專利名稱：生物固相酶催化合成l-茶氨酸的生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物固相酶催化合成L-茶氨酸的生產(chǎn)工藝，屬于生物合成技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
通用名稱L_茶氨酸，英文名=L-Theanine ； 中文化學(xué)名(S)-2-氨基-4-(N-乙級(jí)甲?；?丁酸；
英文化學(xué)名(S) -2-amino-4- (N-ethylcarbamoyl) butanoic acid ； CA 物質(zhì)代號(hào)=CAS:3081-61-6 ； 結(jié)構(gòu)式
權(quán)利要求
1.一種生物固相酶催化合成L-茶氨酸的生產(chǎn)工藝，包括如下步驟和工藝條件(1)生物合成將底物與固相酶催化合成生成L-茶氨酸溶液，再通過(guò)離心與生物固相酶分離，所述底物為谷氨酸鈉、六水氯化鎂、六偏磷酸鈉、鹽酸乙胺及三磷酸腺苷，底物摩爾濃度比例為谷氨酸鈉10 lOOmmorl，六水氯化鎂10 IOOmmorl，六偏磷酸鈉10 lOOmmorl，鹽酸乙胺10 IOOmmorl及三磷酸腺苷10 lOOmmorl，底物與固相酶的配比為 Imorl谷氨酸鈉配100 1000KU生物效價(jià)單位的固相酶；(2)分離純化生成的L-茶氨酸溶液經(jīng)過(guò)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，除去反應(yīng)液中的陰離子，再分步洗脫除去陽(yáng)離子，最后稀氨水洗脫置換游離出L-茶氨酸；(3)脫色濃縮茶氨酸水溶液活性炭脫色后，趕氨，真空薄膜濃縮得純L-茶氨酸濃溶液；(4)結(jié)晶干燥向L-茶氨酸濃溶液加入95%酒精，于0 40°C攪拌，析出L-茶氨酸白色沉淀結(jié)晶，離心分離，真空干燥得白色L-茶氨酸粉末。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)工藝，其特征在于，所述的合成的底物溶液PH值6.5 10。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)工藝，其特征在于，所述的生物合成反應(yīng)溫度25 55 °C。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)工藝，其特征在于，所述的L-茶氨酸濃溶液與95%酒精的體積比為1:5 10。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)工藝，其特征在于所述固相酶由如下工藝制備(A)茶氨酸合成酶的基因克隆及表達(dá)根據(jù)專性親甲基醇菌 Methylovorus mays No. 9 (Biosci. Biotechnol. Biochem. 72 (1)，101-109, 2008)的茶氨酸合成酶的基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物 5’-GAAGGAGATCATATGAAGTCACTG-3‘和 5’-CTAGGATCCTTAGTAAAACTGTACGTAG CGATTGATTTCC -3，，兩對(duì)引物各含有內(nèi)切酶NdeI和BamHI序列，根據(jù)Bio-Rad公司iProof多聚酶的說(shuō)明書(shū)擴(kuò)增基因，其中DNA模板為專性親甲基醇菌Methylovorus mays No. 9的基因組DNA，用內(nèi)切酶NdeI和BamHI消化擴(kuò)增片段，然后連接到載體pREST-lac上，得到茶氨酸合成酶表達(dá)型質(zhì)粒 pREST-lac-GS ；該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3)菌種中表達(dá)，將轉(zhuǎn)化的菌落轉(zhuǎn)移到50毫升LB培養(yǎng)液，成份為16克胰蛋白胨，10克酵母粉，5克氯化鈉，37攝氏度振蕩培養(yǎng)16小時(shí)，離心收集細(xì)胞，大生產(chǎn)時(shí)，將發(fā)酵體積擴(kuò)大至噸級(jí)規(guī)模，管式離心機(jī)連續(xù)離心收集菌體；(B)酶的純化與固定化取菌體細(xì)胞以4倍體積的磷酸緩沖液(20mM，pH7. 4)懸浮，800bar高壓破碎，加5M磷酸鹽溶液(PH8. 0)至終濃度為1. 2M，緩慢攪拌下加適量1%聚丙烯酰胺及氯化鈣溶液使結(jié)絮，板框過(guò)濾或高速離心去渣，清液為酶粗提物溶液，測(cè)定蛋白含量；以每15mg蛋白/克載體的量向酶溶液加入環(huán)氧型固相酶載體，室溫緩慢攪拌M小時(shí)， 棄上清，所得固相酶分別以20mM磷酸鹽緩沖液(pH7. 4)、含IM氯化鈉的20mM磷酸鹽緩沖液(pH7. 4)及20mM磷酸鹽緩沖液(pH7. 4)洗滌，最后，測(cè)定固相酶的活性。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物固相酶催化合成L-茶氨酸的生產(chǎn)工藝，屬于生物合成技術(shù)領(lǐng)域。以谷氨酸鈉、六水氯化鎂、六偏磷酸鈉、鹽酸乙胺及三磷酸腺苷為原料，生物固相酶催化合成L-茶氨酸。包括以下工藝步驟(1)將底物與固相酶催化合成生成L-茶氨酸，再通過(guò)離心分離生物固相酶與反應(yīng)液；(2)反應(yīng)液經(jīng)過(guò)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，除去反應(yīng)液中的陰陽(yáng)離子，生成純化L-茶氨酸；(3)L-茶氨酸水溶液活性炭脫色后，真空薄膜濃縮得L-茶氨酸濃溶液；(4)L-茶氨酸濃溶液加入95%酒精，析出L-茶氨酸白色沉淀結(jié)晶，離心分離，真空干燥得白色L-茶氨酸粉末。具有工藝反應(yīng)專一、產(chǎn)率高、純度好、周期短、能耗低等優(yōu)點(diǎn)，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/60GK102533886SQ20121000662
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月11日
發(fā)明者周丙午, 周興華, 范永軍 申請(qǐng)人:廣東樂(lè)爾康生物科技股份有限公司