專利名稱：編碼類黃酮途徑酶的基因序列及其用途的制作方法
本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為1997年2月28日、申請(qǐng)?zhí)枮?7193973.X、發(fā)明名稱為“編碼類黃酮途徑酶的基因序列及其用途”的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
本發(fā)明一般涉及編碼類黃酮途徑中代謝酶更具體地，類黃酮3’-羥化酶(下文稱為“F3’H”)或其衍生物的基因序列及其它們?cè)谥参锖推渌镏锌刂粕匦纬傻淖饔谩?br> 本說(shuō)明書中作者提及的發(fā)表文章的文獻(xiàn)目錄詳情收錄在說(shuō)明書結(jié)尾部分。說(shuō)明書和權(quán)利要求書中提及的核苷酸和氨基酸序列的序列鑒定號(hào)(SEQ ID NOS)在文獻(xiàn)目錄后定義。SEQ ID NOS的概述及其所涉及的序列在實(shí)施例前提供。
在本說(shuō)明書全文中，除非上下文另有要求，單詞“包含”或其諸如現(xiàn)在時(shí)(comprcies)或進(jìn)行時(shí)(comprising)的時(shí)態(tài)變化將理解為指包括所述元件或整體或元件或整體組但不排除任何其它元件或整體或元件或整體組。
重組DNA技術(shù)迅速發(fā)展的改進(jìn)極大地促進(jìn)了與生物技術(shù)有關(guān)工業(yè)領(lǐng)域的研究和發(fā)展。園藝工業(yè)已成為該技術(shù)最近的受益者，該技術(shù)有助于在扦插后表現(xiàn)出衰老延緩的植物和花中形成疾病抗性。也有些注意力集中在控制花的顏色上。
花卉工業(yè)致力于形成新的和沒(méi)的開花植物品種。產(chǎn)生這樣的新品種的一個(gè)有效的途徑是通近控制花的顏色。使用經(jīng)典育種技術(shù)已成功地產(chǎn)生了大多數(shù)商業(yè)花卉品種的許多顏色。然而，這種方法因受具體種類基因庫(kù)的局限而受到限制，因此，很少使單一種類具有全色譜的有色品種。另外，傳統(tǒng)的育種技術(shù)缺乏精確性?；ǖ拿缹W(xué)吸引力是諸如形態(tài)，香味和顏色的許多因素的組合通過(guò)雜交對(duì)一種特征的修飾常常犧牲一種同樣有價(jià)值的特征。在切花和觀賞種類中以遺傳工程精確改變顏色的能力在產(chǎn)業(yè)上將提供有意義的商業(yè)機(jī)會(huì)，它具有迅速的產(chǎn)品轉(zhuǎn)向且其中新穎性是重要的市場(chǎng)特征。
花的顏色主要是由于兩種類型的色素類黃酮和類胡蘿卜素。類黃酮提供由黃到紅到藍(lán)的顏色范圍。類胡蘿卜素提供橙色或黃色且通常是黃色或橙色花中的主要色素。對(duì)花的顏色起主要作用的類黃酮分子是花青苷，它是花青素，花翠素，3’-甲花翠素，甲基花青素，二甲翠雀素和花葵素的糖基化衍生物，且位于液泡中。不同的花青苷可產(chǎn)生明顯不同的顏色?；ǖ念伾彩軣o(wú)色類黃酮，金屬?gòu)?fù)合物，糖基化，乙?；鸵号輕H的輔助色素形成作用的影響(Forkmann，1991)。
類黃酮色素的生物合成途徑(下文稱為“類黃酮途徑”)已充分了解并在表示于

圖1a和1b中(Ebel和Hahlbrock，1988；Hahlbrock和Grisebach，1979；Wiering和De Vlaming，1984；Schram等，1984；Stafford，1990；van Tunen和Mol，1990；Dooner等，1991；Martin和Gerats，1993；Holton和Cornish，1995)。該途徑中第一個(gè)參與的步驟涉及3個(gè)丙二酰-CoA分子與一個(gè)對(duì)香豆酰-CoA分子的縮合。該反應(yīng)由查耳酮合成酶(CHS)催化。該反應(yīng)的產(chǎn)物2’，4’，4’，6’-四羥基查耳酮正常情況下由查耳酮黃烷酮異構(gòu)酶(CHI)迅速異構(gòu)化產(chǎn)生4’，5，7-三羥黃烷酮。4’，5，7-三羥黃烷酮隨后由黃烷酮3-羥化酶(F3H)在中央環(huán)的3位羥基化產(chǎn)生二氫四羥基黃酮(DHK)。
DHK B環(huán)的羥基化方式在決定花瓣顏色中起著關(guān)鍵性作用。B環(huán)可在3’處或在3’及5’兩處羥基化分別產(chǎn)生二氫櫟皮黃酮(DHQ)和二氫楊酶黃酮(DHM)。在該途徑中涉及的兩個(gè)關(guān)鍵酶是類黃酮3’-羥化酶和類黃酮3’，5’-羥化酶，兩者均是細(xì)胞色素P450類。細(xì)胞色素P450酶在自然界中廣泛分布，已從脊椎動(dòng)物，昆蟲，酵母，真菌，細(xì)菌和植物中分離并測(cè)序了它的基因。
類黃酮3’-羥化酶作用于DHK產(chǎn)生DHQ且作用于4’，5，7-三羥黃烷酮產(chǎn)生圣草酚。DHQ的還原和糖基化產(chǎn)生花青素糖苷和甲基花青素糖苷色素，在許多植物種類(例如玫瑰，石竹和菊)中這些色素產(chǎn)生紅色和粉紅色花色。這些花青苷的合成也可產(chǎn)生其它花色。例如，蘭色矢車菊含有花色素苷。在開花植物中控制類黃酮3’-羥化酶活性或類黃酮途徑中涉及的其它酶的能力可提供控制花瓣顏色的方法。由此可產(chǎn)生單一栽培品種的不同顏色形式，且在有些情況下，單一種類可產(chǎn)生更寬色譜的顏色 已克隆了編碼矮牽牛屬類黃酮3’-羥化酶的核苷酸序列(本文稱為SEQ ID NO26)(見(jiàn)國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朠CT/AU93/00127[WO93/2026])。然而，該序列沒(méi)有能力調(diào)節(jié)植物中3’-羥基化花青苷的合成。因此，需要鑒定其它有效調(diào)節(jié)植物中類黃酮化合物羥基化的編碼類黃酮3’-羥化酶的進(jìn)一步的基因序列。更具體地說(shuō)，需要鑒定有效調(diào)節(jié)植物中3’-羥化花青苷合成的編碼類黃酮3’-羥化酶的進(jìn)一步的基因序列。
根據(jù)本發(fā)明，編碼類黃酮3’-羥化酶的基因序列已得到鑒定和克隆。本發(fā)明的重組基因序列可以通過(guò)，例如，從頭表達(dá)，過(guò)度表達(dá)，抑制，反義抑制和核酶活性來(lái)調(diào)節(jié)編碼該酶的基因的表達(dá)?？刂浦参镏蓄慄S酮3’-羥化酶合成的能力可以調(diào)節(jié)每個(gè)花青苷的組成及改變類黃醇和花青苷的相對(duì)水平，從而能控制組織的顏色，如花瓣，葉，種子和果實(shí)的顏色。下文中描述的本發(fā)明涉及花的顏色的控制，但應(yīng)理解為可延伸到控制其它植物組織比如葉，種子和果實(shí)。
因此，本發(fā)明的一個(gè)方面提供了分離的核酸分子，包含編碼類黃酮3’-羥化酶或其衍生物的核酸序列，其中所述的類黃酮3’-羥化酶或其衍生物比SEQ ID NO26所述的核苷酸序列編碼的類黃酮3’-羥化酶能更有效地調(diào)節(jié)植物中類黃酮化合物的羥化。
本文所用的效率涉及類黃酮3’-羥化酶在植物細(xì)胞中羥化類黃酮化合物的能力。這給植物提供了類黃酮途徑中其它酶的額外底物，從而能通過(guò)，例如，糖基化，酰基化和鼠李糖基化進(jìn)一步修飾該分子以合成有助于形成一系列顏色的各種花青苷。由此，3’-羥基化的花青苷可以得到調(diào)節(jié)。其效率可以方便地通過(guò)選自下列參數(shù)的一種或多種參數(shù)來(lái)估計(jì)以產(chǎn)生的mRNA的量測(cè)定的轉(zhuǎn)錄水平；4’，5，7-三羥黃烷酮和/或DHK的羥基化水平；以合成的翻譯產(chǎn)物的量測(cè)定的mRNA翻譯水平；DHQ或DHM的花青苷衍生物的合成水平；對(duì)組織如，花，種子，葉或水果的顏色的影響程度。
本發(fā)明的另一方面是關(guān)于分離的核酸分子，包含定位于矮牽牛屬中名為Ht1或Ht2的遺傳基因座上或其它有花植物種類相同的這類基因座上的核苷酸序列，其中所說(shuō)的分離的核酸分子編碼類黃酮3’-羥化酶或其互補(bǔ)于編碼該酶的序列。
本發(fā)明的另一方面包含一種分離的核酸分子，包含對(duì)應(yīng)于矮牽牛屬中名為Ht1或Ht2的遺傳基因座，或含控制3’-羥化類黃酮合成的序列的其它有關(guān)植物種類中基因座的核苷酸序列，其中所說(shuō)的分離的核酸分子編碼類黃酮3’-羥化酶或其衍生物，后者比SEQ ID NO26所述的類黃酮3’-羥化酶能更有效地將DHK轉(zhuǎn)化成DHQ。
根據(jù)本發(fā)明的上述方面，提供了一種核酸分子，它包含基本上如SEQ ID NO1所述的或具有與其至少大約60％相似性或能在低度嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO1所述序列雜交的核苷酸序列或其互補(bǔ)核苷酸序列。
