專利名稱：兩條人工合成的位點特異重組識別序列及其應(yīng)用的制作方法
兩條人工合成的位點特異重組識別序列及其應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及人工改造和合成高效特異的位點特異性重組酶系統(tǒng)的識別序列。
背景技術(shù)：
位點特異性重組系統(tǒng)(site-specific recombination system)被發(fā)現(xiàn)廣泛存在于原核生物和低等真核生物，涉及一系列的生物學(xué)功能(Wang Y. J.，et al. Recombinase technology: applications and possibilities. Plant Cell Rep. 2011， 30: 267-285)。位點特異重組描述了一類多樣化的涉及到特定DNA位點之間發(fā)生相互交換的重組進程，其定義涉及到三個方面①需要兩段DNA序列合作；②需要一個特殊的重組酶蛋白來識別重組位點并打斷和重新連接DNA分子；③遵從磷酸二酯鍵能量守恒的規(guī)律來完成 DNA分子的斷裂與再連接過程。其中的位點，或者叫識別位點(recognition site),是指被重組酶識別用以執(zhí)行重組反應(yīng)的DNA特定序列。位點特異重組發(fā)生在特定的識別位點處， 涉及到DNA片段的切割與再連接，導(dǎo)致DNA片段的整合、刪除或顛倒。具體發(fā)生哪種重組反應(yīng)，由兩個識別位點的相對方向和位置決定第一種情況下，一對同向的識別位點位于同一 DNA分子上時，重組酶催化刪除(excision/deletion)反應(yīng)，兩個識別位點之間的所有片段和一個識別位點將被刪除，留下一個識別位點。第二種情況下，一對反向的識別位點位于同一個DNA分子上時，重組酶催化倒位(inversion)反應(yīng)，將兩個識別位點之間的所有片段倒置。第三種情況下，如果一個識別位點位于染色體DNA分子上，另一個識別位點位于游離的質(zhì)粒或線性DNA分子上，重組酶的催化會發(fā)生分子間的片段互換，導(dǎo)致形成雜合染色體，將質(zhì)?；蚓€性DNA分子的片段整合到染色體DNA分子上。
重組酶的類型按重組酶蛋白的催化結(jié)構(gòu)域所包含的氨基酸殘基類型可以將重組酶超級家族分為兩個基本族群，分別是酪氨酸家族和絲氨酸家族。按照酶蛋白分子的大小和重組模式，每個家族又可以細分為不同的單個成員。
最早和研究最清楚的位點特異重組酶系統(tǒng)包括Cre/loxP，F(xiàn)LP/FRT和R/RS，其中的Cre，F(xiàn)LP和R是雙向的酪氨酸家族重組酶，而對應(yīng)的loxP，F(xiàn)RT和RS則是DNA識別位點。 這類雙向的酪氨酸亞家族重組酶介導(dǎo)的遺傳交換發(fā)生在同一的識別為點之間，在自然條件下這種重組反應(yīng)是完全可逆的，但是分子內(nèi)重組(即刪除作用)的效率遠高于分子間的重組 (整合)。單向的酪氨酸亞家族重組酶的識別位點是非同一的，通常被稱為attB(attachment site bacteria)和 attP (attachment site phage)。在缺少稱之為刪除酶(excisionase) 的輔助蛋白存在下，這一類的重組反應(yīng)是不可逆的。這一亞家族中已經(jīng)被證明對基因組操作有用的重組酶包括HK022和改造過的入。
根據(jù)蛋白酶分子的大小，絲氨酸家族的重組酶也可以分為明顯的兩類。小分子的絲氨酸亞家族包含 β -six, γ δ-res, CinH_RS2 和 ParA-MRS, 其中 β , y δ , CinH 和 ParA 是重組酶，而six，res, RS2和MRS是對應(yīng)的DNA識別位點。這一類重組酶雖然也采用同一的識別位點，但實際觀察只發(fā)現(xiàn)了分子內(nèi)的刪除事件發(fā)生，有研究表明由于小分子絲氨酸重組酶的構(gòu)象扭曲導(dǎo)致了它不能促進分子間的整合反應(yīng)，因此，由這一類重組酶介導(dǎo)的刪除被認為是不可逆的事件。代表大分子絲氨酸亞家族的重組酶包括PhiC31，TP901-l，R4， 和Bxbl。這些重組酶作用在兩個序列不同的識別位點上，常稱之為attB和attP，重組后產(chǎn)生新的雜合識別位點attL和attR。這類重組酶能夠催化刪除，倒位和整合反應(yīng)的發(fā)生，但由于重組反應(yīng)后原始識別位點attB和attP改變成attL和attR,因此逆反應(yīng)無法發(fā)生，除非引入一個刪除酶作為第二蛋白輔助。
