專利名稱：人工內切酶及其制法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及分子生物學和酶學領域，更具體地涉及選擇性切割核酸中磷酸二酯鍵的人工內切酶及其制法和用途。
背景技術：
眾所周知，核酸是遺傳信息的攜帶者，是基因表達的物質基礎。它在生物的生長、發(fā)育、繁殖等正常生命活動中具有十分重要的作用，但另一方面，核酸與生命的異常情況，如腫瘤的發(fā)生、放射損傷和遺傳疾病等也密切相關。所以，對核酸的研究已成為現(xiàn)代分子生物學、醫(yī)學和化學生物學研究的重要課題。選擇性地切斷核酸中的磷酸二酯鍵是基因工程的重要問題，但是，在生理條件及非酶存在下，核酸具有很高的穩(wěn)定性。如在pH7及溫度為25℃的環(huán)境中，水解DNA和RNA中磷酸二酯鍵的半衰期分別為8億年和2億年。
目前，水解切斷核酸除用天然酶外還沒有其它有效的辦法，但天然酶識別序列短，一般僅為4～8個堿基，且切斷位點有限，價格昂貴，遠遠不能滿足分子生物學和基因工程的需要。因此，開發(fā)出高效的人工核酸切割試劑的研究，具有非常重要的理論意義和應用價值。
首先，對人工核酸切割試劑的切割機理的研究將大大有助于人們對核酸酶催化機理等生命過程的透徹了解，例如Breslo等通過研究核糖核酸酶A＜RNaseA)的模擬物對RNA的切割機理，來研究RNase A的酶催化機理。而對金屬離子催化核酸水解的機理的研究，可以有助于理解金屬離子參與核酸水解時所起的作用。
其次，核酸切割試劑尤其是定位切割試劑可以作為重要的工具酶。如前所述，天然的核酸限制性內切酶所能識別的堿基序列非常短，只有4～8個堿基對，而在較長的核酸鏈中，這樣短的識別序列出現(xiàn)的頻率會很高，所以當一條較長的核酸鏈被限制性內切酶切斷時，將產生非常多的碎片，這些碎片很難被進一步利用。人工合成的定位切割試劑的識別系統(tǒng)可根據(jù)需要識別任意序列、任意堿基數(shù)的核苷酸，其切割所產生的碎片很少，有利于進一步利用。
第三，人工核酸切割試劑可作為DNA或RNA構象變化的探針及核酸或基因分析的印跡試劑。印跡技術中往往使用化學試劑或是核酸酶來水解與蛋白結合在一起的核酸，但大多數(shù)核酸酶，如脫氧核糖核酸酶I(DNA I)，由于體積太大而只具有有限的分辯率，因此需要更小的化學探針來獲得更高的分辯率。人工核酸切割試劑便可以充當這種化學探針。同理，它也可以作為研究核酸高級結構的探針。
此外，人工核酸切割試劑在疾病的基因治療中有著十分重要的應用。它可以用作各種病癥的DNA堿基診斷試劑、癌癥及愛滋病的特效藥物。
目前的人工核酸切斷試劑大多是以氧化還原反應或自由基的產生為作用機理。其共同特點是要破壞DNA的戊糖環(huán)，從而切斷DNA，應用有局限性。
某些金屬離子雖然水解切斷磷酸二酯鍵，但對DNA的位點無識別作用。例如，沈鶴柏等人在中國科學第31卷第2期(2001年4月)公開了Ce離子可水解寡核苷酸DNA中的磷酸二酯鍵，但都沒有實現(xiàn)對DNA底物(靶序列)的特異性或選擇性切割。
因此，本領域迫切需要開發(fā)可特異性或選擇性識別靶核酸序列的人工內切酶。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的就是提供一種選擇性切割核酸中磷酸二酯鍵的人工內切酶。
本發(fā)明的另一目的是提供所述特異性人工內切酶的制法和用途。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種人工內切酶，它含有識別元件和切割元件，所述的識別元件是6-200個核苷酸的單鏈，切割元件是稀土元素金屬離子，且在單鏈的5′端或3’端具有與鈰離子螯合的鰲合劑，在鰲合劑與單鏈之間具有接頭，且所述的稀土元素選自La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Bo、Y、或其組合。
