專利名稱：新型人細(xì)胞周期蛋白，其編碼序列及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及新的編碼人細(xì)胞周期蛋白Cyclin X多肽的多核苷酸，以及此多核苷酸編碼的多肽。本發(fā)明還涉及此多核苷酸和多肽的用途和制備。Cyclin X多肽是一種新的與細(xì)胞生長調(diào)節(jié)和細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)的細(xì)胞內(nèi)蛋白，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和調(diào)控細(xì)胞周期的活性。
背景技術(shù)：
細(xì)胞周期的內(nèi)源性調(diào)控主要是通過細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)-Cyclin依賴性蛋白激酶(CDK)-CDK抑制蛋白(CKI)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)調(diào)控來實現(xiàn)的。Cyclin和CKI分別對CDK進(jìn)行正反調(diào)控。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了至少近20種Cyclin，包括功能比較明確的Cyclin A、B、C、D1-3、E、F、G、H、K、L、T1-2等。還有幾種Cyclin，如Cyclin I和Cyclin M的功能尚不明確，正在研究中。近年來發(fā)現(xiàn)，Cyclin家族成員不僅能夠調(diào)控細(xì)胞周期，而且有的Cyclin分子在調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄上也具有重要的作用。Cyclin L、Cyclin K、Cyclin T1-2、Cyclin C和Cyclin H等都是能夠在RNA水平上調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的Cyclin分子。Cyclin L、Cyclin K、Cyclin T1-2、Cyclin C和Cyclin H等都與重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件RNA多聚酶II有關(guān)。它們能夠磷酸化RNA多聚酶II的大亞基C末端重復(fù)序列，并且Cyclin L和Cyclin T1-2還與轉(zhuǎn)錄剪切因子SC-35的作用有關(guān)。
鑒于細(xì)胞周期蛋白的重要作用，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的細(xì)胞周期蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的人細(xì)胞周期蛋白Cyclin X蛋白以及其片段、類似物和衍生物。
本發(fā)明的另一目的是提供編碼這些多肽的多核苷酸。
本發(fā)明的另一目的是提供生產(chǎn)這些多肽的方法以及該多肽和編碼序列的用途。
在本發(fā)明的第一方面，提供新穎的分離出的Cyclin X多肽，該多肽是人源的，它包含具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。較佳地，該多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和調(diào)控細(xì)胞周期功能的由(a)衍生的多肽。
在本發(fā)明的第二方面，提供編碼分離的這些多肽的多核苷酸，該多核苷酸包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70％相同性(a)編碼上述人Cyclin X的多核苷酸；和(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中355-1914位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-2667位的序列。
在本發(fā)明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞或者被上述多核苷酸直接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的第四方面，提供了制備具有人Cyclin X蛋白活性的多肽的方法，該方法包含(a)在適合表達(dá)人Cyclin X蛋白的條件下，培養(yǎng)上述被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有人Cyclin X蛋白活性的多肽。
在本發(fā)明的第五方面，提供了與上述的人Cyclin X多肽特異性結(jié)合的抗體。還提供了可用于檢測的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中連續(xù)的10-2667個核苷酸。
在本發(fā)明的第六方面，提供了模擬、促進(jìn)、拮抗人Cyclin X多肽活性的化合物，以及抑制人Cyclin X多肽的表達(dá)的化合物。還提供了篩選和/或制備這些化合物的方法。較佳地，該化合物是人Cyclin X多肽的編碼序列或其片段的反義序列。
在本發(fā)明的第七方面，提供了檢測樣品中是否存在Cyclin X蛋白的方法，它包括將樣品與Cyclin X蛋白的特異性抗體接觸，觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在Cyclin X蛋白。
在本發(fā)明的第八方面，提供了一種檢測與人Cyclin X多肽異常表達(dá)相關(guān)的疾病或疾病易感性的方法，該方法包括檢測編碼所述多肽的核酸序列中是否存在突變。
在本發(fā)明的第九方面，提供了本發(fā)明多肽和編碼序列的用途。例如本發(fā)明多肽可被用于篩選促進(jìn)人Cyclin X多肽活性的激動劑，或者篩選抑制人CyclinX多肽活性的拮抗劑、或者被用于肽指紋圖譜鑒定。本發(fā)明的人Cyclin X蛋白的編碼序列或其片段，可被作為引物用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)，或者作為探針用于雜交反應(yīng)，或者用于制造基因芯片或微陣列。
在本發(fā)明的第十方面，提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明的人Cyclin X多肽或其激動劑、拮抗劑以及藥學(xué)上可接受的載體。這些藥物組合物可治療腫瘤、炎癥、神經(jīng)系統(tǒng)和心血管病等病癥。
在本發(fā)明的第十一方面，提供了Cyclin X的調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和調(diào)控細(xì)胞周期活性的實驗證明。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術(shù)的公開，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖1是本發(fā)明的人Cyclin X蛋白與其他Cyclin家族成員蛋白的氨基酸序列同源性比較圖。第一行序列a6e9是人Cyclin X，下方序列是其他Cyclin家族成員蛋白。60％以上保守的氨基酸在多個序列之間用黑體標(biāo)出，40％以上保守的氨基酸用灰體標(biāo)出。
