專利名稱：一種制備核酸探針庫(kù)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中制備微陣列探針庫(kù)的方法，特別涉及制備核酸探針庫(kù)的方法。
背景技術(shù)：
“生物芯片”的概念自上個(gè)世紀(jì)九十年代被提出后，生物芯片技術(shù)以其集成化、微型化、易于自動(dòng)化等特點(diǎn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超越了許多傳統(tǒng)的生物技術(shù)，并以其巨大的應(yīng)用價(jià)值和市場(chǎng)潛力，吸引了世界范圍的廣泛興趣，在短短的10年時(shí)間內(nèi)獲得了飛躍性的發(fā)展和完善，基于生物芯片的新技術(shù)、新方法層出不窮。目前，生物芯片已由最初的微陣列芯片，基因芯片發(fā)展出了許多紛繁復(fù)雜的門類，其中包括蛋白質(zhì)芯片，抗體微陣列，神經(jīng)元芯片，組織芯片，毛細(xì)管芯片以及芯片實(shí)驗(yàn)室等。在技術(shù)本身不斷完善的同時(shí)，生物芯片的應(yīng)用領(lǐng)域也在不斷地拓寬，除傳統(tǒng)的表達(dá)分析，突變檢測(cè)之外，生物芯片在生命科學(xué)以及與生命科學(xué)相關(guān)的各個(gè)領(lǐng)域亦被廣泛應(yīng)用(Lockhart DJ，et al.NatBiotechnol 1996；141675-1680；Hacia JG，et al.Nat Genet 1996；14441-447；Wodicka L，et al.Nat Biotechnol 1997；151359-1367；Hacia JG.Nat Genet 1999；2142-47；Schena M，et al.Science 1995；270467-470)。
發(fā)展得最為成熟、應(yīng)用最為廣泛的是用于表達(dá)譜變化分析的微陣列芯片。探針的制備是微陣列芯片中的一個(gè)關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)。常規(guī)的表達(dá)譜芯片中的探針一般為雙鏈PCR產(chǎn)物。這種形式探針的獲得方式如下以探針克隆為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖電泳檢測(cè)擴(kuò)增效果，純化濃縮PCR產(chǎn)物，純化的方式一般是試劑盒或者簡(jiǎn)單的乙醇沉淀(Hegde P，et al.Biotechniques 2000；29548-4，556.)，也可以不純化，直接濃縮而用于點(diǎn)樣(Diehl F，et al. Nucl Acids Res 2002；30e79.)。這種方式的缺點(diǎn)是以含有探針克隆的工程菌為起始，需要經(jīng)常性的動(dòng)用原始的克隆庫(kù)，反復(fù)的凍融易導(dǎo)致克隆菌的死亡，而且在實(shí)際的操作中容易導(dǎo)致不同的克隆菌相互之間的交叉污染，克隆菌作為原始的保藏物，一旦死亡或者污染，會(huì)造成很大、甚至不可挽回的損失。另外克隆菌作為活的生物體，保藏條件較為苛刻，對(duì)環(huán)境變化的抗性較弱。在實(shí)際操作中，尤其是在對(duì)外提供服務(wù)時(shí)，需要對(duì)克隆進(jìn)行反復(fù)測(cè)序以確保其準(zhǔn)確性，增加了操作的復(fù)雜度和費(fèi)用。為了克服傳統(tǒng)生物芯片探針制備方式上的問題，有研究者用合成的70mer長(zhǎng)的單鏈探針代替常規(guī)的PCR產(chǎn)物而作為探針(Fisher MA，et al.J Bacteriol2002；1844025-32.；Dudley AM，et al.Proc Natl Acad Sci USA 2002；997554-59.)。這種探針庫(kù)的優(yōu)點(diǎn)是序列明確，探針的濃度明確，且不同探針間的濃度一致，較容易保存，引入交叉污染的概率較小。合成的長(zhǎng)的單鏈探針已經(jīng)可以從專業(yè)公司獲得(Qiagenoperon)。這種探針制備方式的缺點(diǎn)在于一次性購(gòu)置成本高昂；另外，這種探針?biāo)捎玫氖敲鞔_的序列，只能用于分析已知基因，而不能夠分析或者發(fā)現(xiàn)未知基因；再者，探針庫(kù)本身不能夠復(fù)制，一旦用完，需要重新購(gòu)買。這種探針庫(kù)在目前并沒有得到廣泛的應(yīng)用，在已有的應(yīng)用中，對(duì)于其效果的評(píng)價(jià)也是好壞參半。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種廉價(jià)、批量制備核酸探針庫(kù)的方法。
