)上述操作2次。
[0055] 通過洗滌包涵體獲得一定純度的包涵體，具體步驟為：（1)將包涵體分別用 包涵體洗滌液 1 (20mM Tris-HCl, ImM EDTA, 1 % Triton-100, pH 8. 0)、洗滌液 2 (20mM Tris-HCl, ImM EDTA, 1M NaCl,pH 8.0)和洗滌液 3(20mM Tris-HCl, ImM EDTA,2M Urea,pH 8.0)進(jìn)行清洗，離心去除上清獲得粗制包涵體；（2)然后在粗制包涵體中按1 :10(m/v)比 例加入8M Urea變性劑，添加0. 5% β -ME，洗滌過夜，離心去除上清；（3)將沉淀用去離子 水洗漆后按l:l〇(m/v)比例加入2% Zwittergent3-14洗漆8h，離心去除上清，然后將沉淀 用去離子水洗滌后獲得精制包涵體。
[0056] 從圖1可以看出，箭頭指向本發(fā)明的重組人干擾β _lb，圖1表明，通過對(duì)包涵體進(jìn) 行3步洗滌可以去除大部分雜蛋白以及部分特殊雜蛋白，獲得精制包涵體。
[0057] 實(shí)施例2
[0058] 高壓復(fù)性人干擾素 β -lb包涵體：將已獲得的人干擾素 β -lb精制包涵體用去離 子水超聲（功率225-300W，超聲3S，間歇6S，工作時(shí)間30S)重懸，取少量重懸液變性溶解測(cè) 濃度，并以此作為復(fù)性初始濃度的參考值。
[0059] 將包涵體重懸液按一定初始濃度（lmg/mL)分別加到不同復(fù)性緩沖溶液中，混勻 后使用320MPa壓力作用16h，比較復(fù)性結(jié)果。
[0060] 從圖2可以看出，在復(fù)性緩沖體系為（20mM Tris-HCl，0. 5M Arg，pH 8. 0,0. 5% Zwittergent3-14, GSH:GSSG = 1. OmM :0· 2mM)時(shí)獲得最高收率，接近 100%。
[0061] 實(shí)施例3
[0062] SP FF純化：高壓復(fù)性獲得樣品稀釋10倍后使用SP FF柱進(jìn)行純化，平衡緩沖溶 液為20mM PB，pH 7. 0,洗脫緩沖溶液為20mM PB，1M NaCl，pH 7. 0。上樣結(jié)束后先用5%洗 脫緩沖液淋洗，然后按5% -40%洗脫2-3柱體積，收集洗脫峰；
[0063] Buty 1-S純化：在SP FF柱純化獲得樣品中添加 AS至終濃度為0. 4M，然后用 Butyl-S柱進(jìn)行純化，平衡緩沖溶液為20mM PB，0.4M AS，pH 7.0,洗脫緩沖溶液為20mM PB， pH 7.0。上樣結(jié)束后直接以100%洗脫緩沖溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫峰；
[0064] 圖3和圖4分別是SP FF純化層析圖和Butyl-S純化層析圖。
[0065] 通過圖3可以看出，在SP FF層析純化圖中大部分雜蛋白穿透過柱子，干擾素 β -lb結(jié)合在柱上并在洗脫時(shí)主要存在于5 % -40 % B洗脫峰中。進(jìn)一步使用Butyl-S層析 進(jìn)行純化時(shí)，如圖4所示，剩余雜蛋白都穿透過柱子，目標(biāo)蛋白直接通過100% B洗脫下來(lái)。
[0066] 實(shí)施例4
[0067] SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析純化樣品純度：
[0068] 采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法分析純化樣品，圖5-A顯示通過一步SP FF純化 獲得接近80%純度的樣品，進(jìn)一步通過Butyl-S純化獲得樣品純度高于95%，并且通過非 還原型電泳結(jié)果可知純化樣品中不存在二硫鍵聚集。圖5-B中比較了不同上樣量條件下的 純化樣品電泳結(jié)果，進(jìn)一步證明本制備工藝獲得的純品已達(dá)到電泳純。
[0069] 實(shí)施例5
[0070] 圓二色光譜分析檢測(cè)純化樣品的結(jié)構(gòu)：比較人干擾素標(biāo)準(zhǔn)品以及本制備工藝純化 獲得樣品的二級(jí)結(jié)構(gòu)。
[0071] 圖6表明本發(fā)明制備工藝獲得的人干擾素 β -lb中二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為α -螺旋結(jié) 構(gòu)，與標(biāo)準(zhǔn)品一致，符合理論值，說明本發(fā)明得到的純化樣品結(jié)構(gòu)正確。
[0072] 申請(qǐng)人:聲明，本發(fā)明通過上述實(shí)施例來(lái)說明本發(fā)明的工藝方法，但本發(fā)明并不局 限于上述工藝步驟，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述工藝步驟才能實(shí)施。所屬【技術(shù)領(lǐng)域】的 技術(shù)人員應(yīng)該明了，對(duì)本發(fā)明的任何改進(jìn)，對(duì)本發(fā)明所選用原料的等效替換及輔助成分的 添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1. 一種重組人干擾素 β-lb的高壓復(fù)性和組合層析制備方法，其特征在于：所述方法 包括破菌；包涵體的洗滌；高壓復(fù)性和層析純化。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述破菌采用高壓勻漿的方法進(jìn)行。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述包涵體的洗滌包括以下步驟： (1)將所述包涵體用緩沖液進(jìn)行清洗，離心棄上清后獲得粗制包涵體； ⑵在所述粗制包涵體中按1:10 (m/v)的比例加入8M Urea變性劑，添加0. 5% β-巰 基乙醇，洗滌過夜，離心棄上清； (3)將步驟（2)得到的沉淀用去離子水洗滌后，按l:10(m/v)的比例加入2% Zwittergent溶液洗滌，離心棄上清，然后將所得沉淀用去離子水洗滌后獲得精制包涵體。
