專利名稱：酶法水解淫羊藿甙糖基制備低糖淫羊藿甙或甙元的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備低糖淫羊藿甙或甙元的方法，尤其是一種用酶水解淫羊藿甙糖基制備低糖淫羊藿甙或甙元的方法。
背景技術(shù)：
淫羊藿是常用的中藥，是Berberridaceae科淫羊藿屬(Epimedium genus)植物。中華人民共和國藥典(2000年版)收載了如下五種淫羊藿藥材，藥材為干燥的地上部分。即淫羊藿(Epimedium brevicornum Maxim)、箭葉淫羊藿(Epimedium sagittatum)、柔毛淫羊藿(Epimedium pubescens)、巫山淫羊藿(Epimedium wushanenes)、朝鮮淫羊藿(Epimedium koreanum Nakai)等。淫羊藿主要含有異戊烯基取代的黃酮甙(淫羊藿甙)和乙酰基取代的化合物，但是其乙酰基在加工淫羊藿、提取淫羊藿甙的過程中很容易脫掉，因此在淫羊藿中主要含的甙為黃酮甙，即淫羊藿甙。其主要藥效為補腎壯骨、增強內(nèi)分泌，具有激素作用，可促進骨髓細胞DNA合成，促進骨細胞的生長。淫羊藿甙的化學(xué)分子結(jié)構(gòu)為 根據(jù)分子結(jié)構(gòu)式中不同的R2、R1、R3，淫羊藿甙(苷)分為多種，可按序號排列如下R2R1R3淫羊藿甙(苷)1rha-rha-glc-Me淫羊藿甙(苷)2glc-rha-glc-Me淫羊藿甙(苷)3xyl-rha-glc-Me
淫羊藿甙(苷)4 rha-rha- glc- H淫羊藿甙(苷)5 glc-rha- glc- H淫羊藿甙(苷)6 xyl-rha- glc- H淫羊藿甙(苷)7 rha-rha- H Me淫羊藿甙(苷)8 glc-rha- H Me淫羊藿甙(苷)9 xyl-rha- H Me淫羊藿甙(苷)10 rha-rha- H H淫羊藿甙(苷)11 glc-rha- H H淫羊藿甙(苷)12 xyl-rha- H H淫羊藿甙(苷)13 rha--glc- Me淫羊藿甙(苷)14 rha- glc- H淫羊藿甙(苷)15 rha- H Me淫羊藿甙(苷)16 Hglc- Me淫羊藿甙(苷)17 rha- H H淫羊藿甙(苷)18 Hglc- H4’-甲氧基淫羊藿甙元HH Me淫羊藿甙元 HH H上述不同的淫羊藿甙均有3個糖基，即多糖基淫羊藿甙。多糖基淫羊藿甙活性較低，而低糖基淫羊藿甙或淫羊藿甙元活性卻較高，為了得到淫羊藿甙元或者低糖基淫羊藿甙，曾報道過酸堿水解法(孫朋悅等，中國藥物化學(xué)雜志，1998，30(4)，281-284)，但所述方法對甙破壞性大，污染嚴重，目的性差。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的技術(shù)問題，提供一種酶法水解淫羊藿甙糖基，制備低糖淫羊藿甙或甙元的方法，無污染、目的性強、轉(zhuǎn)化率高。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種酶法水解淫羊藿甙糖基制備低糖淫羊藿甙或甙元的方法，其特征在于用酶水解淫羊藿甙糖基，制備低糖淫羊藿甙或甙元。
包括如下步驟a.取能水解淫羊藿甙糖基的酶；b.將酶、淫羊藿甙及緩沖液混合反應(yīng)1-36小時，反應(yīng)條件為溫度4-75℃、PH值3-9；c.提取低糖淫羊藿甙或甙元。
所述的a步驟可由微生物發(fā)酵制備。
所述的微生物發(fā)酵制備是用液態(tài)發(fā)酵或固態(tài)發(fā)酵法得到含酶混合液，在含酶混合液內(nèi)加入硫酸銨或者乙醇提取酶。
所述的微生物可為細菌、霉菌、酵母菌，最好用曲霉屬霉菌。