一種制備核酸探針庫(kù)的方法，是以在5’帶有與克隆的探針序列、載體序列以及培養(yǎng)菌的基因序列無(wú)關(guān)的通用序列，3’帶有探針擴(kuò)增序列的寡核苷酸為引物，以含有探針克隆的培養(yǎng)菌或者質(zhì)粒為模板進(jìn)行擴(kuò)增，得到一級(jí)探針庫(kù)；然后以通用序列為引物，一級(jí)探針庫(kù)為模板進(jìn)行擴(kuò)增，得到二級(jí)探針庫(kù)；以此類推，以探針擴(kuò)增序列為引物，以前面得到的探針庫(kù)為模板進(jìn)行擴(kuò)增，獲得核酸探針庫(kù)。
其中經(jīng)常應(yīng)用的是，得到二級(jí)探針庫(kù)后，以探針擴(kuò)增序列為引物，一級(jí)探針庫(kù)或二級(jí)探針庫(kù)為模板進(jìn)行擴(kuò)增，獲得核酸探針庫(kù)。
在本發(fā)明的方法中，所述一級(jí)探針庫(kù)制備時(shí)的通用序列以及探針擴(kuò)增序列的引物在環(huán)境溫度低于PCR擴(kuò)增的退火溫度時(shí)為發(fā)卡結(jié)構(gòu)。所述發(fā)卡結(jié)構(gòu)是在通用序列的5’端帶有4到10個(gè)堿基長(zhǎng)的序列，該序列與從3’端開始的與其等長(zhǎng)的序列完全互補(bǔ)。
為了使擴(kuò)增的效果更好，所述通用序列與要擴(kuò)增的探針庫(kù)所對(duì)應(yīng)的物種的基因序列、探針庫(kù)所處的載體的序列以及載體所處的工程菌的序列不同源。
在本發(fā)明的方法中，所述擴(kuò)增的產(chǎn)物應(yīng)經(jīng)純化、序列測(cè)定和稀釋后待用。所述探針庫(kù)制備時(shí)的稀釋倍數(shù)一般為10到100,000倍。所述探針庫(kù)制備時(shí)的純化方式為凝膠回收純化，高效液相色譜純化或毛細(xì)管電泳純化。
所述探針庫(kù)的保藏條件之一為冷凍干燥后置于室溫避光保存或者-80℃至-20℃冷凍保存。保藏條件之二為溶于pH為6-8的去離子水或pH為7-9的TE緩沖液后置于-80℃至-20℃保存。
本發(fā)明的原理及工作流程如圖1、圖2所示，圖1中，a，模板；b，在室溫下呈發(fā)卡結(jié)構(gòu)的發(fā)卡引物；c，通用引物；d，常規(guī)引物；以在5’帶有與克隆的探針序列、載體序列以及培養(yǎng)菌的基因序列無(wú)關(guān)的通用序列c，3’帶有探針擴(kuò)增序列d的寡核苷酸為引物，以含有探針克隆的菌培養(yǎng)或者質(zhì)粒為模板a進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)純化，序列測(cè)定和適當(dāng)稀釋后成為一級(jí)探針庫(kù)。然后以通用序列為引物，一級(jí)探針庫(kù)為模板進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)純化和適當(dāng)稀釋后成為二級(jí)探針庫(kù)。然后以探針擴(kuò)增序列為引物，一級(jí)探針庫(kù)或二級(jí)探針庫(kù)為模板進(jìn)行擴(kuò)增，并依此類推獲得制備表達(dá)譜芯片所需要的核酸探針。
本發(fā)明方法綜合了傳統(tǒng)探針制備以及合成70mer探針的優(yōu)點(diǎn)。通過嚴(yán)格的前期處理(高保真擴(kuò)增，膠回收純化及序列測(cè)定)后，可以得到與合成的70mer探針質(zhì)量相當(dāng)?shù)腜CR產(chǎn)物探針；探針庫(kù)本身可以通過PCR產(chǎn)物而大量復(fù)制，因而極大地降低了對(duì)原始克隆庫(kù)的依賴，同時(shí)大大的降低了庫(kù)的成本?？梢耘?1000～10,000倍于常規(guī)方式或者106～108倍于常規(guī)方式)、廉價(jià)地制作微陣列探針庫(kù)，所制備的探針庫(kù)以純化的PCR核酸產(chǎn)物的稀釋物形式存在，有利于保存，對(duì)意外情況的抗打擊能力較強(qiáng)(例如冰箱臨時(shí)斷電)，不會(huì)發(fā)生象菌種死掉的情況。