專利名稱：小麥細(xì)胞周期蛋白基因及其分離方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及小麥細(xì)胞周期蛋白CycD2基因WcycD2的克隆、重組及功能分析與應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域。
本發(fā)明人根據(jù)其它植物中發(fā)表的細(xì)胞周期蛋白CycD2的氨基酸序列，設(shè)計引物，利用反轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從小麥中分離出編碼細(xì)胞周期蛋白CycD2基因WcycD2。進一步構(gòu)建表達載體，轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥，與野生型植物相比，轉(zhuǎn)基因植株生長速率明顯增加，生活周期縮短，提前成熟。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明首次從小麥中分離出編碼細(xì)胞周期蛋白CycD2全長的cDNA，連接到表達載體上，利用農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化擬南芥，轉(zhuǎn)基因植株的生活周期比野生相比提前7天左右。
從小麥根尖中提取總RNA，然后將2微克總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)其它植物中的細(xì)胞周期蛋白CycD2中保守的氨基酸序列，設(shè)計一對引物正向引物5′-ATCGATTGGATTTGGAAGGT-3′反向引物5′-TGC(CT)A(AG)(GC)AGCTG(AC)GTCATCCA-3′進行常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，取2μl PCR產(chǎn)物連接到pGEM-T載體上，轉(zhuǎn)化DH5α細(xì)胞，進行序列測定。然后進行3′和5′末端快速擴增獲得全長的cDNA。具體的PCR試劑與條件為10×反應(yīng)緩沖液 5μl脫氧核苷酸混合物(dNTP) 4μl正向引物(5μM) 4μl反向引物(5μM) 4μl模板cDNA4μlTaqDNA聚合酶0.5μl總體積 50μlPCR反應(yīng)條件為94℃ 3分鐘，然后進入下列循環(huán)94℃ 1分鐘，56℃ 1分鐘，72℃ 1分鐘，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。
結(jié)果擴增到一個DNA片段。取2μl PCR產(chǎn)物連接到pGEM-T載體(Promega公司產(chǎn)品)，轉(zhuǎn)化DH5α細(xì)胞(常用載體宿主細(xì)胞)，平板過夜培養(yǎng)。挑取菌斑，提取質(zhì)粒DNA，用于序列測定。
經(jīng)過3′和5′末端快速擴增獲得全長的cDNA為1821bp，包括起始密碼子前的上游序列和多聚A尾巴。開放閱讀框部分為1059bp，由此推得具353個氨基酸的一段序列，將此氨基酸序列在國際基因庫中進行檢索，表明與已發(fā)表的玉米中的細(xì)胞周期蛋白D2相比，氨基酸同源性高達69％，表明經(jīng)過上述克隆步驟得到了編碼細(xì)胞周期蛋白CycD2的基因。序列表(1)SEQ ID NO 1的信息(a)序列特征*長度1815堿基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型cDNA(c)假設(shè)否
(d)反義否(e)最初來源小麥(f)序列描述SEQ IN NO.11TAATTGGCCA CGCGTCAAAA TAGTAAGGAG GAGGGGGGGG GATATAGTTT ATCCTTTTCG 6061 TTTATCTCTT TGACGGATCA AGAACAGGGG AGGGAGATTG AAGGGGGGGA GGAAGCTATG 120121 CATCCAACGC GTTGGGAGCT CTCCCATATG GTCGACCTGC AGGCGGCCGC GAATTCACTA 180181 GTGATTTCTC TAGATAAATC AGTTCTCGCA TCGGTTTATT GATTGCTCAT TAACCCAGCA 240241 TTCCCGCCGC TGCCATTCTT GGGAGGAGTC AGCATGGTTC CGTCCGGGTA CGACTGCGCC 300301 GCCTCCGTCC TGCTCTGCGC CGAGGACAAC GCCGCCATCC TCGGCCTCGA CGACGACGAG 360361 GAAGACTGCT CCTGGGCGGC GGCGGCCGCC ACCCCGCCGC GCATCGCCGC CGATGCCGCC 420421 GCGGCGGCGG AGGGGTTCCT GGTGGACCAC CCCGTGCAGT CCGATGAGTG CGTGGCGGCG 480481 CTCGTCGAGA CGGAGAAGGA GCACATGCCC GCCGACGGGT ACCCCCAGAT GCTGCTGCGC 540541 CGGCCCGGGG CCCTGGATTT GGCCGCCGTC