在一優(yōu)選例中，所述識別元件的核苷酸序列與待切割的核酸分子的核苷酸序列是特異性互補的。
在另一優(yōu)選例中，稀土金屬離子與識別元件之比為0.1∶1-100∶1。更佳地，稀土金屬離子與識別元件之比為1∶1-10∶1。
在另一優(yōu)選例中，識別元件如式(I)所示 式中，ODN為6-50個核苷酸的單鏈。
在另一優(yōu)選例中，稀土金屬離子選自4價鈰離子，所述的接頭源自乙二胺，所述的鰲合劑源自EDTA酸酐。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種制備人工內切酶的方法，包括步驟(a)用磷酸基活化劑使寡核苷酸單鏈上的磷酸基活化，得到磷酸基活化的寡核苷酸單鏈；(b)將步驟(a)中活化的寡核苷酸單鏈與接頭劑連接，形成帶有接頭的寡核苷酸單鏈；(c)將步驟(b)中獲得的寡核苷酸單鏈與鰲合劑反應，形成帶有鰲合劑的寡核苷酸單鏈；(d)將稀土元素金屬離子加入步驟(c)獲得的帶有鰲合劑的寡核苷酸單鏈，形成內切酶，所述的稀土元素選自La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Bo、Y、或其組合。
在一優(yōu)選例中，所述寡核苷酸單鏈含有6-200個核苷酸。
在另一優(yōu)選例中，所述的磷酸基活化劑是咪唑-HCl，所述的接頭劑是乙二胺，所述的鰲合劑是EDTA酸酐。
在另一優(yōu)選例中，步驟(a)是加入pH＝5.5-7.5的咪唑-HCl緩沖液，使磷酸基活化；步驟(b)是加入1-乙基-(3，3-二甲基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽和乙二胺，于5-30℃攪拌反應6-48小時；步驟(c)是加入pH＝5-8的Tris-HCl緩沖液配成的EDTA酸酐溶液，在5-50℃下攪拌反應0.2-2h；步驟(d)是加入Ce(NO3)4或(NH4)2Ce(NO3)6。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種所述人工內切酶在切割核酸方面的用途，即一種核酸切割方法，其中使用本發(fā)明的人工內切酶進行切割。


圖1是本發(fā)明一種人工內切酶的合成路線示意圖。
圖2是本發(fā)明一種人工內切酶與待酶切底物的結合示意圖。
圖3是本發(fā)明一種人工內切酶的酶切產物的電泳圖。其中，泳道a，0.01MCe4+對26-聚寡核苷酸水解切斷結果；泳道b.限制性人工內切酶水解切斷26-聚寡核苷酸結果。箭頭所指的各物質如下(1)26-聚寡核苷酸；(2)16-聚寡核苷酸；(3)10-聚寡核苷酸和限制性人工內切酶的混合物圖4是lgDNA分子量(lgMW)-DNA相對遷移率(Rf)圖。其中，相對遷移率(Rf)指條帶遷移距離占整個凝膠圖像高度的比值。
具體實施例方式
本發(fā)明人經過廣泛而深入的研究，首次將特異性切割所需的識別元件與由鈰離子構成的切割元件連接起來，形成了可識別特定序列并切割DNA中磷酸二酯鍵的人工內切酶。在此基礎上完成了本發(fā)明。
如本文所用，術語“識別元件”指識別并結合于待切割的核酸底物上特定序列的元件。通常，識別元件就是多個核苷酸構成的、序列與靶序列相同或互補的核酸單鏈。識別元件可以是DNA、RNA或其混合物。
識別元件的長度沒有特別限制。取決于人工內切酶的用途，識別元件的長度可以是至少4個核苷酸，較佳的為6-200個核苷酸，更佳的為8-100個核苷酸，最佳的為10-50個核苷酸。一種特別優(yōu)選的識別元件是寡核苷酸(縮寫為“ODN”)。由于PCR合成技術、DNA合成技術以及眾多分離技術的發(fā)展，本領域技術人員可以輕易地獲得或合成識別元件。
