引物對、制備細胞周期因子y的方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及抗體檢測技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及引物 對、制備細胞周期因子Υ的方法、用于檢測細胞周期因子Υ抗體的試劑盒和用于檢測細胞周 期因子Υ抗體的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]CCNY又稱CyclinY、cyc_Y、細胞周期因子Υ、周期素盒蛋白l(cyclinboxprotein 1)、周期素折疊蛋白l(cyclinfoldprotein1)或周期素盒攜帶蛋白l(cyclin-box carryingprotein1)，是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種細胞周期蛋白，其編碼基因ccny定位于10號 染色體，全長3968bp，有10個外顯子，9個內(nèi)含子。CCNY蛋白含有341個氨基酸，分子量約為 39KD。研究顯示，CCNY基因水平的變化影響著細胞周期的進程，進一步影響著腫瘤細胞的增 殖，迀移與侵襲能力，從而影響著腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的進程。據(jù)最新的研究顯示，CCNY不僅能 夠能促進腦膠質(zhì)瘤細胞的增殖，CCNY還能促進直腸癌瘤細胞的粘附能力、細胞的迀移和侵 襲能力，從而影響著直腸癌細胞的轉(zhuǎn)移。
[0003]細胞周期因子家族的其他成員例如CyclinBl，〇7〇1;[110,0701;[1^等在腫瘤的相關(guān) 研究中均呈現(xiàn)高表達的態(tài)勢，并且在腫瘤患者血清中均檢測出相應(yīng)的抗體存在，而這些細 胞周期素相應(yīng)的抗體部分具有一定的輔助診斷價值，尤其是對腫瘤患者的早期輔助診斷， 部分抗體具有作為腫瘤患者預(yù)后評價的重要參考意義。據(jù)最新的研究報道，CCNY抗體水平 的高低可以用來預(yù)測非小細胞肺癌早期術(shù)后患者的生存期的長短;并且血清CCNY抗體水平 的高低與非小細胞肺癌早期術(shù)后患者是否出現(xiàn)了癌癥復(fù)發(fā)，轉(zhuǎn)移等疾病進展存在著一定的 聯(lián)系。因此臨床醫(yī)生可以通過對血清CCNY抗體水平的監(jiān)測，來預(yù)測疾病的發(fā)展進程，從而及 早調(diào)整臨床治療手段和方法，提高腫瘤患者生活質(zhì)量和延長腫瘤患者的生存時間。由于 CCNY是新發(fā)現(xiàn)的周期因子，所以在其他腫瘤患者中關(guān)于血清CCNY抗體的研究還是空白。
[0004]因此，細胞周期因子Y抗體的檢測的臨床應(yīng)用價值有待研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個目的 在于提出一種快速、簡便和高效地檢測細胞周期因子Y的試劑盒和方法。
[0006]根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了一種引物對。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述引 物對具有SEQIDNO: 1和2所示的核苷酸序列。由此，利用該引物對，可以高效、準(zhǔn)確和快捷 地實現(xiàn)對細胞周期因子Y編碼基因的擴增。
[0007]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了一種制備細胞周期因子Y的方法。根據(jù)本發(fā) 明的實施例，該方法包括:采用前述的引物對，擴增細胞周期因子Y編碼基因；將所得到的細 胞周期因子Y編碼基因亞克隆至質(zhì)粒中，以便獲得重組質(zhì)粒;利用所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿 菌，并對所得到的轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌進行培養(yǎng)，其中，在所述培養(yǎng)過程中通過添加IPTG誘導(dǎo) 所述細胞周期因子Y的表達；以及純化所述細胞周期因子Y。由此，利用本發(fā)明的前述引物進 行基因擴增，擴增的準(zhǔn)確度高、速度快，并且細胞周期因子Y重組表達的效率高。
[0008]根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測細胞周期因子Υ抗體的試劑 盒，其特征在于，包括:固相載體，所述固相載體上攜帶有前述所制備的細胞周期因子;辣根 酶標(biāo)記抗體;辣根酶標(biāo)記抗體稀釋液;洗滌濃縮液;底物顯色液;以及終止液。
[0009]由此，利用本發(fā)明的試劑盒，可以快速，可靠和有效地對血清中CCNY抗體進行檢 測，與免疫組織化學(xué)相比較，本發(fā)明的方法檢測的靈敏度高，成本低，所需設(shè)備簡單，檢測樣 本易獲得，操作方便，易于臨床推廣。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測細胞周期因子Υ抗體的方法。 該方法包括：（1)包被細胞周期因子Υ至試劑板，4°C過夜后洗板，以便得到包被細胞周期因 子Y的固相載體；（2)向所述包被細胞周期因子Y的固相載體中加入5%胎牛血清封閉液，4°C 封閉過夜后洗板，以便得到封閉后的固相載體；（3)將識別細胞周期因子Y的多克隆抗體和 待檢測的血清進行梯度稀釋，加入到所述封閉后的固相載體中，孵育后洗板；（4)向步驟(3) 得到的固相載體中加入辣根酶標(biāo)記抗體，孵育后洗板；（5)向步驟(4)得到的固相載體中加 入底物顯色液；（6)向步驟(5)得到的固相載體中加入終止液，終止反應(yīng)，檢測0D450的值，通 過分析0D450值的大小，判斷血清中細胞周期因子Y抗體濃度。
[0011]由此，利用本發(fā)明的方法，可以快速，可靠和有效地對血清中CCNY抗體進行檢測， 與免疫組織化學(xué)相比較，本發(fā)明的方法檢測的靈敏度高，成本低，所需設(shè)備簡單，檢測樣本 易獲得，操作方便，易于臨床推廣。
[0012] 本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變 得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。
【附圖說明】
[0013]本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點從結(jié)合下面附圖對實施例的描述中將變得 明顯和容易理解，其中：
[0014]圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的制備細胞周期因子Y的流程示意圖；
