一種抗傳染性脾腎壞死病毒的dna疫苗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗傳染性脾腎壞死病毒的DNA疫苗，該DNA疫苗的核酸序列為ISKNV病毒主衣殼蛋白MCP的基因序列。本發(fā)明的DNA疫苗與佐劑QCDC的聯(lián)合使用，具有很好的免疫原性，相對免疫保護率達80%，顯著優(yōu)于現(xiàn)有MCP蛋白疫苗的相對免疫保護率（64.3%），可以開發(fā)成為抗鱖魚傳染性脾腎壞死病毒病新疫苗。本發(fā)明DNA疫苗的制備方法簡單，容易操作，成本低廉，易于市場推廣應(yīng)用。
【專利說明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程疫苗領(lǐng)域，涉及一種DNA疫苗，具體涉及一種抗傳染性脾腎 壞死病毒（ISKNV)的DNA疫苗。 一種抗傳染性脾腎壞死病毒的DNA疫苗

【背景技術(shù)】
[0002] 鱖（Siniperca chuatsi)是我國重要的淡水魚特色養(yǎng)殖品種之一，由傳染性脾腎 壞死病毒（Infectious spleen and kidney necrosis virus, ISKNV)引起的績魚虹彩病毒 病是鱖魚養(yǎng)殖的主要疫病，導(dǎo)致鱖死亡率接近100%，成為制約鱖養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的主要瓶頸。 長期以來，對于鱖病毒病的防治一直沒有有效的藥物，而且藥物防治疾病弊端眾多，如病原 耐藥性、環(huán)境污染、食品安全等。因此作為符合環(huán)境友好和可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略的病害控制措 施，疫苗防治正成為國際現(xiàn)代水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)規(guī)范和研究開發(fā)的前沿?zé)狳c領(lǐng)域。因 此，研制與發(fā)展鱖傳染性脾腎壞死病毒病疫苗是防治鱖魚虹彩病毒病具有戰(zhàn)略意義的輔助 措施。
[0003] DNA疫苗是通過基因重組技術(shù)，由編碼某種抗原蛋白質(zhì)的外源基因和作為真核 表達載體的質(zhì)粒構(gòu)建的重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒通過某種方式被導(dǎo)入生物體內(nèi)，在宿主細胞 中通過宿主細胞的基因轉(zhuǎn)錄和表達系統(tǒng)選擇性表達外源抗原基因，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生對該抗 原蛋白質(zhì)的特異性免疫應(yīng)答，以達到預(yù)防和治療疾病的目的。主衣殼蛋白（major capsid protein，MCP)是ISKNV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒的感染晚期大量表達，表達量占病毒粒 子可溶性蛋白的90%，是主要的免疫原性蛋白。2004年，張敏等進行了 ISKNV主衣殼蛋白 (Major capsid protein, MCP)的原核表達，采用免疫印記的方法初步確定了重組MCP蛋 白與ISKNV MCP蛋白有相同的抗原特性，為ISKNV重組亞單位疫苗的研制提供了思路。2009 年，付小哲等對重組MCP蛋白的免疫原性進行了初步研究，發(fā)現(xiàn)重組MCP蛋白有較好的免疫 原性，相對免疫保護效果可達到64. 3%，可以激發(fā)鱖特異性免疫及非特異性免疫應(yīng)答。到目 前為止，還沒有以ISKNV MCP基因作為DNA疫苗應(yīng)用的研究報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決上述存在的問題，本發(fā)明研制了含抗傳染性脾腎壞死病毒DNA疫苗的重 組質(zhì)粒pcMCP，通過與QCDC佐劑的聯(lián)合使用，可作為抗鱖魚傳染性脾腎壞死病毒病新疫苗， 其相對免疫保護率達到80% (現(xiàn)有重組MCP蛋白疫苗的相對免疫保護率為64. 3%)，本發(fā)明 的MCP DNA疫苗顯著優(yōu)于現(xiàn)有MCP蛋白疫苗。