AGGAGGGACG CCATAGATTG GATTTGGGAG 600601 GTCATTGAGC ATTTCAATTT CGCGCCGTTG ACTGCGGTCC TGTCTGTCAA CTACCTTGAT 660661 AGGTTCCTCT CCGTCTATCC CCTTCCTGAA GGCAAAGCTT GGGTGACACA GCTCTTGGCA 720721 GTGGCTTGCT TGTCCCTCGC TTCAAAGATG GAGGAGACCT ATGTGCCGCT CCCCGTCGAC 780781 CTGCAGGTGG TTGAGGCAAA TTCTGCGTTC GAGGGGAGGA CCATAAAAAG GATGGAGCTT 840841 TTGGTGCTCA GCACCTTAAA ATGGAGGATG CAAGCTGTTA CTGCTTGCTC ATTTATTGAC 900901 TACTTCCTGC GCAAATTCAA TGATCATGAC GCGCCCTCCA TGCTCGCATT CTCCCGCTCG 960961 ACCGACCTCA TCCTGAGCAC AGCTAAAGGA GCTGATTTTT TGGTGTTCAG ACCTTCAGAG 10201021 ATTGCTGCAA GTGTCGCACT TGCCGCATTT GGGGAGCGCA ATACTTCAGT AGTCGAGCGG 10801081 GCTACAACTA CTTGCAAGTT CATAAACAAG GAGCGAGTGT TAAGATGCTA CGAACTGATT 11401141 CAAGACAAGG TAGCAATGGG AACCATTGTC CTAAAGTCAG CTGGATCATC AATGTTCTCT 12001201 GTGCCGCAAA GCCCGATAGG CGTGTCGGAT GCTGCTGCAT GTCTCAGCCA ACAGAGTGAT 12601261 GATACTGCTG TTGGATCTCC AGCAACATGC TACCAAGCCT CTTCGGCAAG CAAAAGGAGG 13201321 AGAATTGGCA GATGACCGAT CTCATGTCGT GCTGTGCTTC AGGTGTGTTG CTCACCGTTT 13801381 TGGCTGTTTT GTTGTTTCAA ACATCTCAAT TCAGTTTGGT CACTCGAGAA CTATAGTGTG 14401441 GTCAAGTAGT TGCTGGAAGG AACAAAAACA CCATAGTCAA TACTTGACCC ATAAGAACAA 15001501 ACAGTTCGCC GCGAGCCTGT TCATGCAATC GACATATGTA AGGGGCATGC TAAGCTGTTA 15601561 GTGTCCTGAG ATGCATGCTG TGTAGGCAGA GATGGAGCAA GGAAGTTGCA TGTTGTAGAG 16201621 ATGAGAGCTC TATTGCCCTG TTTTGTATTT TGGTTCCATA TTCAGTTTCT AATGAACTTT 16801681 AGGCAAGGGC TGCTCTGATC ATTGAGGCGG TGAATGAAAA TGATCCTAAA ACGGATCGGC 17401741 TGAGATACAG AACAGTTTAT ATTTGTTCTG ATGAGTTATA AATTTTGTCG ACAAAAAAAA 18001801 AAAAAAAAAA AAAAA 1815(2)SEQ IN NO.2的信息(a)序列特征*長度353氨基酸
*類型氨基酸*鏈型單鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型蛋白質(zhì)(c)序列描述1 MVPSGYDCAA SVLLCAEDNA AILGLDDDEE DCSWAAAAAT PPRIAADAAA AAEGFLVDHP 6061 VQSDECVAAL VETEKEHMPA DGYPQMLLRR PGALDLAAVR RDAIDWIWEV IEHFNFAPLT 120121 AVLSVNYLDR FLSVYPLPEG KAWVTQLLAV ACLSLASKME ETYVPLPVDL QVVEANSAFE 180181 GRTIKRMELL VLSTLKWRMQ AVTACSFIDY FLRKFNDHDA PSMLAFSRST DLILSTAKGA 240241 DFLVFRPSEI AASVALAAFG ERNTSVVERA TTTCKFINKE RVLRCYELIQ DKVAMGTIVL 300301 KSAGSSMFSV PQSPIGVSDA AACLSQQSDD TAVGSPATCY QASSASKRRR IGR353根據(jù)上述序列，設(shè)計構(gòu)建表達載體的引物正向引物5′-TCTCTAGATAAATCAGTTCTCGCATC-3′反向引物5′-TAGAGCTCCACAGCACGACATGAGATCG-3′以根尖的總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進行PCR擴增出含全長編碼框的序列，先連接到pGEM-T載體上，進行測序鑒定。然后用XbaI和SacI切下該片段，插入到表達載體PBI121的35S啟動子的下游。將構(gòu)建好的表達載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105。