在有關(guān)實(shí)施方案中，提供了一種核酸分子，它包含基本上如SEQ IDNO3所述的或具有與其至少大約60％相似性或能在低度嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO3所述序列雜交的核苷酸序列或其互補(bǔ)核苷酸序列。
在另一相關(guān)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種核酸分子，它包含基本上如SEQ ID NO5所述的或具有與其至少大約60％相似性或能在低度嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO5所述的序列雜交的核苷酸序列或其互補(bǔ)核苷酸序列。
還有另一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案提供了一種核酸分子，它包含基本上如SEQ ID NO7所述的或具有與其至少大約60％相似性或能在低度嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO7所述序列雜交的核苷酸序列或其互補(bǔ)核苷酸序列。
還有本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案涉及一種核酸分子，它包含基本上如SEQ ID NO9所述的或具有與其編碼區(qū)至少大約60％相似性或能在低度嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO9所述序列雜交的核苷酸序列或其互補(bǔ)核苷酸序列。
在另一實(shí)施方案中，提供了一種核酸分子，它包含基本上如SEQ IDNO14所述或具有與其至少大約60％相似性或能在低度嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO14所述序列雜交的核苷酸序列或其互補(bǔ)核苷酸序列。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種核酸分子。它包含基本上如SEQ ID NO16所述或具有與其至少大約60％相似性或能在低度嚴(yán)格條件下與SEQID NO16所述序列雜交的核苷酸序列或其互補(bǔ)核苷酸序列。
還有另一個(gè)實(shí)施方案提供了一種核酸分子，它包含基本上如SEQ IDNO18所述的或具有與其至少大約60％相似性或能在低度嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO18所述的序列雜交的核苷酸序列或其互補(bǔ)核苷酸序列。
而且，本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及一種核酸分子，它包含基本上如SEQ ID NO20所述的或具有與其至少大約60％相似性或能在低等嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO20所述的序列雜交的核苷酸序列或其互補(bǔ)核苷酸序列。
還有另一個(gè)實(shí)施方案涉及一種核酸分子，它包含基本上如SEQ IDNO22所述的或具有與其至少大約60％相似性或能在低度嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO22所述的序列雜交的核苷酸序列或其互補(bǔ)核苷酸序列。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一個(gè)核酸分子，它包含基本上如SEQ ID NO24所述的或具有與其至少大約60％相似性或能在低等嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO24所述的序列雜交的核苷酸序列或其互補(bǔ)核苷酸序列。
在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供了一種分離的核酸分子，它包含基本上如SEQ ID NO1所述的或具有與其至少大約60％相似性或能在低度嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO1所述的序列雜交的核苷酸序列或其互補(bǔ)核苷酸序列，其中所述的核革酸序列定位到矮牽牛屬中稱為Ht1或Ht2的遺傳基因座上或在其它開花植物種類中相應(yīng)的這類基因座上，且其中所述的分離的核酸分子編碼類黃酮3’-羥化酶，或與編碼該酶的序列互補(bǔ)。
本文參考的42℃的低度嚴(yán)格條件包括和包含用于雜交的從至少大約1％到至少大約15％的甲酰胺和從至少大約1M到至少大約2M的鹽，以及作為洗滌條件的至少大約1M到至少大約2M的鹽。如果需要，可使用替換的嚴(yán)格條件，如中等嚴(yán)格條件，它包括和包含用于雜交的從至少大約16％到至少大約30％的甲酰胺和從至少大約0.5M到至少大約0.9M的鹽，以及作為洗滌條件的至少大約0.5M到至少大約0.9M的鹽，或高度嚴(yán)格條件，它包括和包含用于雜交的從至少大約31％到至少大約50％甲酰胺和從至少大約0.01M到至少大約0.15M的鹽，以及作為洗滌條件的至少大約0.01M到至少大約0.15M的鹽。雜交可在不同溫度下進(jìn)行，如果這樣，可據(jù)此調(diào)節(jié)其它條件。
本發(fā)明的另一方面提供了一種核酸分子，它包括編碼基本上如SEQID NO2所述的氨基酸序列或具有與其至少大約50％相似性的氨基酸序列的核苷酸序列或與該編碼序列互補(bǔ)的核苷酸序列。
在有關(guān)實(shí)施方案中，提供了一種核酸分子，它包括編碼基本上如SEQ ID NO4所述的氨基酸序列或具有與其至少大約50％相似性的氨基酸序列的核苷酸序列或與該編碼序列互補(bǔ)的核苷酸序列。
本發(fā)明的另一相關(guān)實(shí)施方案涉及一種核酸分子，它包括編碼基本上如SEQ ID NO6所述的氨基酸序列或具有與其至少大約50％相似性的氨基酸序列的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列。
還有另一相關(guān)的實(shí)施方案提供了一種核酸分子，它包括編碼基本上如SEQ ID NO8所述的氨基酸序列或具有與其至少大約50％相似性的氨基酸序列的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列。
還有另一相關(guān)的實(shí)施方案涉及一種核酸分子，它包括編碼基本上如SEQ ID NO10或SEQ ID NO11或SEQ ID NO12或SEQ ID NO13所述的氨基酸序列或具有與其至少大約50％相似性的氨基酸序列或其互補(bǔ)序列。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種核酸分子，它包括編碼基本上如SEQ ID NO15所述的氨基酸序列或具有與其至少大約50％相似性的氨基酸序列的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列。
還有在另一實(shí)施方案中，提供子一種核酸分子，它包括編碼基本上如SEQ ID NO17所述的氨基酸序列或具有與其至少大約50％相似性的氨基酸序列的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列。
在另一實(shí)施方案涉及一種核酸分子，它包括編碼基本上如SEQ IDNO19所述的氨基酸序列或具有與其至少大約50％相似性的氨基酸序列的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列。
而且，本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及一種核酸分子，它包括編碼基本上如SEQ ID NO21所述的氨基酸序列或具有與其至少大約50％相似性的氨基酸序列的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列。
還有一個(gè)實(shí)施方案涉及一種核酸分子，它包括編碼基本上如SEQ IDNO23所述的氨基酸序列或具有與其至少大約50％相似性的氨基酸序列的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種核酸分子，它包括編碼基本上如SEQ ID NO25所述的氨基酸序列或具有與其至少大約50％相似性的氨基酸序列的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列。