所述的微生物發(fā)酵為有產(chǎn)酶誘導(dǎo)物參與發(fā)酵，產(chǎn)酶誘導(dǎo)物可為黃酮甙或異黃酮甙，可以用含有黃酮甙或異黃酮甙的中草藥或者其提取物。
所述的b步驟的淫羊藿甙濃度為總反應(yīng)物體積的0.1-10％。
所述的緩沖液為醋酸或磷酸。
所述的c步驟為用乙醇沉淀提取或用正丁醇萃取。
本發(fā)明同現(xiàn)有技術(shù)相比，最大的特點是用酶水解淫羊藿甙糖基來制備低糖淫羊藿甙或甙元?？朔爽F(xiàn)有技術(shù)所存在的對甙破壞性大、污染嚴重、目的性差等缺點，具有無污染、目的性強、轉(zhuǎn)化率高的優(yōu)點。尤其是在微生物發(fā)酵中加入了產(chǎn)酶誘導(dǎo)物，可大大提高其產(chǎn)酶量，有助于充分水解淫羊藿甙糖基，更加提高了低糖淫羊藿甙或甙元的轉(zhuǎn)化率。
具體實施例方式實施例1a.以高溫好氧菌Clostridium thermocopriea(文獻1)在含3％玉米粉、1％產(chǎn)酶誘導(dǎo)物——淫羊藿浸出物(干物)培養(yǎng)基中，在溫度為60℃的條件下，振蕩培養(yǎng)30-60小時，離心除菌；往上清液(含酶混合液)中加入65％飽和度的硫酸銨沉淀酶蛋白，用0.02M、pH5醋酸緩沖液透析，離心除渣，凍干，得到甙酶。
b.將0.2克上述甙酶、3克淫羊藿甙1、2、3的混合物或者單體、150毫升醋酸緩沖液(0.2M，pH5.0)混合均勻，使淫羊藿甙1、2、3的混合物占總反應(yīng)體積的0.1-10％，在溫度75℃的條件下攪拌反應(yīng)1小時。
c.反應(yīng)後加入300毫升乙醇沉淀酶蛋白，過濾除去酶蛋白沉淀，濾液減壓蒸干，得到2.1克粗品。
用高效液相色譜法(文獻2)檢測結(jié)果85％以上的甙轉(zhuǎn)化成單糖淫羊藿甙16、甙元。經(jīng)硅膠柱分離(文獻3)，在熱甲醇中溶解、冷甲醇沉淀，得到純0.1克淫羊藿次生甙13、0.05克單糖淫羊藿甙15和16以及0.02克4’-甲氧基淫羊藿甙元。
實施例2a.以高溫好氧菌Clostridium thermocopriea(文獻1)在含4％玉米粉、0.2％產(chǎn)酶誘導(dǎo)物——淫羊藿浸出物(干物)培養(yǎng)基中，在溫度為60℃的條件下，振蕩培養(yǎng)30-60小時，離心除菌，往上清液(含酶混合液)中加入乙醇沉淀酶蛋白，凍干，得到甙酶。
b.將0.3克上述甙酶、2克淫羊藿甙1、2、3的混合物、120毫升醋酸緩沖液(0.2M，pH5.0)混合均勻，使淫羊藿甙1、2、3的混合物占總反應(yīng)體積的0.1-10％，在溫度為5℃的條件下攪拌反應(yīng)36小時。
c.反應(yīng)後加入300毫升乙醇沉淀酶蛋白，過濾除去酶蛋白沉淀，濾液減壓蒸干，得到1.7克粗品。
用高效液相色譜法(文獻2)檢測結(jié)果90％以上的甙轉(zhuǎn)化成單糖淫羊藿甙14、17和18。經(jīng)硅膠柱分離(文獻3)，在熱甲醇中溶解、冷甲醇沉淀，得到純0.3克淫羊藿甙14，0.1克淫羊藿甙17和0.1克淫羊藿甙18。
實施例3a.以高溫好氧菌Clostridium thermocopriea(文獻1)在含3％玉米粉、1％產(chǎn)酶誘導(dǎo)物——人參浸出物(干物)培養(yǎng)基中，在溫度為60℃的條件下，振蕩培養(yǎng)30-60小時，離心除菌，往上清液(含酶混合液)中加入乙醇沉淀酶蛋白，收集蛋白，凍干，得到甙酶。
b.將0.4克上述甙酶、2克淫羊藿甙4、5、6的混合物、120毫升磷酸緩沖液(0.2M，pH5.0)混合均勻，使淫羊藿甙4、5、6的混合物占總反應(yīng)體積的0.1-10％，在溫度60℃條件下，攪拌反應(yīng)18小時。