[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種抗傳染性脾腎壞死病毒的DNA疫苗。
[0006] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是： 一種抗傳染性脾腎壞死病毒的DNA疫苗，其核苷酸序列如SEQ ID N0 :1所示。
[0007] 進一步的，上述DNA疫苗的核酸序列在真核表達載體中進行表達。
[0008] 進一步的，上述DNA疫苗的佐劑為Q⑶C。
[0009] 進一步的，上述DNA疫苗在制備預(yù)防抗病毒藥物中的應(yīng)用。
[0010] 進一步的，上述病毒為傳染性脾腎壞死病毒。
[0011] 本發(fā)明的有益效果是： 1)本發(fā)明構(gòu)建了一種抗鱖魚傳染性脾腎壞死病毒病DNA疫苗，是一種新疫苗，其具 有很好的免疫原性，相對免疫保護率達80% (現(xiàn)有重組MCP蛋白疫苗的相對免疫保護率為 64. 3%)，顯著優(yōu)于現(xiàn)有MCP蛋白疫苗，可以開發(fā)成為抗鱖魚傳染性脾腎壞死病毒病新疫苗。
[0012] 2 )本發(fā)明的DNA疫苗的制備方法簡單，容易操作，成本低廉，易于市場推廣應(yīng)用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 圖1為重組質(zhì)粒的酶切鑒定圖；1為200bp DNA Maker ;2為MCP基因條帶；3為 重組質(zhì)粒pcMCP經(jīng)幻7/7 I和feoR I酶切后的條帶；4為空質(zhì)粒PCDNA3. 1 (+)經(jīng)幻7/7 I和 I酶切后的條帶； 圖2為免疫斑點檢測pcMCP在鱖腦組織細胞（CPB)中的表達情況，1為轉(zhuǎn)染了 pcMCP的 CPB細胞；2為空細胞對照； 圖3為RT-PCR檢測pcMCP在魚體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄表達情況；Μ為200bp DNA Marker ;1為 RT-PCR產(chǎn)物；2為Mcp基因?qū)φ眨?圖4為免疫印跡分析檢測pcMCP在魚體內(nèi)的蛋白表達情況；1為表達純化的MCP蛋白； 2為注射PBS的鱖魚肌肉蛋白；3,注射pcMCP的鱖魚肌肉蛋白； 圖5為不同實驗組的累積死亡率曲線圖，Q+M代表Q⑶C+pcMCP組；Q+3. 1代表 QCDC+pcDNA3. 1 ;Q+P 代表 QCDC+PBS 組；P 代表 PBS 組。

【具體實施方式】
[0014] 實驗例1 : 一、DNA疫苗的構(gòu)建 1. 1 ISKNV MCP基因的擴增 (1)根據(jù)GenBank中傳染性脾腎壞死病毒（ISKNV) MCP基因序列[HQ317460. 1]設(shè)計 引物，并引入酶切位點（以下劃線標(biāo)注)，引物序列如下： P1 :5'_ CGGGTACCATGGCTGCAATCTCA -3'（SEQ ID N0 :2)，引入 Κρη I 酶切位點（下劃 線部分)， Ρ2 :5'_ GCGAATTCTTACAGGATAGGGAAGC _3'（SEQ ID Ν0 :3)，引入 EcoR I 酶切位點（下 劃線部分)，該對引物可擴增出MCP基因序列（如SEQ ID N0 :1所示)。
[0015] (2)以本實驗室自保存的病毒基因組為模板進行PCR擴增，25 μ L PCR反應(yīng)體系包 含：10Xbuffer (含 Mg2+)2. 5μ L，4XdNTP (10mmol/L)0· 5μ L，上下游引物（20μ mol/L)各 0.5以1^，了&9〇嫩聚合酶（5"以〇0.3以1^，0嫩1.(^1^無菌雙蒸水補足。？0?反應(yīng)條件 ： 94°C預(yù)變性 4min ;94°C變性 45S，58°C復(fù)性 45S，72°C延伸 90S，30 個循環(huán)；72°C延伸 10min。
[0016] (3)PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，結(jié)果顯示，在1375bp左右出現(xiàn)亮帶，片 段大小與預(yù)期基本相符，將目的產(chǎn)物進行膠回收純化(具體操作參考試劑盒說明書)。