系統(tǒng)及其作用機制1981年，Sternberg和Hamilton在Pl卩遼菌體中發(fā)現(xiàn)了 Cre/loxP位點特異性重組系統(tǒng)(Sternberg N, Hamilton D. Bacteriophage Pl site-specific recombination :1. Recombination between IoxP sites. J. Mol. Biol. , 1981, 150(4): 467-486)。Pl 曬菌體侵染宿主之后，其基因組DNA在通常情況下并不整合至宿主染色體，而是以單拷貝可自主復(fù)制的環(huán)狀質(zhì)粒形式存在于宿主細胞中。通過缺失分析和足跡分析發(fā)現(xiàn)這個系統(tǒng)的必須元素包括一個重組酶(命名為Cre)和兩個特異性位點(命名為IoxP位點),它們的關(guān)系是 Cre重組酶通過特異性識別IoxP位點發(fā)生作用。
Cre重組酶是由1029bp的一段序列編碼的38kD的蛋白，是整合家族中的一員，具有整合家族的特性，即在離體狀態(tài)下，無輔助因子、拓撲異構(gòu)酶和DNA不復(fù)制時，不需要額外的能量也能夠發(fā)揮作用。Cre重組酶在水溶液中是以單體的形式存在，其熱穩(wěn)定性較強， 最適反應(yīng)溫度為37°C，甚至在高達46°C的情況下仍有活性，因此Cre重組酶適合在這個溫度范圍內(nèi)使用。這一生存溫度的廣譜性就決定了其能夠在哺乳動物的遺傳操作中得到廣泛應(yīng)用。
Cre重組酶由兩個不同區(qū)域折疊而成——較大的C-末端結(jié)構(gòu)域和較小的N-末端結(jié)構(gòu)域，中間由一個短鏈相連。這兩個結(jié)構(gòu)域形成“夾子”結(jié)構(gòu)，以便更好地和大小溝充分接觸。N-端和序列識別有關(guān)，其末端由第20至第120個氨基酸組成；C-端和DNA的結(jié)合及DNA鏈的切割有關(guān)，其末端由第132至第341個氨基酸組成，是Cre重組酶的主要活性中心。在重組過程中，Cre重組酶的C-末端構(gòu)象出現(xiàn)的較大偏差，而2個與Ioxp位點結(jié)合的 N-末端結(jié)構(gòu)卻相似的現(xiàn)象說明兩個亞基中只有一個有剪切活性。
LoxP位點是Cre重組酶的特異識別位點，是一個大小為34bp的DNA序列,包括2 個13bp的反向重復(fù)序列和一個8bp的非對稱間隔區(qū)域。其中間隔區(qū)和其臨近的4bp堿基構(gòu)成反應(yīng)的核心區(qū)(圖1)(王立霞等.Cre重組酶結(jié)構(gòu)與功能的研究進展.生物工程學(xué)報，2002，18(5) : 531-535)。間隔區(qū)8bp序列是反應(yīng)的核心部位，重組過程中DNA鏈的切割和連接均在此進行，而且其非對稱性就決定了 IoxP識別序列具有方向性，從而決定了重組的方向性。
重組機制是4個Cre重組酶分子和2個IoxP位點結(jié)合形成一個復(fù)合體，由于識別的對應(yīng)性，其中只有2個Cre重組酶分子是有活性的。反應(yīng)進行時，Cre重組酶先與DNA結(jié)合，但結(jié)合力較弱。當(dāng)遇到一個IoxP位點時，其結(jié)合作用增強，約是原先作用的20倍以上， 但當(dāng)遇到兩個IoxP位點時,其結(jié)合能力就更強。在Cre重組酶的作用下兩個IoxP位點會發(fā)生聯(lián)會，形成復(fù)合體；然后C末端的Tyr-324與DNA分子的3’ -PO4共價結(jié)合導(dǎo)致DNA — 條鏈的切割；切割后另一條鏈的5’-OH既可與原斷裂部位的3’-P04結(jié)合恢復(fù)原來的構(gòu)型，也可以與另一切割部位的3’ -PO4結(jié)合,形成一個“Holliday”結(jié)構(gòu)的中間體；Holliday中間體會發(fā)生異構(gòu)化，這時在第一次切割過程中發(fā)揮作用的2個Cre酶不再起作用，而兩外2 個Cre酶進行切割DNA的另外一條鏈，并將切割后的兩條鏈連接起來，去掉中間產(chǎn)物，這樣便完成了重組過程。