利用滲透法轉(zhuǎn)化擬南芥，收獲的種子在含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上篩選。對T3代純合植物生長發(fā)育進行觀察，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因植株生長速率明顯增加，可提前7天左右成熟。
根據(jù)上述技術(shù)，從小麥中分離出編碼細(xì)胞周期蛋白CycD2的基因，該基因過量表達能導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因擬南芥的生長速率增加，生活周期縮短。表明該基因表達水平的增加足以促進細(xì)胞分裂和植物生長的加速。因此，讓該基因在小麥、水稻和玉米等農(nóng)作物及其它一些觀賞植物中過量表達，能夠加速植物的生長發(fā)育進程，縮短生活周期，將具有非常重要的經(jīng)濟效益和社會效益.(四)具體發(fā)明實施方式實施方式1.小麥中細(xì)胞周期蛋白CycD2基因的克隆方法1.總RNA的提取采用一步法或RNA kit提取總RNA2.cDNA第一條鏈的合成取2微克總RNA，加入5×反應(yīng)緩沖液4μl，10mM脫氧核糖核酸(dNTP)2μl，核糖核酸酶抑制劑(40-200u/μl)0.5μl，引物oligodT(1μg/μl)1μl，反轉(zhuǎn)錄酶(10u/μl)2μl，42℃反應(yīng)60分鐘，85℃10分鐘終止反應(yīng)，稀釋至200μl。
3.PCR反應(yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)試劑與條件為首先將下列試劑混在一起
10×反應(yīng)緩沖液5μl脫氧核苷酸混合物(dNTP)4μl正向引物(5μM)4μl反向引物(5μM)4μl模板cDNA 4μlTaq DNA聚合酶 0.5μl總體積50μlPCR反應(yīng)條件為94℃ 3分鐘，然后進入下列循環(huán)94℃ 1分鐘，56℃ 1分鐘，72℃ 1分鐘，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。
4.基因克隆取2μl PCR與pGEM-T載體進行連接，操作步驟按Promega公司產(chǎn)品pGEM-T and pGEM-Teasy Vector system說明書進行。然后連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株，在表面涂5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和X-gal的含氨芐青霉素(100微克/毫升)的LB平板上生長過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。
5.質(zhì)粒DNA的提取堿法提取質(zhì)粒DNA。
6.序列測定本工作在大連寶生物工程公司進行。
7.3′和5′序列的分離按Clontech公司的SMART RACE cDNA Amplification Kit說明書進行8.同源檢索利用BLAST軟件將分離出的序列與基因銀行中的序列進行比較。實施方式2小麥細(xì)胞周期蛋白CycD2基因WcycD2，具有如下序列(1)SEQ ID NO1的信息(a)序列特征*長度1815堿基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型cDNA(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來源小麥(f)序列描述SEQ IN NO.11TAATTGGCCA CGCGTCAAAA TAGTAAGGAG GAGGGGGGGG GATATAGTTT ATCCTTTTCG 6061 TTTATCTCTT TGACGGATCA AGAACAGGGG AGGGAGATTG AAGGGGGGGA GGAAGCTATG 120121 CATCCAACGC GTTGGGAGCT CTCCCATATG GTCGACCTGC AGGCGGCCGC GAATTCACTA 180181 GTGATTTCTC TAGATAAATC AGTTCTCGCA TCGGTTTATT GATTGCTCAT TAACCCAGCA 240241 TTCCCGCCGC TGCCATTCTT GGGAGGAGTC AGCATGGTTC CGTCCGGGTA CGACTGCGCC 300301 GCCTCCGTCC TGCTCTGCGC CGAGGACAAC GCCGCCATCC TCGGCCTCGA CGACGACGAG 360361 GAAGACTGCT CCTGGGCGGC GGCGGCCGCC ACCCCGCCGC GCATCGCCGC CGATGCCGCC 420421 GCGGCGGCGG AGGGGTTCCT GGTGGACCAC CCCGTGCAGT CCGATGAGTG CGTGGCGGCG 480481 CTCGTCGAGA CGGAGAAGGA GCACATGCCC GCCGACGGGT ACCCCCAGAT GCTGCTGCGC 