[0017] 1. 2重組真核表達質(zhì)粒pcMCP的構(gòu)建 (1)將純化后的ISKNV mcp PCR產(chǎn)物及提取的真核表達載體PCDNA3.1 ( + )，分別用 Κρη I 和EcoR I 進行雙酶切。pcDNA3. 1( + )的酶切體系為：10XNEB Buffer 5yL，100XBSA 0· 5μ L，Kpn I (2〇υ/μ L)1 μ L，EcoR I (2〇υ/μ L)1 μ L，PCDNA3. 1( + )15μ L(7y g/μ L)，滅 菌雙蒸水補足 50yL。MCP 的酶切體系為：10XNEB Buffer 5yL，100XBSA 0.5yL，Kpn I (20U/yL)lyL，EcoR I (20U/yL)lyL, MCP 35yL (3以8/^〇，滅菌雙蒸水補足5(^1^ 將酶切產(chǎn)物進行回收純化(具體操作參考試劑盒說明書)。
[0018] (2)將回收后的PCR產(chǎn)物和pcDNA3. 1 ( + )質(zhì)粒16°C連接過夜，連接體系為： pcDNA3. l( + )(9ng/y L) 3. 0yL,MCP 5. 0 μ L(7ng/μ L), T4 DNA ligase (5U/μ L) l.OyL, 2X Rapid Ligation Buffer 1. 0 μ L. (3)將連接反應(yīng)液5yL加入100yL DH5a感受態(tài)細胞（Takara, Japan)中，輕輕旋 轉(zhuǎn)離心管以混勻，置冰浴30min后，將感受態(tài)細胞置于42°C水浴熱激90S，然后快速轉(zhuǎn)到冰 浴中冷卻3min。再向每個離心管中加入900 μ L滅菌的LB培養(yǎng)基，混勻后置于37°C搖床振 蕩培養(yǎng)45min (轉(zhuǎn)速200rpm/min)。吸取100 μ L已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞涂布LB平板(含amp 50 μ g/mL)，37°C正置培養(yǎng)30min后，倒置培養(yǎng)16h。
[0019] (4)挑取白色菌落，接種于3mL加 Amp (終濃度50 μ g/mL)的LB液體培養(yǎng)基中， 37°C、200rpm培養(yǎng)過夜。吸取1. 5mL菌液提取質(zhì)粒，用Kpnl，EcoRI酶切鑒定重組子，反應(yīng) 體系如下： 10X H buffer lyL;ddH20 6 yL;Kpn I (15U/yL) 0.5yL;質(zhì)粒 DNA 2.5yL。
[0020] 10XH buffer 1 μ L ;(ΜΗ206 μ L ;EcoR I (15U/y L) 0· 5μ L ;質(zhì)粒 DNA 2.5yL。
[0021] 37°C反應(yīng)lh，l%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果。結(jié)果顯示（圖1)可以從重組的 質(zhì)粒中酶切出相應(yīng)大小的目的片段，說明目的片段已插入質(zhì)粒中。再將質(zhì)粒送至測序公 司測序，測序結(jié)果證明重組表達載體pcMCP已正確構(gòu)建，即獲得含抗傳染性脾腎壞死病毒 (ISKNV) DNA疫苗的重組質(zhì)粒pcMCP。
[0022] 二、重組質(zhì)粒pcMCP的表達效果檢測 2. 1重組真核表達質(zhì)粒pcMCP在鱖腦組織細胞系（CPB)中的表達 (1)質(zhì)粒pcMCP轉(zhuǎn)染CPB細胞 1)轉(zhuǎn)染前一天，胰酶消化細胞并計數(shù)，在24孔板中接種細胞，過夜，貼壁生長，使其在 轉(zhuǎn)染日密度為90%，細胞鋪板在0. 5mL含10%血清M199培養(yǎng)基中正常生長。
[0023] 2)對于每孔細胞，使用50yL無血清培養(yǎng)基（MEM培養(yǎng)基）稀釋0.8yg-1.0yg DNA。
[0024] 3)對于每孔細胞，使用 50 μ L MEM 培養(yǎng)基稀釋 1 μ L-3 μ L Lipofectamine 2000 試齊[J。Lipofectamine 2000稀釋后，在5min內(nèi)同稀釋的DNA混合。保溫時間過長會降低活 性。
[0025] 4)混合（2)中稀釋的DNA和⑶中稀釋的Lipofectamine2000,在室溫保溫 20min〇
[0026] 5)將細胞用無血清的MEM培養(yǎng)基洗兩次。
[0027] 6)將（4)中的混合物直接加入細胞培養(yǎng)板中，搖動培養(yǎng)板，輕輕混勻。用膠布封 好并作好標(biāo)記。