圖2是本發(fā)明的人Cyclin X蛋白氨基酸序列保守區(qū)分析示意圖。
圖3是本發(fā)明的人Cyclin X蛋白的Kyte-doolitte疏水性分析的疏水性曲線圖。
圖4是本發(fā)明的人Cyclin X RT-PCR表達(dá)分析，提示Cyclin X表達(dá)于很多造血和實體腫瘤細(xì)胞以及某些人正常細(xì)胞中。
圖5是本發(fā)明的人Cyclin X Northern印跡雜交所顯示的分布。結(jié)果提示Cyclin X是一種具特定組織分布的分子。
圖6是本發(fā)明的人Cyclin X C末端高抗原性區(qū)的原核表達(dá)電泳圖。
具體實施例方式
Cyclin X是發(fā)明人利用大規(guī)模隨機(jī)測序法從人骨髓基質(zhì)細(xì)胞中首先發(fā)現(xiàn)和分離的一個Cyclin家族新成員。Cyclin X與Cyclin L、Cyclin K、Cyclin T1-2、Cyclin C和Cyclin H均表現(xiàn)較高的同源性。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，CyclinX基因及其蛋白非常符合Cyclin家族成員的特點(diǎn)。NCBI基因組BLAST分析顯示，Cyclin X基因定位于人基因組1號染色體短臂末端。Northern印記雜交和反轉(zhuǎn)錄PCR分析結(jié)果顯示，Cyclin X的mRNA在正常人體組織和細(xì)胞系中的分布很廣泛。
已經(jīng)進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn)，Cyclin在細(xì)胞周期的調(diào)控中具有非常重要的作用，與腫瘤、病毒感染如艾滋病和肝炎等病理現(xiàn)象關(guān)系密切。與Cyclin X同源性較高的Cyclin分子都是與RNA聚合酶II相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，說明Cyclin X也非常有可能是一個與RNA聚合酶II相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。因此，進(jìn)一步探討Cyclin X與腫瘤、病毒感染如艾滋病的關(guān)系具有更廣闊的前景，對于揭示細(xì)胞周期的調(diào)控機(jī)制、預(yù)防和治療疾病都有可能產(chǎn)生巨大的指導(dǎo)作用。
在本發(fā)明中，術(shù)語“Cyclin X蛋白”、“Cyclin X多肽”或“細(xì)胞周期蛋白Cyclin X”可互換使用，都指具有細(xì)胞周期蛋白Cyclin X氨基酸序列(SEQID NO2)的蛋白或多肽。
如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的Cyclin X蛋白或多肽”是指Cyclin X多肽基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化Cyclin X蛋白?；旧霞兊亩嚯脑诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明還包括人Cyclin X蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然人CyclinX蛋白相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。
在本發(fā)明中，術(shù)語“人Cyclin X多肽”指具有人Cyclin X蛋白活性的SEQID NO.2序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與人Cyclin X蛋白相同功能的、SEQID NO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括人Cyclin X蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與人Cyclin X DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人Cyclin X多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含人Cyclin X多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了人Cyclin X多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人Cyclin X多肽序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供人Cyclin X蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人CyclinX多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“人Cyclin X蛋白保守性變異多肽”指與SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。
表1


本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO2的蛋白質(zhì)，但與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
編碼SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術(shù)語“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴(yán)格條件”是指(1)在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％ Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物學(xué)功能和活性。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼Cyclin X蛋白的多聚核苷酸。
本發(fā)明中的多肽和多核苷酸優(yōu)選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質(zhì)。
本發(fā)明的人Cyclin X核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science1985；2301350-1354)被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。特別是很難從文庫中得到全長的cDNA時，可優(yōu)選使用RACE法(RACE-cDNA末端快速擴(kuò)增法)，用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的序列信息適當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成?？捎贸Ｒ?guī)方法如通過凝膠電泳分離和純化擴(kuò)增的DNA/RNA片段。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或Cyclin X蛋白編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。
