傳染性肌肉壞死病毒的rt?lamp檢測試劑盒及檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種傳染性肌肉壞死病毒的RT?LAMP檢測試劑盒及檢測方法，其中所述試劑盒包括外引物F3、B3和內(nèi)引物FIP、BIP混合液，所述引物F3、B3、FIP、BIP的核苷酸序列分別如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。所述檢測方法是采用RT?LAMP檢測體系對樣品中是否含有傳染性肌肉壞死病毒進(jìn)行檢測，該方法操作簡便，對實(shí)驗(yàn)儀器要求較低，在普通恒溫水浴鍋中反應(yīng)60min即可完成，而且可以通過在終產(chǎn)物中加入染料的方法直接用肉眼觀察結(jié)果，能快速準(zhǔn)確地鑒定傳染性肌肉壞死病病毒，在對蝦水產(chǎn)養(yǎng)殖中具有廣闊的推廣應(yīng)用前景。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種傳染性肌肉壞死病毒的RT-LAMP檢測試 劑盒及檢測方法。 傳染性肌肉壞死病毒的RT-LAMP檢測試劑盒及檢測方法
【背景技術(shù)】
[0002] 對4下傳染性肌肉壞死病（infectious myonecrosis，IMN)最初于2002年8月爆發(fā)于 巴西Piaui州的凡納濱對蝦養(yǎng)殖場，并很快在巴西東北沿岸蔓延開來，目前已傳至亞洲。該 病感染對蝦腹部末端體節(jié)及尾扇出現(xiàn)肌肉壞死，呈現(xiàn)肌肉發(fā)白及不透明癥狀，外觀呈烤焦 狀。組織學(xué)觀察表明，該病主要感染對蝦的肌肉組織和淋巴器官，且常伴隨著浮腫及血細(xì)胞 纖維化，在壞死肌纖維及纖維化的血細(xì)胞之間常有液體堆集，在淋巴器官及肌肉細(xì)胞質(zhì)中 常有深色嗜堿包涵體。因在養(yǎng)殖過程中各個階段均可感染，因此在整個養(yǎng)殖季節(jié)的累計死 亡率可達(dá)70 %，尤其在接近成體階段，對蝦感染此病將造成更大的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003] 而引起這種傳染性肌肉壞死病的病毒名稱定為傳染性肌肉壞死病毒(infectious myonecrosis visus，IMNV)，目前，已建立了幾種針對傳染性肌肉壞死病毒IMNV的組織學(xué)及 分子生物學(xué)檢測方法。如采用常規(guī)組織切片技術(shù)發(fā)現(xiàn)MNV主要感染對蝦的肌肉組織和淋巴 器官，且感染組織有深色嗜堿包涵體;建立了 MNV的套式RT-PCR檢測方法;建立了 MNV的原 位雜交方法（Insitu hybridization)，在組織切片中經(jīng)抗體與地高辛標(biāo)記的IMNV探針結(jié) 合，在對蝦的血淋巴和肌肉中觀察到明顯的藍(lán)紫色;建立了頂NV的real-time RT-PCR定量 檢測方法，最低可檢測到1 0拷貝的IMNV ;還有人研發(fā)了 IMNV RT-PCR檢測試劑盒 (IQ2000TM頂NV)。但以上這些檢測方法只適合于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)操作，不便于大面積推廣。
[0004] 中國臺灣某公司已從中國海南凡納濱對蝦中檢測至IjMNV，可見，頂NV極有可能已 傳入中國并正在擴(kuò)散，開展對蝦傳染性肌肉壞死病的研究及預(yù)警刻不容緩。對中國大陸主 要凡納濱對蝦養(yǎng)殖場進(jìn)行傳染性肌肉壞死病調(diào)查、開發(fā)簡便易行的檢測試劑盒、檢測方法 對預(yù)防傳染性肌肉壞死病將具有積極的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對目前存在的問題，本發(fā)明提供檢測傳染性肌肉壞死病毒的RT-LAMP檢測試劑 盒及檢測方法，能夠快速準(zhǔn)確的檢測出傳染性肌肉壞死病毒。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0007] -種傳染性肌肉壞死病毒的RT-LAMP檢測試劑盒，所述試劑盒包括外引物F3、B3和 內(nèi)引物FIP、BIP混合液，所述引物F3、B3、FIP、BIP的核苷酸序列分別如SEQIDN0.1、SEQID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4所示。