在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供了一種分離的核酸分子，它包括編碼基本上如SEQ ID NO2所述的氨基酸序列或具有與其至少大約50％相似性的氨基酸序列的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列，其中所述的核苷酸序列定位到矮牽牛屬中稱為Ht1或Ht2的遺傳基因座上或其它開花植物種類中相應(yīng)的這類基因座上，其中所述的分離的核酸分子編碼類黃酮3’-羥化酶或其衍生物或是該編碼序列的互補(bǔ)序列。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“相似性”包括在核苷酸或氨基酸水平上所比較的序列間完全相同。在核苷酸水平上沒(méi)有相同性的地方，“相似性”包括產(chǎn)生在結(jié)構(gòu)，功能，生物化學(xué)和/或構(gòu)象水平上互相相關(guān)的不同氨基酸的序列之間的差異。在氨基酸水平上沒(méi)有相同性的地方，“相似性”包括在結(jié)構(gòu)，功能，生物化學(xué)和/或構(gòu)象水平上互相相關(guān)的氨基酸。
SEQ ID NO1所示的核酸分子編碼來(lái)自矮牽牛屬的類黃酮3’-羥化酶。其它適合的F3’H基因的例子來(lái)自石竹(SEQ ID NO3)，金魚草屬(SEQ ID NO5)，擬南芥屬(SEQ ID NO7)，擬南芥屬基因組DNA克隆(SEQ ID NO9)，玫瑰(SEQ ID NO14)，菊(SEQID NO16)，蝴蝶草屬(SEQ ID NO18)，日本牽?；?SEQ ID NO20)，龍膽(SEQ ID NO22)和lisianthus(SEQ ID NO24)。盡管本發(fā)明特別列舉了上述F3’H基因，但本發(fā)明可延伸到任何植物種類的F3’H基因，只要這些F3’H基因在核苷酸水平上具有與選自SEQ ID NO1或3或5或7或14或16或18或20或22或24的核酸分子至少大約60％的相似性或在氨基酸水平上具有與選自SEQ ID NO2或4或6或8或10，11，12，13或15或17或19或21或23或25的氨基酸分子至少大約50％的相似性。本發(fā)明進(jìn)一步延伸到來(lái)自任何植物種類的F3’H基因，只要這些F3’H基因在核苷酸水平上具有與SEQ ID NO9的編碼區(qū)域至少大約60％的相似性。
本發(fā)明的核酸分子一般是在非天然存在狀態(tài)下的基因序列。一般來(lái)說(shuō)，這意味著從其天然狀態(tài)分離出來(lái)或人工合成或在非天然存在環(huán)境中產(chǎn)生。更具體地，它包括體外形成或維持的核酸分子，包括基因組DNA片段，重組或合成的分子和與異源性核酸連接的核酸。它也延伸到編碼F3’H的基因組DNA或cDNA或其部分，或者相對(duì)于其自身的或其它啟動(dòng)子方向相反的部分。它進(jìn)一步延伸到相對(duì)于其它核酸序列至少部分純化的天然存在的序列。
術(shù)語(yǔ)“核酸分子”包括核酸分離物和基因序列，在本文中以其最普遍的含義使用，它包括F3’H中的氨基酸序列直接地或經(jīng)堿基的互補(bǔ)系列限定的任何核苷酸堿基的接近系列。該氨基酸序列可組成全長(zhǎng)的F3’H或其有活性的截短形式或可相應(yīng)于該酶的特定區(qū)域，如N-端，C-端或中間部分。本文涉及的核酸分子也包含作為基因探針或作為能調(diào)節(jié)植物中相應(yīng)基因表達(dá)的“反義”分子的寡核苷酸。本文使用的“反義分子”也可包括含有相對(duì)于其自身的或另一啟動(dòng)子反向的結(jié)構(gòu)基因組或cDNA基因或其部分的基因構(gòu)建體。因此，本發(fā)明的核酸分子可適用于作為共同抑制分子，核酶分子，有義分子和反義分子以調(diào)節(jié)3’-羥基化花青苷的水平。
在另一實(shí)施方案中，編碼F3’H的核酸分子或其各種衍生物用于減小內(nèi)源性F3’H的活性，選擇性地，編碼該酶的核酸分子或其各種衍生物以反義方向使用以減小F3’H的活性。盡管不希望以任一理論限制本發(fā)明，但將該核酸分子導(dǎo)入細(xì)胞中通過(guò)降低同源內(nèi)源性基因的轉(zhuǎn)錄或通過(guò)增加相應(yīng)mRNA的轉(zhuǎn)換來(lái)產(chǎn)生這一結(jié)果是可能的。使用含有有義或反義方向的F3’H核酸分子或其各種衍生物的基因構(gòu)建體可實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。在更進(jìn)一步的改進(jìn)方案中，可使用核酶滅活靶核酸分子。選擇性地，核酸分子編碼一種功能性F3’H且它用于升高植物中該酶的水平。
本文提及的類黃酮F3’H活性的改變涉及將活性升高或降低到正常內(nèi)源性或現(xiàn)存活性水平之上或之下達(dá)30％，或更優(yōu)選30-50％，或甚至更優(yōu)選50-75％或更優(yōu)選75％或更大。使用Stotz和Forkmann(1982)所述方法的改進(jìn)方式(見(jiàn)實(shí)施例7)或通過(guò)按實(shí)施例5所述測(cè)定F3’H產(chǎn)物，比如櫟皮黃酮，花青素或甲基花青素的量可較容易地測(cè)定活性水平。
本發(fā)明進(jìn)一步延伸到以寡核苷酸引物或探針形式存在的核酸分子，該引物或探針在高度，優(yōu)選在中等，且最優(yōu)選在低等嚴(yán)格條件下能與上述核酸分子，特別是選自SEQ ID NO1，3，5，7，9，14，16，18，20，22或24中所述的核酸分子的一部分雜交。優(yōu)選地該部分對(duì)應(yīng)于F3’H基因的5’或3’端。為了方便，本文所說(shuō)的5’端定義為基本上在初級(jí)轉(zhuǎn)錄子5’端至該基因中央部分之間的區(qū)域，本文所說(shuō)的3’端定義為基本上在該基因中央部分至初級(jí)轉(zhuǎn)錄子3’端之間的區(qū)域。因此，很明顯寡核苷酸或探針可與5’端或3’端或與5’和3’端共有的區(qū)域雜交。
核酸分子或其互補(bǔ)形式可編碼全長(zhǎng)酶或其部分或其衍生物。“衍生物”指相對(duì)于天然存在的酶有任意單一或多處氨基酸取代，缺失和增加，且包括部分，片段，分部，融合分子，同源物和類似物。關(guān)于這點(diǎn)，核酸包括天然存在的編碼F3’H的核苷酸序列或可包含對(duì)所述天然存在的序列的單一或多個(gè)核苷酸取代，缺失和/或增加。融合分子可以是編碼2個(gè)或多個(gè)F3’H的核苷酸序列之間的融合，或編碼F3’H的核酸序列與編碼任何其它蛋白質(zhì)類分子的核苷酸序列之間的融合。融合分子在改變底物特異性中有用。
本發(fā)明的核酸分子或其互補(bǔ)形式或F3’H的衍生物也可包括不管其是否具有活性的“部分”。有活性的或有功能的核酸分子是編碼具有F3’H活性的酶的分子。有活性的或有功能的分子進(jìn)一步包括具有部分活性的分子，例如，底物特異性降低的F3’H應(yīng)認(rèn)為具有部分活性。核酸分子的衍生物可作為寡核苷酸探針，作為用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或各種突變技術(shù)的引物，用于產(chǎn)生反義分子或核酶構(gòu)建體。它們也可用于形成共同抑制構(gòu)建體。根據(jù)本發(fā)明這一方面的核酸分子可編碼或不編碼具有功能的F3’H。“部分”可來(lái)自該核酸分子的5’端或3’端與5’及3’端共有的區(qū)域。
本發(fā)明的F3’H的氨基酸插入衍生物包括氨基和/或羥基末端融合物以及單個(gè)或多個(gè)氨基酸的序列內(nèi)插入。插入氨基酸序列的變異體是那些其中將一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基導(dǎo)入了蛋白質(zhì)的預(yù)定位點(diǎn)的變異體，盡管也可能進(jìn)行隨機(jī)插入并適當(dāng)篩選所得的產(chǎn)物。缺失變異體的特征在于從序列中去掉了一個(gè)或多個(gè)氨基酸。置換氨基酸變異體是那些其中序列中的至少一個(gè)殘基被去掉并在其位置插入不同的殘基的變異體。典型的置換是根據(jù)下面表1進(jìn)行的取代。
表1 適合于氨基酸置換的殘基 原始?xì)埢湫偷闹脫Q Ala Ser Arg Lys Asn Gln；His Asp Glu Cys Ser Gln Asn Glu Asp Gly Pro His Asn；Gln Ile Leu；Val Leu Ile；Val Lys Arg；Gln；Glu Met Leu；Ile Phe Met；Leu；Tyr Ser Thr Thr Ser Trp Tyr Tyr Trp；Phe Val Ile；Leu 在F3’H通過(guò)氨基酸置換改變時(shí)，氨基酸一般被具有相似特性，如疏水性，親水性，電負(fù)性，側(cè)鏈大小等的其它氨基酸置換。典型的氨基酸置換是單一殘基。氨基酸插入通常是大約1-10個(gè)氨基酸殘基的級(jí)別，缺失變化范圍為1-20個(gè)殘基。優(yōu)選地，缺失或插入在相鄰的堿基對(duì)中進(jìn)行，即，缺失2個(gè)殘基或插入2個(gè)殘基。