通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)(Science，1984；2241431)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來表達(dá)或生產(chǎn)重組的Cyclin X多肽。一般來說有以下步驟(1).用本發(fā)明的編碼人Cyclin X多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；
(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；(3).從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
本發(fā)明中，人Cyclin X多核苷酸序列可插入到重組表達(dá)載體中。術(shù)語“重組表達(dá)載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動物細(xì)胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體。在本發(fā)明中適用的載體包括但不限于在細(xì)菌中表達(dá)的基于T7的表達(dá)載體(Rosenberg，et al.Gene，1987，56125)；在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的pMSXND表達(dá)載體(Lee and Nathans，J Bio Chem.2633521，1988)和在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的來源于桿狀病毒的載體。總之，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的一個重要特征是通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟動子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含人Cyclin X編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a LaboratoryManual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動子上，以指導(dǎo)mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動子；λ噬菌體PL啟動子；真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細(xì)胞或其病毒中表達(dá)的啟動子。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。
此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。
宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細(xì)胞；CHO、COS、293細(xì)胞、或Bowes黑素瘤細(xì)胞的動物細(xì)胞等。
本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細(xì)胞中表達(dá)時，如果在載體中插入增強(qiáng)子序列時將會使轉(zhuǎn)錄得到增強(qiáng)。增強(qiáng)子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用于啟動子以增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄?？膳e的例子包括在復(fù)制起始點(diǎn)晚期一側(cè)的100到270個堿基對的SV40增強(qiáng)子、在復(fù)制起始點(diǎn)晚期一側(cè)的多瘤增強(qiáng)子以及腺病毒增強(qiáng)子等。
本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體、啟動子、增強(qiáng)子和宿主細(xì)胞。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時間。
在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
重組的人Cyclin X蛋白或多肽有多方面的用途。這些用途包括(但不限于)直接做為藥物治療Cyclin X蛋白功能低下或喪失所致的疾病，和用于篩選促進(jìn)或?qū)笴yclin X蛋白功能的抗體、多肽或其它配體。用表達(dá)的重組人Cyclin X蛋白篩選多肽庫可用于尋找有治療價值的能抑制或刺激人Cyclin X蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本發(fā)明還包括對人Cyclin X DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于人Cyclin X基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人Cyclin X基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制人Cyclin X蛋白的分子，也包括那些并不影響人Cyclin X蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的人Cyclin X基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的人Cyclin X基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)人Cyclin X蛋白或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol. 6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodiesand T Cell Hvbridomas，El sevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人Cyclin X蛋白功能的抗體以及不影響人Cyclin X蛋白功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用人Cyclin X基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人Cyclin X基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而獲得。
抗人Cyclin X蛋白的抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中，檢測活檢標(biāo)本中的人Cyclin X蛋白。此外，與人Cyclin X蛋白結(jié)合的單克隆抗體也可用放射性同位素標(biāo)記，注入體內(nèi)可跟蹤其位置和分布。這種放射性標(biāo)記的抗體可作為一種非創(chuàng)傷性診斷方法用于腫瘤細(xì)胞的定位和判斷是否有轉(zhuǎn)移。