[0008] 優(yōu)選地，所述試劑盒采用天根磁珠法病毒DNA/RNA提取試劑盒。
[0009 ] 更優(yōu)選地，所述試劑盒還包括5 X LAMP反應(yīng)液、ddH2〇、IyL樣品總RNA。
[0010]其中，所述5XLAMP反應(yīng)液包括 10.0mM Tris-HCl，5.0mM(NH4)2S〇4,25.0mM KC1， 5.0~IOmM MgS〇4,〇.〇5%吐溫20,5.0mM dNTPs，0.5UAxL逆轉(zhuǎn)錄酶AMV RTtase，0.5UAxL熱 啟動等溫擴(kuò)增酶。
[0011] 優(yōu)選地，所述外引物和內(nèi)引物的濃度之比為1:3~10。
[0012] 更優(yōu)選地，其特征在于，所述外引物F3、B3的濃度均為0.2μΜ，內(nèi)引物FIP、BIP的濃 度均為1 .ΟμΜ。
[0013] 其中，所述CldH2O為去除核糖核酸酶和脫氧核糖核酸酶的超純水。
[0014]利用前述RT-LAMP檢測試劑盒檢測傳染性肌肉壞死病毒的方法，所述方法包括如 下步驟：
[0015] (1)提取待測樣品總RNA作為反應(yīng)模板；
[0016] (2)陽性對照品準(zhǔn)備：利用已經(jīng)經(jīng)過鑒定的保存完好的傳染性肌肉壞死病毒滅活 菌株進(jìn)行RNA提取，之后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，設(shè)計引物合成傳染性肌肉壞死病病毒ORFl多聚蛋白 編碼區(qū)l-1680bp，連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中進(jìn)行擴(kuò)繁，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR驗(yàn) 證，陽性克隆進(jìn)行保存?zhèn)溆茫?br>[0017] (3)配制RT-LAMP檢測體系：按總反應(yīng)體積為20yL為例，采用4yL 5 X LAMP反應(yīng)液： lO.OmM Tris-HCl，5.0mM(NH4)2S〇4,25.0mM KC1，5.0~IOmM MgS〇4,0.05%吐溫20,5.0mM dNTPs，0.5UAxL逆轉(zhuǎn)錄酶AMV RTtase，0.5UAxL熱啟動等溫擴(kuò)增酶;4yL 5X引物混合液包 括:外引物F3和B3,內(nèi)引物FIP和BIP;其中，外引物和內(nèi)引物的濃度之比為1:8; IlyL去除核 糖核酸酶和脫氧核糖核酸酶的超純水;IyL樣品總RNA;
[0018] (4)將配制好的檢測體系在63°C恒溫下進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)60min，80°C溫度條件下 Bst 失活 IOmin;
[0019] (5)RT-LAMP反應(yīng)結(jié)果判定包括如下方法：
[0020] A、RT-LAMP反應(yīng)的目視檢測方法：
[0021] 根據(jù)反應(yīng)后管內(nèi)液體的顏色判斷檢測樣品為陰性或陽性，其中，陰性對照呈現(xiàn)淺 橘黃色，陽性對照呈熒光綠色；
[0022] B、RT-LAMP反應(yīng)的濁度檢測方法
[0023] 反應(yīng)結(jié)束后，將所有0.2ml離心管在1000 Orpm轉(zhuǎn)速下進(jìn)行離心Imin，觀察管底，陰 性對照管底無沉淀，陽性對照有白色沉淀，樣品根據(jù)有無白色沉淀進(jìn)行判斷陰陽性；
[0024] C、RT-LAMP反應(yīng)的凝膠電泳檢測方法
[0025] 用含溴化乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外透射儀下觀察核酸帶，陽性對照擴(kuò) 增產(chǎn)物凝膠電泳后，可見從點(diǎn)樣孔的拖尾現(xiàn)象以及很多不同擴(kuò)增長度的條帶，陰性對照無 條帶，樣品根據(jù)電泳后條帶有無進(jìn)行判斷陰陽性。
[0026] 其中，所述待測樣品總RNA的提取方法包括：
[0027] (1)取200yL血漿/血清/淋巴液至1 · 5ml離心管中；
[0028] (2)向離心管中加入15yL磁珠懸浮液G重懸；