使用本領(lǐng)域熟知的肽合成技術(shù)，如固相肽合成(Merrifield，1964)等，或經(jīng)重組DNA操作可較容易地制備上面提及的氨基酸變異體。在含已知或部分已知序列的DNA的預(yù)定位點(diǎn)進(jìn)行置換突變的技術(shù)是熟知的，包括，例如，M13突變。用以產(chǎn)生表現(xiàn)為置換，插入或缺失變異體的變異蛋白質(zhì)的DNA序列操作一般在，例如，Sambrook等(1989)中進(jìn)行了描述。
本發(fā)明的F3’H的重組或合成突變體或衍生物的其它例子包括單個(gè)或多個(gè)置換，缺失和/或增加與酶相連的任意分子，如糖類、脂類和/或蛋白質(zhì)或多肽。
術(shù)語(yǔ)“類似物”和“衍生物”也延伸到F3’H的任意的不管其是否有功能的化學(xué)等效物，還可延伸到上述任意氨基酸衍生物。如果本發(fā)明這個(gè)方面的“類似物”和“衍生物”是非功能性的，它們可作為F3’H活性的興奮劑或拮抗劑。為了方便，本文提到的“F3’H”包括提及的任何衍生物，包括其部分，突變體，片段，同源物或類似物。
本發(fā)明用來(lái)自矮牽牛屬，石竹，玫瑰，金魚草屬，擬南芥屬，菊，lisianthus，蝴蝶草屬，牽?；ê妄埬懙暮怂嵝蛄袨槔?，因?yàn)樗鼈兇砹酥两褡畛Ｒ?jiàn)和優(yōu)選的材料來(lái)源。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將馬上意識(shí)到相似的序列可以從任何來(lái)源，如從其它植物或某些微生物中分離。其它植物的例子包括，但不限于玉米，煙草，矢車菊，天竺葵屬，蘋果，扶郎花屬和非洲紫羅蘭。本發(fā)明包括所有這些直接或間接編碼類黃酮途徑的酶且特別是F3’H的核酸序列，而不考慮它們的來(lái)源。
本文期望的核酸分子能以單獨(dú)的方式存在，也可與載體分子，如表達(dá)載體結(jié)合。術(shù)語(yǔ)載體分子以其最廣的含義使用，包括用于核酸分子的能幫助將核酸轉(zhuǎn)化入植物細(xì)胞和/或幫助整合到植物基因組中的任何中間載體。例如，中間載體可適合在電穿孔，微粒轟擊，土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化中使用或由DNA或RNA病毒插入。本文包含的中間載體和/或核酸分子可以或不必穩(wěn)定整合入植物基因組。這樣的載體分子也可在原核細(xì)胞中復(fù)制和/或表達(dá)。優(yōu)選地，載體分子或其部分能整合到植物基因組中。核酸分子可另外含有能指導(dǎo)核酸分子在植物細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子序列。核酸分子和啟動(dòng)子也可通過(guò)如上所述的任何方式導(dǎo)入細(xì)胞中。
根據(jù)本發(fā)明，編碼F3’H或其衍生物或其部分的核酸分子可以任一方向?qū)胫参飦?lái)允許，許可或促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)mRNA的生產(chǎn)水平和/或由mRNA合成酶的水平，從而提供將DHK和/或其它合適的底物(如果在植物細(xì)胞中合成)最終轉(zhuǎn)變成花色素的花青苷衍生物，如花青素和/或甲基花青素，或選擇性地通過(guò)降低或消除內(nèi)源性或現(xiàn)存的F3’H活性來(lái)抑制該代謝物這種轉(zhuǎn)變。細(xì)胞質(zhì)中mRNA的合成和/或由mRNA合成酶在本文中稱為“表達(dá)”?；ㄇ嗨氐暮铣捎兄诋a(chǎn)生紅或蘭色的花色。在植物中以任一方向表達(dá)核酸分子可以是組成型的，誘導(dǎo)型的或發(fā)育型的，也可以是組織特異性的。
根據(jù)本發(fā)明的這一方面，提供了產(chǎn)生能合成F3’H或其功能性衍生物的轉(zhuǎn)基因植物的的方法，所述的方法包括在允許所述的核酸分子最終表達(dá)的條件下用含有編碼所述的F3’H的核酸序列的核酸分子穩(wěn)定轉(zhuǎn)化合適植物的細(xì)胞，從該細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物并在足以允許核酸分子表達(dá)的條件下讓所述的轉(zhuǎn)基因植物生長(zhǎng)一段時(shí)間。由此轉(zhuǎn)基因植物可以產(chǎn)生相對(duì)于可比較的非轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的量更高水平的F3’H活性。
本發(fā)明的另一方面涉及一種用于產(chǎn)生減少內(nèi)源性或現(xiàn)存F3’H活性的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述的方法包括用含有編碼F3’H的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列的核酸分子穩(wěn)定轉(zhuǎn)化合適植物的細(xì)胞，從該細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物，且如果需要，則在足以允許該核酸分子表達(dá)的條件下讓所述的轉(zhuǎn)基因植物生長(zhǎng)。
本發(fā)明的另一方面涉及產(chǎn)生內(nèi)源性或現(xiàn)存F3’H活性減小的遺傳修飾的植物的方法，上述的方法包含通過(guò)用導(dǎo)入植物細(xì)胞的適當(dāng)改變的F3’H基因或其衍生物或部分經(jīng)同源重組修飾內(nèi)源性序列來(lái)改變F3’H基因并從該細(xì)胞再生遺傳修飾的植物。
根據(jù)本發(fā)明的這些方面，優(yōu)選的核酸分子基本上如SEQ ID NO1，3，5，7，14，16，18，20，22，24所述，或是9的編碼區(qū)域，或具有與它們至少大約60％的相似性，或能在低度嚴(yán)格條件下與它們雜交。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明包含產(chǎn)生表現(xiàn)出改變的花色的轉(zhuǎn)基因開花植物的方法，上述的方法包含用本發(fā)明的核酸分子穩(wěn)定轉(zhuǎn)化合適的植物細(xì)胞，從這些細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物并在足以允許該核酸分子表達(dá)成F3’H酶的條件下讓上述的轉(zhuǎn)基因植物生長(zhǎng)一段時(shí)間。選擇性地，上述的方法可包括用本發(fā)明的核酸分子或其互補(bǔ)序列穩(wěn)定轉(zhuǎn)化合適的植物的細(xì)胞，從該細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物并在足以改變內(nèi)源性或現(xiàn)存F3’H活性水平的條件下讓上述的轉(zhuǎn)基因植物生長(zhǎng)一段時(shí)間。優(yōu)選地，改變了的水平應(yīng)低于可比較的非轉(zhuǎn)基因植物中內(nèi)源性或現(xiàn)存的F3’H活性水平。
在相關(guān)實(shí)施方案中，本發(fā)明包含產(chǎn)生表現(xiàn)了改變的花色的開花植物的方法，所述的方法包含通過(guò)用導(dǎo)入植物細(xì)胞的適當(dāng)改變的F3’H基因或其衍生物經(jīng)同源重組修飾內(nèi)源性序列來(lái)改變F3’H基因并從該細(xì)胞再生遺傳修飾的植物。
本發(fā)明的核酸分子可以是或不是發(fā)育調(diào)控的。優(yōu)選地，3’-羥基化的花青苷水平的調(diào)節(jié)導(dǎo)致花色改變，包括根據(jù)受體植物的生理?xiàng)l件產(chǎn)生紅色花或其它顏色差別?！笆荏w植物”是指能合成F3’H酶的底物或合成F3’H酶本身，且具有所需顏色發(fā)育必需的適當(dāng)生理特性和基因型的植物。它可包括但不限于矮牽牛屬，石竹，菊，玫瑰，金魚草屬，煙草，矢車菊，天竺葵屬，lisianthus，扶郎花屬，蘋果，鳶尾，百合花，非洲紫羅蘭，龍膽，蝴蝶草屬和日本牽?；ā?br> 因此，本發(fā)明推延到產(chǎn)生能調(diào)節(jié)3’-羥基化的花青苷水平的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述的方法包括用含有編碼F3’H或其衍生物的核苷酸序列或該編碼序列的互補(bǔ)序列的核酸分子穩(wěn)定轉(zhuǎn)化合適植物的細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)，從所述的細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)再生轉(zhuǎn)基因植物。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)馬上知道可應(yīng)用于本發(fā)明的方法的各種變化，如增加或減小靶植物中天然存在的酶活性水平使得顏色的差異不同。