540541 CGGCCCGGGG CCCTGGATTT GGCCGCCGTC AGGAGGGACG CCATAGATTG GATTTGGGAG 600601 GTCATTGAGC ATTTCAATTT CGCGCCGTTG ACTGCGGTCC TGTCTGTCAA CTACCTTGAT 660661 AGGTTCCTCT CCGTCTATCC CCTTCCTGAA GGCAAAGCTT GGGTGACACA GCTCTTGGCA 720721 GTGGCTTGCT TGTCCCTCGC TTCAAAGATG GAGGAGACCT ATGTGCCGCT CCCCGTCGAC 780781 CTGCAGGTGG TTGAGGCAAA TTCTGCGTTC GAGGGGAGGA CCATAAAAAG GATGGAGCTT 840841 TTGGTGCTCA GCACCTTAAA ATGGAGGATG CAAGCTGTTA CTGCTTGCTC ATTTATTGAC 900901 TACTTCCTGC GCAAATTCAA TGATCATGAC GCGCCCTCCA TGCTCGCATT CTCCCGCTCG 960961 ACCGACCTCA TCCTGAGCAC AGCTAAAGGA GCTGATTTTT TGGTGTTCAG ACCTTCAGAG 10201021 ATTGCTGCAA GTGTCGCACT TGCCGCATTT GGGGAGCGCA ATACTTCAGT AGTCGAGCGG 10801081 GCTACAACTA CTTGCAAGTT CATAAACAAG GAGCGAGTGT TAAGATGCTA CGAACTGATT 11401141 CAAGACAAGG TAGCAATGGG AACCATTGTC CTAAAGTCAG CTGGATCATC AATGTTCTCT 12001201 GTGCCGCAAA GCCCGATAGG CGTGTCGGAT GCTGCTGCAT GTCTCAGCCA ACAGAGTGAT 12601261 GATACTGCTG TTGGATCTCC AGCAACATGC TACCAAGCCT CTTCGGCAAG CAAAAGGAGG 13201321 AGAATTGGCA GATGACCGAT CTCATGTCGT GCTGTGCTTC AGGTGTGTTG CTCACCGTTT 13801381 TGGCTGTTTT GTTGTTTCAA ACATCTCAAT TCAGTTTGGT CACTCGAGAA CTATAGTGTG 14401441 GTCAAGTAGT TGCTGGAAGG AACAAAAACA CCATAGTCAA TACTTGACCC ATAAGAACAA 15001501 ACAGTTCGCC GCGAGCCTGT TCATGCAATC GACATATGTA AGGGGCATGC TAAGCTGTTA 15601561 GTGTCCTGAG ATGCATGCTG TGTAGGCAGA GATGGAGCAA GGAAGTTGCA TGTTGTAGAG 16201621 ATGAGAGCTC TATTGCCCTG TTTTGTATTT TGGTTCCATA TTCAGTTTCT AATGAACTTT 16801681 AGGCAAGGGC TGCTCTGATC ATTGAGGCGG TGAATGAAAA TGATCCTAAA ACGGATCGGC 17401741 TGAGATACAG AACAGTTTAT ATTTGTTCTG ATGAGTTATA AATTTTGTCG ACAAAAAAAA 18001801 AAAAAAAAAA AAAAA 1815(2)SEQ IN NO.2的信息(a)序列特征長度355氨基酸類型氨基酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(b)分子類型蛋白質(zhì)(d)序列描述1 MVPSGYDCAA SVLLCAEDNA AILGLDDDEE DCSWAAAAAT PPRIAADAAA AAEGFLVDHP 6061 VQSDECVAAL VETEKEHMPA DGYPQMLLRR PGALDLAAVR RDAIDWIWEV IEHFNFAPLT 120121 AVLSVNYLDR FLSVYPLPEG KAWVTQLLAV ACLSLASKME ETYVPLPVDL QVVEANSAFE 180181 GRTIKRMELL VLSTLKWRMQ AVTACSFIDY FLRKFNDHDA PSMLAFSRST DLILSTAKGA 240241 DFLVFRPSEI AASVALAAFG ERNTSVVERA TTTCKFINKE RVLRCYELIQ DKVAMGTIVL 300301 KSAGSSMFSV PQSPIGVSDA AACLSQQSDD TAVGSPATCY QASSASKRRR IGR 353實施方式3表達載體的構(gòu)建1.根據(jù)分離出的細(xì)胞周期蛋白CycD2基因的核苷酸序列，設(shè)計引物正向引物5′-TCTCTAGATAAATCAGTTCTCGCATC-3′反向引物5′-TAGAGCTCCACAGCACGACATGAGATCG-3′以根尖的總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng).
