一種抗傳染性脾腎壞死病毒的病毒樣顆粒和疫苗及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗傳染性脾腎壞死病毒的病毒樣顆粒和疫苗及其制備方法，所述抗傳染性脾腎壞死病毒的病毒樣顆粒由同時表達(dá)的流感病毒基質(zhì)蛋白M1和融合蛋白HA-24構(gòu)成；所述融合蛋白HA-24由流感病毒HA蛋白與魚類傳染性脾腎壞死病毒ORF24構(gòu)建而成，所述融合蛋白HA-24的核酸序列如SEQ?ID?NO:3、5、7、9或11所示。所述抗傳染性脾腎壞死病毒的病毒樣顆粒的制備方法，包括以下步驟：制備融合基因HA-24；制備重組桿狀病毒穿梭載體rBacmid；制備重組昆蟲桿狀病毒；獲得同時表達(dá)流感病毒基質(zhì)蛋白M1和融合蛋白HA-24的病毒樣顆粒。所述疫苗包含上述任一項所述的病毒樣顆粒。本發(fā)明混合病毒樣顆粒疫苗能引起機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生強型應(yīng)答，免疫力強，持續(xù)時間長，能預(yù)防魚類傳染性脾腎壞死病毒病，而且非常安全。
【專利說明】一種抗傳染性脾腎壞死病毒的病毒樣顆粒和疫苗及其制備 方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及病毒樣顆粒領(lǐng)域，尤其涉及一種抗傳染性脾腎壞死病毒的病毒樣顆粒 和疫苗及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 傳染性脾腎壞死病毒（Infectious Spleen and Kidney Necrosis Virus, ISKNV) 屬于虹彩病毒科，可以使多種魚類得傳染性脾腎壞死病，造成鱖魚、石斑、卵形鯧鰺等大量 死亡，感染后10天內(nèi)死亡可達(dá)90%以上，給養(yǎng)殖魚類帶來很大的經(jīng)濟損失。
[0003] 目前控制該病的最好方法為疫苗免疫，但國內(nèi)外尚無有效藥物。全病毒滅活疫苗 的效果不理想，保護(hù)率一般不超過50%。日本、韓國有報道采用DNA疫苗控制與ISKNV相似 的其它虹彩病毒，并取得一定的成效。但DNA疫苗的使用具有危險性，不能直接進(jìn)入人類的 食物鏈。有學(xué)者采用大腸桿菌表達(dá)ISKNV的結(jié)構(gòu)蛋白，制備亞單位疫苗，取得一定的效果， 但也達(dá)不到產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)對疫苗的要求。因此，提高ISKNV基因工程疫苗的免疫效力，開發(fā)新的 疫苗具有緊迫性。
[0004] 科學(xué)研究證明病毒樣顆粒（VLPs)具有很好的免疫效力和應(yīng)用前景。VLPs是含有 某種病毒的一個或多個主要結(jié)構(gòu)蛋白，在體外表達(dá)系統(tǒng)中自動組裝成的不包含病毒核酸的 空心顆粒。流感病毒的表面膜蛋白HA是引起機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的主要誘發(fā)物，而基質(zhì)蛋白 Ml是形成病毒外殼的主體，亦可作為組織型免疫應(yīng)答的誘發(fā)物。有關(guān)的研究證明，基質(zhì)蛋白 Ml的正確表達(dá)，是保證病毒外殼形成的重要環(huán)節(jié)。Ml蛋白和HA這2個主要結(jié)構(gòu)蛋白同時 表達(dá)就可以自動組裝成空心的沒有病毒基因組的病毒樣顆粒。VLPs的形態(tài)和大小與真實的 病毒粒子相同或相似，所以能有效的誘導(dǎo)機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫保護(hù)反應(yīng)，作為一種新型 疫苗顯示出了良好的應(yīng)用前景。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，有必要針對上述疫苗效力差等問題，提供一種傳染性脾腎壞死病毒的 病毒樣顆粒和疫苗及其制備方法。
[0006] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0007] -種抗傳染性脾腎壞死病毒的病毒樣顆粒，由同時表達(dá)的流感病毒基質(zhì)蛋白Ml 和融合蛋白HA-24構(gòu)成；所述融合蛋白HA-24由流感病毒HA蛋白與魚類傳染性脾腎壞死病 毒0RF24構(gòu)建而成，所述融合蛋白HA-24的核酸序列如SEQ ID N0:3、5、7、9或11所示。
[0008] -種抗傳染性脾腎壞死病毒的病毒樣顆粒的制備方法，包括以下步驟：
[0009] ①將傳染性脾腎壞死病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白0RF24基因替換流感病毒HA基因的一部 分，二者構(gòu)成融合基因 HA-24,融合基因 HA-24的核酸序列如SEQ ID N0:3、5、7、9或11所 示；