因此，本發(fā)明延伸到含有全部或部分本發(fā)明的核酸元件和/或其任何同源或相關(guān)形式或它們中任何一個(gè)的反義形式的所有轉(zhuǎn)基因植物，特別是那些表現(xiàn)出花色改變的轉(zhuǎn)基因植物。該轉(zhuǎn)基因植物可含有導(dǎo)入的核酸分子，該核酸分子含有編碼F3’H的核苷酸序列或該編碼序列的互補(bǔ)序列。一般來(lái)說(shuō)，該核酸可穩(wěn)定地導(dǎo)入植物基因組，盡管本發(fā)明還延伸到將F3’H核苷酸序列導(dǎo)入能在植物細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的自主復(fù)制核酸序列，如DNA或RNA病毒。本發(fā)明還延伸到從該轉(zhuǎn)基因植物獲得的種子。這類種子，特別是如果有色，則可用作植物的特有標(biāo)記。
本發(fā)明的另一方面涉及F3’H的重組形式。該酶的重組形式提供了用于研究的材料來(lái)源來(lái)發(fā)展活性更大的酶，且可用于建立產(chǎn)生有色化合物的體外系統(tǒng)。
本發(fā)明還有一個(gè)方面涉及本文所述的基因序列在制造用于調(diào)節(jié)植物或植物細(xì)胞中的3’-羥基化花青苷水平的基因構(gòu)建體中的用途。
本發(fā)明的另一方面提供了表現(xiàn)出花色改變的來(lái)自本文所述的轉(zhuǎn)基因植物的花，特別是切花。
本發(fā)明的另一方面涉及含有編碼F3’H或其衍生物的核苷酸序列或該編碼序列的互補(bǔ)序列的核酸分子，其中所述的核酸分子能在植物細(xì)胞中表達(dá)。術(shù)語(yǔ)“表達(dá)(expressed)”相當(dāng)于上文定義的術(shù)語(yǔ)“表達(dá)(expression)”。
根據(jù)本發(fā)明的這一和其它方面的核酸分子，相對(duì)于國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朠CT/AU93/00127[WO 93/20206]公開的質(zhì)粒PCGP809中包含的PCGP619cDNA插入片段的效率而言允許，許可或促進(jìn)更高效率地調(diào)節(jié)3’-羥基化花青苷。術(shù)語(yǔ)“植物細(xì)胞”包括單個(gè)的植物細(xì)胞或植物細(xì)胞團(tuán)，如愈傷組織中，小植株或植株或其部分，包括花和種子。
本發(fā)明的另一方面提供了包括編碼F3’H的核苷酸序列或該編碼序列的互補(bǔ)序列的核酸分子，其中所述的核酸分子的翻譯產(chǎn)物含有氨基酸序列RPPNSGA。優(yōu)選地，所述的核酸分子的翻譯含有氨基酸序列RPPNSGAXHXAYNYXDL，且更優(yōu)選地，所述的核酸分子的翻譯產(chǎn)物包含氨基酸序列RPPNSGAXHXAYNYXDL[X]nGGEK，其中X代表任意氨基酸，[X]n代表0至500位氨基酸的氨基酸序列。
本發(fā)明進(jìn)一步由以下提及的非限制性的附圖和實(shí)施例進(jìn)行描述。在附圖中 圖1(圖1a和1b)是P.hybrida花中類黃酮生物合成途徑的示意圖，顯示了轉(zhuǎn)化中涉及的酶和遺傳基因座。該途徑中涉及的酶表示如下PAL＝苯丙氨酸氨基裂解酶；C4H＝肉桂酸鹽-4-羥化酶；4CL＝4-香豆酸；CoA連接酶；CHS＝查耳酮合成酶；CHI＝查耳酮異構(gòu)酶；F3H＝黃烷酮-3-羥化酶；F3’H＝類黃酮3’-羥化酶；F3’5’H＝類黃酮3’5’羥化酶；FLS＝黃烷醇合成酶；DFR＝二氫黃烷醇-4-還原酶；ANS＝花青苷合成酶；3GT＝UDP-葡萄糖花青苷-3-葡萄糖苷；3RT＝UDP-鼠李糖花青苷-3-葡萄糖苷鼠李糖苷轉(zhuǎn)移酶；ACT＝花青苷-3-蕓香糖苷?；D(zhuǎn)移酶；5GT＝UDP-葡萄糖花青苷5-葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶；3’OMT＝花青苷O-甲基轉(zhuǎn)移酶；3’，5’OMT＝花青苷3’，5’-O-甲基轉(zhuǎn)移酶。在該途徑中的3種類黃酮表示為P-3-G＝花葵素-3-葡萄糖苷；DHM＝二氫楊酶黃酮；DHQ＝二氫櫟皮黃酮。在P.hybrida中僅以較低水平合成類黃醇，楊酶黃酮且極少合成花青苷，花葵素。
圖2是質(zhì)粒pCGP161的示意圖，該質(zhì)粒含有編碼來(lái)自P.hybrida的肉桂酸-4-羥化酶的cDNA克隆(F1)。0.7kb EcoR I/XhoI片段的32P標(biāo)記的片段用于探測(cè)美國(guó)國(guó)旗紅花瓣的cDNA文庫(kù)。詳情見(jiàn)實(shí)施例4。縮寫如下Amp＝氨芐青霉素抗性基因；ori＝復(fù)制起點(diǎn)；T3＝T3RNA聚合酶的識(shí)別序列；T7＝T7RNA聚合酶的識(shí)別序列。也標(biāo)記了限制性酶位點(diǎn)。
圖3是質(zhì)粒pCGP602的示意圖，pCGP602含有編碼來(lái)自P.hybrida的類黃酮3’5’羥化酶(Hf1)的cDNA克隆(617)。含Hf1編碼區(qū)的1.6kb Bsp HI/Fsp I片段的32P標(biāo)記的片段用于探測(cè)國(guó)旗紅花瓣的cDNA文庫(kù)。詳情見(jiàn)實(shí)施例4?？s寫如下Amp＝氨芐青霉素抗性基因；ori＝復(fù)制起點(diǎn)；T3＝T3RNA聚合酶的識(shí)別序列；T7＝T7RNA聚合酶的識(shí)別序列。還標(biāo)記了限制性酶位點(diǎn)。
圖4是質(zhì)粒pCGP175的示意圖，pCGP175含有編碼來(lái)自P.hybrida的類黃酮3’5’羥化酶(Hf2)的cDNA克隆(H2)。一起含有Hf2編碼區(qū)的1.3kb EcoRI/Xho I和0.5kb Xho I片段的32P標(biāo)記的片段用于探測(cè)美國(guó)國(guó)旗紅花瓣cDNA文庫(kù)。詳情見(jiàn)實(shí)施例4?？s寫如下Amp＝氨芐青霉素抗性基因；ori＝復(fù)制起點(diǎn)；T3＝T3RNA聚合酶的識(shí)別序列；T7＝T7RNA聚合酶的識(shí)別序列。還標(biāo)記了限制性酶位點(diǎn)。
圖5是質(zhì)粒pCGP619的示意圖，pCGP619含有編碼來(lái)自P.hybrida的細(xì)胞色素P450的651cDNA克隆。1.8kb EcoR I/Xho I片段的32P標(biāo)記的片段用于探測(cè)美國(guó)國(guó)旗紅花瓣的cDNA文庫(kù)。詳情見(jiàn)實(shí)施例4?？s寫如下Amp＝氨芐青霉素抗性基因；ori＝復(fù)制起點(diǎn)；T3＝T3RNA聚合酶的識(shí)別序列；T7＝T7 RNA聚合酶的識(shí)別序列。還標(biāo)記了限制性酶位點(diǎn)。
圖6表示用pCGP1805中包含的OGR-38cDNA克隆的32P標(biāo)記的片段探測(cè)的RNA印跡的放射自顯影照片(見(jiàn)實(shí)施例6)。各泳道含有20μg從V23(ht1/ht1)×VR(Ht1/ht1)回交群體植物的花或葉分離的總RNA樣品。在含高水平櫟皮黃酮(Q+)的VR類(Ht1/ht1)花中檢測(cè)到1.8kb的轉(zhuǎn)錄物(泳道9-14)。在含少量或不含櫟皮黃酮(Q-)的V23類(ht1/ht1)花中檢測(cè)到水平低得多的相同大小的轉(zhuǎn)錄物(泳道3-8)。在VR葉(泳道1)和V23花瓣(泳道2)中也檢測(cè)到了減少的轉(zhuǎn)錄物水平。這在實(shí)施例5中描述。
圖7是酵母表達(dá)質(zhì)粒pCGP1646的示意圖(見(jiàn)實(shí)施例7)。來(lái)自pCGP1805的OGR-38cDNA插入片段以“有義”的方向克隆到表達(dá)載體pYE22m中的酵母甘油醛-3-磷酸脫氯酶啟動(dòng)子(PGAP)后。TRP1＝Trp1基因，IR1＝2μm質(zhì)粒的反應(yīng)重復(fù)，TGAP＝來(lái)自酵母甘油醛-3-磷酸脫氫的基因的終止子序列。還標(biāo)記了限制性酶位點(diǎn)。