[0029] (3)向離心管中加入2〇yL Proteinase K;
[0030] (4)向樣本中加入300yL Carrier RNA工作液，蓋上管蓋，振蕩混勾IOsec;
[0031] (5)室溫孵育IOmin，期間每3min上下顛倒混勻IOsec，使磁珠和核酸充分結(jié)合，離 心以收集附著在管壁及管蓋的液體；
[0032] (6)將離心管放置于磁力架上靜置lmin，待磁珠完全吸附時小心去除液體；
[0033] (7)將離心管從磁力架上取下，加入500yL漂洗液PWC，振蕩混勻Imin;
[0034] (8)將離心管放置于磁力架上靜置lmin，磁珠完全吸附后，小心吸去液體；
[0035] (9)將離心管從磁力架上取下，加入500yL漂洗液PWE，振蕩混勻Imin;
[0036] (10)將離心管放置于磁力架上靜置lmin，磁珠完全吸附后，小心吸去液體；
[0037] (11)重復(fù)步驟(9)和（10)-次；
[0038] (12)離心管于磁力架上，56Γ晾干5~lOmin。
[0039]本發(fā)明的有益效果是：
[0040] 本發(fā)明針對傳染性肌肉壞死病病毒的ORFlpolyprotein基因設(shè)計了一套LAMP特異 性引物，建立了一種用于傳染性肌肉壞死病病毒基因檢測的方法。與傳統(tǒng)PCR方法相比，該 方法操作簡便，實(shí)驗(yàn)儀器要求較低，在普通恒溫水浴鍋中反應(yīng)60min即可完成，而且可以通 過在終產(chǎn)物中加入染料的方法直接用肉眼觀察結(jié)果，能快速準(zhǔn)確地鑒定傳染性肌肉壞死病 病毒，在對蝦水產(chǎn)養(yǎng)殖中具有廣闊的推廣應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0041]圖1是傳染性肌肉壞死病毒RNA提取后的電泳圖；
[0042] 圖2是傳染性肌肉壞死病毒cDNA-pMDlS-I1酶切驗(yàn)證電泳圖；
[0043] 圖3是本發(fā)明反應(yīng)后的渾濁度進(jìn)行比較；
[0044] 圖4是本發(fā)明經(jīng)過反應(yīng)并且離心后的渾濁度進(jìn)行比較；
[0045] 圖3和圖4中，從左到右的管分別為管1、管2、管3和管4,其中，管1-空白對照，管
[0046] 2-陰性對照，管3-陽性對照，管4-樣品；
[0047]圖5是凝膠電泳檢測圖；
[0048] 圖5中M為marker，1-空白對照，2-陰性對照，3-陽性對照，4-樣品；
【具體實(shí)施方式】
[0049] 下面將通過具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。提供這些實(shí)施例是為了能夠更 透徹地理解本發(fā)明，并且能夠?qū)⒈景l(fā)明的范圍完整的傳達(dá)給本領(lǐng)域的技術(shù)人員。
[0050] 如在通篇說明書及權(quán)利要求當(dāng)中所提及的"包含"或"包括"為一開放式用語，故應(yīng) 解釋成"包含但不限定于"。說明書后續(xù)描述為實(shí)施本發(fā)明的較佳實(shí)施方式，然所述描述乃 以說明書的一般原則為目的，并非用以限定本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的保護(hù)范圍當(dāng)視所附權(quán) 利要求所界定者為準(zhǔn)。
[0051] 本發(fā)明所采用的各種試劑及其儀器，如無特別說明，均購買自市場。
[0052] 一、RT-LAMP 引物設(shè)計
[0053] 首先在NCBI上進(jìn)行序列搜索，選取傳染性肌肉壞死病病毒ORFIPolyprotein部分 序列具體選取的序列如SEQ ID NO.5所示，使用在線引物設(shè)計軟件(PrimerExplorer V4,網(wǎng) ilb^http://primerexplorer. jp/elamp4.0.0/index.增的DNA分為 六個獨(dú)立的區(qū)域，根據(jù)這六個區(qū)域分別設(shè)計LAMP反應(yīng)所需的引物，所述引物包括內(nèi)引物FIP 和BIP、外引物F3和B3。引物序列如下：
[0054] 上游外引物F3:AACTCCCACGTGGGTAAG(SEQ ID N0.1)
[0055] 下游外引物B3:CTTGATGGAITTAAGCCGAA(SEQ ID N0.2)