[0010] ②將流感病毒的基質(zhì)蛋白Ml基因和融合蛋白HA-24基因插入昆蟲桿狀病毒 pFastBac-Dual載體上，經(jīng)酶切鑒定及測序，篩選出陽性重組載體，并轉(zhuǎn)化含有桿狀病毒穿 梭載體的DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒穿梭載體rBacmid ;
[0011] ③利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，將含外源基因的重組桿狀病毒穿梭載體rBacmid轉(zhuǎn)染入 宿主昆蟲細(xì)胞株sf-9中，獲得重組昆蟲桿狀病毒；
[0012] ④培養(yǎng)受重組昆蟲桿狀病毒轉(zhuǎn)染的宿主昆蟲細(xì)胞，使其得以高效地表達(dá)流感病毒 的結(jié)構(gòu)蛋白Ml和融合蛋白HA-24,并自動組裝成同時表達(dá)流感病毒基質(zhì)蛋白Ml和融合蛋白 HA-24的病毒樣顆粒。
[0013] 優(yōu)選地，步驟①中的HA-24基因是由傳染性脾腎壞死病毒0RF24與流感病毒HA基 因先合成融合基因，然后用PCR擴增而成。
[0014] 優(yōu)選地，步驟③中Sf-9細(xì)胞在27°C培養(yǎng)4-5天，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，再侵染新的 sf-9細(xì)胞，獲得放大后高滴度的重組昆蟲桿狀病毒。
[0015] 優(yōu)選地，步驟④中受重組昆蟲桿狀病毒轉(zhuǎn)染的宿主昆蟲細(xì)胞在27°C培養(yǎng)3天，表 達(dá)的流感病毒Ml蛋白和融合蛋白HA-24,自動組裝成VLPs。
[0016] 一種包含上述任一項所述的病毒樣顆粒的魚類傳染性脾腎壞死病毒基因工程疫 苗。
[0017] 本發(fā)明提供的抗傳染性脾腎壞死病毒的病毒樣顆粒和疫苗及其制備方法具有明 顯的優(yōu)點和效果：
[0018] (l)VLPs疫苗能引起機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生強型應(yīng)答，免疫力強，持續(xù)時間長，能預(yù)防 魚類傳染性脾腎壞死病毒病。
[0019] (2)病毒樣顆粒不含病毒基因組，這種空殼結(jié)構(gòu)的VLPs在免疫動物體內(nèi)就不會發(fā) 生病毒基因與宿主染色體基因整合，而且整個生產(chǎn)過程不接觸活的有感染力的病毒，因此 非常安全。
[0020] (3)和一般的基因工程亞單位疫苗比較，在這種新型的病毒樣顆粒中，大量的傳染 性脾腎壞死病毒結(jié)構(gòu)蛋白位于顆粒表面，能刺激機體產(chǎn)生更好的免疫反應(yīng)，免疫效果更好。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1為本發(fā)明實施例1中PCR擴增產(chǎn)物電泳圖。其中，泳道1為marker，泳道2為 HA-24,泳道3為Ml，泳道4為空白對照。
[0022] 圖2為本發(fā)明實施例1中Ml和HA-24基因在懸浮培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞sf-9中表達(dá)的 Western blots圖。其中，泳道1為marker,泳道2為陰性對照，泳道3為實驗組樣品。
[0023] 圖3為本發(fā)明實施例1中純化后的病毒樣顆粒的Western blots圖。其中，泳道 1為marker，泳道2為陰性對照，泳道3為實驗組樣品。

【具體實施方式】
[0024] 本發(fā)明借助流感病毒VLPs平臺，將魚類傳染性脾腎壞死病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白 0RF24與流感病毒HA的一部分融合形成一個新的融合蛋白HA-24,然后在昆蟲細(xì)胞中同時 表達(dá)HA-24和Ml蛋白，自動組裝成VLPs。以表達(dá)融合蛋白HA-24的VLPs作為抗原，制備一 種預(yù)防魚類傳染性脾腎壞死病毒的新型基因工程疫苗。本發(fā)明新型的魚類傳染性脾腎壞死 病毒基因工程疫苗還可以包括佐劑。
[0025] 本發(fā)明以Bac-to-Bac昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)為基礎(chǔ)，將流感病毒HA蛋白與魚類 傳染性脾腎壞死病毒0RF24構(gòu)建成融合蛋白HA-24,同時表達(dá)流感病毒基質(zhì)蛋白Ml和融合 蛋白HA-24,二者共同自動組裝構(gòu)建出類似流感病毒的VLP空殼粒子。
[0026] 首先，將魚類傳染性脾腎壞死病毒0RF24基因替換流感病毒HA基因的一部分，二 者構(gòu)成融合基因（HA-24)，0RF24基因位于融合基因 HA-24的5'端，替換相等長度的HA基 因的5'端序列，以保障融合基因 Η A-24的長度與HA基因長度大致相等。