探針庫(kù)是純化的核酸，所以擴(kuò)增條件比菌種和質(zhì)粒更容易控制，基本不會(huì)有非特異擴(kuò)增，用于點(diǎn)樣的擴(kuò)增產(chǎn)物的純化也可以較現(xiàn)在的常規(guī)方式簡(jiǎn)單。因?yàn)榭梢猿楦杀４?，輸送起?lái)極其方便。本發(fā)明的方法可以用于血液相關(guān)病毒快速檢測(cè)芯片，進(jìn)一步擴(kuò)大后可以用于常規(guī)的表達(dá)譜芯片，對(duì)于大批量制備表達(dá)譜芯片和高通量藥物篩選芯片的探針庫(kù)具有重要意義。


圖1為本發(fā)明的原理圖。
圖2為本發(fā)明的操作流程圖。
圖3為制備人基因微陣列探針的電泳檢測(cè)圖譜。
圖4為制備感染性病原芯片探針的電泳檢測(cè)圖譜。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1制備人類基因克隆探針庫(kù)1、人類基因探針克隆從生物芯片北京國(guó)家工程研究中心的人類基因克隆庫(kù)中隨機(jī)挑選了三個(gè)不同長(zhǎng)度的克隆175C1，175D3，175A5(生物芯片北京國(guó)家工程研究中心統(tǒng)一編號(hào))，其所包含的人類基因克隆的長(zhǎng)度分別為490bp，750bp和1000bp，從長(zhǎng)度上基本覆蓋全部的克隆。這些克隆將以兩種不同的形式作為表達(dá)譜芯片探針制備的模板。第一種形式為保存的工程菌培養(yǎng)物，第二種形式為堿裂解法制備的質(zhì)粒。
2、引物常規(guī)引物上游引物5’CTG CAA GGC GAT TAA GTT GGG TAA C 3’；下游引物5’GTG AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGA AAC AGC 3’；通用引物上游引物5’TCA CTT GCT TCC GTT GAG G 3’；下游引物5’GGT TTC GGA TGT TAC AGC GT 3’；
發(fā)卡引物上游引物5’GTTA CCTCACTTGCTTCCGTTGAGG CTG CAA GGC GAT TAA GTTGGG TAA C3’；下游引物5’GCTGTTGGTTTCGGATGTTACAGCGT GTG AGC GGA TAA CAATTT CAC ACA GGAAAC AGC3’。發(fā)卡引物的下劃線部分為反向互補(bǔ)序列，粗體部分為常規(guī)引物序列。
3、PCR體系及熱循環(huán)采用天為時(shí)代的便捷PCR反應(yīng)系列(2×Pfu master mix)。PCR反應(yīng)系中的天為時(shí)代的Pfu預(yù)混合物的終濃度為1×，上下游引物的終濃度均為0.5μM。模板為菌培養(yǎng)或者純化的質(zhì)粒，如果是菌培養(yǎng)，則加入量為2μL，質(zhì)粒則為30ng。反應(yīng)體系總體積為50μL。熱循環(huán)條件為預(yù)變性94℃3分鐘；主循環(huán)94℃30秒，55℃30秒，72℃1分鐘，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10分鐘，4℃保持。PCR反應(yīng)在MJ的PTC-200熱循環(huán)儀上進(jìn)行。
4、電泳體系采用1×TBE作為電泳緩沖液，瓊脂糖凝膠的濃度為1.7％，電泳在EmbiTec Runone電泳儀上進(jìn)行，施加100V電壓，電泳時(shí)間為30分鐘。分子量參照為TaKaRa的DL2000(6個(gè)條帶的大小從小到大依次為100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp和2000bp)。分子量參照的上樣量為5μL，PCR產(chǎn)物的上樣量為3μL。除非特別說明，實(shí)驗(yàn)所采用的均為同一電泳體系。
5、制備一級(jí)探針庫(kù)采用發(fā)卡引物，分別以菌培養(yǎng)物和純化的質(zhì)粒為模板進(jìn)行高保真擴(kuò)增。PCR體系及熱循環(huán)程序如第3步所述。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，電泳體系如第4步所述。對(duì)以質(zhì)粒為模板的高保真擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠回收純化，電泳檢測(cè)純化結(jié)果。用pH值中性的無(wú)菌去離子水1,000倍稀釋純化產(chǎn)物獲得一級(jí)探針庫(kù)。實(shí)驗(yàn)中設(shè)置了常規(guī)引物擴(kuò)增參照，其他條件同發(fā)卡引物擴(kuò)增。