本發(fā)明中的抗體可用于治療或預(yù)防與人Cyclin X蛋白相關(guān)的疾病。給予適當(dāng)劑量的抗體可以刺激或阻斷人Cyclin X蛋白的產(chǎn)生或活性。
抗體也可用于設(shè)計成針對體內(nèi)某一特殊部位的免疫毒素。如人Cyclin X蛋白高親和性的單克隆抗體可與細(xì)菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，紅豆堿等)共價結(jié)合。一種通常的方法是用巰基交聯(lián)劑如SPDP，攻擊抗體的氨基，通過二硫鍵的交換，將毒素結(jié)合于抗體上，這種雜交抗體可用于殺滅人CyclinX蛋白陽性的細(xì)胞(例如淋巴結(jié)細(xì)胞等)。
多克隆抗體的生產(chǎn)可用人Cyclin X蛋白或多肽免疫動物，如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)，包括但不限于弗氏佐劑等。
利用本發(fā)明蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與Cyclin X蛋白發(fā)生相互作用的物質(zhì)，如配體、抑制劑、激動劑或拮抗劑等。
本發(fā)明蛋白及其抗體、抑制劑、激動劑、拮抗劑或受體等，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。
本發(fā)明的多肽或其激動劑或拮抗劑可直接用于疾病治療，例如，用于腫瘤、炎癥，神經(jīng)系統(tǒng)和心血管病方面的治療。在使用本發(fā)明時，還可同時使用其他治療劑，如IFN-α、IFN-β、TNF-α、TNF-β等。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明Cyclin X多肽或其激動劑、拮抗劑以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的Cyclin X蛋白或其拮抗劑、激動劑施用于哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約l0微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
人Cyclin X蛋白的多聚核苷酸也可用于多種治療目的。基因治療技術(shù)可用于治療由于Cyclin X蛋白的無表達(dá)或異常/無活性的Cyclin X蛋白的表達(dá)所致的細(xì)胞增殖、發(fā)育或代謝異常。重組的基因治療載體(如病毒載體)可設(shè)計成表達(dá)變異的Cyclin X蛋白，以抑制內(nèi)源性的Cyclin X蛋白活性。來源于病毒的表達(dá)載體如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒、單純皰疹病毒、細(xì)小病毒等可用于將Cyclin X基因轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。構(gòu)建攜帶Cyclin X基因的重組病毒載體的方法可見于已有文獻(xiàn)(Sambrook，et al.)。另外重組人Cyclin X基因可包裝到脂質(zhì)體中，然后再轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。
抑制人Cyclin XmRNA的寡聚核苷酸(包括反義RNA和DNA)以及核酶也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。核酶是一種能特異性分解特定RNA的酶樣RNA分子，其作用機(jī)制是核酶分子與互補(bǔ)的靶RNA特異性雜交后進(jìn)行核酸內(nèi)切作用。反義的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技術(shù)獲得，如固相磷酸酰胺化學(xué)合成法合成寡核苷酸的技術(shù)已廣泛應(yīng)用。反義RNA分子可通過編碼該RNA的DNA序列在體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄獲得。這種DNA序列已整合到載體的RNA聚合酶啟動子的下游。為了增加核酸分子的穩(wěn)定性，可用多種方法對其進(jìn)行修飾，如增加兩側(cè)的序列長度，核糖核苷之間的連接應(yīng)用磷酸硫酯鍵或肽鍵而非磷酸二酯鍵。
多聚核苷酸導(dǎo)入組織或細(xì)胞內(nèi)的方法包括將多聚核苷酸直接注入到體內(nèi)組織中；或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質(zhì)粒等)先將多聚核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞中，再將細(xì)胞移植到體內(nèi)等。
能與人Cyclin X蛋白結(jié)合的多肽分子可通過篩選由各種可能組合的氨基酸結(jié)合于固相物組成的隨機(jī)多肽庫而獲得。篩選時，必須對人Cyclin X蛋白分子進(jìn)行標(biāo)記。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測人Cyclin X蛋白水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領(lǐng)域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。試驗中所檢測的人Cyclin X蛋白水平，可以用作解釋人Cyclin X蛋白在各種疾病中的重要性和用于診斷Cyclin X蛋白起作用的疾病。
一種檢測檢測樣品中是否存在Cyclin X蛋白的方法是利用Cyclin X蛋白的特異性抗體進(jìn)行檢測，它包括將樣品與Cyclin X蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在Cyclin X蛋白。
Cyclin X蛋白的多聚核苷酸可用于Cyclin X蛋白相關(guān)疾病的診斷和治療。在診斷方面，Cyclin X蛋白的多聚核苷酸可用于檢測Cyclin X蛋白的表達(dá)與否或在疾病狀態(tài)下Cyclin X蛋白的異常表達(dá)。如Cyclin XDNA序列可用于對活檢標(biāo)本的雜交以判斷Cyclin X蛋白的表達(dá)異常。雜交技術(shù)包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術(shù)方法都是公開的成熟技術(shù)，相關(guān)的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達(dá)分析和基因診斷。用Cyclin X蛋白特異的引物進(jìn)行RNA-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)體外擴(kuò)增也可檢測Cyclin X蛋白的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
檢測Cyclin X基因的突變也可用于診斷Cyclin X蛋白相關(guān)的疾病。CyclinX蛋白突變的形式包括與正常野生型Cyclin X DNA序列相比的點(diǎn)突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等?？捎靡延械募夹g(shù)如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達(dá)，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