[0027] 然后，按照形成流感病毒樣顆粒的方法，將流感病毒的基質(zhì)蛋白Ml和融合蛋白 HA-24的DNA片斷，構(gòu)建于昆蟲桿狀病毒的載體質(zhì)粒內(nèi)，并使其重組入昆蟲桿狀病毒的遺傳 物質(zhì)DNA內(nèi)，利用宿主昆蟲細(xì)胞表達(dá)這些外源蛋白，自動組裝成不含流感病毒遺傳物質(zhì)的 病毒樣顆粒，病毒樣顆粒形成后將釋放入細(xì)胞培養(yǎng)液中。這樣形成的VLPs具有傳染性脾腎 壞死病毒0RF24蛋白。
[0028] 實施例1抗傳染性脾腎壞死病毒的病毒樣顆粒
[0029] 1、Ml基因和HA-24的擴增
[0030] 1. 1融合基因 HA-24的合成
[0031] 將傳染性脾腎壞死病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白基因0RF24替換H1N1流感病毒HA蛋白基因 的一部分，二者構(gòu)成融合基因（HA-24)，0RF24基因位于融合基因 HA-24的5'端，替換相當(dāng) 長度的HA基因的5'端序列，以保障融合基因 HA-24的長度與HA基因長度大致相等。融合 序列中0RF24和HA序列的長度可做相應(yīng)的調(diào)整。融合基因的核酸序列如SEQ ID N0:3所 示，其氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示。SEQ ID N0:3的第1-936位堿基為0RF24的基因， 第937-1701位堿基為HA的基因 ；SEQ ID N0:4的第1-312位氨基酸為0RF24的氨基酸，第 313-566位堿基為HA的氨基酸。融合基因根據(jù)其核酸序列人工合成。
[0032] 1. 2流感病毒RNA抽提和RT-PCR
[0033] 流感病毒RNA的提取按GibcoBRL公司TRIzol LS Reagent RNA提取試劑盒的使用 說明書（方法）進(jìn)行。分別取250yL流感病毒H1N1亞型毒株感染尿囊液和750yL TRIzol LS，加入1. 5 mL微量離心管內(nèi)，用吸管吹打充分混勻，室溫放置10min ;加入200 μ L氯仿，劇 烈振蕩15s，室溫靜置5分鐘后，4°C下12000rpm離心15min ;取上清于一新的滅菌1. 5mL離 心管內(nèi)，加入500 μ L異丙醇，充分混勻，室溫放置10min，在4°C下12000r/m離心10min ;傾 去上清，沉淀中加入70 %的乙醇750 μ L，輕輕混勻，洗滌一次，4°C下12000r/m離心15min， 棄去上清，風(fēng)干；加入10yL用DEPC水處理的無 RNA酶的三蒸水溶解病毒RNA (沉淀），直 接用于RT-PCR或-80°C保存?zhèn)溆谩?br> [0034] RT-PCR參照TaKaRa的AMV反轉(zhuǎn)錄酶的使用說明進(jìn)行，在20 μ L反應(yīng)體系中分別 加入以下組分：RNA :3μ L ;5XRT buffer :4μ L ;dNTPs :4μ L ;RNA 酶抑制劑：0· 5μ L ;引物 UP :1μ L ;引物DN:ly L ;AMV :2μ L ;DEPCtK :補至 20μ L?；靹蚝螅覝胤胖?10min，42°C保 溫lh，冰浴2min，RT產(chǎn)物直接用于PCR擴增或-20°C保存。
[0035] 1. 3HA-24 和 Ml 基因的 PCR 擴增
[0036] 根據(jù)Ml基因序列（SEQ ID N0:1，其蛋白序列為SEQ ID N0:2)設(shè)計的1對引物， 用于擴增Ml基因，其兩端分別加上了 Sal I和Hind III的酶切位點位于PPH啟動子下，這2 個引物序列（SEQ ID N0:13-14)分別是：
[0037] MISal I :5, -GCCGTCGACATGAGTCTTCTAACCGAG-3'
[0038] MIHind III : 5，-GCCAAGCTTTCACTTGAATCGTTG-3，
[0039] 根據(jù)融合基因 HA-24的序列（SEQ ID NO:3)設(shè)計的1對引物，用于擴增融合基因 HA-24,其兩端分別加上了 Xho I和Sph I酶切位點，位于P10啟動子下，引物序列（SEQ ID NO: 15-16)如下：
[0040] H Xhol I:5'-GG CTCGATATGGATAAGTATGTGCTCAG-3'
[0041] H Sph I:5,-ACAT GCATGCTTAAATACATATTCTGCACT-3'