2.取2μl PCR與pGEM-T載體進行連接，操作步驟按Promega公司產(chǎn)品pGEM-Tand pGEM-TeasyVector system說明書進行。然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株，在表面涂5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和X-gal的含氨芐青霉素(100微克/毫升)的LB平板上生長過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。堿法提取質(zhì)粒DNA，進行序列測定。
3.用XabI和SacI兩個限制性內(nèi)切酶將該基因從pGEM-T載體上切下，與相同酶酶切的PBI121連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α細(xì)胞，然后在含氨芐青霉素的LB固體平板上培養(yǎng)，對菌落進行PCR鑒定和質(zhì)粒DNA的酶切分析。
4.將構(gòu)建好的表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105。實施方式4基因功能分析1.種植擬南芥。
2.挑取鑒定好的農(nóng)桿菌單克隆于含50毫克/升卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)。
3.離心，農(nóng)桿菌沉淀用滲透培養(yǎng)基(5％蔗糖，0.1M MgCl2，0.5％Silwet L-77)懸浮，菌液OD600在0.8左右。
4.將擬南芥花序浸入滲透液中，浸泡5分鐘。
5.收獲的種子在篩選培養(yǎng)基(1×MS鹽，1％蔗糖，pH5.7，0.8％瓊脂，卡那霉素30毫克/升)篩選，得到抗性植株。
6.將T3代純合株系種子放在與野生型種子在相同的條件下，測量植株的高度，觀察其生長發(fā)育狀況。序列表<110>山東農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>小麥細(xì)胞周期蛋白基因及其分離方法與應(yīng)用<160>1<170>patent In 3.1<210>1<211>1815<212>cDNA<213>小麥(Triticum aestivum)<221>1-1815<400>1taattggcca cgcgtcaaaa tagtaaggag gagggggggg gatatagttt atccttttcg 60tttatctctt tgacggatca agaacagggg agggagattg aaggggggga ggaagctatg 120catccaacgc gttgggagct ctcccatatg gtcgacctgc aggcggccgc gaattcacta 180gtgatttctc tagataaatc agttctcgca tcggtttatt gattgctcat taacccagca 240ttcccgccgc tgccattctt gggaggagtc agcatggttc cgtccgggta cgactgcgcc 300gcctccgtcc tgctctgcgc cgaggacaac gccgccatcc tcggcctcga cgacgacgag 360gaagactgct cctgggcggc ggcggccgcc accccgccgc gcatcgccgc cgatgccgcc 420gcggcggcgg aggggttcct ggtggaccac cccgtgcagt ccgatgagtg cgtggcggcg 480ctcgtcgaga cggagaagga gcacatgccc gccgacgggt acccccagat gctgctgcgc 540cggcccgggg ccctggattt ggccgccgtc aggagggacg ccatagattg gatttgggag 600gtcattgagc atttcaattt cgcgccgttg actgcggtcc tgtctgtcaa ctaccttgat 660aggttcctct ccgtctatcc ccttcctgaa ggcaaagctt gggtgacaca gctcttggca 720gtggcttgct tgtccctcgc ttcaaagatg gaggagacct atgtgccgct ccccgtcgac 780ctgcaggtgg ttgaggcaaa ttctgcgttc gaggggagga ccataaaaag gatggagctt 840ttggtgctca gcaccttaaa atggaggatg caagctgtta ctgcttgctc atttattgac 900tacttcctgc gcaaattcaa tgatcatgac gcgccctcca tgctcgcatt ctcccgctcg 960accgacctca tcctgagcac agctaaagga gctgattttt tggtgttcag accttcagag 1020attgctgcaa gtgtcgcact tgccgcattt