專利名稱：從鮮蒜中提取蒜酶生產(chǎn)工藝的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及從植物中提取蒜酶生物制劑的方法，是一種從鮮蒜中提取蒜酶生產(chǎn)工藝。
背景技術：
大蒜(Allium sativum L.)是歷史悠久的藥食兩用植物。大蒜又名胡蒜，為百合科蔥屬植物蒜(Allium sativum L.)的地下鱗莖。近代研究發(fā)現(xiàn)，大蒜具有抗癌、降血脂、殺滅真菌等作用，成為德、美、日等國研究的熱點。蒜酶(Alliinase，EC 4.4.1.4)又名蒜氨酸裂解酶、烷基硫代半胱氨酸酶。存在于細胞的液泡中。為六個磷酸吡哆醛和兩個亞單位組成。在280、430nm處有最大吸收。等電點pH4.9。目前公認蒜酶催化蒜氨酸(Alliin，2-烯丙基半胱氨酸亞砜)產(chǎn)生大蒜辣素(Allicin，二烯丙基硫代亞磺酸酯)、阿霍烯(ajoenes)等系列揮發(fā)性含硫有機化合物而發(fā)揮多種藥效。

最佳催化溫度37℃、pH5.0-8.0，10分鐘即可將80％蒜氨酸轉(zhuǎn)化為大蒜辣素(Allicin，ally 2-propenethisulfinate)。又名二烯丙基硫代亞磺酸酯或蒜素。
蒜酶與蒜氨酸分別獨立的存在于大蒜的鱗莖中，搗碎后這兩種物質(zhì)相互接觸，迅速發(fā)生分解反應。因此，從大蒜中提取到蒜酶是十分困難的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種從鮮蒜中提取蒜酶生產(chǎn)工藝。
本發(fā)明的技術方案是這樣來實現(xiàn)的一種從鮮蒜中提取蒜酶生產(chǎn)工藝，按以下步驟進行第一步蒜瓣加蒜酶提取液打漿分離出清液先將蒜瓣溫度控制在-5℃至5℃范圍內(nèi)，并控制溫度在-5℃至5℃范圍內(nèi)，加入蒜酶提取液并磨成100至200目的蒜漿，蒜酶提取液的加入量為蒜瓣重量的0.8至1.2倍，并進一步分離出第一清液；第二步分步沉淀得到粗蒜酶控制溫度在-5℃至5℃范圍內(nèi)，在攪拌下將硫酸銨加入第一清液中，使其全部溶解并用比重計控制硫酸銨濃度在20％至30％重量體積百分比濃度范圍內(nèi)，然后分離出第二清液；在攪拌下將硫酸銨加入第二清液中，使其全部溶解并用比重計控制硫酸銨濃度在40％至50％重量體積百分比濃度范圍內(nèi)，然后分離出第一糊狀沉淀物粗蒜酶；第三步透析脫鹽-調(diào)節(jié)等電點-冷凍干燥得到蒜酶將第一糊狀沉淀物裝入聚氨酯袋，于流動的-5℃至5℃范圍內(nèi)的冰水透析槽中透析40小時至50小時，然后用磷酸調(diào)節(jié)等電點pH到4.9后分離出第二糊狀沉淀物即糊狀蒜酶。
上述提取液含有絡合劑、抗氧劑、緩沖劑及丙三醇的水溶液。
上述絡合劑可為乙二胺四乙酸二鈉；上述抗氧劑可為巰基丙醇；上述緩沖劑可為磷酸鹽。
蒜酶提取液可為在磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液中加入按緩沖液體積加入0.1％至0.3％的二乙胺四乙酸二鈉、0.02％至0.06％的巰基乙醇，0.3％至1.0％的氯化鈉、5％至15％的丙三醇。
在上述生產(chǎn)工藝中，可將第二糊狀沉淀物放入冷凍干燥機進行干燥，使水分含量低于2.0％，得到凍干蒜酶，然后用氮氣或惰性氣體進行密閉保存。
上述分離所用設備可采用冷凍密閉式漿渣自分離磨漿機或離心摔干機或低溫管式離心分離機。
本發(fā)明適宜于以鮮蒜為原料批量化生產(chǎn)藥用蒜酶。本發(fā)明所得蒜酶產(chǎn)品經(jīng)過SDS-凝膠電泳證明其具有較高的純度。依據(jù)與標準蛋白(C分子量14400～97400)比移值計算其蒜酶產(chǎn)品單聚體分子量為67000道爾頓。米氏常數(shù)Km為3.6mmol/L。其產(chǎn)品平均活力為765U/g。


附圖1為蒜酶(A、B)、標準蛋白(C，3mg/mL)電泳圖；附圖2為底物(蒜氨酸)和反應產(chǎn)物(丙酮酸、大蒜辣素)高效液相色譜分析(即HPLC)色譜圖；附圖3為蒜酶催化蒜氨酸反應動力學曲線。