本發(fā)明的序列對染色體鑒定也是有價值的。簡而言之，根據(jù)本發(fā)明CyclinX蛋白的cDNA制備PCR引物(優(yōu)選15-35bp)，可以將序列定位于染色體上。然后，將這些引物用于PCR篩選含各條人染色體的體細(xì)胞雜合細(xì)胞。只有那些含有相應(yīng)于引物的人基因的雜合細(xì)胞會產(chǎn)生擴(kuò)增的片段。
一旦序列被定位到準(zhǔn)確的染色體位置，此序列在染色體上的物理位置就可以與基因圖數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。這些數(shù)據(jù)可見于例如，V.Mckusick，MendelianInheritance in Man(可通過與Johns Hopkins University Welch Medical Library聯(lián)機(jī)獲得)。然后可通過連鎖分析，確定基因與業(yè)已定位到染色體區(qū)域上的疾病之間的關(guān)系。
在本發(fā)明的一個實例中，提供了一種分離的多核苷酸，它編碼具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的多肽。本發(fā)明的多核苷酸是從人骨髓基質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞cDNA文庫中分離出的。其序列如SEQ ID NO1所示，它包含的多核苷酸序列全長為2667個堿基，其開放讀框位于355-1997位，編碼全長為520個氨基酸的人Cyclin X蛋白(SEQ ID NO2)。該Cyclin X蛋白屬于Cyclin家族分子，與CyclinL、Cyclin K、Cyclin T1-2、Cyclin C及Cyclin H氨基酸序列高度同源，在Ig樣結(jié)構(gòu)域內(nèi)一致性可高達(dá)50％以上，相似性則可達(dá)60％。RT-PCR分析表明Cyclin X在很多腫瘤細(xì)胞中有表達(dá)。Northern印跡分析表明Cyclin X mRNA在人脾、甲狀腺、前列腺、睪丸、卵巢、小腸、結(jié)腸、外周血淋巴細(xì)胞、腦、胎盤、肺、肝、骨骼肌、腎和胰腺等組織都有不同程度的分布。在肝、卵巢、心臟和胰腺的表達(dá)水平相對較高，而在脾、結(jié)腸、外周血淋巴細(xì)胞、肺和骨骼肌組織表達(dá)水平相對較低。噻唑藍(lán)(MTT)實驗結(jié)果顯示，Cyclin X過表達(dá)或低表達(dá)能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞生長。碘化丙啶(PI)染色后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測的結(jié)果表明，Cyclin X過表達(dá)或低表達(dá)能夠調(diào)控細(xì)胞周期。已進(jìn)行的研究提示，Cyclin X可能與RNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的關(guān)鍵因素RNA多聚酶II和剪切因子SC-35，以及Cyclin依賴性激酶(CDK)家族成員PITSLRE有關(guān)。推測Cyclin X通過作用于細(xì)胞內(nèi)的Cyclin依賴性激酶(CDK)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)信號，調(diào)控多種生理和病理活動，具有潛在的抗腫瘤，抗炎癥作用。因此，Cyclin X蛋白或其相關(guān)的拮抗劑、激動劑等可為治療腫瘤、病毒感染、炎癥、神經(jīng)系統(tǒng)和心血管病等疾病提供新的免疫診斷和靶向治療途徑，因而具有巨大的應(yīng)用前景。
下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人的《分子克隆實驗指南》(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1人Cyclin X cDNA的克隆用Trizol試劑(Life Technologies)提取人骨髓基質(zhì)細(xì)胞總RNA。然后，從總RNA中分離poly(A)mRNA。將poly(A)mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA后，用SuperScriptII克隆試劑盒(Life Technologies)將cDNA片段定向插入到載體的多克隆位點(diǎn)上，轉(zhuǎn)化DH5α細(xì)菌形成cDNA質(zhì)粒文庫。用雙脫氧法測定隨機(jī)挑選克隆的5’末端的序列。將測定的cDNA序列與已有的公共DNA序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有一個cDNA克隆的DNA序列為新的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)cDNA。通過合成一系列引物對新克隆所含的DNA序列進(jìn)行雙向測定。計算機(jī)分析表明，克隆所含的cDNA是一個新的EST序列。利用生物信息學(xué)電子克隆方法，推斷出此EST的全長cDNA。通過合成一系列引物利用PCR反應(yīng)從人白血病Raji細(xì)胞cDNA中克隆了其全長cDNA。通過合成一系列引物對新克隆所含的DNA序列進(jìn)行雙向測定，證明其為全長cDNA(如SEQ ID NO1所示)，編碼一個新的蛋白質(zhì)(如SEQ ID NO2所示)。此蛋白質(zhì)被命名為人細(xì)胞周期蛋白Cyclin X，其編碼基因命名為人細(xì)胞周期蛋白Cyclin X基因。
序列SEQ ID NO1全長為2667bp，包括334bp的5’端非編碼區(qū)和750bp的3’端非編碼區(qū)，編碼含520個氨基酸的多肽。理論上計算未糖基化的成熟分子的分子量約為58.15kD。Cyclin X包含2個Cyclin家族保守結(jié)構(gòu)域。疏水分析(圖3)為發(fā)現(xiàn)信號肽和跨膜區(qū)，提示Cyclin X蛋白為細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白。
BLAST分析(圖1)表明Cyclin X與已知基因不同，與人細(xì)胞周期蛋白CyclinL一致性達(dá)65％，相似性達(dá)77％，并且在Cyclin結(jié)構(gòu)域內(nèi)氨基酸序列高度同源(圖3)，屬于細(xì)胞周期蛋白Cyclin家族分子。
Cyclin X蛋白在結(jié)構(gòu)上具有Cyclin家族的結(jié)構(gòu)特征，包括具有三個Cyclin結(jié)構(gòu)域，有明顯的細(xì)胞核定位信號等(圖2)。此外，Cyclin X蛋白也包含一個N-糖基化位點(diǎn)(224-227殘基)、兩個cAMP-和cGMP-依賴性蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)(403-406、484-487殘基)、八個蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)(226-228、338-340、351-353、355-357、400-402、446-448、466-468、504-506殘基)和兩個酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)(385-391、447-454殘基)。
