專利名稱：納豆激酶的生產(chǎn)方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提出的采用納豆芽孢桿菌產(chǎn)生納豆激酶的生產(chǎn)方法及其用途屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及到高產(chǎn)菌株發(fā)酵和酶的生產(chǎn)方法。
納豆是一種營養(yǎng)豐富的優(yōu)質(zhì)發(fā)酵食品，它是利用納豆菌接種蒸煮過的大豆在適當(dāng)溫度下發(fā)酵得到的，在日本已做為傳統(tǒng)食品，并且納豆在日本民間被用來預(yù)防和治療心血管等疾病。1987年日本須見氏發(fā)現(xiàn)納豆中存在與血栓溶解酶相類似的酶，并命名為Nattokinase(納豆激酶)，以后他證實(shí)了納豆激酶經(jīng)食用到血液這樣長的時間也很穩(wěn)定，從此納豆激酶被廣泛關(guān)注。
日本專利JP6261744A(1994)中描述，采用中國生產(chǎn)大豆進(jìn)行固體發(fā)酵生產(chǎn)納豆激酶，其發(fā)酵條件為首先50℃、18小時，然后5℃、24小時。
日本專利JP6153977A(1994)中記載采用液體發(fā)酵方法生產(chǎn)納豆激酶，其發(fā)酵培養(yǎng)基組成為2％果糖、1.5％大豆蛋白胨、0.2％酵母浸出物、0.1％KH2PO4、0.3％K2HPO4、0.05％MgSO4·5H2O、0.02％CaCl2·2H2O，發(fā)酵溫度30℃、40小時。所述納豆激酶活性單位為0.42-1.48u/ml。大規(guī)模的分離純化采用丁基瓊脂糖凝膠4B(Butyl Sepharose 4B)、葡聚糖凝膠G-25(Sephadex G-25)和丙烯葡聚糖凝膠S-200HR(Sephacryl S-200HR)。
野生的納豆菌株和由此得到納豆激酶的一般生產(chǎn)方法不夠理想，主要是產(chǎn)率不高和不適于工業(yè)生產(chǎn)。
本發(fā)明的目的就是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出一種采用納豆芽孢桿菌X-501高產(chǎn)菌株進(jìn)行固體和液體發(fā)酵產(chǎn)生納豆激酶的高產(chǎn)方法。
本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案達(dá)到1.一種納豆芽孢桿菌，其特征在于本菌株確定為納豆芽孢桿菌(Bacillusnatto)X-501，該菌株保藏于北京的CGMCC，保藏號為0449。2.一種由權(quán)利要求1所述的納豆芽孢桿菌X-501培養(yǎng)產(chǎn)生納豆激酶的生產(chǎn)方法，其特征在于1)納豆芽孢桿菌X-501在大豆或大豆制品為主要培養(yǎng)基上進(jìn)行固體或液體發(fā)酵；2)固體發(fā)酵或液體發(fā)酵固體發(fā)酵采用水發(fā)黃豆破碎或不破碎，滅菌后直接進(jìn)行接種進(jìn)行發(fā)酵，豆餅粉、豆渣、脫脂大豆粉也可用做發(fā)酵原料；發(fā)酵時溫度控制為22-40℃，最佳溫度為36-38℃，相對濕度控制為80-95％，發(fā)酵周期為18-60小時；液體發(fā)酵采用豆乳做發(fā)酵基質(zhì)，可稀釋或不稀釋進(jìn)行發(fā)酵；利用大豆粉、豆餅粉、豆渣使用量為1-8％，最佳用量為2-5％；添加牛肉膏或玉米漿可以