[0042] 采用Ml和HA-24各自特異性引物，將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或合成的DNA片斷直接用作PCR 擴增Ml和HA-24基因的模板。PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性3min，94°C變性40S，56°C退火 908,721：延伸908，循環(huán)30次，最后延伸101^11，？〇?產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠（含0.5即/ mL溴化乙錠，EB)電泳檢測。電泳結(jié)果如圖1所示，PCR擴增的Ml基因的長度約0. 75Kb，融 合基因 HA-24的長度約為1. 7Kb。
[0043] 所有的PCR產(chǎn)物樣品經(jīng)電泳凝膠抽提后，獲得純化的Ml和HA-24基因 DNA片段， 經(jīng)限制性內(nèi)切酶3&11/把11(1111(消化組片段）、乂11〇1和5?111(消化撤-24片斷）371： 分別消化后，再進(jìn)一步純化，以備構(gòu)建重組質(zhì)粒用。具體操作如下：制備1%瓊脂糖凝膠含 0. 5ug/mL溴化乙錠，將所有PCR樣品加入凝膠的樣品槽內(nèi)，設(shè)置電壓100V，電泳時間40min 在長波紫外燈下，切下含有樣品帶的凝膠條，裝入小塑料離心管中。參照膠回收試劑盒 (Qiagen公司產(chǎn)品）說明書，抽提純化Ml和HA-24基因 DNA片段。經(jīng)限制性內(nèi)切酶37°C過 夜消化后，用膠回收試劑盒（Qiagen公司產(chǎn)品），按照說明書指導(dǎo)，離心過柱，純化回收酶切 消化后的Ml和HA-24片段。
[0044] 2、構(gòu)建表達(dá)Ml和HA-24基因的昆蟲桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒及在昆蟲細(xì)胞中合成重組 的昆蟲桿狀病毒
[0045] 2. 1構(gòu)建表達(dá)Ml的重組質(zhì)粒
[0046] 昆蟲桿狀病毒質(zhì)粒PFastBac-dual (Invitrogen公司產(chǎn)品）經(jīng)限制性內(nèi) 切酶Sal I /Hind III 37°C酶切3小時后，用膠回收試劑盒回收純化酶切后的質(zhì)粒 PFastBac-dual。在T4DNA連接酶的作用下，酶切后的質(zhì)粒與酶切后的M1DNA片段于16°C 連接過夜。反應(yīng)體系如下：1〇ΧΤ4連接緩沖液lmL，Ml酶切回收的DNA片段3mL，酶切 PFastBac-dual質(zhì)?；厥债a(chǎn)物1 μ L，T4DNA連接酶1 μ L，ddH20補至10 μ L。采用熱休克方 法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)導(dǎo)入ToplO感受態(tài)細(xì)胞中加入到于一小塑料離心管中，輕輕混合后將小管 置于冰上30min，轉(zhuǎn)入42°C水浴中熱休克90s，迅速放回冰上5分鐘，向其中加入200 μ LLB 培養(yǎng)液。37°C搖床培養(yǎng)1小時。取100 μ L菌液涂布于LB固體培養(yǎng)基（含有氨芐和慶大霉 素兩種抗生素）上，37°C培養(yǎng)16h，從平板上挑取陽性克隆菌落，進(jìn)行菌液PCR，抽提質(zhì)粒后 用5 &11/把11(1111進(jìn)行單或雙酶切鑒定。0嫩序列測定后，獲得重組質(zhì)粒？?&8丨8 &(3-(1皿這1。
[0047] 2. 2構(gòu)建表達(dá)HA-24和Ml基因的重組質(zhì)粒
[0048] 重組質(zhì)粒PFastBac-dualMl經(jīng)限制性內(nèi)切酶Xho I /Nco I酶切后，在T4DNA連接 酶的作用下，將被同樣的內(nèi)切酶消化后的HA-24基因 DNA片段插入到P10啟動子的下方，此 連接產(chǎn)物隨后經(jīng)熱體克法轉(zhuǎn)導(dǎo)入ToplO感受態(tài)細(xì)胞中，培養(yǎng)、抽提數(shù)個陽性克隆菌落的重 組質(zhì)粒DNA，菌液PCR和Xho I /Nco I酶切鑒定及DNA序列測序確定無誤后，獲得二度重組 的質(zhì)粒。DNA測序后，S卩為所需的重組昆蟲桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒PFastBac-dual-Ml-HA-24。
[0049] 2. 3重組昆蟲桿狀病毒基因組的合成及提取