圖8是雙元質(zhì)粒pCGP1867的示意圖(實(shí)施例8中所述)。pCGP1805的Ht1 cDNA插入片段(OGR-38)以“有義”的方向克隆到表達(dá)載體pCGP293的Mac啟動(dòng)子后。縮寫如下LB＝左側(cè)邊界；RB＝右側(cè)邊界；Gm＝慶大霉素抗性基因；35S＝來(lái)自花椰菜花葉病毒35S基因的啟動(dòng)子區(qū)；npt II＝新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II基因；tml 3’＝來(lái)自土壤桿菌屬tml基因的終止子區(qū)；mas 3’＝來(lái)自土壤桿菌屬的甘露堿合成酶基因的終止子區(qū)域。ori pRi＝來(lái)自毛根土壤桿菌質(zhì)粒的廣譜宿主范圍的復(fù)制起點(diǎn)；ori Col E1＝來(lái)自Colcinin E1質(zhì)粒的高拷貝復(fù)制起點(diǎn)。還標(biāo)記了限制性酶位點(diǎn)。
圖9是雙元質(zhì)粒pCGP1810的示意圖，它的構(gòu)建在實(shí)施例13中描述。來(lái)自pCGP1807的KC-1cDNA插入片段(見(jiàn)實(shí)施例12)以“有義”的取向克隆到表達(dá)載體p CGP293的Mac啟動(dòng)子后?？s寫如下LB＝左側(cè)邊界；RB＝右側(cè)邊界；Gm＝慶大霉素抗性基因；35S＝來(lái)自花椰菜花葉病毒35S基因的啟動(dòng)子區(qū)；nptII＝新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II基因；tml 3’＝來(lái)自土壤桿菌屬tml基因的終止子區(qū)域；mas 3’＝來(lái)自土壤桿菌屬甘露堿合成酶基因的終止子區(qū)域；ori pRi＝來(lái)自毛根土壤桿菌質(zhì)粒的廣譜宿主范圍的復(fù)制起點(diǎn)；ori Col E1＝來(lái)自Colcinin E1質(zhì)粒的高拷貝復(fù)制起點(diǎn)。還標(biāo)記了限制性酶位點(diǎn)。
圖10是雙元質(zhì)粒pCGP1813的示意圖，其構(gòu)建在實(shí)施例14中描述。來(lái)自pCGP1807的KC-1cDNA插入片段(見(jiàn)實(shí)施例12)以“有義”方向克隆到mac啟動(dòng)子和mas終止子之間。MacKC-1mas表達(dá)元件隨后克隆到雙元載體pWTT2132中。縮寫如下Tet＝四環(huán)素抗性基因；LB＝左側(cè)邊界；RB＝右側(cè)邊界，sur B＝來(lái)自乙酰乳酸合成酶基因的編碼區(qū)和終止子序列；35S＝來(lái)自花椰菜花葉病毒35S基因的啟動(dòng)子區(qū)，mas 3’＝來(lái)自土壤桿菌屬甘露堿合成酶基因的終止子區(qū)；PVS1＝來(lái)自綠膿假單胞菌質(zhì)粒的廣譜宿主范圍的復(fù)制起點(diǎn)，pACYCori＝來(lái)自大腸桿菌pACYC184的修飾的復(fù)制子。還標(biāo)記了限制性酶位點(diǎn)。
圖11表示用Am 3Ga差異顯示PCR片段的32P標(biāo)記的片段探測(cè)的Southern印跡的放射自顯影照片(如實(shí)施例16所述)。各泳道含10μg從N8(Eos+)，K16(eos-)或K16×N8F2群體的植物中分離的EcoRV消化的基因組DNA樣品。在來(lái)自產(chǎn)花青素的植物(表示為“+”)的基因組DNA中檢測(cè)到雜交帶(泳道1，3，4，5，6，7，9，10，12和15)。在來(lái)自不生產(chǎn)花青素的植物(用“-”表示)的基因組DNA樣品中沒(méi)有觀察到特異性雜交(泳道2，8，11，13和14)。
圖12表示用Am3Ga差異顯示PCR片段的32P標(biāo)記的片段探測(cè)的RNA印跡的放射自顯影照片。各泳道含10μg從N8(Eos+)×K16(eos-)F2群體植物的花或葉分離的總RNA樣品。在產(chǎn)生化青素的K16×N8F2花(花青素+)(植物#1，#3，#4，#5和#8)中檢測(cè)到1.8Kb的轉(zhuǎn)錄物。在不產(chǎn)生花青素的K16×N8F2花(花青素-)(植物#6，#11，#12)中或在花中產(chǎn)生花青素的K16×N8F2植物的葉樣品(#13L)中沒(méi)有檢測(cè)到轉(zhuǎn)錄物。詳情在實(shí)施例17中提供。
圖13是雙元質(zhì)粒pCGP250的示意圖，其構(gòu)建在實(shí)施例20中描述。含來(lái)自pCGP246的1至1711位核苷酸(SEQ ID NO5)的sd F3’HcDNA插入片段(見(jiàn)實(shí)施例18)以“有義”方向克隆到表達(dá)載體pCGP293的Mac啟動(dòng)子后。縮寫如下LB＝左側(cè)邊界；RB＝右側(cè)邊界；Gm＝慶大霉素抗性基因；35S＝來(lái)自花椰菜花葉病毒35S基因的啟動(dòng)子區(qū)；npt II＝新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II基因；tml 3’＝來(lái)自土壤桿菌屬tml基因的終止子區(qū)；mas 3’＝來(lái)自土壤桿菌屬甘露堿合成酶基因的終止子區(qū)；ori pRi＝來(lái)自毛根土壤桿菌質(zhì)粒的廣譜宿主范圍的復(fù)制起點(diǎn)；oriCol E1＝來(lái)自Colcinin E1質(zhì)粒的高拷貝的復(fù)制起。還標(biāo)記了限制性酶位點(diǎn)。
圖14是雙元質(zhì)粒pCGP231的示意圖，其構(gòu)建在實(shí)施例20中描述。含來(lái)自pCGP246的104至1711位核苷酸(SEQ ID NO5)的sd F3’HcDNA插入片段以“有義”方向克隆到表達(dá)載體pCGP293的Mac啟動(dòng)子后。縮寫如下LB＝左側(cè)邊界；RB＝右側(cè)邊界；Gm＝慶大霉素抗性基因；35S＝來(lái)自花椰菜葉病毒35S基因的啟動(dòng)子區(qū)；nptII＝新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II基因；tml 3’＝來(lái)自土壤桿菌屬tml基因的終止子區(qū)；mas 3’＝來(lái)自土壤桿菌屬甘露堿合成酶基因的終止子區(qū)域；ori pRi＝來(lái)自毛根土壤桿菌質(zhì)粒的廣譜宿主范圍的復(fù)制起點(diǎn)；ori Col E1＝來(lái)自colcinin E1質(zhì)粒的高拷貝復(fù)制起點(diǎn)。還標(biāo)記了限制性酶位點(diǎn)。
圖15是雙元質(zhì)粒pBI-Tt 7-2的示意圖。將來(lái)自E-5的6.5kb EcoRI/Sal I Tt7基因組片段克隆到EcoRI/Sal I切割的pBI101中，代替原有的GUS基因。所示的Tt7(F3’H)基因的方向(5’至3’)通過(guò)DNA測(cè)序確定?？s寫如下LB＝左側(cè)邊界；RB＝右側(cè)邊界；nos 5’＝來(lái)自土壤桿菌屬胭脂堿合成酶基因的啟動(dòng)子區(qū)；npt II＝新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II基因的編碼區(qū)；nos 3’＝來(lái)自土壤桿菌屬胭脂堿合成酶基因的終止子區(qū)域；npt I＝新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶I基因的編碼區(qū)。還標(biāo)記了限制性酶位點(diǎn)。
圖16是雙元質(zhì)粒pCGP2166的示意圖，其構(gòu)建在實(shí)施例26中描述。來(lái)自pCGP2158的玫瑰#34cDNA插入片段(見(jiàn)實(shí)施例25)以“有義”方向克隆到pCGP293表達(dá)載體的Mac啟動(dòng)子后?？s寫如下LB＝左側(cè)邊界；RB＝右側(cè)邊界；Gm＝慶大霉素抗性基因；35S＝來(lái)自花椰菜花葉病毒35S基因的啟動(dòng)子區(qū)；npt II＝新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II基因；tml 3’＝來(lái)自土壤桿菌屬tml基因的終止子區(qū)域；mas 3’＝來(lái)自土壤桿菌屬甘露堿合成酶基因的終止子區(qū)；ori pBi＝來(lái)自毛根土壤桿菌質(zhì)粒的廣譜宿主范圍的復(fù)制起點(diǎn)；ori Col E1＝來(lái)自Colcinin E1質(zhì)粒的高拷貝復(fù)制起點(diǎn)。還標(biāo)記了限制性酶位點(diǎn)。