促進(jìn)納豆芽孢桿菌X-501對納豆激酶的分泌，牛肉膏使用量為0.2-2％，最佳為1-1.5％玉米漿使用量為0.5-1.5％，最佳為0.5-1.0％；發(fā)酵時溫度控制為22-40℃，最佳溫度為36-38℃，發(fā)酵周期18-48小時，pH值控制為6.8-7.0；試驗(yàn)時搖瓶培養(yǎng)條件500ml三角搖瓶，培養(yǎng)基裝量60-100ml，當(dāng)偏心距為2.54cm的旋轉(zhuǎn)搖床時，轉(zhuǎn)數(shù)250-350rpm，當(dāng)采用偏心距為5.0cm的旋轉(zhuǎn)搖床時，轉(zhuǎn)數(shù)為180-240rpm；生產(chǎn)時發(fā)酵罐培養(yǎng)條件通氣控制為1∶0.4-1∶1v/v/min，攪拌200-300rpm，罐溫36-38℃，罐壓0.03-0.05MPa；3)提取對于固體發(fā)酵，先用5-10倍量的0.1-0.15M的氯化鈉溶液在4-10℃下攪拌抽提1-2小時后先粗預(yù)濾，除去大顆粒發(fā)酵基質(zhì)，壓濾或離心去除菌體；濾液或上清液中加0.02-0.05％CaCl2，并在低溫下再進(jìn)行超濾濃縮20-50倍，加冷酒精至乙醇含量達(dá)75-80％，或加固體硫酸銨使飽和度逐漸達(dá)80％，以便納豆激酶沉淀下來；對于液體發(fā)酵，則直接進(jìn)行壓濾或離心除去菌體；濾液或上清液中加0.02-0.05％CaCl2，并在低溫下再進(jìn)行超濾濃縮20-50倍，加冷酒精至乙醇含量達(dá)75-80％，或加固體硫酸銨使飽和度逐漸達(dá)80％，以便納豆激酶沉淀下來；4)純化經(jīng)75％的酒精沉淀或固體硫酸銨沉淀出來的沉淀物用0.05M PH7.6的磷酸緩沖液溶解，加入固體硫酸銨逐漸達(dá)80％飽和度，高速離心，收集沉淀物。沉淀物用0.05M PH6.5磷酸緩沖液溶解并透析，在CM32離子交換柱上層析，收集活性組分。該組分進(jìn)行超濾濃縮，得到高濃度的酶液，再進(jìn)行SephacrylS-100HR凝膠柱層析，收集活性組分，該組分經(jīng)超濾濃縮透析而得到納豆激酶的純化產(chǎn)品。
3.一種如權(quán)利要求2所述方法培養(yǎng)的納豆激酶的用途，其特征在于，該納豆激酶沉淀物溶解脫鹽后，可直接與輔料豆粉、奶粉、豆奶粉、糊精混合調(diào)配至所需要求的酶活單位，經(jīng)冷凍干燥后制成納豆激酶膠囊或其他形式的保健食品；也可將納豆激酶沉淀物溶解脫鹽后直接進(jìn)行冷凍干燥，再用少量葡萄糖或乳糖調(diào)配至所要求的酶活單位制成保健食品添加劑。
4.一種如權(quán)利要求2所述方法培養(yǎng)的納豆激酶的用途，其特征在于，上述納豆激酶的純化產(chǎn)品經(jīng)冷凍干燥制成醫(yī)用注射針劑。
下面更詳細(xì)的說明本發(fā)明的技術(shù)方案本發(fā)明提出的納豆芽孢桿菌(Bacillus natto)X-501屬于納豆菌株，該菌株于2000年5月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱為CGMCC，保藏號為0449。
該菌種特征如下1.形態(tài)特征于30℃培養(yǎng)2-4天后，X-501菌體為短桿狀，不成鏈，直或直形0.6～0.8×1.1～1.5μm，能運(yùn)動，鞭毛側(cè)生，有芽孢，芽孢中生，不膨大，在一個孢子囊細(xì)胞中，孢子不多于一個；革蘭氏染色陽性；抗酸染色陰性。