[0050] 將純化的重組PFastBac-dual-Ml-HA-24質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)入特殊的E. coli感受態(tài)細(xì)胞 株DHlOBac細(xì)胞中（美國Invitrogen公司產(chǎn)品）。DHlOBac細(xì)胞含有一特殊的大分子質(zhì)粒 Bacmid，其內(nèi)包含有昆蟲桿狀病毒AcMNPV的全部基因組。一旦重組的表達(dá)質(zhì)粒整合入大 分子質(zhì)粒Bacmid的特別位點后，經(jīng)3種抗菌素（慶大霉素、四環(huán)素和卡那霉素）的篩選及 IPIG的誘導(dǎo)和X-Gal底物反應(yīng)進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，陽性克隆菌落呈白色，而非重組的野生菌 落呈蘭色。實驗條件均按照Invitrogen公司提供的實驗手冊指導(dǎo)而設(shè)定。挑選的陽性克 隆置于3mL的LB培養(yǎng)液中（含上述3種抗生素），經(jīng)37°C搖床培養(yǎng)24小時，按照實驗手冊 標(biāo)明的大分子質(zhì)粒Bacmid小量制備法，提取純化帶有Ml基因和HA-24基因的重組大分子 質(zhì)粒 Bacmid〇
[0051] 2. 4重組昆蟲桿狀病毒的制備
[0052] 將昆蟲細(xì)胞株sf-9細(xì)胞（美國Invitrogen公司產(chǎn)品）培養(yǎng)于無血清的sf-900II 昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液中（Invitrogen公司產(chǎn)品），溫度設(shè)置為27°C，根據(jù)Invitrogen公司提 供的實驗手冊，細(xì)胞密度為5xl0 5個/mL，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將純化的重組大分子質(zhì)粒 Bacmidl μ g與脂質(zhì)溶液cellfectin (Invitrogen公司產(chǎn)品）6 μ L混合入200 μ L的無血清 無雙抗的培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)染sf-9細(xì)胞，27°C培養(yǎng)4至5天后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，3000r/m離 心10分鐘收集上清液除去細(xì)胞碎片，獲得低滴度的重組昆蟲桿狀病毒，再用此上清液感染 新培養(yǎng)的sf-9細(xì)胞（每毫升上清液感染4xl0 6個sf-9細(xì)胞）；3天后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液， 即為所需的放大培養(yǎng)后的高濃度重組昆蟲桿狀病毒，命名為Bac-Ml-HA-24。
[0053] 對獲取的用于放大培養(yǎng)和蛋白表達(dá)的重組昆蟲桿狀病毒進(jìn)行蝕斑實驗，確定病毒 的噬斑形成單位（plaque forming units, PFU)，具體步驟為：
[0054] 1)用含10% FBS的Grace' s培養(yǎng)基將Sf-9細(xì)胞傳代接種到六孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞 密度為約IX 1〇6個cells/mL，每孔加2mL(6孔板），輕輕混勻室溫使細(xì)胞貼壁1小時以上。
[0055] 2)將P3代種毒液用不含F(xiàn)BS的Grace' s培養(yǎng)基做10倍倍比稀釋待用。
[0056] 3)棄去六孔板中的培養(yǎng)基，用不含血清的培養(yǎng)基清洗細(xì)胞3次，然后將上述稀釋 好的重組病毒液加入孔中，每個稀釋度做兩個復(fù)孔，室溫下感染1小時。
[0057] 4)制備覆蓋液（以下為一塊六孔板的量）：7mL2XGrace' s medium+140 μ 1的雙 抗+7mL2%的高壓滅菌agarose膠+1. 4mL FBS，輕輕地混勻，然后將瓶再放置42°C水浴，病 毒感染lh后吸盡每孔中的病毒液，并快速用上述制備的覆蓋液覆蓋細(xì)胞。
[0058] 5)待瓊脂糖凝固后將六孔板用保鮮膜包好并置于27°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5天。
[0059] 6)加入lmL濃度為lmg/mL的中性紅，室溫孵育2小時后吸去染液，觀察到重組病 毒形成的近似透明的小點即為空斑。計算統(tǒng)計觀察病毒空斑的形成情況（PFU)，病毒的滴度 約為 4. 5X109(PFU/mL)。
[0060] 3、Ml和HA-24基因在懸浮培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞sf-9中的表達(dá)