如本文所用，術語“切割元件”指人工內切酶中能夠切割DNA的部分。較佳地，所切割的是DNA中的磷酸二酯鍵。一種優(yōu)選的切割元件是稀土元素金屬離子，如鈰離子等，尤其是與鰲合劑部分形成穩(wěn)定結構的鈰離子。
如本文所用，“鰲合劑”指與切割元件(如鈰離子)螯合，從而起穩(wěn)定作用并形成配合物的試劑。可用于本發(fā)明的鰲合劑沒有特別限制，可以是任何起螯合作用，且對識別元件的識別功能和切割元件的切割功能沒有實質性損害的分子。代表性的例子包括(但并不限于)EDTA、氨三乙酸等。
如本文所用，“接頭”指位于識別元件和切割元件之間，起連接作用的分子。由于稀土元素離子如鈰離子通常被鰲合劑所螯合，因此，接頭通常位于識別元件的5’端或3’端和與鈰離子螯合的鰲合劑之間。可用于本發(fā)明的接頭沒有特別限制，可以是任何起連接作用，且對識別元件的識別功能和切割元件的切割功能沒有實質性損害的分子。代表性的例子包括(但并不限于)乙二胺。
本發(fā)明的人工內切酶是人工合成的、能選擇性水解切斷DNA的切斷試劑，由通過接頭連接在一起的識別元件和切割元件組成。在一優(yōu)選例中，本發(fā)明的識別元件是用不同長度和不同堿基序列寡聚DNA，切斷系統(tǒng)是用Ce離子。將寡聚DNA和Ce離子連結合成人工內切酶。
由于識別元件可以識別DNA特定的核苷酸序列，切割元件就可以在想切斷的部位水解切斷DNA的磷酸二酯鍵。
本發(fā)明還提供了制備人工內切酶的方法，該方法包括以下四個步驟(a)磷酸基的活化。
用磷酸基活化劑使寡核苷酸單鏈上的磷酸基活化，從而得到磷酸基活化的寡核苷酸單鏈?？捎糜诒景l(fā)明的活化劑沒有特別限制。優(yōu)選的活化劑包括(但并不限于)咪唑-HCl等。反應通常在pH5.0-8.0，較佳地在pH 5.5-7.5下，以及0-50℃(較佳地5-35℃)的溫度下進行0.1-10小時，較佳地0.5-2小時。
(b)添加接頭在該步驟中，將步驟(a)中活化的寡核苷酸單鏈與接頭劑連接，形成帶有接頭的單鏈寡聚核苷酸?？捎糜诒景l(fā)明的接頭劑沒有特別限制。優(yōu)選的接頭劑包括(但并不限于)乙二胺等。反應通常在pH5.0-8.0，較佳地在pH 5.5-7.5下，以及0-50℃(較佳地5-35℃)的溫度下進行1-100小時，較佳地2-50小時。
此外，該步驟宜在偶聯(lián)劑如1-乙基-(3，3-二甲基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(CDI)存在下進行。一種優(yōu)選方式是先添加CDI，反應約1小時，然后在添加接頭劑。
(c)添加鰲合劑在該步驟中，將步驟(b)中獲得的寡核苷酸單鏈與鰲合劑反應，形成帶有鰲合劑的寡核苷酸單鏈?？捎糜诒景l(fā)明的鰲合劑沒有特別限制。優(yōu)選的鰲合劑包括(但并不限于)EDTA、氨三乙酸等。反應通常在pH4.5-8.5，較佳地在pH5.0-8.0下，以及0-60℃(較佳地10-40℃)的溫度下進行0.1-10小時，較佳地0.5-2小時。
(d)添加稀土元素離子將稀土元素離子(如鈰離子)加入步驟(c)獲得的帶有鰲合劑的寡核苷酸單鏈，即可形成本發(fā)明的內切酶。鈰離子通常以鹽形式加入。
研究已表明，下列稀土元素的金屬離子均對DNA的磷酸二酯鍵具有水解斷裂作用La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Bo、Y、或其組合。關于稀土元素的金屬離子均對DNA的磷酸二酯鍵的水解斷裂作用，可參見各種文獻，例如Komiyama M等人，Nucleosides & Nucleotides，1994，13(6-7)1297-1309；朱兵等人，“稀土元素對3′-腺嘌呤及3′-鳥嘌呤核苷酸的水解裂解作用”化學學報，1998，5647-51；以及康玉專、沈鶴柏等人，稀土，2000，21卷，第6期，第10頁。