圖17是雙元質(zhì)粒pCGP2169的示意圖，其構(gòu)建在實(shí)施例27中描述。來(lái)自pCGP2158的玫瑰#34cDNA插入片段以“有義”方向克隆到CaMV35S啟動(dòng)子和ocs終止子之間。隨后將35S玫瑰#34ocs表達(dá)元件克隆到雙元載體pWTT2132中。縮寫如下Tet＝四環(huán)素抗性基因；LB＝左側(cè)邊界；RB＝右側(cè)邊界；sur B＝來(lái)自乙酰乳酸合成酶基因的主體區(qū)域和終止子區(qū)域；35S＝來(lái)自花椰菜花葉病毒35S基因的啟動(dòng)子區(qū)域，OSS＝來(lái)自土壤桿菌屬章魚堿合成酶基因的終止子區(qū)域；pVS1＝來(lái)自綠膿假單胞菌質(zhì)粒的廣譜宿主范圍的復(fù)制起點(diǎn)，pACY Cori＝來(lái)自大腸桿菌的pACYC184的修飾的復(fù)制子。還標(biāo)記了限制性酶位點(diǎn)。
圖18是雙元質(zhì)粒pLN85的示意圖，其構(gòu)建在實(shí)施例28中描述。來(lái)自pCHRM1的菊RM6i cDNA插入片段以“反義”方向克隆到花椰菜花葉病毒35S基因啟動(dòng)子(35S)之后。其它縮寫如下LB＝左側(cè)邊界；RB＝右側(cè)邊界；ocs3’＝來(lái)自土壤桿菌屬章魚堿合成酶基因的終止子區(qū)域；pnosnptIInos 3’＝含來(lái)自土壤桿菌屬胭脂堿合成酶基因的啟動(dòng)子區(qū)表達(dá)元件；新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II基因的編碼區(qū)和來(lái)自土壤桿菌屬胭脂堿合成酶基因的終止子區(qū)；ori T＝復(fù)制轉(zhuǎn)移起點(diǎn)；trf A＊＝順式作用復(fù)制功能；ori Col E1＝來(lái)自Colcinin E1質(zhì)粒的高拷貝復(fù)制起點(diǎn)；Tn 7SpR/StR＝來(lái)自轉(zhuǎn)座子Tn7的壯觀霉素和鏈霉素抗性基因；ori VRK2＝質(zhì)粒RK2的廣譜宿主范圍的復(fù)制起點(diǎn)。還標(biāo)記了限制性酶位點(diǎn)。
圖19是酵母表達(dá)質(zhì)粒pYTHT6的示意圖，其構(gòu)建在實(shí)施例30中描述。來(lái)自pTHT6的THT6cDNA插入片段以“有義”方向克隆到表達(dá)載體pYE22m的酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動(dòng)子(PGAP)后。縮寫如下TRP1＝Trp1基因；IR1＝2μm質(zhì)粒的反向重復(fù)；TGAP＝來(lái)自酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的終止子序列。還標(biāo)記了限制性酶位點(diǎn)。
本說(shuō)明書中使用的氨基酸縮寫在下面表2中顯示。
表2 氨基酸縮寫符號(hào) 氨基酸3字母符號(hào)單字母符號(hào) L-丙氨酸AlaA L-精氨酸ArgR L-天冬酰胺 AsnN L-天冬氨酸 AspD L-半胱氨酸 CysC L-谷氨酰胺 GlnQ L-谷氨酸GluE L-甘氨酸GlyG L-組氨酸HisH L-異亮氨酸 IleI L-亮氨酸LeuL L-賴氨酸LysK L-甲硫氨酸 MetM L-苯丙氨酸 PheF L-脯氨酸ProP L-絲氨酸SerS L-蘇氨酸ThrT L-色氨酸TrpW L-酪氨酸TyrY L-纈氨酸ValV 表3提供了本文提及的序列指定的SEQ ID NO的總結(jié) 表3 序列 物種SEQ ID NO pCGP 1805的cDNA插入片段矮牽牛屬SEQ ID NO1 相應(yīng)的氨基酸序列 矮牽牛屬SEQ ID NO2 pCGP246的cDNA插入片段 石竹SEQ ID NO3 相應(yīng)的氨基酸序列 石竹SEQ ID NO4 pCGP246的cDNA插入片段金魚草屬SEQ ID NO5 相應(yīng)的氨基酸序列 金魚草屬SEQ ID NO6 cDNA部分序列 擬南芥屬SEQ ID NO7 相應(yīng)的氨基酸序列 擬南芥屬SEQ ID NO8 基因組序列 擬南芥屬SEQ ID NO9 外顯子I的相應(yīng)的氨基酸序列擬南芥屬SEQ ID NO10 外顯子II的相應(yīng)氨基酸序列 擬南芥屬SEQ ID NO11 外顯子III的相應(yīng)氨基酸序列擬南芥屬SEQ ID NO12 外顯子IV的相應(yīng)氨基酸序列 擬南芥屬SEQ ID NO13 pCGP2158的cDNA插入片段 玫瑰SEQ ID NO14 相應(yīng)的氨基酸序列 玫瑰SEQ ID NO15 pCHRM1的cDNA插入片段 菊 SEQ ID NO16 相應(yīng)的氨基酸序列 菊 SEQ ID NO17 THT cDNA序列 蝴蝶草屬SEQ ID NO18 相應(yīng)的氨基酸序列 蝴蝶草屬SEQ ID NO19 MHT 85cDNA序列 日本牽?；? SEQ ID NO20 相應(yīng)的氨基酸序列 日本牽?；? SEQ ID NO21 GHT13cDNA序列龍膽SEQ ID NO22 相應(yīng)的氨基酸序列 龍膽SEQ ID NO23 pL3-6的cDNA插入片段 Lisianthus SEQ ID NO24 相應(yīng)的氨基酸序列 Lisianthus SEQ ID NO25 出自WO 93/20206的cDNA序列矮牽牛屬SEQ ID NO26 寡核苷酸poly T-anch ASEQ IDNO27 寡核苷酸poly T-anch CSEQ ID NO28 寡核苷酸ploy T-anch GSEQ ID NO29 保守的氨基酸引物區(qū) SEQ ID NO30 相應(yīng)的寡核苷酸序列 SEQ ID NO31 保守的氨基酸引物區(qū) SEQ ID NO32 相應(yīng)的寡核苷酸序列 SEQ ID NO33 寡核苷酸引物Pet Haem-New SEQ ID NO34 保守的氨基酸引物區(qū) SEQ ID NO35 相應(yīng)的寡核苷酸序列 SEQ ID NO36 寡核苷酸Snapred Race A SEQ ID NO37 寡核苷酸Snapred Race C SEQ ID NO38 寡核苷酸poly-C RaceSEQ ID NO39 寡核苷酸引物Pet Haem SEQ ID NO40 分別含質(zhì)粒pCGP 1867，pCGP1810和pCGP231的無(wú)毒的微生物根癌土壤桿菌菌株AGL0(Agrobacterium tumefaciens AGL0)于1996年2月23日保存于澳大利亞政府分析實(shí)驗(yàn)室，1 suakin Street，Pymble，New South Wales，2037，澳大利亞，且指定的保藏號(hào)分別為96/10967，96/10968和96/10969。
分離類黃酮3’-羥化酶和相關(guān)的核酸序列 實(shí)施例1植物材料 矮牽牛屬 所用的Petunia hybrida品種在表4中提供。
表4 植物在光強(qiáng)度10,000lux，白晝長(zhǎng)度14小時(shí)，溫度22℃至26℃的特定生長(zhǎng)室中生長(zhǎng)。
石竹屬 麝香石竹變種Kortina Chanel的花從Van Wyk和Son FlowerSupply，Victoria獲得。
麝香石竹花在如下限定的發(fā)育階段收獲 階段1封閉的花蕾，花瓣不可見(jiàn)。
階段2花蕾?gòu)堥_花瓣尖端可見(jiàn)。
階段3幾乎全部花瓣尖端暴露。“畫筆階段”。
階段4外側(cè)花瓣與莖成45角。
階段5花完全張開。
金魚草屬 使用的金魚草株系來(lái)自親本株系K16(eos-)和N8(Eos+)。F3’H活性與Eos基因之間有嚴(yán)格相關(guān)性，已知Eos基因控制黃烷酮，黃烷醇和花青苷的3’羥基化(Forkmann和Stotz，1981)。K16是缺乏F3’H活性的純合隱性突變體，而N8是F3’H活性的野生型。這些品系相似，但不同源。親本株系和來(lái)自自交(K16×N8)F1植物的種子從Dr.C.Martin(John Innes Centre，Norwich，UK)處獲得。
擬南芥屬 擬南芥株系Columbia(Tt7)，Landsberg eracta(Tt7)和NW88(tt7)從諾丁漢擬南芥貯存中心(Nottingham ArabidopsisStock Centre)獲得。野生型擬南芥(Tt7)種子具有特征性的棕色。tt7突變體的種子具有淡棕色的種子，其植株的特征在于葉中花青苷含量減小(Koornneef等，1982)。Tt7植物合成花青素，而tt7突變體中積累花葵素，表明Tt7基因控制類黃酮3’-羥基化。