實施例2用RT-PCR方法進(jìn)行人Cyclin X的細(xì)胞表達(dá)分析用Trizol試劑提取處于對數(shù)生長期的HL-60等各種細(xì)胞系的總RNA，取5μg細(xì)胞總RNA與1μg Oligo-dT12-18混合，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系為20μl，反應(yīng)結(jié)束后加80μl ddH2O進(jìn)行稀釋。PCR擴(kuò)增Cyclin X所用的引物如下有義引物5’CAGGCTGTACTCCGGGGTGCTCATCA(SEQ ID NO3)，反義引物5’CACGTGTCACCGGTCCCTCAGTTCCATTTC(SEQ ID NO4)，同時以β-actin作為陽性對照。PCR反應(yīng)體積為50μl，其中含反轉(zhuǎn)錄模板10μl、0.5mM引物、0.2mM dNTP和1U rTaq DNA聚合酶(Takara Inc.)，擴(kuò)增參數(shù)為95℃ 15秒、57℃ 30秒、72℃ 30秒，28個循環(huán)后PCR產(chǎn)物行1.5％瓊脂糖凝膠電泳初步確認(rèn)。DNA序列分析結(jié)果表明該P(yáng)CR產(chǎn)物的編碼DNA序列與SEQ ID NO1所示的471-2088完全相同。
RT-PCR結(jié)果(圖4)顯示Cyclin X mRNA在大多數(shù)實體腫瘤細(xì)胞和造血腫瘤細(xì)胞中有表達(dá)。
實施例3人Cyclin X的Northern印跡分析按如下常規(guī)方法進(jìn)行Northern印跡待檢濾膜置于10ml經(jīng)68℃預(yù)熱的雜交液，在雜交爐(Bellco)中于68℃預(yù)雜交30分鐘；將標(biāo)記好的cDNA探針于95～100℃變性2～5分鐘，置冰上迅速冷卻后加入雜交液(cDNA探針終濃度為2～10ng/ml或1～2×106cpm/ml)，充分混勻，于68℃雜交2小時。雜交結(jié)束后，濾膜用2×SSC、0.05％ SDS室溫淋洗數(shù)次，繼振蕩沖洗30～40分鐘，其間更換洗液數(shù)次。隨后用0.1×SSC、0.1％ SDS于50℃振蕩沖洗20～40分鐘。最后濾膜用塑料保鮮膜包裹，于-70℃曝光X線膠片24～48小時。
Northern印跡雜交結(jié)果(圖5)顯示Cyclin X在人脾、甲狀腺、前列腺、睪丸、卵巢、小腸、結(jié)腸、外周血淋巴細(xì)胞、腦、胎盤、肺、肝、骨骼肌、腎和胰腺組織都有不同程度的分布。位置約在5.3kb處，這表明Cyclin X蛋白是一種特定表達(dá)的蛋白。
實施例4人Cyclin X的C末端片段重組表達(dá)在該實施例中，以實施例1中的全長質(zhì)粒DNA為模板，用序列如下的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得人Cyclin X C末端高抗原性區(qū)DNA作為插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5’端寡核苷酸引物序列為5’-TAGGATCCAGGCTGTACTCCGGGGTGCTCATCA-3’(SEQ ID NO5)該引物含有BamH I限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)之后是人Cyclin X的部分編碼序列；3’端引物序列為5’-GAGAATTCTGCGTCTTGGGGCCTCTTCTATCT-3’(SEQ ID NO6)該引物含有EcoR I限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、翻譯終止子和人Cyclin X的部分編碼序列。
將獲得的PCR產(chǎn)物純化后經(jīng)BamH I和EcoR I雙酶切后再與表達(dá)載體質(zhì)粒pGEM-2T(Pharmacia公司)按常規(guī)方法重組并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌BL2l，挑取陽性克隆鑒定后純化并測序(ABI公司的377型測序儀，BigDye Terminator試劑盒，PE公司)。選取含有正確序列的人Cyclin X cDNA BamH I和EcoR I酶切片段的pGEX-2T，形成載體pGEX-2T-人Cyclin X，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21。陽性克隆用Bam H I和EcoR I雙酶切鑒定，產(chǎn)物行1.5％瓊脂糖凝膠電泳分析。經(jīng)測序證實，已插入了所設(shè)計的Cyclin X編碼序列。
挑表達(dá)Cyclin X的陽性BL21克隆接種于200ml LB細(xì)菌培養(yǎng)基中，37℃250rpm振蕩培養(yǎng)12-15hr，1∶10稀釋于預(yù)熱的LB培養(yǎng)基繼續(xù)振蕩培養(yǎng)1.5hr，加100mM IPTG至0.2mM后32℃誘導(dǎo)4-5hr，5,000g于4℃離心10min去上清，置冰上用50ml 1×PBS(0.14M NaCl，2.7mM KCl，10.1mM Na2HPO4，1.8mMKH2PO4，pH7.3)重懸，超聲(B.Braun Labsonic U)破碎后再加入20％ TritonX-100至1％輕搖30min，然后12,000g于4℃離心10min，上清過1ml 50％谷胱甘肽Sepharose 4B層析柱，1×PBS充分洗滌后，加入500ul谷胱甘肽洗脫緩沖液(10mM谷胱甘肽，50mM Tris-HCl，pH8.0)室溫靜置30分鐘后收集洗脫液，重復(fù)洗脫2-3次，得到人Cyclin X C末端高抗原性區(qū)的GST融合蛋白。(圖6)此外，用對應(yīng)于全長編碼區(qū)的引物替換上述引物，重復(fù)上述試驗，獲得全長Cyclin X-GST融合蛋白。融合蛋白的分子量與預(yù)測值相符。
實施例5抗人Cyclin X抗體的產(chǎn)生將實施例4中獲得的重組的Cyclin X C末端高抗原性區(qū)的GST融合蛋白用來免疫動物以產(chǎn)生抗體，具體方法如下。重組分子用層析法進(jìn)行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進(jìn)行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund′s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund′s佐劑乳化的同樣抗原，對小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進(jìn)行腹膜內(nèi)注射以加強(qiáng)免疫。每隔14天進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，至少進(jìn)行三次。獲得的抗血清的特異反應(yīng)活性用它在體外沉淀人Cyclin X基因翻譯產(chǎn)物的能力加以評估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗體可特異性地與本發(fā)明蛋白發(fā)生結(jié)合。