[0028] 7) 28°C培養(yǎng)5h后，更換新鮮的含10%血清的M199培養(yǎng)基，28°C繼續(xù)培養(yǎng)。細胞 轉(zhuǎn)染時，設(shè)空細胞對照。
[0029] 8) 72h后，胰酶消化收獲細胞。
[0030] (2)免疫斑點分析pcMCP在細胞內(nèi)的表達 1)培養(yǎng)細胞先用PBS清洗，然后用8M的尿素和50mM的Tris-Cl (pH7. 5)進行溶解。
[0031] 2)將5 μ L細胞溶解液滴到PVDF膜上，60°C烘干lh。
[0032] 3)用含5%的脫脂奶粉的封閉液封閉，室溫搖床孵育l_2h。
[0033] 4)棄封閉液,立即加入一抗和新的封閉液（1:1000),室溫孵育l_2h。
[0034] 5)用 PBST 漂洗 3 次，lOmin/次。
[0035] 6)棄掉一抗及封閉液，立即加入辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(H+L)和新的封閉液 (1:5000)，室溫孵育lh。
[0036] 7)去掉辣根過氧化物酶溶液，PBST漂洗3次，lOmin/次。
[0037] 8)漂洗后的膜移入干凈培養(yǎng)皿，按膜面積加入0. lmL/cm2的底物溶液與H202混合 液（10mL底物溶液加入10 μ L 30%H202液，混勻后立即使用）。
[0038] 9)室溫輕搖，仔細觀察蛋白帶的生色反應(yīng)，一旦蛋白帶的顏色深度達到要求（約 2-3min)，即用水稍為漂洗，將濾膜轉(zhuǎn)移到裝PBS的培養(yǎng)皿中，終止反應(yīng)。
[0039] 10)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pcMCP質(zhì)粒的細胞樣品有明顯的斑點出現(xiàn)，而陰性細胞對照則 沒有斑點（圖2)。說明本發(fā)明的DNA疫苗可以很好地真核細胞內(nèi)表達。
[0040] 2. 2重組質(zhì)粒pcMCP在魚體內(nèi)的表達檢測 (1) pcMCP在魚體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄檢測 1)用 Wizard Plus Minipreps DNA Purification System 無菌狀態(tài)下大量提取 pcMCP。
[0041] 2)鱖魚(約10g)暫養(yǎng)一周后，在其背鰭基部用lmL注射器肌注20 μ g pcMCP (溶 于100 μ L生理鹽水)，同時分別設(shè)注射pcDNA3. 1+和生理鹽水的鱖魚做對照。
[0042] 3)免疫三天后，用Trizol試劑分別提取免疫組和對照組注射部位肌肉的總RNA， 免疫組的總RNA用DNase處理以徹底除去pcMcp的污染。
[0043] 4)用經(jīng)PCR檢測無 pcMCP污染的總RNA做模板，按RT-PCR試劑盒Powerscript II reverse transcriptase (Clontech)介紹的方法進行 cDNA 合成。PCR 擴增條件與 "1.1" 中的PCR相同。結(jié)果顯示（圖3)所擴增的片段與MCP基因大小相符合，說明pcMcp在魚體 內(nèi)能夠正常地進行轉(zhuǎn)錄。
[0044] (2) pcMCP在魚體內(nèi)的蛋白表達檢測 1)用 Wizard Plus Minipreps DNA Purification System 無菌狀態(tài)下大量提取 pcMCP。
[0045] 2)鱖魚(約10g)暫養(yǎng)一周后，在其背鰭基部用lmL注射器肌注20 μ g pcMCP (溶 于100 μ L生理鹽水)，同時設(shè)注射PBS的鱖魚做對照。
[0046] 3)免疫三天后，取免疫組和對照組注射部位肌肉用50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5)勻漿(終濃度為 100mg/ml)，然后 4°C 16,000 g 離心 10 min。
[0047] 4)取20 μ L上清，進行SDS-PAGE電泳，電泳完畢后，將凝膠上分離的蛋白轉(zhuǎn)移到 PVDF膜上，在80mA的電流下轉(zhuǎn)移4h，麗春紅染色觀察轉(zhuǎn)移情況。
[0048] 5)用含5%的脫脂奶粉的封閉液封閉無關(guān)蛋白的潛在結(jié)合位點，室溫搖床孵育 l-2h。