2.培養(yǎng)特征菌株X-501在四種培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)3～5天后的結(jié)果見表1。
表1菌株X-501的培養(yǎng)特征
3.化學(xué)分類按Lechevalier薄板層析法進(jìn)行全細(xì)胞水解液分析的結(jié)果表明菌株X-501含有meso-DAP(二氨基庚二酸，Diaminopinelic acid)，甘氨酸；無特征性糖(糖型C)。
4.菌株X-501的生理生化特征見表2表2菌株X-501的生理生化特征
5穩(wěn)定性檢測5.1X-501菌株隔著平皿蓋在紫外光下照射72小時后，菌體生長良好，將其轉(zhuǎn)接第二、第三代，其活力良好，胞壁化學(xué)組分與參照菌株相同。
5.2生長溫度試驗(yàn)菌株X-501在不同溫度的生長情況見表3。
表3 菌株X-501在不同溫度的生長情況
5.3乙醇耐受力試驗(yàn)結(jié)果見表4。
表4 X-501菌株的乙醇耐受力
5.4酸堿性試驗(yàn)X-501菌株在不同pH下的生長情況見表5。
表5 X-501菌株在pH不同下的生長情況
5.5耐鹽實(shí)驗(yàn)X-501菌株在不同NaCl濃度下的生長情況見表6。
表6 X-501菌株在不同鹽濃度下的生長情況
本發(fā)明的納豆芽孢桿菌X-501的生產(chǎn)方法如下菌株X-501在大豆或大豆制品(包括大豆粉，豆餅粉，脫脂大豆粉，豆渣，豆乳等)為主要基質(zhì)的培養(yǎng)基上進(jìn)行固體或液體發(fā)酵。
發(fā)酵對于固體發(fā)酵可用水發(fā)黃豆經(jīng)破碎或不破碎，經(jīng)滅菌后，直接接種進(jìn)行發(fā)酵。豆餅粉、大豆粉、豆渣、脫脂大豆粉也可用作為發(fā)酵原料，發(fā)酵時溫度控制為22-40℃，最適溫度36-38℃相對濕度控制為80-95％，發(fā)酵周期為18-60小時。
對于液體發(fā)酵還可用豆乳作為發(fā)酵基質(zhì)可經(jīng)稀釋或不稀釋進(jìn)行發(fā)酵。利用大豆粉、豆餅粉、豆渣等使用量為1-8％，最佳用量為2-5％。液體發(fā)酵時添加牛肉膏或玉米漿可以促進(jìn)納豆菌對納豆激酶的分泌，玉米漿使用量0.5-1.5％，最佳用量0.5-1.0％；1.0％；牛肉膏0.5-2％，最適用量1-1.5％。液體發(fā)酵時溫度可控制在22-40℃，最適溫度36-38℃，發(fā)酵周期18-48小時。PH值可控制在6.8-7.0。
試驗(yàn)時搖瓶培養(yǎng)條件500ml三角搖瓶，培養(yǎng)基裝量60-100ml，當(dāng)采用偏心距為2.54cm的旋轉(zhuǎn)搖床時，轉(zhuǎn)數(shù)250-350rpm，當(dāng)采用偏心距為5.0cm的旋轉(zhuǎn)搖床時，轉(zhuǎn)數(shù)為180-240rpm；生產(chǎn)時發(fā)酵罐培養(yǎng)條件通氣控制為1∶0.4-1∶1v/v/min，攪拌200-300rpm，罐溫36-38℃，罐壓0.03-0.05MPa；納豆激酶的提取對于固體發(fā)酵可先用5-10倍量的0.1-0.15M的氯化鈉液在4-10℃下攪拌抽提1-2小時后先粗預(yù)濾，除去大顆粒發(fā)酵基質(zhì)，壓濾或離心去除菌體。對于液體發(fā)酵則直接進(jìn)行壓濾或離心除去菌體。濾液或上清液中加0.02-0.05％CaCl2，并在低溫下再進(jìn)行超濾濃縮20-50倍，加冷酒精至乙醇含量達(dá)75-80％，或加固體硫酸銨使飽和度逐漸達(dá)80％，以使納豆激酶沉淀下來。