6、制備二級(jí)探針庫(kù)采用通用引物，以一級(jí)探針庫(kù)為模板進(jìn)行高保真擴(kuò)增。PCR體系及熱循環(huán)程序如第3步所述。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，電泳體系如第4步所述。不對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，直接用pH值中性的無(wú)菌去離子水1,000倍稀釋純化產(chǎn)物獲得二級(jí)探針庫(kù)。
7、制備生物芯片點(diǎn)樣用探針采用常規(guī)引物，分別以一級(jí)探針庫(kù)和二級(jí)探針庫(kù)為模板進(jìn)行擴(kuò)增。PCR體系及熱循環(huán)程序如第3步所述。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，電泳體系如第4步所述。電泳檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，圖中1、4175C1，490bp；2、5175D3，750bp；3、6175A5，1000bp；1-6均采用常規(guī)引物進(jìn)行擴(kuò)增；1-3的模板為一級(jí)庫(kù)，4-6的模板為二級(jí)庫(kù)。從圖中可以看出，以一級(jí)探針庫(kù)和二級(jí)探針庫(kù)為模板均可進(jìn)行有效擴(kuò)增，能以較高的效率獲得特異的探針?？蓪?duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行濃縮或者不濃縮而用于點(diǎn)樣制備微陣列。
實(shí)施例2、制備臨床感染性疾病病原克隆探針庫(kù)1、臨床感染性疾病病原探針克隆從生物芯片北京國(guó)家工程研究中心的臨床感染性疾病病原克隆庫(kù)中挑選了四個(gè)不同長(zhǎng)度的克隆pTP205，pHCV244，pHIV309和pHBV538，其所包含的臨床感染性疾病病原克隆的長(zhǎng)度分別為205bp，244bp，309bp和538bp。這些克隆對(duì)應(yīng)于四種不同的病原體TP(梅毒螺旋體)，HCV(丙型肝炎病毒)，HIV(愛滋病病毒)以及HBV(乙型肝炎病毒)。這些克隆將以質(zhì)粒的形式作為芯片探針制備的模板。
2、引物常規(guī)引物梅毒螺旋體上游引物5’AAC ACG ATC CGC TAC GAC TAC TAC 3’，下游引物5’CCC TAT ACC CGT TCG CAA TCA AAG 3’；丙型肝炎病毒上游引物5’CTC GCA AGC ACC CTA TCA GGC AGT 3’，下游引物5’GCA GAA AGC GTC TAG CCA TGG CGT 3’；艾滋病病毒上游引物5’TGG GAA GTT CAA TTA GGA ATA CCA C 3’，下游引物5’TCC TAC ATA CAA ATC ATC CAT GTA TTG 3’乙型肝炎病毒上游引物5’GTT CAA GCC TCC AAG CTG TG 3’，下游引物5’CTG CGA GGC GAG GGA GTT CT 3’。
通用引物上游引物5’TCA CTT GCT TCC GTT GAG G 3’，下游引物5’GGT TTC GGA TGT TAC AGC GT 3’發(fā)卡引物(下劃線部分為反向互補(bǔ)序列，粗體部分為常規(guī)引物序列)梅毒螺旋體上游引物5’GTAGTAGTTCACTTGCTTCCGTTGAGG AAC ACGATC CGC TAC GAC TAC TAC3’，下游引物5’CTTTGATTGGTTTCGGATGTTACAGCGT CCC TATACC CGT TCG CAA TCA AAG3’；丙型肝炎病毒上游引物5’CTGCCTGTCACTTGCTTCCGTTGAGG CTC GCAAGC ACC CTA TCA GGC AGT3’，下游引物5’GCCATGGGTTTCGGATGTTACAGCGT GCA GAA AGCGTC TAG CCATGG CGT3’；艾滋病病毒上游引物5’GTGGTATTTCACTTGCTTCCGTTGAGG TGG GAA GTTCAA TTA GGA ATA CCA C3’，下游引物5’CAATACATGGTTTCGGATGTTACAGCGT TCC TAC ATACAA ATC ATC CAT GTA TTG3’