[0015]圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的檢測血清中細胞周期因子Y抗體的方法流程 圖；
[0016]圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的試劑盒的多克隆抗體標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線示意 圖；
[0017]圖4顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的凝膠電泳結(jié)果示意圖。
【具體實施方式】
[0018]下面詳細描述本發(fā)明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終 相同或類似的標(biāo)號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附 圖描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。
[0019] 在本發(fā)明的描述中，術(shù)語"縱向"、"橫向"、"上"、"下"、"前"、"后"、"左"、"右"、"豎 直"、"水平"、"頂"、"底"等指示的方位或位置關(guān)系為基于附圖所示的方位或位置關(guān)系，僅是 為了便于描述本發(fā)明而不是要求本發(fā)明必須以特定的方位構(gòu)造和操作，因此不能理解為對 本發(fā)明的限制。
[0020] 需要說明的是，術(shù)語"第一"、"第二"僅用于描述目的，而不能理解為指示或暗示相 對重要性或者隱含指明所指示的技術(shù)特征的數(shù)量。由此，限定有"第一"、"第二"的特征可以 明示或者隱含地包括一個或者更多個該特征。進一步地，在本發(fā)明的描述中，除非另有說 明，"多個"的含義是兩個或兩個以上。
[0021] 引物對和制備細胞周期因子Y的方法
[0022]根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了一種引物對。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該引物 對具有SEQIDNO: 1和2所示的核苷酸序列。由此，利用該引物對，可以高效、準(zhǔn)確和快捷地 實現(xiàn)對細胞周期因子Y編碼基因的擴增。
[0023]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了一種制備細胞周期因子Y的方法。參考圖1， 根據(jù)本發(fā)明的實施例，對該方法進行解釋說明，該方法包括：
[0024]S100:擴增細胞周期因子Y編碼基因
[0025] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，采用前述的引物對，擴增細胞周期因子Y編碼基因。由此，通 過該引物對，可以準(zhǔn)確、高效地擴增細胞周期因子Y編碼基因，有利于后續(xù)的轉(zhuǎn)化和表達。
[0026] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，利用PCR擴增細胞周期因子Y編碼基因，其中，反應(yīng)體 系:A549肺腺癌細胞的cDNA2μ1，2υ/μ1pfuDNA聚合酶 1μ1，10πιΜdNTP1μ1、10πιΜ上游引物 和下游引物各ΙμL，10XPCRbuffer5μ1，補水至50μ1;反應(yīng)條件:熱啟動95°C5min;循環(huán)參 數(shù)為:變性94°C30s、退火溫度62.5°C45s、延伸72°Clmin共30個循環(huán);72°C延伸10min，4°C終 止反應(yīng)，以便得到擴增后的細胞周期因子Y編碼基因。由此，在該條件下，利用PCR進行細胞 周期因子Y編碼基因的擴增，擴增準(zhǔn)確率更佳，速度更快。其中，在溫度為62.5°C條件下進行 退火，即保證引物同目的序列有效退火，且非特異性結(jié)合率小，如果溫度過高，引物不易同 目的序列退火，而溫度過低，非特異性結(jié)合率高。
[0027]S200將所得到的細胞周期因子Y編碼基因亞克隆至質(zhì)粒中
[0028]根據(jù)本發(fā)明的實施例，將所得到的細胞周期因子Y編碼基因亞克隆至質(zhì)粒中，獲得 重組質(zhì)粒。
[0029]根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，利用Ncol/Xhol酶切體系將擴增后的細胞周期因子Y編 碼基因雙酶切后克隆至pET30a( + )質(zhì)粒中，得到重組質(zhì)粒，并對重組質(zhì)粒進行擴增。在酶切 連接到質(zhì)粒后，在質(zhì)粒上的終止密碼子前有6個組氨酸表達的核酸序列，利用IPTG誘導(dǎo)啟動 子啟動合成蛋白程序，通過起始密碼子+目的基因+終止密碼子，表達出蛋白。
[0030]S300利用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌
[0031]根據(jù)本發(fā)明的實施例，利用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并對所得到的轉(zhuǎn)化后的大腸 桿菌進行培養(yǎng)，其中，在該培養(yǎng)過程中通過添加IPTG誘導(dǎo)細胞周期因子Y的表達。由此，IPTG 誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌的啟動子啟動合成蛋白程序，高效地表達細胞周期因子Y。
[0032]根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，利用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21大腸桿菌，并對轉(zhuǎn)化后 的大腸桿菌進行培養(yǎng)，當(dāng)轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌的培養(yǎng)液的0D600為0.6時，向轉(zhuǎn)化后的大腸桿 菌培養(yǎng)液中加入IPTG，其中，IPTG的濃度為0.4mM/L，得到細胞周期因子Y，其中，該細胞周期 因子Y是以組氨酸-細胞周期因子Y重組蛋白的形式存在的。由此，當(dāng)轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌的培 養(yǎng)液的0D600為0.6時，大腸桿菌處于對數(shù)生長期，用IPTG誘導(dǎo)表達后，更易得到蛋白產(chǎn)物。 [0033]S400純化細胞周期因子Y
[0034]根據(jù)本發(fā)明的實施例，純化細胞周期因子Y。由此，從破壁的大腸桿菌中純化細胞 周期因子Y，避免雜蛋白對細胞周期因子Y的影響。