位點特異重組系統(tǒng)的應(yīng)用位點特異重組作為遺傳工程中最重要的重組技術(shù)，擁有多項生物學(xué)功能，包括介導(dǎo)DNA 片段的刪除、倒位和整合；且與其他重組技術(shù)比較，擁有靶向性高、不易受位置效應(yīng)影響和重組效率高等明顯的優(yōu)勢，尤其適合于高等真核生物的應(yīng)用。因此，該技術(shù)受到廣大研究者們的普遍重視，被廣泛應(yīng)用于基因組工程的各個領(lǐng)域。這些應(yīng)用包括①重組酶介導(dǎo)的刪除應(yīng)用；②重組酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)控制；③重組酶介導(dǎo)的染色體工程重組酶介導(dǎo)的整合效益；⑤重組酶介導(dǎo)的整合與刪除的聯(lián)合策略；⑥重組酶介導(dǎo)的盒式交換。其中重組酶介導(dǎo)的刪除應(yīng)用受到高度關(guān)注，成為了植物中的應(yīng)用熱點，該技術(shù)是最早用來產(chǎn)生無選擇標記基因的轉(zhuǎn)基因植物的技術(shù)之一，應(yīng)用該技術(shù)能夠消除標記基因在環(huán)境生物安全的潛在基因漂移威脅。標記基因的移除也能保證相同的標記基因能夠在隨后的下一輪基因轉(zhuǎn)化中再次被使用。目前，已報道了一大批重組介導(dǎo)的標記刪除策略在現(xiàn)代植物中的應(yīng)用和作物物種中的應(yīng)用。2006年，孟三都公司利用Cre/loxP系統(tǒng)研發(fā)的首例應(yīng)用于商業(yè)化的無標記轉(zhuǎn)基因玉米LY038獲得了美國國家專利局的專利許可。
然而，已報道的位點特異性重組酶系統(tǒng)，其介導(dǎo)的刪除應(yīng)用的刪除效率均十分有限，難以滿足大規(guī)模生產(chǎn)實踐應(yīng)用的需要。羅克明等的研究表明(Luo，K.M.，et al.’ GM-gene-deletor’ fused loxP-FRT recognition sequences dramatically improve the efficiency of FLP or CRE recombinase on transgene excision from pollen and seed of tobacco plants. Plant Biotechnol. J., 2007, 5: 263-274),改造和應(yīng)用新的更高效的識別位點有助于提高位點特異性重組酶系統(tǒng)的重組效率。發(fā)明內(nèi)容
鑒于以上情況，為了提高Cre/loxP位點特異性重組酶系統(tǒng)的重組效率，有效增加其介導(dǎo)的刪除應(yīng)用的刪除效率并應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物的安全技術(shù)中，本發(fā)明提供了兩條人工合成的新的高效特異的重組酶識別位點序列，將其應(yīng)用于植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)中，成功介導(dǎo)并高效特異地刪除了外源基因。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案本發(fā)明提供了一條人工合成的位點特異性重組酶系統(tǒng)的識別序列，所述的識別序列為如下1)、2)、3)或4)的DNA序列1)具有如SEQID NO.1所示的DNA序列；2)與I)限定的DNA序列具有80%以上的同源性，且具有與SEQID NO.1相同功能的 DNA序列；3)在嚴格條件下與I)限定的DNA序列雜交且具有與SEQID NO.1相同功能的DNA序列；4)將SEQID NO.1的序列經(jīng)過單核苷酸或寡核苷酸插入、缺失或替換所產(chǎn)生的且與SEQ ID NO.1具有相同功能的由SEQ ID NO.1衍生的DNA序列。
本發(fā)明還提供了另外一條人工合成的位點特異性重組酶系統(tǒng)的識別序列，所述的識別序列為如下1)、2)、3)或4)的DNA序列1)具有如SEQID NO. 2所示的DNA序列；2)與I)限定的DNA序列具有80%以上的同源性，且具有與SEQID NO. 2相同功能的 DNA序列；3)在嚴格條件下與I)限定的DNA序列雜交且具有與SEQID NO. 2相同功能的DNA序列；4)將SEQID NO. 2的序列經(jīng)過單核苷酸或寡核苷酸插入、缺失或替換所產(chǎn)生的且與SEQ ID NO. 2具有相同功能的由SEQ ID NO. 2衍生的DNA序列。