實施例6人Cyclin X調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和調(diào)控細(xì)胞周期的活性檢測將含全長Cyclin X的質(zhì)粒DNA以LipofectAMINE試劑(Invitrogen)轉(zhuǎn)染人肝癌SMMC 7721細(xì)胞和人乳腺癌MCF-7細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后60h進(jìn)行MTT實驗和碘化丙啶(PI)染色后流式細(xì)胞儀檢測。
結(jié)果顯示過表達(dá)或低表達(dá)Cyclin X能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和調(diào)控細(xì)胞周期。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>第二軍醫(yī)大學(xué)免疫學(xué)研究所<120>新型人細(xì)胞周期蛋白，其編碼序列及用途<130>024974<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2667<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(355)..(1914)<223><400>1ccggggtctc tgtgcgaacg tgggcatctt ggaagagtcc cagccccgct cggggcgcac 60aggcaggcgc tctcagcacg gcacccgcgc ctccgctagg gacagacatg cttccgggtc120ggccggcacc gcggagtccc ctgggtaacg agcccgcccc acccgcgcca ggttccggcg180tcggcgttag gcgcgttgct gacgggcagg ttatgtagcc aattgcggct aggcggcgtc240gcgctggtcg cgggccgaac caatggcacg cgacggggcg gggcggtggc ggccgtggag300cttcgcgagg agccgccctg agggaagaag ccgaagggga gtcggcggca caaa atg 357Met1gcg gcg gcg gcg gcg gcg gct ggt gct gca ggg tcg gca gct ccc gcg 405Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Ala Gly Ser Ala Ala Pro Ala5 10 15gca gcg gcc ggc gcc ccg gga tct ggg ggc gca ccc tca ggg tcg cag 453Ala Ala Ala Gly Ala Pro Gly Ser Gly Gly Ala Pro Ser Gly Ser Gln20 25 30ggg gtg ctg atc ggg gac agg ctg tac tcc ggg gtg ctc atc acc ttg 501Gly Val Leu Ile Gly Asp Arg Leu Tyr Ser Gly Val Leu Ile Thr Leu35 40 45gag aac tgc ctc ctg cct gac gac aag ctc cgt ttc acg ccg tcc atg 549Glu Asn Cys Leu Leu Pro Asp Asp Lys Leu Arg Phe Thr Pro Ser Met50 55 60 65tcg agc ggc ctc gac acc gac aca gag acc gac ctc cgc gtg gtg ggc 597Ser Ser Gly Leu Asp Thr Asp Thr Glu Thr Asp Leu Arg Val Val Gly70 75 80tgc gag ctc atc cag gcg gcc ggt atc ctg ctc cgc ctg ccg cag gtg 645Cys Glu Leu Ile Gln Ala Ala Gly Ile Leu Leu Arg Leu Pro Gln Val85 90 95gcc atg gct acc ggg cag gtg ttg ttc cag cgg ttc ttt tat acc aag 693Ala Met Ala Thr Gly Gln Val Leu Phe Gln Arg Phe Phe Tyr Thr Lys100 105 110tcc ttc gtg aag cac tcc atg gag cat gtg tca atg gcc tgt gtc cac 741Ser Phe Val Lys His Ser Met Glu His Val Ser Met Ala Cys Val His115 120 125ctg gct tcc aag ata gaa gag gcc cca aga cgc ata cgg gac gtc atc 789Leu Ala Ser Lys Ile Glu Glu Ala Pro Arg Arg Ile Arg Asp Val Ile130 135 140 145aat gtg ttt cac cgc ctt cga cag ctg aga gac aaa aag aag ccc gtg 837Asn Val Phe His Arg Leu Arg Gln Leu Arg Asp Lys Lys Lys Pro Val150 155 160cct cta cta ctg gat caa gat tat gtt aat tta aag aac caa att ata 885Pro Leu Leu Leu Asp Gln Asp Tyr Val Asn Leu Lys Asn Gln Ile Ile165 170 175aag gcg gaa aga cga gtt ctc aaa gag ttg ggt ttc tgc gtc cat gtg 933Lys Ala Glu Arg Arg Val Leu Lys Glu Leu Gly Phe Cys Val His Val180 185 190aag cat cct cat aag ata atc gtt atg tac ctt cag gtg tta gag tgt 98lLys His Pro His Lys Ile Ile Val Met Tyr Leu Gln Val Leu Glu Cys195 200 205gag cgt aac caa cac ctg gtc cag acc tca tgg aat tac atg aac gac 1029Glu Arg Asn Gln His Leu Val Gln Thr Ser Trp Asn Tyr Met Asn Asp210 215 220 225agc ctt cgc acc gac gtc ttc gtg cgg ttc cag cca gag agc atc gcc 1077Ser Leu Arg Thr Asp Val Phe Val Arg Phe Gln Pro Glu Ser Ile Ala230 235 240tgt gcc tgc att tat ctt gct gcc cgg acg ctg gag atc cct ttg ccc 1125Cys Ala Cys Ile Tyr Leu Ala Ala Arg Thr Leu Glu Ile Pro Leu Pro