[0056] 上游內(nèi)引物FIP:AGTCAGTACTGACCGATTTGCGCAAAGCCCATTGATGTAGC(SEQ ID N0.3)
[0057] 下游內(nèi)引物BIP:GATCACAAAAATGAAGGACCATGTCTCGAGTGAGGCAAGTGTT(SEQ ID NO. 4)
[0058] 二、配制傳染性肌肉壞死病病毒RT-LAMP檢測試劑盒
[0059] 首先對樣品RNA進(jìn)行提取，其提取方法為：
[0060] (1)取200yL血漿/血清/淋巴液至1.5ml離心管中；
[0061] (2)向離心管中加入15yL磁珠懸浮液G重懸；
[0062] (3)向離心管中加入2〇yL Proteinase K;
[0063] (4)向樣本中加入300yL Carrier RNA工作液，蓋上管蓋，振蕩混勾IOsec;
[0064] (5)室溫孵育IOmin，期間每3min上下顛倒混勻IOsec，使磁珠和核酸充分結(jié)合，離 心以收集附著在管壁及管蓋的液體；
[0065] (6)將離心管放置于磁力架上靜置lmin，待磁珠完全吸附時小心去除液體；
[0066] (7)將離心管從磁力架上取下，加入500yL漂洗液PWC，振蕩混勻Imin;
[0067] (8)將離心管放置于磁力架上靜置lmin，磁珠完全吸附后，小心吸去液體；
[0068] (9)將離心管從磁力架上取下，加入500yL漂洗液PWE，振蕩混勻Imin;
[0069] (10)將離心管放置于磁力架上靜置lmin，磁珠完全吸附后，小心吸去液體；
[0070] (11)重復(fù)步驟(9)和（10)-次；
[0071] (12)離心管于磁力架上，56°C晾干5~lOmin。
[0072] 然后配制RT-LAMP檢測體系：
[0073] 4yL 5XLAMP反應(yīng)液：10.0mM Tris-HCl，5.0mM(NH4)2S〇4,25.0mM KC1，5.0~IOmM MgS〇4，0 · 05 % 吐溫20，5 · OmM dNTPs，0 · 5U/yL逆轉(zhuǎn)錄酶AMV RTtase，0 · 5U/yL熱啟動等溫擴(kuò) 增酶；
[0074] 4yL 5 X引物混合液包括:外引物F3和B3，內(nèi)引物FIP和BIP;其中，外引物和內(nèi)引物 的濃度之比為1:8;
[0075] IlyL去除核糖核酸酶和脫氧核糖核酸酶的超純水；
[0076] IyL 樣品總 RNA。
[0077]將配制好的反應(yīng)體系在63 °C恒溫水浴鍋中反應(yīng)60分鐘，80 °CBst失活10分鐘。
[0078] 三、陽性對照品準(zhǔn)備
[0079]利用已經(jīng)經(jīng)過鑒定的保存完好的傳染性肌肉壞死病毒滅活菌株進(jìn)行總RNA提取 (提取后的RNA電泳圖如圖1所示），之后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，設(shè)計引物合成傳染性肌肉壞死病病 毒ORF1多聚蛋白編碼區(qū)I -1680bp，連接到pMD 18-T載體上(cDNA-pMD 18-T酶切驗(yàn)證電泳圖如 圖2所示），轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中進(jìn)行擴(kuò)繁，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR驗(yàn)證，陽性克隆進(jìn)行保存?zhèn)溆茫?br>[0080]四、產(chǎn)物檢測：
[00811 A、RT-LAMP反應(yīng)的目視檢測方法
[0082]根據(jù)反應(yīng)后管內(nèi)液體的顏色判斷檢測樣品為陰性或陽性，其中，陰性對照呈現(xiàn)淺 橘黃色，陽性對照呈熒光綠色；
[0083] B、RT-LAMP反應(yīng)的濁度檢測方法
[0084] 反應(yīng)結(jié)束后，將0.2ml離心管1000 Orpm轉(zhuǎn)速下進(jìn)行離心Imin，觀察管底，陰性對照 管底無沉淀，陽性對照有白色沉淀，樣品根據(jù)有無白色沉淀進(jìn)行判斷陰陽性；
[0085] C、RT-LAMP反應(yīng)的凝膠電泳檢測方法