[0061] 將200mL sf-9細(xì)胞混合液懸浮培養(yǎng)于1升體積的三角搖瓶中，細(xì)胞培養(yǎng)液為無血 清的 sf_900II(或 Invitrigen 公司的 Grace insect medium),搖床搖速為 100r/m，溫度 恒定于27°C。當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到2X1細(xì)胞/mL時，用Bac-Ml-HA-24昆蟲桿狀病毒DNA轉(zhuǎn)染 sf-9細(xì)胞，病毒的Μ0Ι = 1。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞經(jīng)恒溫?fù)u動培養(yǎng)3天后，收集所有樣品，4°C離心30 分鐘，離心速度為3000r/m，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。離心下來的細(xì)胞沉淀物用細(xì)胞裂解液處 理后，4°C離心10分鐘，離心速度為10, 000r/m，保留離心后的細(xì)胞裂解抽提上清液。實驗進(jìn) 行的同時構(gòu)建合成的野生型昆蟲桿狀病毒用于轉(zhuǎn)染懸浮培養(yǎng)的sf-9細(xì)胞，MOI = 1，作為設(shè) 置的陰性對照，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)、樣品的收集及細(xì)胞裂解的條件與步驟與上述實驗一樣。
[0062] 收集的所有樣品用于Western blots分析。其實驗操作如下：
[0063] 1)每個樣品（包括陰性對照）分別取10 μ L的細(xì)胞裂解抽提上清液，再各自加入 10 μ L的2ΧSDS上樣緩沖液。100°C處理5min后，將所有20 μ L的混合樣品加入4% -12% SDS聚丙烯酰胺凝膠的點樣孔中。設(shè)置恒定電壓120V，溫度為4°C，時間3小時，當(dāng)藍(lán)色指示 劑溴酚蘭完全靠入凝膠底端時，停止電泳，取出凝膠。
[0064] 2)剪一張與凝膠相同大小的硝酸纖維素膜（PVDF膜）及兩張濾紙，PVDF膜用甲醇 浸泡5分鐘后與凝膠、濾紙一起浸入預(yù)冷2小時以上的轉(zhuǎn)移緩沖液中，按濾紙--凝膠-- 硝酸纖維素膜--濾紙的順序安裝入轉(zhuǎn)印夾。將夾中靠近凝膠的一側(cè)接負(fù)極，恒壓25V轉(zhuǎn) 移電泳lh.用鑷子夾取出硝酸纖維素膜，用PBS-T漂洗液洗滌，而后轉(zhuǎn)移至5%的脫脂奶粉 /PBS溶液中，搖蕩封閉1小時。
[0065] 3)用PBS-T漂洗液洗滌3次，每次3分鐘；然后將硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)入一塑料袋中， 加入3mL以1:500稀釋于5%脫脂奶粉/PBS中抗H1N1流感病毒雞源多克隆抗體（一抗）， 置于4°C平緩搖動過夜。翌日，取出纖維素膜，用PBS-T漂洗液洗滌3次，每次10分鐘，將此 硝酸纖維素膜再裝入另一新的塑料袋中，加入5mL以1:10000稀釋于5%脫脂奶粉/PBS中 的辣根過氧化物酶標(biāo)記的驢抗雞IgG(二抗），室溫下?lián)u動溫育lh。棄二抗，PBS-T漂洗纖 維素膜3次，每次10分鐘，將漂洗后的硝酸纖維素膜移至一平皿中，加入DAB第五顯色液。
[0066] 如圖2所示，在相對應(yīng)的分子量位置上有Ml (約25KDa)和HA-24 (約70KDa)的特 異性條帶。說明Ml和HA-24在轉(zhuǎn)染的懸浮培養(yǎng)的SF-9昆蟲細(xì)胞中有效地表達(dá)了。
[0067] 4、病毒樣顆粒的純化
[0068] 將上述離心收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清液裝入13mL的超速離心管內(nèi)，稱重、平衡、封管 后，放入超速離心機（Bechmem公司產(chǎn)品）內(nèi)，4°C 100, OOOrpm離心1小時，然后取出離心管， 小心倒掉上清液，保留離心管底的深沉物。加入5mL的PBS，放入4°C冰箱內(nèi)，溶解24小時。 次日，在另一個13mL的超速離心管內(nèi)，先小心地加入lmL 60%的庶糖溶液，然后依次加入 lmL 30%及3mL20%的庶糖溶液，最后將5mL的溶解后的樣品液置于其上。精確稱重、平衡 后，封管上超速離心機。4°C 100, OOOrpm離心1小時。取出離心管，收集位于30%與60% 濃度交界處的條帶，即純化的病毒樣顆粒。
[0069] Western blots分析純化濃縮后的病毒樣顆粒樣品。其操作步驟與上述步驟3中 Western blots分析一樣，只是將所取的樣品進(jìn)行了稀釋，S卩l(xiāng)yL的病毒樣顆粒樣品，加入 9 4 1^的水，再加入1(^1^的2父505上樣緩沖液。1001：變性51^11后，上樣入4%-12%聚丙 烯酰氨凝膠樣品槽內(nèi)。由圖3Western blots結(jié)果顯示，所獲得的大分子顆粒，的確是由Ml 和HA-24構(gòu)成的病毒樣顆粒。說明轉(zhuǎn)染后，病毒樣顆粒在宿主細(xì)胞中有效地自我組裝，并釋 放入細(xì)胞培養(yǎng)上清液中。
[0070] 實施例2抗傳染性脾腎壞死病毒的病毒樣顆粒