具體實施例方式
本發(fā)明不受下述實施例的限制，可根據(jù)上述本發(fā)明的技術方案和實際情況來確定具體的實施方式。
實施例，按下述步驟進行第一步在蒜瓣中加蒜酶提取液打漿分離出清液先將蒜瓣溫度控制在-5℃至5℃范圍內(nèi)，并控制溫度在-5℃至5℃范圍內(nèi)，加入蒜酶提取液并磨成100至200目的蒜漿，蒜酶提取液的加入量為蒜瓣重量的0.8倍或1.2倍，并進一步分離出第一清液；第二步分步沉淀得到粗蒜酶控制溫度在-5℃至5℃范圍內(nèi)，在攪拌下將硫酸銨加入第一清液中，使其全部溶解并用比重計控制硫酸銨濃度在20％至30％重量體積百分比濃度范圍內(nèi)，然后分離出第二清液；在攪拌下將硫酸銨加入第二清液中，使其全部溶解并用比重計控制硫酸銨濃度在40％至50％重量體積百分比濃度范圍內(nèi)，然后分離出第一糊狀沉淀物粗蒜酶；第三步透析脫鹽-調(diào)節(jié)等電點-冷凍干燥得到蒜酶將第一糊狀沉淀物裝入聚氨酯袋，于流動的-5℃至5℃范圍內(nèi)的冰水透析槽中透析40小時至50小時，然后用磷酸調(diào)節(jié)等電點pH到4.9后分離出第二糊狀沉淀物即糊狀蒜酶。
最好將第二糊狀沉淀物放入冷凍干燥機進行干燥，使水分含量低于2.0％，得到凍干蒜酶，然后用氮氣或惰性氣體進行密閉保存，這樣有利于長期保存。
在上述實施例中提取液為含有絡合劑、抗氧劑、緩沖劑及丙三醇的水溶液；絡合劑可為乙二胺四乙酸二鈉；抗氧劑可為巰基丙醇；緩沖劑可為磷酸鹽；蒜酶提取液最好為在磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液中加入按緩沖液體積加入0.1％或0.3％的二乙胺四乙酸二鈉、0.02％或0.06％的巰基乙醇，0.3％或1.0％的氯化鈉、5％或15％的丙三醇。
分離所用設備采用冷凍密閉式漿渣自分離磨漿機或離心摔干機或低溫管式離心分離機。
下面是對上述實施例所得產(chǎn)品即蒜酶的確認一、SDS凝膠電泳測定蒜酶產(chǎn)品純度及分子量SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)條件采用10％分離膠，4.5％濃縮膠制板。點樣量20μL。CC型垂直電泳槽，甘油-羥甲基胺基甲烷—HCl-十二烷基磺酸鈉緩沖液。電壓20mA電泳展開，考馬斯亮藍染色。結(jié)果顯示一根條帶。依據(jù)與標準蛋白(C分子量14400～97400)比移值得回歸方程Y＝-1.7297X+5.6399(r＝0.97)。
計算蒜酶樣品(批號A011105、B020120)單聚體分子量為67000道爾頓。如附圖1所示。
二、蒜酶活力效價
建立HPLC同時測定底物蒜氨酸、產(chǎn)物大蒜辣素及丙酮酸的方法。如附圖2所示。蒜酶產(chǎn)品0.100g，純化水超聲30秒使溶解，制成1.00mg/ml供試液。以蒜氨酸(Indofine Chemical Company，Inc.USA含量99.5％。)作標準對照品。Hypersil-BDS-C18色譜柱(4.6mm×250mm，5um)，柱溫35℃，流動相甲醇-水(3∶2)，流率0.8ml/min，214nm檢測。進樣量10l測定。以相鄰的蒜氨酸和丙酮酸色譜峰計算產(chǎn)品(蒜酶)的活力效價。實施例所得五批蒜酶產(chǎn)品催化活力平均為765U/g。
1蒜酶活力單位(U)＝每分鐘裂解 mol蒜氨酸(底物)需要的酶量( )。五批蒜酶產(chǎn)品平均蒜酶活力為765U/g。1蒜酶活力單位(U)=W'×n177.2×5×W]]>三、酶促反應動力學曲線和參數(shù)蒜酶產(chǎn)品加底物(蒜氨酸)分別配成試液。超聲混合30秒，35℃水浴保溫。分別于5、15、25min，及1、3、5、7、9、11、13hr吸取反應液適量，加甲醇混勻。過0.45μm濾膜，HPLC進樣10μl，得到色譜圖。計算蒜氨酸、丙酮酸及大蒜辣素含量。繪制酶促反應曲線，如附圖3所示。