對于液體發(fā)酵，則直接進(jìn)行壓濾或離心除去菌體，濾液或上清液中加0.02-0.05％CaCl2，并在低溫下再進(jìn)行超濾濃縮20-50倍，加冷酒精至乙醇含量達(dá)75-80％，或加固體硫酸銨使飽和度逐漸達(dá)80％，以使納豆激酶沉淀下來。納豆激酶的純化經(jīng)75％酒精沉淀或固體硫酸銨沉淀出來的沉淀物用0.05M PH7.6磷酸緩沖液溶解，加入固體硫酸銨逐漸達(dá)80％飽和度。高速離心，收集沉淀物。沉淀物用0.05M PH6.5磷酸緩沖液溶解并透析，在CM32離子交換柱上層析，收集活性組分。該組分進(jìn)行超濾濃縮，得到高濃度的酶液，再進(jìn)行Sephacryl S-100HR凝膠柱層析，收集活性組分，該組分經(jīng)超濾濃縮透析而得到納豆激酶的純化產(chǎn)品。納豆激酶的用途納豆激酶沉淀物溶解脫鹽后可直接與其他輔料(豆粉、奶粉、豆奶粉及糊精等)混合調(diào)配至所要求的酶活單位，經(jīng)冷凍干燥后制成納豆激酶膠囊或其它形式的保健食品，也可將納豆激酶沉淀物脫鹽后直接進(jìn)行冷凍干燥，再用少量葡萄糖或乳糖調(diào)配至所要求的酶活單位制成保健食品。
上述納豆激酶的純化產(chǎn)品經(jīng)凍動干燥即成高活性的納豆激酶成品，利用該成品可制成醫(yī)用注射針劑。
經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)納豆激酶實(shí)際上是并無激活血漿中纖溶酶原的作用，納豆激酶可直接降解纖維蛋白及纖維蛋白原?？诜{豆激酶不但可以經(jīng)腸道吸收進(jìn)入血液循環(huán)直接作用血栓，還可誘導(dǎo)肝臟或血管內(nèi)皮產(chǎn)生TPA(組織型纖溶酶原激活因子)使生物體自身纖溶酶系統(tǒng)活化，從而溫和持續(xù)地提高血液的纖溶活性。
活性單位定義——納豆激酶的溶纖活性可采用小球下降法來進(jìn)行測定。在該測定體系下(見附錄I)我們規(guī)定小球從凝塊頂部下降至凝塊底部需300秒(5分鐘)時的酶量為1個纖溶單位。在該測定體系中，如果加入的酶量在1-2個溶纖單位時，小球下降的時間與酶的活性單位呈一直線關(guān)系。因此可以通過一個已知單位標(biāo)準(zhǔn)酶來測定樣品中的酶活力。
采用納豆芽孢桿菌X-501在以大豆/大豆粉為主要原料的發(fā)酵生產(chǎn)中可以獲得較野生菌株高十幾倍的酶活，液體發(fā)酵最高酶活達(dá)9.1u/ml。在固體發(fā)酵中可達(dá)22.9u/g大豆。本發(fā)明中采用的生產(chǎn)原料簡單，價格便宜，并且工藝參數(shù)合理。因此，可以在最短的生產(chǎn)時間內(nèi)獲得較高的產(chǎn)酶量。實(shí)施例1500ml三角瓶加入3.2g大豆粉，1.2g牛肉膏，80ml自來水，調(diào)pH 6.9，121℃滅菌15min，接入105納豆芽孢桿菌X-501孢子液0.8ml.。在偏心距2.54cm旋轉(zhuǎn)式搖瓶機(jī)中，旋轉(zhuǎn)速度300rpm，38℃恒溫培養(yǎng)28小時測得酶活7.6u/ml。實(shí)施例2500ml三角瓶加入4.0g生大豆餅粉，1.5g牛肉膏，100ml自來水，調(diào)pH6.9，121℃滅菌15min，接入105納豆芽孢桿菌X-501孢子液1.0ml，在偏心距2.54cm旋轉(zhuǎn)式搖瓶機(jī)中，旋轉(zhuǎn)速度300rpm，38℃恒溫培養(yǎng)30小時測得酶活2.5u/ml。