所述的識別序列是能夠被重組酶特異識別和切割，與重組酶一起組成位點特異性重組酶系統(tǒng)，并高效地實現(xiàn)其所有生物學(xué)功能。
所述重組酶為Cre重組酶或FLP重組酶。
所述的識別序列是以細菌噬菌體Pl來源的Cre/loxP系統(tǒng)的識別位點IoxP為改造對象，以IoxP的DNA序列的部分或全部進行延長或串聯(lián)重復(fù)，并在每一個延長或串聯(lián)的片段之間添加1-4個間隔堿基。
本發(fā)明還提供了一種表達載體，所述表達載體含有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO. 2 所示的識別序列。
所述表達載體含有一個重組酶表達盒和兩個同向的如權(quán)利要求1或2所述的識別序列。
本發(fā)明另外還提供了上述表達載 體的應(yīng)用，該應(yīng)用是將所述表達載體轉(zhuǎn)化植物或植物部分。
所述的植物部分為細胞、原生質(zhì)體、細胞組織培養(yǎng)物、愈傷組織、細胞塊、胚芽、花粉、胚珠、花瓣、花柱、雄蕊、根、莖、葉、種子、根尖及花藥中的任一種。
所述植物為糧食作物、蔬菜作物、花卉作物、能源作物中的任一種。
本發(fā)明的顯著優(yōu)點本發(fā)明成功的獲得了兩條新的高效特異的識別位點，能夠在重組酶的介導(dǎo)下導(dǎo)致外源基因被成功、有效并特異地刪除。
本發(fā)明利用所獲得的兩條識別序列來構(gòu)建高效特異的位點特異性重組酶系統(tǒng)并應(yīng)用于植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)中，用來高效刪除不再需要的植物轉(zhuǎn)基因，提高了轉(zhuǎn)基因植物的生物安全性和食品安全性，并有利于提高公眾對轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的接受程度，具備顯著的社會效益和經(jīng)濟效益。


圖1為IoxP位點的DNA序列；大的空心箭頭表示IoxP位點的左右臂(arms)，互為反向重復(fù)序列；小箭頭表示重組酶識別切割的位點。
圖2為新的識別位點的設(shè)計方案；A表示IoxP位點，B表示LI位點，C表示L2位點；箭頭表示IoxP位點的arms,箭頭方向表示arms的方向；短的矩形框表示IoxP位點的間隔序列。
圖3為含有新的識別位點的植物表達載體的T-DNA區(qū)的結(jié)構(gòu)示意圖；LB，T-DNA的左邊界；RB, T-DNA的右邊界；識別位點表示新的識別位點LI或L2 ;Actinl表示基因的啟動子\gus表示J3 -glucuronichso基因；Tnos表示農(nóng)桿菌胭脂合成酶的終止序列； Gluc表示胚乳特異性基因基因的啟動子；CreM表示經(jīng)過人工密碼子偏好優(yōu)化改造過的cre重組酶基因；CaMV35S表示花椰菜花葉病毒35S的啟動子;如(//表示潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因。
圖4為PCR擴增片段檢測轉(zhuǎn)基因水稻再生植株；泳道1-12為轉(zhuǎn)質(zhì)粒 P1300-GUSACS-L1的水稻再生植株；泳道M表示DNA的分子Marker ;泳道13-22為轉(zhuǎn)質(zhì)粒 P1300-GUSACS-L2的水稻再生植株'gus片段的PCR擴增產(chǎn)物的大小為643bp。
圖5為轉(zhuǎn)基因水稻的⑶S組織化學(xué)染色分析;A表示轉(zhuǎn)質(zhì)粒P1300-GUSACS-L1、 P1300-GUSACS-L2和對照質(zhì)粒pCAMBIA1300_AGS的再生水稻的營養(yǎng)器官的⑶S組織化學(xué)染色結(jié)果的示例，其中A-1為根組織，A-2為莖組織，A-3為葉組織；B表示非轉(zhuǎn)基因水稻植株的營養(yǎng)器官的⑶S組織化學(xué)染色結(jié)果的示例，其中B-1為根組織，B-2為莖組織，B-3為葉組織；C為轉(zhuǎn)不同質(zhì)粒水稻種子的GUS組織化學(xué)染色結(jié)果的示例，其中C-1為非轉(zhuǎn)基因的種子，C-2為轉(zhuǎn)質(zhì)粒pl300-GUSACS-Ll或pl300-GUSACS_L2的再生水稻的種子，C-3為轉(zhuǎn)對照質(zhì)粒pCAMBIA1300-AGS的再生水稻的種子。