c.反應(yīng)後加入300毫升乙醇沉淀酶蛋白，過濾除去蛋白沉淀，濾液減壓蒸干，得到低糖基淫羊藿甙1.5克粗品。
經(jīng)硅膠柱分離(文獻3)，在熱甲醇中溶解、冷甲醇沉淀，得到純0.3克淫羊藿甙14、0.1克淫羊藿甙17和0.06克淫羊藿甙元。
實施例4a.以黑曲霉菌(Aspegillus niger)在含4％麥芽浸出物、0.5％產(chǎn)酶誘導(dǎo)物——淫羊藿浸出物(干物)的培養(yǎng)基中，在28-30℃攪拌通風(fēng)培養(yǎng)50-100小時，離心除菌，得含酶混合液，用60-75％飽和度的硫酸銨沉淀酶蛋白，收集蛋白，溶于1/10發(fā)酵液體積的醋酸緩沖液(0.02M，pH5.0)中，透析除去硫酸銨，離心除渣，即為酶液。
b.將3克淫羊藿甙4、5、6的混合物或者其單體(占總反應(yīng)體積的0.1-10％)、100毫升醋酸緩沖液(0.02M，pH5.0)和20毫升上述酶液混合，使在20-55℃反應(yīng)1-4小時。
c.加入1/3總反應(yīng)體積的正丁醇萃取皂甙三次，減壓蒸干，得到低糖基次生皂甙粗品2克。
用硅膠柱分離方法(文獻3)得到0.1克的純淫羊藿甙17、18和0.15克淫羊藿甙元。
實施例5a.同實施例4；b.將1克淫羊藿甙7、8、9的混合物或者其單體(占總反應(yīng)體積的0.1-10％)、50毫升醋酸緩沖液(0.02M，pH5.0)和20毫升酶液混合，在20-55℃反應(yīng)1-4小時。
c.加入1/3總反應(yīng)體積的正丁醇萃取皂甙三次，減壓蒸干，得到低糖基次生皂甙粗品2克。
用高效液相色譜法(文獻2)檢測結(jié)果85％以上的甙轉(zhuǎn)化成單糖淫羊藿甙17、甙元。用硅膠柱分離方法(文獻3)得到0.1克的純淫羊藿甙17和0.05克淫羊藿甙元。
實施例6a.米曲霉菌(Aspegillus oryzae)在含5％麥麩浸出物、0.2％產(chǎn)酶誘導(dǎo)物——淫羊藿甙或者蘆丁、或者1％其黃酮類來源植物的浸出物的培養(yǎng)基中，在溫度為28-30℃的條件下攪拌，通風(fēng)培養(yǎng)50-100小時，離心除菌得含酶混合液，加入乙醇沉淀酶蛋白，收集蛋白，加入1/5發(fā)酵液體積的醋酸緩沖液(0.02M，pH5.0)，即為酶液。
b.將上述酶液按實施例4的b、c步驟處理淫羊藿甙1、2、3，得到單糖淫羊藿甙13、15、16和4’-甲氧基甙元；處理各種淫羊藿甙4、5、6，得到單糖淫羊藿甙14、17、18和甙元。
實施例7a.同實施例6；b.將10克淫羊藿提取物(甙含量60％以上)、酶液50毫升、400毫升醋酸緩沖液(0.02M，pH5.0)混合在20-55℃反應(yīng)1-4小時。
c.加入1/3總反應(yīng)體積的正丁醇萃取皂甙三次，減壓蒸干，得到低糖基次生甙粗品5克。
用高效液相色譜法(文獻2)檢測結(jié)果，主要含有單糖淫羊藿甙15、16、17、18，少量的淫羊藿甙13、14和4’-甲氧基淫羊藿甙元和甙元。
實施例8a.假絲酵母在含淫羊藿粉10％的麥麩培養(yǎng)基(干物1000克)上接種，分裝在茄子瓶中30℃固體培養(yǎng)3～6天，收集培養(yǎng)物，在培養(yǎng)基干物中加入6000毫升的生理鹽水，浸泡一小時，離心取上清(含酶混合液)，加入飽和度60～75％的硫酸銨，使酶蛋白沉淀，收集沉淀，用800毫升的pH5、0.02M醋酸鈉緩沖液溶解，透析除去硫酸銨，離心除渣，即得1000毫升左右的酶液。
b.將上述酶液按實施例4的方法處理淫羊藿甙1、2、3、4、5、6和混合物得到單、雙糖淫羊藿甙或甙元。
實施例中所述文獻為1.Fengxie Jin et al(金鳳燮等)J.Int.Syst.Bact，1988，38，279-281.