實(shí)施例3100g經(jīng)水浸泡過夜的大豆，裝入一只φ16cm平皿中(記作A)，另取100g同樣處理的大豆，經(jīng)碾碎放入另一個φ16cm平皿中(記作B)，121℃滅菌20min，冷卻后各接入105納豆芽孢桿菌X-501孢子懸液2.0ml。攪拌后置37℃恒溫室，控制濕度90％，培養(yǎng)24小時。從A、B兩平皿中各取1.0g，分別溶于5ml生理鹽水中，浸提過夜，其溶纖活力分別為每克培養(yǎng)物A22.9u和B12.1u。實(shí)施例4液體發(fā)酵工藝將一支納豆芽孢桿菌X-501活化斜面菌種用10ml無菌水洗脫后接入300L發(fā)酵罐中(培養(yǎng)基裝量為250L)。發(fā)酵培養(yǎng)基組分為大豆粉4％，牛肉膏1.5％，自來水補(bǔ)足體積至250L，121℃滅菌30分鐘，滅菌后PH為6.7-7.0，發(fā)酵溫度為38℃，攪拌速度250rpm，通氣量為1∶0.7v/v/m，發(fā)酵時間為30小時，發(fā)酵單位最終為8.5u/ml。實(shí)施例5提取工藝，納豆激酶膠囊制取250L發(fā)酵液→離心除去菌體→上清加CaCl20.02％～0.05％→離心得上清液→上清超濾至10L(濃縮25倍)→加乙醇至乙醇含量為75％，→4℃存放8小時→離心得沉淀→沉淀物進(jìn)行抽濾至干→加少量生理鹽水溶解添加輔料(豆奶粉)→冷凍干燥成粉狀→裝膠囊。酶活總收率43％。實(shí)施例6純化工藝，納豆激酶醫(yī)用注射針劑的制取將由300L發(fā)酵罐上得到的一批250L發(fā)酵液(發(fā)酵單位9.1u/ml)按實(shí)施例5提取工藝提取得乙醇沉淀物溶解后，再經(jīng)硫酸銨沉淀，收集沉淀物再進(jìn)行透析脫鹽。透析后的酶液先經(jīng)羧甲基纖維素CM32陽離子交換柱層析，收集高活性組分，經(jīng)超濾液濃縮至小體積。再經(jīng)SephacrylS-100HR凝膠柱層析，收集高活性組分，經(jīng)超濾濃縮后進(jìn)行冷凍干燥，制成醫(yī)用注射針劑。
權(quán)利要求
1.一種納豆芽孢桿菌，其特征在于本菌株確定為納豆芽孢桿菌(Bacillus natto)X-501，該菌株保藏于北京的CGMCC，保號為0449。
2.一種由權(quán)利要求1所述的納豆芽孢桿菌X-501培養(yǎng)產(chǎn)生納豆激酶的生產(chǎn)方法，其特征在于1) 納豆芽孢桿菌X-501在大豆或大豆制品為主要培養(yǎng)基上進(jìn)行固體或液體發(fā)酵；2) 固體發(fā)酵或液體發(fā)酵固體發(fā)酵采用水發(fā)黃豆破碎或不破碎，滅菌后直接接種進(jìn)行發(fā)酵，豆餅粉、豆渣、脫脂大豆粉也可用做發(fā)酵原料；發(fā)酵時溫度控制為22-40℃，最佳溫度為36-38℃，相對濕度控制為80-95％，發(fā)酵周期為18-60小時；液體發(fā)酵采用豆乳做發(fā)酵基質(zhì)，可稀釋或不稀釋進(jìn)行發(fā)酵；利用大豆粉、豆餅粉、豆渣使用量為1-8％，最佳用量為2-5％；添加牛肉膏或玉米漿可以促進(jìn)納豆芽孢桿菌X-501對納豆激酶的分泌，牛肉膏使用量為0.2-2％，最佳為1-1.5％，玉米漿使用量為0.5-1.5％，最佳為0.5-1.0％發(fā)酵時溫度控制為22-40℃，最佳溫度為36-38℃，發(fā)酵周期18-48小時，pH值控制為6.8-7.0；試驗(