ggggagcgca atacttcagt agtcgagcgg 1080gctacaacta cttgcaagtt cataaacaag gagcgagtgt taagatgcta cgaactgatt 1140caagacaagg tagcaatggg aaccattgtc ctaaagtcag ctggatcatc aatgttctct 1200gtgccgcaaa gcccgatagg cgtgtcggat gctgctgcat gtctcagcca acagagtgat 1260gatactgctg ttggatctcc agcaacatgc taccaagcct cttcggcaag caaaaggagg 1320agaattggca gatgaccgat ctcatgtcgt gctgtgcttc aggtgtgttg ctcaccgttt 1380tggctgtttt gttgtttcaa acatctcaat tcagtttggt cactcgagaa ctatagtgtg 1440gtcaagtagt tgctggaagg aacaaaaaca ccatagtcaa tacttgaccc ataagaacaa 1500acagttcgcc gcgagcctgt tcatgcaatc gacatatgta aggggcatgc taagctgtta 1560gtgtcctgag atgcatgctg tgtaggcaga gatggagcaa ggaagttgca tgttgtagag 1620atgagagctc tattgccctg ttttgtattt tggttccata ttcagtttct aatgaacttt 1680aggcaagggc tgctctgatc attgaggcgg tgaatgaaaa tgatcctaaa acggatcggc 1740tgagatacag aacagtttat atttgttctg atgagttata aattttgtcg acaaaaaaaa 1800aaaaaaaaaa aaaaa 181權(quán)利要求
1.一種克隆的小麥細(xì)胞周期蛋白基因WcycD2，其特征在于它具有SEQ IN NO1所示的序列，(a)序列特征*長度1815堿基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型cDNA(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來源小麥(f)序列描述SEQ IN NO.11TAATTGGCCA CGCGTCAAAA TAGTAAGGAG GAGGGGGGGG GATATAGTTT ATCCTTTTCG 6061 TTTATCTCTT TGACGGATCA AGAACAGGGG AGGGAGATTG AAGGGGGGGA GGAAGCTATG 120121 CATCCAACGC GTTGGGAGCT CTCCCATATG GTCGACCTGC AGGCGGCCGC GAATTCACTA 180181 GTGATTTCTC TAGATAAATC AGTTCTCGCA TCGGTTTATT GATTGCTCAT TAACCCAGCA 240241 TTCCCGCCGC TGCCATTCTT GGGAGGAGTC AGCATGGTTC CGTCCGGGTA CGACTGCGCC 300301 GCCTCCGTCC TGCTCTGCGC CGAGGACAAC GCCGCCATCC TCGGCCTCGA CGACGACGAG 360361 GAAGACTGCT CCTGGGCGGC GGCGGCCGCC ACCCCGCCGC GCATCGCCGC CGATGCCGCC 420421 GCGGCGGCGG AGGGGTTCCT GGTGGACCAC CCCGTGCAGT CCGATGAGTG CGTGGCGGCG 480481 CTCGTCGAGA CGGAGAAGGA GCACATGCCC GCCGACGGGT ACCCCCAGAT GCTGCTGCGC 540541 CGGCCCGGGG CCCTGGATTT GGCCGCCGTC AGGAGGGACG CCATAGATTG GATTTGGGAG 600601 GTCATTGAGC ATTTCAATTT CGCGCCGTTG ACTGCGGTCC TGTCTGTCAA CTACCTTGAT 660661 AGGTTCCTCT CCGTCTATCC CCTTCCTGAA GGCAAAGCTT GGGTGACACA GCTCTTGGCA 720721 GTGGCTTGCT TGTCCCTCGC TTCAAAGATG GAGGAGACCT ATGTGCCGCT CCCCGTCGAC 780781 CTGCAGGTGG TTGAGGCAAA TTCTGCGTTC GAGGGGAGGA CCATAAAAAG GATGGAGCTT 840841 TTGGTGCTCA GCACCTTAAA ATGGAGGATG CAAGCTGTTA CTGCTTGCTC ATTTATTGAC 900901 TACTTCCTGC GCAAATTCAA TGATCATGAC GCGCCCTCCA TGCTCGCATT CTCCCGCTCG 