2.馬卓等，中國醫(yī)藥學(xué)雜志，2002，22(11)，697。
3.孫朋悅等，中國藥物化學(xué)雜志，1998，30(4)，281-284。
權(quán)利要求
1.一種酶法水解淫羊藿甙糖基制備低糖淫羊藿甙或甙元的方法，其特征在于用酶水解淫羊藿甙糖基，制備低糖淫羊藿甙或甙元。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶法水解淫羊藿甙糖基制備低糖淫羊藿甙或甙元的方法，其特征在于包括如下步驟a.取能水解淫羊藿甙糖基的酶；b.將酶、淫羊藿甙及緩沖液混合反應(yīng)1-36小時，反應(yīng)條件為溫度4-75℃、PH值3-9；c.提取低糖淫羊藿甙或甙元。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶法水解淫羊藿甙糖基制備低糖淫羊藿甙或甙元的方法，其特征在于所述的a步驟可由微生物發(fā)酵制備。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的酶法水解淫羊藿甙糖基制備低糖淫羊藿甙或甙元的方法，其特征在于所述的微生物發(fā)酵制備是用液態(tài)發(fā)酵或固態(tài)發(fā)酵法得到含酶混合液，在含酶混合液內(nèi)加入硫酸銨或者乙醇提取酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的酶法水解淫羊藿甙糖基制備低糖淫羊藿甙或甙元的方法，其特征在于所述的微生物為細菌、霉菌、酵母菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的酶法水解淫羊藿甙糖基制備低糖淫羊藿甙或甙元的方法，其特征在于所述的微生物為曲霉屬(Aspergillus genus)霉菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的酶法水解淫羊藿甙糖基制備低糖淫羊藿甙或甙元的方法，其特征在于所述的微生物發(fā)酵為有產(chǎn)酶誘導(dǎo)物參與發(fā)酵。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶法水解淫羊藿甙糖基制備低糖淫羊藿甙或甙元的方法，其特征在于所述的b步驟的淫羊藿甙濃度為總反應(yīng)物體積的0.1-10％。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶法水解淫羊藿甙糖基制備低糖淫羊藿甙或甙元的方法，其特征在于所述的緩沖液為醋酸或磷酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶法水解淫羊藿甙糖基制備低糖淫羊藿甙或甙元的方法，其特征在于所述的c步驟為用乙醇沉淀提取或用正丁醇萃取。
全文摘要
本發(fā)明提供一種酶法水解淫羊藿甙糖基制備低糖淫羊藿甙或甙元的方法，是用酶水解淫羊藿甙糖基，制備低糖淫羊藿甙或甙元。包括如下步驟取能水解淫羊藿甙糖基的酶；將酶、淫羊藿甙及緩沖液混合反應(yīng)1－36小時，反應(yīng)條件為溫度4－75℃、pH值3－9；提取低糖淫羊藿甙或甙元?？朔爽F(xiàn)有技術(shù)所存在的對甙破壞性大，污染大，目的性差等缺點，具有無污染、目的性強、轉(zhuǎn)化率高的優(yōu)點。尤其是在微生物發(fā)酵中加入了產(chǎn)酶誘導(dǎo)物，可大大提高其產(chǎn)酶量，有助于充分水解淫羊藿甙糖基，更加提高了低糖淫羊藿甙或甙元的轉(zhuǎn)化率。
文檔編號C12P19/00GK1473938SQ0313363
公開日2004年2月11日 申請日期2003年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月1日
發(fā)明者魚紅閃, 金鳳燮, 姚新生 申請人:金鳳燮