yàn)時搖瓶培養(yǎng)條件500ml三角搖瓶，培養(yǎng)基裝量60-100ml，當(dāng)偏心距為2.54cm的旋轉(zhuǎn)搖床時，轉(zhuǎn)數(shù)250-350rpm，當(dāng)采用偏心距為5.0cm的旋轉(zhuǎn)搖床時，轉(zhuǎn)數(shù)為180-240rpm；生產(chǎn)時發(fā)酵罐培養(yǎng)條件通氣控制為1∶0.4-1∶1v/v/min，攪拌200-300rpm，罐溫36-38℃，罐壓0.03-0.05MPa；3)提取對于固體發(fā)酵，先用5-10倍量的0.1-0.15M的氯化鈉溶液在4-10℃下攪拌抽提1-2小時后先粗預(yù)濾，除去大顆粒發(fā)酵基質(zhì)，壓濾或離心去除菌體；濾液或上清液中加0.02-0.05％CaCl2，并在低溫下再進(jìn)行超濾濃縮20-50倍，加冷酒精至乙醇含量達(dá)75-80％，或加固體硫酸銨使飽和度逐漸達(dá)80％，以便納豆激酶沉淀下來；對于液體發(fā)酵，則直接進(jìn)行壓濾或離心除去菌體；濾液或上清液中加0.02-0.05％CaCl2，并在低溫下再進(jìn)行超濾濃縮20-50倍，加冷酒精至乙醇含量達(dá)75-80％，或加固體硫酸銨使飽和度逐漸達(dá)80％，以便納豆激酶沉淀下來；4)純化經(jīng)75％的酒精沉淀或固體硫酸銨沉淀出來的沉淀物用0.05M PH7.6的磷酸緩沖液溶解，加入固體硫酸銨逐漸達(dá)80％飽和度，高速離心，收集沉淀物。沉淀物用0.05M PH6.5磷酸緩沖液溶解并透析，在CM32離子交換柱上層析，收集活性組分。該組分進(jìn)行超濾濃縮，得到高濃度的酶液，再進(jìn)行Sephacryl S-100HR凝膠柱層析，收集活性組分，該組分經(jīng)超濾濃縮透析而得到納豆激酶的純化產(chǎn)品。
3.一種如權(quán)利要求2所述方法培養(yǎng)的納豆激酶的用途，其特征在于，該納豆激酶沉淀物溶解脫鹽后，可直接與輔料豆粉、奶粉、豆奶粉、糊精混合調(diào)配至所需要求的酶活單位，經(jīng)冷凍干燥后制 成納豆激酶膠囊或其他形式的保健食品；也可將納豆激酶沉淀物 溶解脫鹽后直接進(jìn)行冷凍干燥，再用少量葡萄糖或乳糖調(diào)配至所要求的酶活單位制成保健食品添加劑。
4.一種如權(quán)利要求2所述方法培養(yǎng)的納豆激酶的用途，其特征在于，上述納豆激酶的純化產(chǎn)品經(jīng)冷凍干燥制成醫(yī)用注射針劑。
全文摘要
本發(fā)明提出的采用納豆芽孢桿菌產(chǎn)生納豆激酶的生產(chǎn)方法及用途屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明要解決野生納豆菌種和由此得到的納豆激酶一般生產(chǎn)方法不夠理想的技術(shù)問題。提出的納豆芽孢桿菌(Bacillus natto)X－501,它保藏于CGMCC,保藏號為0449,納豆激酶的生產(chǎn)方法包括在大豆等培養(yǎng)基上按規(guī)定規(guī)范利用固體或液體發(fā)酵、提取和純化工藝等。本發(fā)明的納豆激酶經(jīng)處理后可制成膠囊、保健食品及保健食品添加劑、醫(yī)用注射針劑。
文檔編號C12N9/48GK1273274SQ00107589
公開日2000年11月15日 申請日期2000年5月22日 優(yōu)先權(quán)日2000年5月22日
發(fā)明者章震興, 孫狄 申請人:北京市孚曼生物技術(shù)研究所