可用于本發(fā)明的鈰離子源沒有特別限制。優(yōu)選的鈰離子源包括(但并不限于)鈰的無機酸鹽如鹽酸鹽、硝酸鹽、硫酸鹽，和鈰的有機酸鹽如乙酸鹽，或其混合物等。鈰的化合價可以是2價、3價或4價，或其組合。優(yōu)選的鈰的化合價是4價。特別優(yōu)選的是鈰的無機酸鹽如鹽酸鹽、硝酸鹽。
本發(fā)明的人工內切酶在大范圍的pH值、溫度和工作濃度下均可有效地切割核酸分子。通常其工作pH約為4.0-8.5，較佳地pH約為5-7.5。工作溫度約為0-60℃，較佳地約25-50℃。工作濃度以鈰離子計大于約1×10-4mol/L即可，例如1×10-4mol/L-5×10-1mol/L。
本發(fā)明的人工內切酶作為一種工具酶在分子生物學、遺傳工程和醫(yī)療領域中有廣泛的應用。其主要優(yōu)點在于(1)對于不被天然內切酶識別序列，可以設計和合成特異性的本發(fā)明的人工內切酶。例如對于某些與疾病相關的單核苷酸多態(tài)性(SNP)，可以通過PCR擴增特定片段，然后用識別該SNP的內切酶切割，從而進行檢測。
(2)特異性地識別和切割核酸底物。
(3)制法簡便，成本低廉。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
試劑和儀器26聚寡聚核苷酸的DNA序列為5’-GGAGGCGAACGATACGCATCGACTGT-3’，10聚寡核苷酸的DNA序列是5’-GTTCGCCTCC-3’，均購自上海生工生物工程有限公司。其余試劑均為市售分析純。
實施例1人工內切酶的合成識別元件是10-聚寡核苷酸(ODN)，其序列為5’-X GTT CGC CTC C-3’，其中X為磷酸基團。用該序列的ODN，按圖1所示路線合成人工內切酶。方法如下(1)磷酸基活化往5’-P-10-mers ODN中加入pH＝5-8的咪唑-HCl(Imidazole-HCl)緩沖液，于25℃攪拌反應1-2小時，使5’-P-10-mers ODN上的磷酸基活化。
(2)添加接頭在充分振蕩后加入1-乙基-(3，3-二甲基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(CDI)，再加入乙二胺，于25℃攪拌反應12-24小時。純化后得到帶EDA的5’-P-10-mersODN(5’-EDA-P-10-mers ODN)。
(3)添加鰲合劑向5’-EDA-P-10-mers ODN中加入pH＝5-8的Tris-HCl緩沖液，使其溶解，再加EDTA酸酐，在30℃下攪拌反應0.5-1h后得到5’-EDTA-P-10-mers ODN。
(4)添加鈰離子加入Ce離子(Ce(NO3)4形式)，得到ODN-Ce配合物，即人工內切酶。
實施例2定位切斷在該實施例中，測試實施例1中制備的10-mers ODN-鈰配合物人工核酸酶定位切斷26-mers Oligo DNA的能力。
不同來源的DNA單鏈之間若有互補序列或同源順序部分，則能通過分子雜交，在退火條件下形成雜合雙鏈。5’-EDTA-P-10-mers ODN中寡聚核苷酸結構中的10個堿基與26-mers ODN(序列為5’-GGA GGC GAA CGA TAC GCA TCG ACTGT-3’)中的10個堿基互補，所以在適當?shù)臈l件下可以以堿基互補配對原則，雜交形成雙螺旋結構，如圖2所示。
將26聚的寡核苷酸底物和實施例1的人工內切酶，在pH＝6-8的Tris-HCl緩沖液中與30℃-40℃溫度下，反應24-48小時。然后取反應產物進行電泳。
定位切斷的電泳圖如圖3所示。結果，26聚的核酸底物被切割成10聚和16聚的產物。這表明人工核酸酶能對Oligo DNA進行高效的定位切斷。