245 250 255aat cgt ccc cat tgg ttt ctt ttg ttt gga gca act gaa gaa gaa att 1173Asn Arg Pro His Trp Phe Leu Leu Phe Gly Ala Thr Glu Glu Glu Ile260 265 270cag gaa atc tgc tta aag atc ttg cag ctt tat gct cgg aaa aag gtt 122lGln Glu Ile Cys Leu Lys Ile Leu Gln Leu Tyr Ala Arg Lys Lys Val275 280 285gat ctc aca cac ctg gag ggt gaa gtg gaa aaa aga aag cac gct atc 1269Asp Leu Thr His Leu Glu Gly Glu Val Glu Lys Arg Lys His Ala Ile290 295 300 305gaa gag gca aag gcc caa gcc cgg ggc ctg ttg cct ggg ggc aca cag 1317Glu Glu Ala Lys Ala Gln Ala Arg Gly Leu Leu Pro Gly Gly Thr Gln310 315 320gtg ctg gat ggt acc tcg ggg ttc tct cct gcc ccc aag ctg gtg gaa 1365Val Leu Asp Gly Thr Ser Gly Phe Ser Pro Ala Pro Lys Leu Val Glu325 330 335tcc ccc aaa gaa ggt aaa ggg agc aag cct tcc cca ctg tct gtg aag 1413Ser Pro Lys Glu Gly Lys Gly Ser Lys Pro Ser Pro Leu Ser Val Lys340 345 350aac acc aag agg agg ctg gag ggc gcc aag aaa gcc aag gcg gac agc 146lAsn Thr Lys Arg Arg Leu Glu Gly Ala Lys Lys Ala Lys Ala Asp 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Asp Lys Lys Lys Pro145 150 155 160Val Pro Leu Leu Leu Asp Gln Asp Tyr Val Asn Leu Lys Asn Gln Ile165 170 175Ile Lys Ala Glu Arg Arg Val Leu Lys Glu Leu Gly Phe Cys Val His180 185 190Val Lys His Pro His Lys Ile Ile Val Met Tyr Leu Gln Val Leu Glu195 200 205Cys Glu Arg Asn Gln His Leu Val Gln Thr Ser Trp Asn Tyr Met Asn210 215 220Asp Ser Leu Arg Thr Asp Val Phe Val Arg Phe Gln Pro Glu Ser Ile225 230 235 240Ala Cys Ala Cys Ile Tyr Leu Ala Ala Arg Thr Leu Glu Ile Pro Leu245 250 255Pro Asn Arg Pro His Trp Phe Leu Leu Phe Gly Ala Thr Glu Glu Glu260 265 270Ile Gln Glu Ile Cys Leu Lys Ile Leu Gln Leu Tyr Ala Arg Lys Lys275 280 285Val Asp Leu Thr His Leu Glu Gly Glu Val Glu Lys Arg Lys His Ala290 295 300Ile Glu Glu Ala Lys Ala Gln Ala Arg Gly Leu Leu Pro Gly Gly Thr305 310 315 320Gln Val Leu Asp Gly Thr Ser Gly Phe Ser Pro Ala Pro Lys Leu Val325 330 335Glu Ser Pro Lys Glu Gly Lys Gly Ser Lys Pro Ser Pro Leu Ser Val340 345 350Lys Asn Thr Lys Arg Arg Leu Glu Gly Ala Lys Lys Ala Lys Ala Asp355 360 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3權(quán)利要求
1.一種分離的人Cyclin X多肽，其特征在于，它包含具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，該多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和調(diào)控細(xì)胞周期功能的由(a)衍生的多肽。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70％同源性(a)編碼如權(quán)利要求1和2所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。
4.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的多肽。
5.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸的序列選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中355-1914位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-2667位的序列。
6.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求3所述的多核苷酸。
7.一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求6所述的載體。
8.一種具有人Cyclin X多肽活性的多肽的制備方法，其特征在于，該方法包含(a)在適合表達(dá)人Cyclin X多肽的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有人Cyclin X多肽活性的多肽。
9.一種能與權(quán)利要求1所述的人Cyclin X多肽特異性結(jié)合的抗體。
10.一種藥物組合物，其特征在于，它含有安全有效量的權(quán)利要求1所述的多肽以及藥學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及了一種新型細(xì)胞周期蛋白(Cyclin X)。本發(fā)明提供編碼此蛋白分子的多核苷酸和經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生這種蛋白分子的方法。本發(fā)明還公開了這種新型細(xì)胞周期蛋白分子及其多核苷酸編碼序列的用途。本發(fā)明還證實了Cyclin X能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和調(diào)控細(xì)胞周期。本發(fā)明還公開了此蛋白分子用于疾病的診斷及治療的策略，特別是可用于惡性腫瘤的診斷和治療。
文檔編號C12N15/12GK1477115SQ0213655
公開日2004年2月25日 申請日期2002年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月19日
發(fā)明者楊連君, 李楠, 曹雪濤 申請人:第二軍醫(yī)大學(xué)免疫學(xué)研究所