4. 如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述高壓復(fù)性采用將所述包涵體 重懸后直接進(jìn)行復(fù)性； 優(yōu)選地，將所述包涵體的重懸液加到復(fù)性緩沖溶液中，混勻后在180-320MPa壓力下作 用10-16h，優(yōu)選為320MPa壓力下作用16h ; 優(yōu)選地，所述復(fù)性緩沖溶液為20mM Tris-HCl，0. 5M精氨酸，pH 8. 0,0. 5 % Zwittergent，GSH:GSSG = 1. 0mM:0. 2mM。
5. 如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述純化方法包括SPFF陽(yáng)離子交 換和Butyl-S疏水層析。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述SP FF陽(yáng)離子交換層析方法包括將高壓 復(fù)性獲得的樣品稀釋10倍后上樣，上樣結(jié)束后先用5%洗脫緩沖液淋洗，然后用5-40%洗 脫2-3柱體積。
7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述SP FF陽(yáng)離子交換層析方法用到的平衡 緩沖溶液為20mM PB，pH 7. 0,所述洗脫緩沖液為20mM PB，1M NaCl，pH 7. 0。
8. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于：所述Butyl-S疏水層析方法包括將SP FF陽(yáng) 離子交換層析獲得的樣品中添加硫酸銨至終濃度為0. 4M，然后用Butyl-S FF柱進(jìn)行純化。
9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述Butyl-S疏水層析方法中用到的平衡緩 沖液為20mM ΡΒ，(λ 4M AS，pH 7. 0,洗脫緩沖液為20mM PB，pH 7. 0,直接以100%洗脫緩沖 溶液進(jìn)行洗脫。
10. 如權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟： (1) 破菌：采用高壓勻漿的方法進(jìn)行破菌； (2) 包涵體的洗滌：先將所述包涵體用緩沖液進(jìn)行清洗，離心棄上清后獲得粗制包涵 體；然后在所述粗制包涵體中按1:10 (m/v)的比例加入8M Urea變性劑，添加0.5% β-巰 基乙醇，洗滌過夜，離心棄上清；再將得到的沉淀用去離子水洗滌后，按l:l〇(m/v)的比例 加入2% Zwittergent溶液洗漆，離心棄上清，然后將所得沉淀用去離子水洗漆后獲得精制 包涵體； (3) 高壓復(fù)性：將步驟（2)得到的精制包涵體用去離子水超聲重懸，并將包涵體重懸 液加入到復(fù)性緩沖溶液中，混勻后在180_320MPa壓力下作用10-16h，其中復(fù)性緩沖溶液為 20mM Tris-HCl，0. 5M 精氨酸，pH 8. 0,0· 5% Zwittergent，GSH:GSSG = 1. OmM :0· 2mM ; (4) 純化：先采用SP FF陽(yáng)離子交換層析再利用Butyl-S疏水層析方法進(jìn)行純化； 其中，所述SP FF陽(yáng)離子交換層析方法包括將高壓復(fù)性獲得的樣品稀釋10倍后上樣， 上樣結(jié)束后先用5%洗脫緩沖液淋洗，然后用5-40%洗脫2-3柱體積，所述SP FF陽(yáng)離子交 換層析方法用到的平衡緩沖溶液為20mM PB，pH 7.0,所述洗脫緩沖液為20mM PB，1M NaCl， pH 7. 0 ； 其中，所述Butyl-S疏水層析方法包括將SP FF陽(yáng)離子交換層析獲得的樣品中添加 AS 至終濃度為〇. 4M，然后用Butyl-S柱進(jìn)行純化；所述Butyl-S疏水層析方法中用到的平衡 緩沖液為20禮？8,0.41^5，？!17.0，洗脫緩沖液為201111?8，？!17.0，直接以100%洗脫緩 沖溶液進(jìn)行洗脫。 (5)對(duì)純化后的蛋白進(jìn)行純度及結(jié)構(gòu)檢測(cè)。
【文檔編號(hào)】C07K14/565GK104193818SQ201410437913
【公開日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年8月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月29日
【發(fā)明者】劉永東, 蘇志國(guó), 王祺, 張純 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院過程工程研究所