實施例3相對遷移率的測定重復實施例2并測定相對遷移率。這里的相對遷移率是指條帶遷移距離占整個凝膠圖象高度的比值。采用Smart View2001軟件得到已知分子的lgMW和Rf，由最小二乘法算出相應的一次方程，并最終求出未知分子量。
結果如圖4所示，圖中數(shù)據(jù)點的分子量分別對應于10和16個堿基的寡核苷酸。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
權利要求
1.一種人工內切酶，其特征在于，它含有識別元件和切割元件，所述的識別元件是6-200個核苷酸的單鏈，切割元件是稀土元素金屬離子，且在單鏈的5′端或3’端具有與鈰離子螯合的鰲合劑，在鰲合劑與單鏈之間具有接頭，且所述的稀土元素選自La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Bo、Y、或其組合。
2.如權利要求1所述的內切酶，其特征在于，所述識別元件的核苷酸序列與待切割的核酸分子的核苷酸序列是特異性互補的。
3.如權利要求1所述的內切酶，其特征在于，稀土金屬離子與識別元件之比為0.1∶1-100∶1。
4.如權利要求1所述的內切酶，其特征在于，稀土金屬離子與識別元件之比為1∶1-10∶1。
5.如權利要求1所述的內切酶，其特征在于，識別元件如式(I)所示 式中，ODN為6-50個核苷酸的單鏈。
6.如權利要求1所述的內切酶，其特征在于，稀土金屬離子選自4價鈰離子，所述的接頭源自乙二胺，所述的鰲合劑源自EDTA酸酐。
7.一種制備人工內切酶的方法，其特征在于，包括步驟(a)用磷酸基活化劑使寡核苷酸單鏈上的磷酸基活化，得到磷酸基活化的寡核苷酸單鏈；(b)將步驟(a)中活化的寡核苷酸單鏈與接頭劑連接，形成帶有接頭的寡核苷酸單鏈；(c)將步驟(b)中獲得的寡核苷酸單鏈與鰲合劑反應，形成帶有鰲合劑的寡核苷酸單鏈；(d)將稀土元素金屬離子加入步驟(c)獲得的帶有鰲合劑的寡核苷酸單鏈，形成內切酶，所述的稀土元素選自La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Bo、Y、或其組合。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，寡核苷酸單鏈含有6-200個核苷酸。
9.如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述的磷酸基活化劑是咪唑-HCl，所述的接頭劑是乙二胺，所述的鰲合劑是EDTA酸酐。
10.如權利要求7所述的方法，其特征在于，步驟(a)是加入pH＝5.5-7.5的咪唑-HCl緩沖液，使磷酸基活化；步驟(b)是加入1-乙基-(3，3-二甲基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽和乙二胺，于5-30℃攪拌反應6-48小時；步驟(c)是加入pH＝5-8的Tris-HCl緩沖液配成的EDTA酸酐溶液，在5-50℃下攪拌反應0.2-2h；步驟(d)是加入Ce(NO3)4或(NH4)2Ce(NO3)6。
全文摘要
本發(fā)明提供了可選擇性切割核酸中磷酸二酯鍵的人工內切酶及其制法和用途。所述的內切酶含有識別元件和切割元件，所述的識別元件是6－200個核苷酸的單鏈，切割元件是稀土金屬離子，在單鏈核苷酸的5′端或3’端具有與金屬離子螯合的螯合劑，且在螯合劑與單鏈之間具有接頭。本發(fā)明的人工內切酶可作為工具酶廣泛應用于分子生物學、遺傳工程和醫(yī)療領域。
文檔編號C12N9/14GK1475564SQ0213648
公開日2004年2月18日 申請日期2002年8月14日 優(yōu)先權日2002年8月14日
發(fā)明者沈鶴柏 申請人:上海師范大學