[0049] 6)棄封閉液,立即加入一抗和新的封閉液（1:1000),室溫孵育l_2h。
[0050] 7)轉(zhuǎn)移掉封閉液，用PBST漂洗3次，lOmin/次。
[0051] 8)立即加入辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(H+L)和新的封閉液（1:5000)，室溫孵育 lh〇
[0052] 9)去掉辣根過氧化物酶溶液，PBST漂洗3次，lOmin/次。
[0053] 10)漂洗后的膜移入干凈培養(yǎng)皿，按膜面積加入0. lmL/cm2的底物溶液與H202混 合液（10mL底物溶液加入10 μ L 30%H202液，混勻后立即使用）。
[0054] 11)室溫輕搖，仔細觀察蛋白帶的生色反應(yīng)，一旦蛋白帶的顏色深度達到要求（約 2-3min)，即用水稍為漂洗，將濾膜轉(zhuǎn)移到裝PBS的培養(yǎng)皿中，終止反應(yīng)。
[0055] 12)結(jié)果顯示免疫鱖肌肉組織樣品所在泳道有一特異的蛋白帶（蛋白分子量約為 50kD)，而對照鱖樣品中則無此帶（圖4)。說明pcMCP在魚體內(nèi)能夠正常地進行蛋白表達。
[0056] 三、重組質(zhì)粒pcMCP的免疫保護效果 3. 1實驗鱖魚 體質(zhì)量40-50g，在充氣及流水養(yǎng)殖池內(nèi)暫養(yǎng)2周。從中隨機挑取20尾，經(jīng)鏡檢觀察寄 生蟲、肝臟分離細菌、PCR檢測ISKNV全部陰性，確認健康后用于實驗。實驗期間水溫27? 31°C，每天投喂餌料魚（鯪魚），攻毒后改為每隔3天投喂一次餌料魚。
[0057] 3.2疫苗的制備 1)用 Wizard Plus Minipreps DNA Purification System 無菌狀態(tài)下大量提取 pcMCP。
[0058] 2)將pcMCP用PBS調(diào)整濃度為100 μ g/ml的pcMCP溶液，然后滴加佐劑Q⑶C(含 quilA 20 yg/ml，膽固醇20yg/ml，二甲溴化銨10 yg/ml，聚丙烯酸樹脂0·05%(ν/ν))，每 100mL的pcMCP溶液中滴加3. 5mL佐劑QCDC。
[0059] 3.3實驗分組 將實驗鱖魚隨機分為4個實驗組，分別為Q⑶C+pcMCP，Q⑶C+pcDNA3. 1，Q⑶C+PBS和 PBS組，每組30尾。其中QCDC+pcMCP組背肌注射核酸疫苗20 μ g/尾，QCDC+pcDNA3. 1組背 肌注射空質(zhì)粒20 μ g/尾。各組的注射體積均為200 μ L/尾。
[0060] 3. 4攻毒實驗 免疫后28天，腹腔注射10TCID50病毒液，連續(xù)觀察15d，每天早晚觀察記錄各組魚的 死亡情況。取死亡魚的脾、腎進行ISKNV的PCR檢測，對肝、脾、腎、腦進行細菌分離，以確定 死因，并計算相對免疫保護率（Relative percentage survival, RPS)。結(jié)果顯示（圖5)， Q⑶C+pcMCP組的相對保護率為80%，明顯高于其他三組。
[0061] 上述實驗結(jié)果說明，添加佐劑QCDC的pcMCP核酸疫苗具有很好的免疫原性，可以 開發(fā)成為抗鱖魚傳染性脾腎壞死病毒病新疫苗。 〈110>中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所 〈120> -種抗傳染性脾腎壞死病毒的DNA疫苗 <130> <160> 3 <170> Patentln version 3. 5 <210> 1 <211> 1359 <212> DNA 〈213>病毒基因 <400> 1 atgtctgcaa tctcaggtgc aaacgtaacc agcgggttca tcgacatctc cgcgtttgat 60 gcgatggaga cccacttgta cggcggcgac aatgccgtga cctactttgc ccgtgagacc 120 gtgcgtaggt cctggtacag caaactgccc gtcaccctgt caaaacagac tggccatgcc 180 aattttgggc aggagtttag tgtgacggtg gcgaggggcg gcgactacct cattaatgtg 240 tggctgcgtg ttaagatccc ctccatcaca tccagcaagg agaacagcta catccgctgg 300 tgcgacaatc tgatgcacaa