[0071] 將傳染性脾腎壞死病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白基因0RF24替換H1N1流感病毒HA蛋白基因 的一部分，二者構(gòu)成融合基因（HA-24)，0RF24基因位于融合基因 HA-24的5'端，替換相當(dāng) 長度的HA基因的5'端序列，以保障融合基因 HA-24的長度與HA基因長度大致相等。融合 序列中0RF24和HA序列的長度可做相應(yīng)的調(diào)整。融合基因的核酸序列如SEQ ID N0:5所 示，其氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示。SEQ ID N0:5的第1-906位堿基為0RF24的基因， 第907-1701位堿基為HA的基因 ；SEQ ID NO:6的第1-302位氨基酸為ORF24的氨基酸，第 303-566位堿基為HA的氨基酸。融合基因根據(jù)其核酸序列人工合成。其他實驗步驟和實驗 條件與實施例1相同。
[0072] 實施例3抗傳染性脾腎壞死病毒的病毒樣顆粒
[0073] 將傳染性脾腎壞死病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白基因0RF24替換H1N1流感病毒HA蛋白基因 的一部分，二者構(gòu)成融合基因（HA-24)，0RF24基因位于融合基因 HA-24的5'端，替換相當(dāng) 長度的HA基因的5'端序列，以保障融合基因 HA-24的長度與HA基因長度大致相等。融合 序列中0RF24和HA序列的長度可做相應(yīng)的調(diào)整。融合基因的核酸序列如SEQ ID N0:7所 示，其氨基酸序列如SEQ ID N0:8所示。SEQ ID N0:7的第1-876位堿基為0RF24的基因， 第877-1701位堿基為HA的基因 ；SEQ ID N0:8的第1-292位氨基酸為0RF24的氨基酸，第 293-566位堿基為HA的氨基酸。融合基因根據(jù)其核酸序列人工合成。其他實驗步驟和實驗 條件與實施例1相同。
[0074] 實施例4抗傳染性脾腎壞死病毒的病毒樣顆粒
[0075] 將傳染性脾腎壞死病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白基因0RF24替換H1N1流感病毒HA蛋白基因 的一部分，二者構(gòu)成融合基因（HA-24)，0RF24基因位于融合基因 HA-24的5'端，替換相當(dāng) 長度的HA基因的5'端序列，以保障融合基因 HA-24的長度與HA基因長度大致相等。融合 序列中0RF24和HA序列的長度可做相應(yīng)的調(diào)整。融合基因的核酸序列如SEQ ID N0:9所 示，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 10所示。SEQ ID N0:9的第1-846位堿基為0RF24的基因， 第847-1701位堿基為HA的基因 ；SEQ ID N0:10的第1-282位氨基酸為0RF24的氨基酸， 第283-566位堿基為HA的氨基酸。融合基因根據(jù)其核酸序列人工合成。其他實驗步驟和 實驗條件與實施例1相同。
[0076] 實施例5抗傳染性脾腎壞死病毒的病毒樣顆粒
[0077] 將傳染性脾腎壞死病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白基因0RF24替換H1N1流感病毒HA蛋白基因 的一部分，二者構(gòu)成融合基因（HA-24)，0RF24基因位于融合基因 HA-24的5'端，替換相當(dāng) 長度的HA基因的5'端序列，以保障融合基因 HA-24的長度與HA基因長度大致相等。融合 序列中0RF24和HA序列的長度可做相應(yīng)的調(diào)整。融合基因的核酸序列如SEQ ID N0:11所 示，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 12所示。SEQ ID NO: 11的第1-816位堿基為0RF24的基 因，第817-1701位堿基為HA的基因 ；SEQ ID NO: 12的第1-272位氨基酸為0RF24的氨基 酸，第273-566位堿基為HA的氨基酸。融合基因根據(jù)其核酸序列人工合成。其他實驗步驟 和實驗條件與實施例1相同。
[0078] 實施例6疫苗免疫試驗
[0079] 將實施例1-5純化的病毒樣顆粒（VLPs)與佐劑（M0NTANIDE ISA 763A, seppic, France)等體積混合制成VLPs疫苗，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0080] 280尾卵形鯧鰺（金鯧魚）平均體重100g，飼養(yǎng)于水泥池中，隨機分為7組。第 1?5組為試驗組，分別免疫實施例1?實施例5制備的VLPs疫苗，每尾注射0. lmL (含抗原 50ug) VLPs疫苗；第6組注射PBS溶液與等量佐劑混合而成的陰性對照疫苗（不含抗原）； 第7組不注射疫苗。免疫方式為背部肌肉注射。免疫后28天尾靜脈采血，每組5尾，常規(guī) 分離血清，以純化的傳染性脾腎壞死病毒為抗原，采用ELISA方法檢測血清中抗體。