具體實施方式
本發(fā)明提供了兩條人工合成的新的高效特異的重組酶識別位點序列，將其應(yīng)用于植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)中，成功介導(dǎo)并高效特異地刪除了外源基因。具體的步驟為1、根據(jù)IoxP位點的結(jié)構(gòu)和作用機制并參考羅克明等的改造方法，以IoxP位點的全部或部分序列為基礎(chǔ)進行延長或串聯(lián)重復(fù)，并在每一段延長或串聯(lián)重復(fù)的片段之間添加1-4 個堿基進行間隔，以此構(gòu)成新的識別位點；2、設(shè)計兩段短序列，使之分別含有相同的以上兩個同向的新的識別位點，并在每一個新的識別位點的兩側(cè)都添加幾個限制酶位點以方便后續(xù)載體構(gòu)建。按照設(shè)計的方案，人工合成這兩條短片段并插入到中間載體pGH中，經(jīng)過測序驗證；3、分別以合成的兩個短片段為基礎(chǔ)構(gòu)建植物表達載體，使得組成型啟動子控制的目的基因(GUS)表達盒和胚乳特異性啟動子控制的重組酶基因表達盒均被置于兩個同向的識別位點之間，并將構(gòu)建物轉(zhuǎn)化水稻細胞，獲得轉(zhuǎn)基因水稻植株；4、通過檢測轉(zhuǎn)基因水稻種子中GUS基因在胚和胚乳組織的表達差異，來分析和判斷外源基因(⑶S基因表達盒和重組酶基因表達盒)是否被成功、有效地刪除。
以下結(jié)合具體實施例進一步闡述本發(fā)明，但是本發(fā)明不限于此。本發(fā)明所用的植物材料為日本晴水稻(Oryza sativa L. japonica ck ),其它實驗材料如無特別說明均為市售購買產(chǎn)品。
實施例1新識別位點的設(shè)計與合成根據(jù)IoxP位點的結(jié)構(gòu)和作用機制并參考羅克明等的改造方法，以IoxP位點的全部或部分序列為基礎(chǔ)進行延長或串聯(lián)重復(fù)，并在每一段延長或串聯(lián)重復(fù)的片段`之間添加1-4個堿基進行間隔，以此構(gòu)成新的識別位點，分別設(shè)計為LI和L2。其中LI為IoxP位點的雙片段串聯(lián)重復(fù)，中間添加了 4個堿基的間隔序列，其結(jié)構(gòu)示意圖如圖2B所示，序列如SEQ ID NO.1所示；L2為以IoxP位點為基礎(chǔ)，在其兩側(cè)分別以原有的arms為單位繼續(xù)重復(fù)串聯(lián)2倍，并在每個arms之間添加一個堿基,其結(jié)構(gòu)示意圖如圖2C所示,序列如SEQ ID NO. 2所/Jn ο
為了驗證新的識別位點LI和L2的功能，我們分別設(shè)計合成了兩個短片段L3和 L4。其中L3含有兩個同向的LI片段且在每個LI片段的兩端均添加了適當(dāng)?shù)拿盖形稽c以方便于后續(xù)的載體構(gòu)建，其序列如SEQ ID NO. 3所示，經(jīng)人工合成后插入載體pGH中得到 PGH-Ll并經(jīng)過測序驗證；L4含有兩個同向的L2片段且在每個L2片段的兩端均添加了適當(dāng)?shù)拿盖形稽c以方便于后續(xù)的載體構(gòu)建，其序列如SEQ ID NO. 4所示，經(jīng)人工合成后插入載體 PGH中得到pGH-L2并經(jīng)過測序驗證。
實施例2植物表達載體的構(gòu)建2.1 植物表達載體 pl300-GUSACS-Ll 和 pl300_GUSACS_L2 的獲得用&ORI和AiI雙酶切載體pl300-Gluc-CreM-Tnos，補平后回收3. 8kb大小的片段 (Gluc-CreM-Tnos),插入到經(jīng)5 Ι單酶切并補平和去磷酸化處理的pGH_Ll載體上,構(gòu)建成中間載體PCre-Ll ;用通ol和AiI雙酶切質(zhì)粒pl300_LF_GFSAGS，補平后回收3. 6kb左右大小的片段(Actinl-GUS-Tnos)，將其插入到用ZAoI單酶切并補平和去磷酸化處理的中間載體pCre-Ll中，構(gòu)建成中間載體pCre_Gus_Ll ;用/*1^11單酶切中間載體pCre-Gus_Ll, 補平后回收8. Okb左右大小的片段(Actinl-Gus-Tnos-Tnos-CreM -Gluc),連接到質(zhì)粒 PCAMBIA1300的&oRI位點(預(yù)先補平處理)，構(gòu)建成最終表達載體pl300-GUSACS_Ll，其 T-DNA區(qū)的結(jié)構(gòu)如圖3所示。