乙型肝炎病毒上游引物5’CACAGCTT TCACTTGCTTCCGTTGAGG GTT CAAGCC TCC AAG CTG TG3’，下游引物5’AGAACTCCGGTTTCGGATGTTACAGCGT CTG CGAGGC GAGGGA GTT CT3’。
3、PCR體系及熱循環(huán)采用天為時(shí)代的便捷PCR反應(yīng)系列(2×Pfu master mix)。PCR反應(yīng)系中的天為時(shí)代的Pfu預(yù)混合物的終濃度為1×，上下游引物的終濃度均為0.5μM。模板為菌培養(yǎng)或者純化的質(zhì)粒，如果是菌培養(yǎng)，則加入量為2μL，質(zhì)粒為30ng。反應(yīng)體系總體積為50μL。熱循環(huán)條件為預(yù)變性94℃3分鐘；主循環(huán)94℃30秒，55℃30秒，72℃1分鐘，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10分鐘，4℃保持。PCR反應(yīng)在MJ的PTC-200熱循環(huán)儀上進(jìn)行。
4、電泳體系采用1×TBE作為電泳緩沖液，瓊脂糖凝膠的濃度為1.7％，電泳在EmbiTec Runone電泳儀上進(jìn)行，施加100V電壓，電泳時(shí)間為30分鐘。分子量參照為TaKaRa的DL2000(6個(gè)條帶的大小從小到大依次為100bp，250b，500bp，750bp，1000bp和2000bp)。分子量參照的上樣量為5μL，PCR產(chǎn)物的上樣量為3μL。
5、制備一級(jí)探針庫(kù)采用發(fā)卡引物，分別以菌培養(yǎng)物和純化的質(zhì)粒為模板進(jìn)行高保真擴(kuò)增。PCR體系及熱循環(huán)程序如第3步所述。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，電泳體系如第4步所述。對(duì)以質(zhì)粒為模板的高保真擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠回收純化，電泳檢測(cè)純化結(jié)果。用pH值中性的無(wú)菌去離子水1,000倍稀釋純化產(chǎn)物獲得一級(jí)探針庫(kù)。實(shí)驗(yàn)中設(shè)置了常規(guī)引物擴(kuò)增參照，其他條件同發(fā)卡引物擴(kuò)增。
6、制備二級(jí)探針庫(kù)采用通用引物，以一級(jí)探針庫(kù)為模板進(jìn)行高保真擴(kuò)增。PCR體系及熱循環(huán)程序如第3步所述。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，電泳體系如第4步所述。不對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，直接用pH值中性的無(wú)菌去離子水1,000倍稀釋純化產(chǎn)物獲得二級(jí)探針庫(kù)。
7、制備生物芯片點(diǎn)樣用探針采用常規(guī)引物，分別以一級(jí)探針庫(kù)和二級(jí)探針庫(kù)為模板進(jìn)行擴(kuò)增。PCR體系及熱循環(huán)程序如第3步所述。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，電泳體系如第4步所述。檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，圖中泳道1、2、3、4分別為205bp，244bp，309bp和538bp，均以二級(jí)庫(kù)為模板，采用常規(guī)引物進(jìn)行擴(kuò)增?？梢钥闯?，以一級(jí)探針庫(kù)和二級(jí)探針庫(kù)為模板均可進(jìn)行有效擴(kuò)增，能以較高的效率獲得特異的探針。可對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行濃縮或者不濃縮而用于點(diǎn)樣制備微陣列。
權(quán)利要求