960961 ACCGACCTCA TCCTGAGCAC AGCTAAAGGA GCTGATTTTT TGGTGTTCAG ACCTTCAGAG 10201021 ATTGCTGCAA GTGTCGCACT TGCCGCATTT GGGGAGCGCA ATACTTCAGT AGTCGAGCGG 10801081 GCTACAACTA CTTGCAAGTT CATAAACAAG GAGCGAGTGT TAAGATGCTA CGAACTGATT 11401141 CAAGACAAGG TAGCAATGGG AACCATTGTC CTAAAGTCAG CTGGATCATC AATGTTCTCT 12001201 GTGCCGCAAA GCCCGATAGG CGTGTCGGAT GCTGCTGCAT GTCTCAGCCA ACAGAGTGAT 12601261 GATACTGCTG TTGGATCTCC AGCAACATGC TACCAAGCCT CTTCGGCAAG CAAAAGGAGG 13201321 AGAATTGGCA GATGACCGAT CTCATGTCGT GCTGTGCTTC AGGTGTGTTG CTCACCGTTT 13801381 TGGCTGTTTT GTTGTTTCAA ACATCTCAAT TCAGTTTGGT CACTCGAGAA CTATAGTGTG 14401441 GTCAAGTAGT TGCTGGAAGG AACAAAAACA CCATAGTCAA TACTTGACCC ATAAGAACAA 15001501 ACAGTTCGCC GCGAGCCTGT TCATGCAATC GACATATGTA AGGGGCATGC TAAGCTGTTA 15601561 GTGTCCTGAG ATGCATGCTG TGTAGGCAGA GATGGAGCAA GGAAGTTGCA TGTTGTAGAG 16201621 ATGAGAGCTC TATTGCCCTG TTTTGTATTT TGGTTCCATA TTCAGTTTCT AATGAACTTT 16801681 AGGCAAGGGC TGCTCTGATC ATTGAGGCGG TGAATGAAAA TGATCCTAAA ACGGATCGGC 17401741 TGAGATACAG AACAGTTTAT ATTTGTTCTG ATGAGTTATA AATTTTGTCG ACAAAAAAAA 18001801 AAAAAAAAAA AAAAA 1815
2.一種權(quán)利要求1所述的細(xì)胞周期蛋白基因的克隆方法，其特征在于從小麥中提取總RNA，然后利用2微克總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)其它植物中的細(xì)胞周期蛋白CycD2保守的氨基酸序列設(shè)計一對引物正向引物5′-ATCGATTGGATTTGGAAGGT-3′反向引物5′-TGC(CT)A(AG)(GC)AGCTG(AC)GTCATCCA-3′進行常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，將擴增出的DNA片段連接到pGEM-T載體上，轉(zhuǎn)化DH5α細(xì)胞，用于序列測定，然后經(jīng)過3’/5’末端快速擴增得到全長的cDNA為1815bp。
3.一種權(quán)利要求1所述的細(xì)胞周期蛋白基因的功能，其特征在于該基因在擬南芥中過量表達，能加速植物的生長進程，轉(zhuǎn)入小麥、水稻和玉米等農(nóng)作物中，縮短植物的生活周期。
全文摘要
本發(fā)明涉及小麥細(xì)胞周期蛋白CycD2基因WcycD2的克隆、重組及功能分析，屬于分子生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域。從小麥根尖中提取總RNA，然后將2微克總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)其它植物中的細(xì)胞周期蛋白CycD2中保守的氨基酸序列，設(shè)計引物，進行常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，然后連接到pGEM－T載體上，轉(zhuǎn)化DH5α細(xì)胞，進行序列測定。然后進行3′和5′末端快速擴增獲得全長的cDNA。進一步，構(gòu)建正義表達載體，轉(zhuǎn)化擬南芥。與野生型植物相比，轉(zhuǎn)基因植株生長速率明顯增加，生活周期縮短，提前成熟。該基因在擬南芥中過量表達能大大加速植物的生長進程。因此，該基因可用于轉(zhuǎn)入小麥、水稻和玉米等農(nóng)作物中，達到加速植物生長進程的目的，具有重要的應(yīng)用前景。
文檔編號C12P19/34GK1408721SQ0213554
公開日2003年4月9日 申請日期2002年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月18日
發(fā)明者張憲省, 王芳, 李全梓, 李興國 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)