tctagtggag gaggtgtcgg tgtcatttaa cgacctggtg 360 gcacagaccc tcaccagcga gttccttgac ttctggaacg cctgcatgat gcccggcagc 420 aaacagtctg gctacaacaa gatgattggc atgcgcagcg acctggtggc cggcatcacc 480 aacggccaga ctatgcccgc cgtctacctt aatttgccca ttcccctctt cttt acccgt 540 gacacgggcc tggcgttgcc taccgtgtct ctgccgtaca acgaggtgcg catccacttc 600 aagctgcggc gctgggagga cctgctcatc agccagagca accaggccga catggccata 660 tcgaccgtca ccctggctaa cattggcaat gtagcacccg cactgaccaa tgtgtctgtg 720 atgggcactt acgctgtact gacaagcgag gagcgtgagg tggtggccca gtctagtcgt 780 agcatgctca ttgaacagtg ccaggtggcg ccccgtgtgc ccgtcacgcc cgcagacaat 840 tctttggtgc atctggacct caggttcagt caccccgtga aggccttgtt ctttgcagta 900 aagaacgtca cccaccgcaa cgtgcaaagc aactacaccg cggccagtcc cgtgtatgtc 960 aacaacaagg tgaatctgcc attgatggcc accaatcccc tgtccgaggt gtcactcatt 1020 tacgagaaca cccctcggct ccaccagatg ggagtagact acttcacatc tgtcgacccc 1080 tactactttg cgcccagcat gcctgagatg gatggtgtta tgacctactg ctatacgttg 1140 gacatgggca atatcaaccc catgggttca accaactacg gccgcctgtc caacgtcacc 1200 ctgtcatgta aggtgtcgga caatgcaaag accaccgcgg cgggcggtgg cggcaacggc 1260 tccggctaca cggtggccca aaagtttgaa ctggtcgtta ttgctgtcaa ccacaacatc 1320 atgaagattg ctgacggcgc cgcaggcttc cctctgtaa 1359 〈210〉 2 〈211〉 23 〈212〉 DNA 〈213〉人工引物 〈400> 2 cgggtaccat ggctgcaatc tea 23 〈210〉 3 〈211〉 25 〈212〉 DNA 〈213〉人工引物 〈400> 3 gcgaattctt acaggatagg gaagc 25
【權(quán)利要求】
1. 一種抗傳染性脾腎壞死病毒的DNA疫苗，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種DNA疫苗，其特征在于：其核酸序列在真核表達載體中 進行表達。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種DNA疫苗，其特征在于：該疫苗的佐劑為QCDC。
4. 權(quán)利要求1?3任一所述的DNA疫苗在制備預(yù)防抗病毒藥物中的應(yīng)用。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于：所述的病毒為傳染性脾腎壞死病毒。
【文檔編號】A61K48/00GK104096240SQ201410280461
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年6月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月20日
【發(fā)明者】李寧求, 付小哲, 吳淑勤, 林強, 劉禮輝, 張德峰 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所