1.一種制備核酸探針庫(kù)的方法，其特征在于以在5’帶有與克隆的探針序列、載體序列以及培養(yǎng)菌的基因序列無(wú)關(guān)的通用序列，3’帶有探針擴(kuò)增序列的寡核苷酸為引物，以含有探針克隆的培養(yǎng)菌或者質(zhì)粒為模板進(jìn)行擴(kuò)增，得到一級(jí)探針庫(kù)；然后以通用序列為引物，一級(jí)探針庫(kù)為模板進(jìn)行擴(kuò)增，得到二級(jí)探針庫(kù)；以此類推，以探針擴(kuò)增序列為引物，以前面得到的探針庫(kù)為模板進(jìn)行擴(kuò)增，獲得核酸探針庫(kù)。
2.如權(quán)利要求1所述的制備核酸探針庫(kù)的方法，其特征在于得到二級(jí)探針庫(kù)后，以探針擴(kuò)增序列為引物，一級(jí)探針庫(kù)或二級(jí)探針庫(kù)為模板進(jìn)行擴(kuò)增，獲得核酸探針庫(kù)。
3.如權(quán)利要求1所述的制備核酸探針庫(kù)的方法，其特征在于所述一級(jí)探針庫(kù)制備時(shí)的通用序列以及探針擴(kuò)增序列的引物在環(huán)境溫度低于PCR擴(kuò)增的退火溫度時(shí)為發(fā)卡結(jié)構(gòu)。
4.如權(quán)利要求3所述的制備核酸探針庫(kù)的方法，其特征在于所述發(fā)卡結(jié)構(gòu)是在通用序列的5’端帶有4到10個(gè)堿基長(zhǎng)的序列，該序列與從3’端開始的與其等長(zhǎng)的序列完全互補(bǔ)。
5.如權(quán)利要求1所述的制備核酸探針庫(kù)的方法，其特征在于所述通用序列與要擴(kuò)增的探針庫(kù)所對(duì)應(yīng)的物種的基因序列、探針庫(kù)所處的載體的序列以及載體所處的工程菌的序列不同源。
6.如權(quán)利要求1或2或3或4或5所述的制備核酸探針庫(kù)的方法，其特征在于所述擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)純化、序列測(cè)定和稀釋后待用。
7.如權(quán)利要求6所述的制備核酸探針庫(kù)的方法，其特征在于所述探針庫(kù)制備時(shí)的稀釋倍數(shù)為10到100,000倍。
8.如權(quán)利要求6所述的制備核酸探針庫(kù)的方法，其特征在于所述探針庫(kù)制備時(shí)的純化方式為凝膠回收純化，高效液相色譜純化或毛細(xì)管電泳純化。
9.如權(quán)利要求1所述的制備核酸探針庫(kù)的方法，其特征在于所述探針庫(kù)的保藏條件為冷凍干燥后置于室溫避光保存或者-80℃至-20℃冷凍保存。
10.如權(quán)利要求1所述的制備核酸探針庫(kù)的方法，其特征在于所述探針庫(kù)的保藏條件為溶于pH為6-8的去離子水或pH為7-9的TE緩沖液后置于-80℃至-20℃保存。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備核酸探針庫(kù)的方法，目的是提供一種廉價(jià)、批量制備核酸探針庫(kù)的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是以在5’帶有與克隆的探針序列、載體序列以及培養(yǎng)菌的基因序列無(wú)關(guān)的通用序列，3’帶有探針擴(kuò)增序列的寡核苷酸為引物，以含有探針克隆的培養(yǎng)菌或者質(zhì)粒為模板進(jìn)行擴(kuò)增，得到一級(jí)探針庫(kù)；然后以通用序列為引物，一級(jí)探針庫(kù)為模板進(jìn)行擴(kuò)增，得到二級(jí)探針庫(kù)；以此類推，以探針擴(kuò)增序列為引物，以前面得到的探針庫(kù)為模板進(jìn)行擴(kuò)增，獲得核酸探針庫(kù)。采用本發(fā)明的方法可以批量、廉價(jià)地制備微陣列探針庫(kù)，所制備探針庫(kù)利于保存，抗打擊能力強(qiáng)，擴(kuò)增條件易于控制，可以減少甚至消除非特異擴(kuò)增，探針純化較傳統(tǒng)方式簡(jiǎn)單。
文檔編號(hào)C12P19/00GK1515684SQ0310009
公開日2004年7月28日 申請(qǐng)日期2003年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月9日
發(fā)明者陶生策, 程京, 馬雪梅 申請(qǐng)人:清華大學(xué), 北京博奧生物芯片有限責(zé)任公司