通過類似的構(gòu)建流程，將pGH-Ll替換為pGH-L2，獲得植物表達載體 P1300-GUSACS-L2。
2.2陽性對照表達載體PCAMBIA1300-AGS的獲得用限制酶沿ol和油al雙酶切質(zhì)粒pBlue-AGS獲得⑶S表達盒片段，插入到Sal\和 Xbal雙酶切的質(zhì)粒pCAMBIA1300中，構(gòu)建得到植物表達載體pCAMBIA1300 - AGS。
實施例3轉(zhuǎn)基因水稻的獲得3.1 NB培養(yǎng)基配方(基本培養(yǎng)基)N6 大量硝酸鉀 KNO3 2830 mg. L_\ 硫酸氨(NH4) 2S04 4 6 3 mg. Λ 磷酸二氫鉀 KH2PO4 400 mg. Γ1，硫酸鎂 MgSO4 · 7Η20 185 mg. Λ 氯化鈣 CaC12 · 2H20 1 66 mg. L-1 ；B5 微量硼酸 H3BO4 3 mg. Λ 硫酸錳 MnSO4 .H2O 7. 58 mg. Λ 硫酸鋅 ZnSO4 · 7Η20 2 mg. ΙΛ 碘化鉀 KI O. 75 mg. Λ 鑰酸鈉 Na2Mo04 · 2H20 0. 25 mg. Λ 硫酸銅 CuSO4 · 5H200.025 mg. ΙΛ 氯化鈷 CoCl2 · 6H20 0. 025 mg. L-1 ；鐵鹽硫酸亞鐵 FeSO4 · 7H20 27. 8 mg. Γ1，乙二胺四乙酸二鈉 Na2EDTA 37. 3 mg. Γ1 ； 肌醇肌醇 Myo-1nositol 100 mg. L-1 ；有機成分鹽酸硫胺素ThiamineHCl 10 mg.171,鹽酸批卩多醇PyridoxineHCl I mg.171,尼克酸 Niacin I mg.171,水解酪蛋白 Casamino acids 300 mg.L—1，谷氨酰胺 Glutamine 250 mg. L-1,腦氨酸 Proline 500 mg. L-1,甘氨酸 Glycine 2 mg. L-1,鹿糖 Sucrose 30000 mg. L-1,瓊脂 Phytagel 2400 mg. L-1 pH 值 5· 8-5. 9。
注意有機成分不能高壓滅菌，須用濾器抽濾，分裝后-20°C保存 3.2愈傷組織的培養(yǎng)取水稻幼穗開花12-15 d后的幼嫩種子，剝?nèi)シf殼，于75%的乙醇滅菌O. 5-1 min, 再用10-30%次氯酸納溶液滅菌15-30 min,超凈臺中無菌水沖洗3_4遍，置于無菌濾紙上晾干。用鑷子及解剖針取出幼胚，置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基(基本培養(yǎng)基+ 2，4 - D 2 mg L-1 ；pH 5.8-5.9)上，27° C暗培養(yǎng)。10-15 d后切除幼胚的芽鞘等，只留下末端的細胞膨大體，轉(zhuǎn)接于新的誘導(dǎo)培養(yǎng)基(基本培養(yǎng)基+ 2，4 - D 2 mg Γ1 ；pH 5.8-5.9)中，其后每20 d在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)I次，3次后獲得生長迅速的胚性愈傷組織作農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。
3. 3農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化參照BIO-RAD公司電激儀的說明書，分別將植物表達載體P1300-GUSACS-L1、 P1300-GUSACS-L2和對照載體pCAMBIA1300_AGS通過電激法轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌LBA4404中。
取生長旺盛的胚性愈傷組織于滅菌培養(yǎng)皿中，加入相應(yīng)濃度(00_值1-2)的農(nóng)桿菌液(上述載體轉(zhuǎn)化后的根癌農(nóng)桿菌LBA4404)浸泡3-5 min后將愈傷組織取出晾干，然后轉(zhuǎn)接于鋪有一張無菌濾紙的共培養(yǎng)基(基本培養(yǎng)基+ 2，4 - D 2 mg Γ1 + AS 100 μΜ ；ρΗ5.2)上，28 ° C避光共培養(yǎng)2-3 d。共培養(yǎng)后，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到無菌培養(yǎng)皿中，超凈臺中無菌水漂洗3次，再用含羧芐青霉素250 mg L—1的無菌水洗I次以殺除農(nóng)桿菌，取出愈傷組織后用無菌濾紙吸干，轉(zhuǎn)接于含羧芐青霉素250 mg L—1和hygromycin 50 mg L—1或PPT 15 mg L—1的篩選培養(yǎng)基(基本培養(yǎng)基+ 2， 4 - D 2 mg Γ1 +羧芐青霉素250 mg Γ1 + hygromycin 50 mg I71 (或 PPT 15 mg L-1,pH 5.8-5· 9)上 28。C 避光培養(yǎng)篩選抗性愈傷組織。侵染過的愈傷組織在篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)20-30 d后，將邊緣長出的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)接于新的篩選培養(yǎng)基上繼續(xù)篩選1-2次。
在篩選培養(yǎng)基篩選獲得的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)接于分化培養(yǎng)基(基本培養(yǎng)基+ KT 10 mg I/1+ NAA 0.4 mg Γ1 ；ρΗ 5· 8_5· 9)上，28° C 暗培養(yǎng) 7-10 d，然后移至光照下(14 h/ d)培養(yǎng)，隨后逐漸長出綠點，最后分化成小苗。小苗完全分化后，轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基中(1/2 MS無機鹽(指無機鹽含量減半)+ MS有機成分(是指NB培養(yǎng)基配方(基本培養(yǎng)基)中的有機成分，包含鹽酸硫胺素ThiamineHCl 10 mg.廠1,鹽酸批卩多醇PyridoxineHCl I mg.171, 尼克酸 Niacin I mg.171,水解酪蛋白 Casamino acids 300 mg.171,谷氨酸胺 Glutamine 250 mg. L \ 腦氛酸 Proline 500 mg. L S 甘氛酸 Glycine 2 mg. L \ 鹿糖 Sucrose 30000 mg.171,瓊脂 Phytagel 2400 mg. L-1) + hygromycin 30 mg L-1 (或 PPT 10 mg L-1) ；pH5.8-5.9)28 ° C，光照14 h/d培養(yǎng)14-21 d進行生根并篩選。生根后獲得的抗性小苗洗去根部培養(yǎng)基后，移于1/10 MS營養(yǎng)液水培3-5 d可長出新根，然后移栽 于溫室或網(wǎng)室水田。
3. 4轉(zhuǎn)基因水稻的PCR檢測提取植物基因組DNA，采用CTAB法，過程如下取約O.1g的水稻葉片在液氮中磨成粉末，將適量的粉末材料轉(zhuǎn)移至1. 5mlEP管中。加 Λ 600μ1預(yù)熱(95°C)的1. 5X CTAB緩沖液，然后65°C溫浴45min。取出EP管，冷卻至室溫后加入600μ1氯仿異戊醇(24:1)混合均勻，然后IOOOOrpm離心lOmin，取出后吸取上清液到另一新的EP管中。加入2/3體積的異丙醇混合均勻，冰浴至DNA絲狀物出現(xiàn)。稍微離心沉淀DNA，倒掉上清液。加入600μ175%乙醇洗滌，放置30min。倒掉上清液，室溫下吹干 DNA。加入100μ1 ddH20溶解DNA。電泳檢測植物總DNA含量。
PCR檢測再生植株中的基因，合成一對引物上游引物為5’ -ACGACTCGTCCGTCCTGTAG-3’下游引物為5’-CCGCATCACGCAgTTCAA -3’ PCR反應(yīng)體系如下表(表I) 表I PCR反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.一條人工合成的位點特異性重組酶系統(tǒng)的識別序列，其特征在于所述的識別序列為如下1)、2)、3)或4)的DNA序列1)具有如SEQID NO.1所示的DNA序列；2)與I)限定的DNA序列具有80%以上的同源性，且具有與SEQID NO.1相同功能的 DNA序列；3)在嚴格條件下與I)限定的DNA序列雜交且具有與SEQID NO.1相同功能的DNA序列；4)將SEQID NO.1的序列經(jīng)過單核苷酸或寡核苷酸插入、缺失或替換所產(chǎn)生的且與SEQ ID NO.1具有相同功能的由SEQ ID NO.1衍生的DNA序列。