[0081] 結(jié)果表明，第6、7組抗體為陰性，第1?5組樣品全部為陽性，平均ELISA滴度分 別為：第 1 組 2700±360,第 2 組 2693±425,第 3 組 2599±410,第 4 組 2812±393,第 5 組 2581±403，說明￥1^8疫苗能刺激產(chǎn)生高滴度抗體。免疫后30天，用111051'(：10 5(|15謂￥病毒 攻毒，觀察3周。結(jié)果顯示，第1組死亡8尾，存活32尾；第2組死亡8尾，存活32尾；第3 組死亡9尾，存活31尾；第4組死亡7尾，存活33尾；第5組死亡10尾，存活30尾；第6、 7組在14天內(nèi)全部死亡，表明VLPs疫苗對卵形鯧鰺具有較好的保護(hù)作用，可以預(yù)防傳染性 脾腎壞死病毒對卵形鯧鰺的感染。
[0082] 以上所述實施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并 不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員 來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保 護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
【權(quán)利要求】
1. 一種抗傳染性脾腎壞死病毒的病毒樣顆粒，其特征在于，所述病毒樣顆粒由同時表 達(dá)的流感病毒基質(zhì)蛋白Ml和融合蛋白HA-24構(gòu)成；所述融合蛋白HA-24由流感病毒HA蛋 白與魚類傳染性脾腎壞死病毒0RF24構(gòu)建而成，所述融合蛋白HA-24的核酸序列如SEQ ID N0:3、5、7、9 或 11 所示。
2. -種抗傳染性脾腎壞死病毒的病毒樣顆粒的制備方法，其特征在于，包括以下步 驟： ① 將傳染性脾腎壞死病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白0RF24基因替換流感病毒HA基因的一部分，二 者構(gòu)成融合基因 HA-24,融合基因 HA-24的核酸序列如SEQ ID N0:3、5、7、9或11所示； ② 將流感病毒的基質(zhì)蛋白Ml基因和融合蛋白HA-24基因插入昆蟲桿狀病毒 pFastBac-Dual載體上，經(jīng)酶切鑒定及測序，篩選出陽性重組載體，并轉(zhuǎn)化含有桿狀病毒穿 梭載體的DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒穿梭載體rBacmid ; ③ 利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，將含外源基因的重組桿狀病毒穿梭載體rBacmid轉(zhuǎn)染入宿主 昆蟲細(xì)胞株sf-9中，獲得重組昆蟲桿狀病毒； ④ 培養(yǎng)受重組昆蟲桿狀病毒轉(zhuǎn)染的宿主昆蟲細(xì)胞，使其得以高效地表達(dá)流感病毒的 結(jié)構(gòu)蛋白Ml和融合蛋白HA-24,并自動組裝成同時表達(dá)流感病毒基質(zhì)蛋白Ml和融合蛋白 HA-24的病毒樣顆粒。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的流感病毒和傳染性脾腎壞死病毒的病毒樣顆粒的制備方法， 其特征在于，步驟①中的HA-24基因是由傳染性脾腎壞死病毒0RF24與流感病毒HA基因先 合成融合基因，然后用PCR擴增而成。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的流感病毒和傳染性脾腎壞死病毒的病毒樣顆粒的制備方 法，其特征在于，步驟③中sf-9細(xì)胞在27°C培養(yǎng)4-5天，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，再侵染新的 sf-9細(xì)胞，獲得放大后高滴度的重組昆蟲桿狀病毒。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的流感病毒和傳染性脾腎壞死病毒的病毒樣顆粒的制備方法， 其特征在于，步驟④中受重組昆蟲桿狀病毒轉(zhuǎn)染的宿主昆蟲細(xì)胞在27°C培養(yǎng)3天，表達(dá)的 流感病毒Ml蛋白和融合蛋白HA-24,自動組裝成VLPs。
6. -種包含權(quán)利要求1-5任一項所述的病毒樣顆粒的魚類傳染性脾腎壞死病毒基因 工程疫苗。
【文檔編號】A61K39/12GK104195119SQ201410381379
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月6日
【發(fā)明者】曹永長, 薛春宜, 劉大才 申請人:中山大學(xué)