[0086]用含溴化乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外透射儀下觀察核酸帶，陽性對照擴(kuò) 增產(chǎn)物凝膠電泳后，可見從點(diǎn)樣孔的拖尾現(xiàn)象以及很多不同擴(kuò)增長度的條帶，陰性對照無 條帶，樣品根據(jù)電泳后條帶有無進(jìn)行判斷陰陽性。
[0087]五、結(jié)果分析
[0088] 1、根據(jù)肉眼觀察可知，樣品呈熒光綠色，說明樣品中含有傳染性肌肉壞死病病毒。
[0089] 2、將反應(yīng)后的濁度進(jìn)行進(jìn)行比較，比較結(jié)果見圖3,從圖中的對比可以看出，管1和 管2管看上去比較透明，無白色沉淀，而管3和管4變渾濁，因?yàn)楣?為陽性對照，管4和管3均 變渾濁，說明管4中的樣品發(fā)生了反應(yīng)，也就是樣品中含有傳染性肌肉壞死病病毒。
[0090] 將反應(yīng)后的對比物繼續(xù)進(jìn)行離心，然后比較結(jié)果見圖4,從圖中的對比可以看出， 同樣是管1和管2管看上去比較透明，無白色沉淀，而管3和管4變渾濁，同樣說明樣品中含有 傳染性肌肉壞死病病毒。
[0091] 3、檢測的凝膠電泳圖見圖5,從圖5中可以看出，3和4均擴(kuò)增出一定長度的條帶，說 明樣品中含有傳染性肌肉壞死病病毒。
[0092] 以上所述僅為本發(fā)明的實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā) 明說明書內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運(yùn)用在其他相關(guān)的技術(shù)領(lǐng) 域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種傳染性肌肉壞死病毒的RT-LAMP檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括外引 物F3、B3和內(nèi)引物FIP、BIP混合液，所述引物F3、B3、FIP、BIP的核苷酸序列分別如SEQID NO.USEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4所示。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的傳染性肌肉壞死病毒的RT-LAMP檢測試劑盒，其特征在于，所 述試劑盒采用天根磁珠法病毒DNA/RNA提取試劑盒。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的傳染性肌肉壞死病毒的RT-LAMP檢測試劑盒，其特征在于，所 述試劑盒還包括5 X LAMP反應(yīng)液、ddH20、lyL樣品總RNA。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的傳染性肌肉壞死病毒的RT-LAMP檢測試劑盒，其特征在于，所 述5 X LAMP反應(yīng)液包括 10 · OmM Tris-HCl，5 · OmM(NH4)2S〇4，25 · OmM KC1，5 · 0~10mMMgS〇4， 0.05% 吐溫20，5. OmM dNTPs，0.5U/yL逆轉(zhuǎn)錄酶AMV RTtase，0.5U/yL熱啟動等溫擴(kuò)增酶。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的傳染性肌肉壞死病毒的RT-LAMP檢測試劑盒，其特征在于，所 述外引物和內(nèi)引物的濃度之比為1:3~10。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的傳染性肌肉壞死病毒的RT-LAMP檢測試劑盒，其特征在于，所 述外引物F3、B3的濃度均為0.2μΜ，內(nèi)引物FIP、BIP的濃度均為1 .ΟμΜ。7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的傳染性肌肉壞死病毒的RT-LAMP檢測試劑盒，其特征在于，所 述ddH20為去除核糖核酸酶和脫氧核糖核酸酶的超純水。8. 