顯示蒜酶的特性反應曲線5分鐘以內(nèi)為酶促反應初速度(呈現(xiàn)一級反應S+E→P。其速度方程為-d[S]/dt＝k1[S])；25分鐘達到最大反應速度(呈現(xiàn)混合級反應E+SES→E+P。)。大蒜辣素隨時間濃度增加，15分鐘至13hr其濃度基本穩(wěn)定(25分-13hr接近零級反應)。
催化裂解反應符合米氏方程1/V＝0.129/[S]+0.0358。
回歸方程Y＝35.78+0.129X(r＝0.996)最大反應速度Vmax＝27.9mol·min-1·mg-1米氏常數(shù)Km＝3.6mmol/L。
權利要求
1.一種從鮮蒜中提取蒜酶生產(chǎn)工藝，其特征在于按以下步驟進行第一步在蒜瓣中加蒜酶提取液打漿分離出清液先將蒜瓣溫度控制在-5℃至5℃范圍內(nèi)，并控制溫度在-5℃至5℃范圍加入蒜酶提取液并磨成100至200目的蒜漿，蒜酶提取液的加入量為蒜瓣重量的0.8至1.2倍，并進一步分離出第一清液；第二步分步沉淀得到粗蒜酶控制溫度在-5℃至5℃范圍內(nèi)，在攪拌下將硫酸銨加入第一清液中，使其全部溶解并用比重計控制硫酸銨濃度在20％至30％重量體積百分比濃度范圍內(nèi)，然后分離出第二清液；在攪拌下將硫酸銨加入第二清液中，使其全部溶解并用比重計控制硫酸銨濃度在40％至50％重量體積百分比濃度范圍內(nèi)，然后分離出第一糊狀沉淀物粗蒜酶；第三步透析脫鹽-調(diào)節(jié)等電點-冷凍干燥得到蒜酶將第一糊狀沉淀物裝入聚氨酯袋，于流動的-5℃至5℃范圍內(nèi)的冰水透析槽中透析40小時至50小時，然后用磷酸調(diào)節(jié)等電點pH到4.9后分離出第二糊狀沉淀物即糊狀蒜酶。
2.根據(jù)權利要求1所述的從鮮蒜中提取蒜酶生產(chǎn)工藝，其特征在于蒜酶提取液為含有絡合劑、抗氧劑、緩沖劑及丙三醇的水溶液。
3.根據(jù)權利要求2所述的從鮮蒜中提取蒜酶生產(chǎn)工藝，其特征在于絡合劑為乙二胺四乙酸二鈉；抗氧劑為巰基丙醇；緩沖劑為磷酸鹽。
4.根據(jù)權利要求1或2或3所述的從鮮蒜中提取蒜酶生產(chǎn)工藝，其特征在于蒜酶提取液為在磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液中加入按緩沖液體積加入0.1％至0.3％的二乙胺四乙酸二鈉、0.02％至0.06％的巰基乙醇，0.3％至1.0％的氯化鈉、5％至15％的丙三醇。
5.根據(jù)權利要求1或2或3所述的從鮮蒜中提取蒜酶生產(chǎn)工藝，其特征在于將第二糊狀沉淀物放入冷凍干燥機進行干燥，使水分含量低于2.0％，得到凍干蒜酶，然后用氮氣或惰性氣體進行密閉保存。
6.根據(jù)權利要求4所述的從鮮蒜中提取蒜酶生產(chǎn)工藝，其特征在于將第二糊狀沉淀物放入冷凍干燥機進行干燥，使水分含量低于2.0％，得到凍干蒜酶，然后用氮氣或惰性氣體進行密閉保存。
7.根據(jù)權利要求1或2或3或6所述的從鮮蒜中提取蒜酶生產(chǎn)工藝，其特征在于分離所用設備采用冷凍密閉式漿渣自分離磨漿機、離心摔干機及低溫管式離心分離機。
8.根據(jù)權利要求4所述的從鮮蒜中提取蒜酶生產(chǎn)工藝，其特征在于分離所用設備采用冷凍密閉式漿渣自分離磨漿機、離心摔干機及低溫管式離心分離機。
9.根據(jù)權利要求5所述的從鮮蒜中提取蒜酶生產(chǎn)工藝，其特征在于分離所用設備采用冷凍密閉式漿渣自分離磨漿機或離心摔干機或低溫管式離心分離機。
全文摘要
一種從鮮蒜中提取蒜酶生產(chǎn)工藝，按以下步驟進行第一步加蒜酶提取液打漿分離出清液；第二步分步沉淀得到粗蒜酶；第三步經(jīng)透析脫鹽，調(diào)節(jié)等電點及冷凍干燥得到蒜酶。適宜于以鮮蒜為原料批量化生產(chǎn)藥用蒜酶。本發(fā)明所得蒜酶產(chǎn)品經(jīng)過SDS－凝膠電泳證明其具有較高的純度。依據(jù)與標準蛋白(C分子量14400～97400)比移值計算其蒜酶產(chǎn)品單聚體分子量為67000道爾頓。米氏常數(shù)K
文檔編號C12N9/88GK1424397SQ03100419
公開日2003年6月18日 申請日期2003年1月13日 優(yōu)先權日2003年1月13日
發(fā)明者陳堅, 王偉萍, 王軼睿, 茍萍 申請人:陳堅