2.一條人工合成的位點特異性重組酶系統(tǒng)的識別序列，其特征在于所述的識別序列為如下1)、2)、3)或4)的DNA序列1)具有如SEQID NO. 2所示的DNA序列；2)與I)限定的DNA序列具有80%以上的同源性，且具有與SEQID NO. 2相同功能的 DNA序列；3)在嚴格條件下與I)限定的DNA序列雜交且具有與SEQID NO. 2相同功能的DNA序列；4)將SEQID NO. 2的序列經(jīng)過單核苷酸或寡核苷酸插入、缺失或替換所產(chǎn)生的且與SEQ ID NO. 2具有相同功能的由SEQ ID NO. 2衍生的DNA序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一條人工合成的位點特異性重組酶系統(tǒng)的識別序列，其特征在于所述的識別序列是能夠被重組酶特異識別和切割，與重組酶一起組成位點特異性重組酶系統(tǒng)，并高效地實現(xiàn)其所有生物學(xué)功能。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一條人工合成的位點特異性重組酶系統(tǒng)的識別序列，其特征在于所述重組酶為Cre重組酶或FLP重組酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一條人工合成的位點特異性重組酶系統(tǒng)的識別序列，其特征在于所述的識別序列是以細菌噬菌體Pl來源的Cre/loxP系統(tǒng)的識別位點IoxP為改造對象，以IoxP的DNA序列的部分或全部進行延長或串聯(lián)重復(fù)，并在每一個延長或串聯(lián)的片段之間添加1-4個間隔堿基。
6.—種表達載體,其特征在于所述表達載體含有如權(quán)利要求1或2所述的識別序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種表達載體,其特征在于所述表達載體含有一個重組酶表達盒和兩個同向的如權(quán)利要求1或2所述的識別序列。
8.如權(quán)利要求6所述的表達載體的應(yīng)用，其特征在于將所述表達載體轉(zhuǎn)化植物或植物部分。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的表達載體的應(yīng)用，其特征在于所述的植物部分為細胞、原生質(zhì)體、細胞組織培養(yǎng)物、愈傷組織、細胞塊、胚芽、花粉、胚珠、花瓣、花柱、雄蕊、根、莖、葉、種子、根尖及花藥中的任一種。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的表達載體的應(yīng)用，其特征在于所述植物為糧食作物、蔬菜作物、花卉作物、能源作物中的任一種。
全文摘要
本發(fā)明提供了兩條人工合成的位點特異性重組酶系統(tǒng)的識別序列及其應(yīng)用，所述識別序列為SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的DNA序列；本發(fā)明人工改造和合成了高效特異的位點特異性重組酶系統(tǒng)的識別序列。利用該識別序列來構(gòu)建高效特異的位點特異性重組酶系統(tǒng)并應(yīng)用于植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)中，用來高效刪除不再需要的植物轉(zhuǎn)基因，提高轉(zhuǎn)基因植物的生物安全性和食品安全性，并有利于提高公眾對轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的接受程度。
文檔編號C12N15/63GK103060321SQ201310020868
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月21日
發(fā)明者王 鋒, 胡太蛟, 趙永利 申請人:福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所