利用權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的RT-LAMP檢測試劑盒檢測傳染性肌肉壞死病毒的方 法，其特征在于，所述方法包括如下步驟： (1) 提取待測樣品總RNA作為反應(yīng)模板； (2) 陽性對照品準(zhǔn)備：利用已經(jīng)經(jīng)過鑒定的保存完好的傳染性肌肉壞死病毒滅活菌株 進(jìn)行RNA提取，之后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，設(shè)計引物合成傳染性肌肉壞死病病毒0RF1多聚蛋白編碼 區(qū)l-1680bp，連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中進(jìn)行擴(kuò)繁，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR驗(yàn)證， 陽性克隆進(jìn)行保存?zhèn)溆茫? (3) 配制RT-LAMP檢測體系：按總反應(yīng)體積為20yL為例，采用4yL 5 X LAMP反應(yīng)液： lO.OmM Tris-HCl，5.0mM(NH4)2S〇4,25.0mM KC1，5.0 ~10mM MgS〇4,0.05% 吐溫 20， 5.0mMdNTPs，0.5UAiL逆轉(zhuǎn)錄酶AMV RTtase，0.5UAxL熱啟動等溫擴(kuò)增酶;4yL 5X引物混合 液包括:外引物F3和B3，內(nèi)引物FIP和BIP;其中，外引物和內(nèi)引物的濃度之比為1:8; 11 lyL去 除核糖核酸酶和脫氧核糖核酸酶的超純水;lyL樣品總RNA; (4) 將配制好的檢測體系在63°C恒溫下進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)60min，80°C溫度條件下Bst失 活lOmin; (5) 對RT-LAMP反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行判定，所述判定包括如下方法： A. RT-LAMP反應(yīng)的目視檢測方法 根據(jù)反應(yīng)后管內(nèi)液體的顏色判斷檢測樣品為陰性或陽性，其中，陰性對照呈現(xiàn)淺橘黃 色，陽性對照呈熒光綠色； B. RT-LAMP反應(yīng)的濁度檢測方法 反應(yīng)結(jié)束后，將0.2ml離心管在lOOOOrpm的轉(zhuǎn)速下進(jìn)行離心lmin，觀察管底，陰性對照 管底無沉淀，陽性對照有白色沉淀，樣品根據(jù)有無白色沉淀進(jìn)行判斷陰陽性； C. RT-LAMP反應(yīng)的凝膠電泳檢測方法 用含溴化乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外透射儀下觀察核酸帶，陽性對照擴(kuò)增產(chǎn) 物凝膠電泳后，能夠見到從點(diǎn)樣孔的拖尾現(xiàn)象以及很多不同擴(kuò)增長度的條帶，陰性對照無 條帶，樣品根據(jù)電泳后條帶有無進(jìn)行判斷陰陽性。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的利用RT-LAMP檢測試劑盒檢測傳染性肌肉壞死病毒的方法，其 特征在于，所述待測樣品總RNA的提取方法包括： (1) 取200yL血漿/血清/淋巴液至1.5ml離心管中； (2) 向離心管中加入15yL磁珠懸浮液G重懸； (3) 向離心管中加入2〇yL Proteinase K; (4) 向樣本中加入300yL Carrier RNA工作液，蓋上管蓋，振蕩混勾lOsec; (5) 室溫孵育lOmin，期間每3min上下顛倒混勻lOsec，使磁珠和核酸充分結(jié)合，離心以 收集附著在管壁及管蓋的液體； (6) 將離心管放置于磁力架上靜置lmin，待磁珠完全吸附時小心去除液體； (7) 將離心管從磁力架上取下，加入500yL漂洗液PWC，振蕩混勻lmin; (8) 將離心管放置于磁力架上靜置lmin，磁珠完全吸附后，小心吸去液體； (9) 將離心管從磁力架上取下，加入500yL漂洗液PWE，振蕩混勻lmin; (10) 將離心管放置于磁力架上靜置lmin，磁珠完全吸附后，小心吸去液體； (11) 重復(fù)步驟(9)和（10)-次； (12) 離心管于磁力架上，56°C瞭干5~lOmin。
【文檔編號】C12Q1/68GK106086233SQ201610403622
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月8日
【發(fā)明人】劉清亮, 代玲玲, 孫艷麗, 張瑗, 孫琳琳
【申請人】山東拜爾檢測有限公司