玫瑰 Rosa hybrida變種Kardinal的花從Van Wyk和Son Flower Supply，Victoria獲得。
Rosa hybrida花發(fā)育階段限定如下 階段1未沉積色素，緊密關(guān)閉的花蕾(10-12mm高；5mm寬)。
階段2沉積有色素，緊密關(guān)閉的花蕾(15mm高；9mm寬)。
階段3沉積有色素，關(guān)閉的花蕾；萼片剛開始打開(20-25mm高；13-15mm寬) 階段4花蕾開始張開；花瓣著色較重；萼片分離(花蕾25-30mm高且18mm寬)。
階段5萼片完全展開；其中一些卷曲?；ò曛^重且展開(花蕾30-33mm高且20mm寬)。
菊 菊花發(fā)育階段限定如下 階段0未見(jiàn)花蕾。
階段1花蕾可見(jiàn)小花完全被苞片覆蓋。
階段2花蕾?gòu)堥_小花頂端可見(jiàn)。
階段3小花緊緊地重疊。
階段4幾乎所有小花頂端暴露；外側(cè)小花開放但不水平。
階段5外側(cè)小花水平。
階段6花達(dá)到成熟。
實(shí)施例2細(xì)菌菌株 使用的大腸桿菌菌株是 DH5α supE44，Δ(lacZYA-ArgF)U169，

80lacZΔM15，hsdR17(rk-，mk+)，recA1，endA1，gyrA96，thi-1，relA1，deoR(Hanahan，1983和BRL，1986). XL1-Blue MRF′Δ(mcr A)183，Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173，endA1，supE44，thi-1，recA1，gyrA96，relA1，lac[F′proAB，lacIqZΔM15，Tn10(Tetr]c(Stratagene) XL1-Blue supE44，hsdR17(rk-，mk+)，recA1，endA1，gyrA96，thi-1，relA1，lac[F′proAB，lacIq，lacZΔM15，Tn10(tetr)] SOLR e14-(mcrA)，Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)171，sbcC，recB，recJ，umuC::Tn5(kanr)，uvrC，lac，gyrA96，thi-1，relA1，[F′proAB，lacIqZΔM15]，Su-非抑制性的(Stratagene) DH10B(Zip)F-mcrA，Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)，

80d lacZΔM15，ΔlacX74，deoR，recA1，araD139，Δ(ara，leu)7697，galU，galK1λ，rspL，nupG Y1090r- ΔlacU169，(Δlon)？，araD139，strA，supF，mcrA，trpC22::Tn10(Tetr)[pMC9 Ampr，Tetr]，mcrB，hsdR 喪失毒性的根癌土壤桿菌菌株AGL0(Lazo等，1991)從R.Ludwig處(加利福利亞大學(xué)，生物學(xué)系，Santa Cruz，USA)獲得。
克隆載體pBluescript從Stratagene公司獲得。
根據(jù)Inoue等(1990)所述的方法進(jìn)行大腸桿菌菌株DH5α細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。
實(shí)施例3一般方法 DNA探針的32P標(biāo)記 使用寡聚核苷酸標(biāo)記試劑盒(Bresatec)用50μci[α-32P]-dCTP放射性標(biāo)記DNA片段(50-100ng)。未摻入的[α-32P]-dCTP通過(guò)用Sephadex G-50(Fine)柱層析去除。
DNA序列分析 使用來(lái)自應(yīng)用生物系統(tǒng)的PRISMTM Ready反應(yīng)染色引物循環(huán)測(cè)序試劑盒進(jìn)行DNA測(cè)序。按照廠商提供的方法進(jìn)行。使用Perkin ElmerPCR儀(GeneAmp PCR System 9600)進(jìn)行循環(huán)測(cè)序反應(yīng)并在自動(dòng)373A DNA測(cè)序儀(應(yīng)用生物系統(tǒng))上走膠。
使用FASTA和TFASTA程序(Pearson和Lipman，1988)或BLAST程序(Altschul等，1990)進(jìn)行與Genbank，SWISS-PROT和EMBL數(shù)據(jù)庫(kù)的同源性研究。使用LFASTA程序(Pearson和Lipman，1988)獲得序列的相似百分?jǐn)?shù)。除非另有說(shuō)明，在所有情況下核苷酸序列比較使用的缺口值(ktup)為6，氨基酸序列比較使用的缺口值(ktup)為2。
使用在MacVectorTM 6.0(Oxford Molecular Ltd.)中應(yīng)用的Clustal W程序進(jìn)行多個(gè)序列排列(缺口值為2)。
實(shí)施例4從P.hybrida變種國(guó)旗紅中分離對(duì)應(yīng)于Ht1基因座的類黃酮3’-羥化酶(F3’H)的cDNA克隆 為了分離連鎖到Ht1基因座且編碼矮牽牛屬類黃酮途徑中的類黃酮3’-羥化酶(F3’H)的cDNA克隆，從階段1至3的矮牽牛屬國(guó)旗紅(OGR)花中分離RNA并制備花瓣的cDNA文庫(kù)。OGR花含以花青素為基礎(chǔ)的色素且有高水平的類黃酮3’-羥化酶活性。用從已知在類黃酮途徑中包含的3種細(xì)胞色素P450cDNA克隆和在酵母中具有類黃酮3’-羥化酶活性的一種細(xì)胞色素P450cDNA克隆(651)分離的32P標(biāo)記片段的混合物篩選OGR cDNA文庫(kù)。這些包括一個(gè)編碼肉桂酸-4-羥化酶(C4H)的矮牽牛屬cDNA克隆和2個(gè)編碼類黃酮3’，5’-羥化酶(F3’5’H)(Holton等，1993)的矮牽牛屬cDNA克隆(由Hf1和Hf2基因座編碼)。
矮牽牛屬變種OGR cDNA文庫(kù)的構(gòu)建 使用Turpen和Griffith(1986)的方法從P.hybrida變種OGR階段1至3的花的花瓣組織分離總RNA。使用oligotex-dTTM(Qiagen)從總RNA篩選Poly(A)+RNA。
用5μg從OGR的1至3階段分離的poly(A)+RNA作模板，使用ZAP-cDNA Gigapack III Gold克隆試劑盒(stratagene)在λZAP中構(gòu)建定向花瓣cDNA文庫(kù)。獲得的重組子總數(shù)為2.46×106。
轉(zhuǎn)染XL1-Blue MRF’細(xì)胞后，包裝的cDNA混合物以每15cm直徑平板50,000pfu涂板。平板在37℃培養(yǎng)8小時(shí)，噬菌體在100mM NaCl，8mM MgSO4，50mM Tris-HCl pH8.0，0.01％(W/V)明膠[噬菌體貯存緩沖液(PSB)]中洗脫(Sambrook等，1989)。加入氯仿，并在4℃貯存作為擴(kuò)增文庫(kù)的噬菌體。
轉(zhuǎn)染XL1-Blue MRF’細(xì)胞后，100,000pfu的擴(kuò)增文庫(kù)以每15cm平板10,000pfu的密度在NZY平板上鋪板(Sambrook等，1989)，并在37℃培養(yǎng)8小時(shí)。在4℃放置過(guò)夜后，取一式二份轉(zhuǎn)移到Colony/PlaqueScreenTM濾膜(DuPont)上并按廠商建議進(jìn)行處理。
探針的分離 F3’5’H探針 按Holton等(1993)和美國(guó)專利號(hào)5,349,125所述分離的對(duì)應(yīng)于Hf1或Hf2基因座的2個(gè)類黃酮3’，5’羥化酶在篩選方法中應(yīng)用。來(lái)自矮牽牛屬的C4H cDNA克隆 在用于分離對(duì)應(yīng)于Hf1或Hf2基因座的2個(gè)類黃酮3’，5’-羥化酶cDNA克隆的篩選方法中(Holton等，1993；美國(guó)專利號(hào)5,349,125)分離了許多細(xì)胞色素P450cDNA克隆。這些cDNA克隆中一個(gè)(F1)(包含于pCGP 161中)(圖2)根據(jù)與以前鑒定的來(lái)自綠豆的C4H克隆的序列相同性鑒定為編碼肉桂酸4-羥化酶(C4H)(Mizutani等，1993)。序列數(shù)據(jù)從矮牽牛屬F1cDNA克隆5’端的295個(gè)核苷酸產(chǎn)生。在測(cè)序的295個(gè)核苷酸中與綠豆C4H克隆有83.1％的相似性且在推測(cè)的氫基酸序列中有93.9％的相似性。
651cDNA克隆 包含于pCGP619(圖5)中的651cDNA克隆的分離與鑒定在
發(fā)明者F·布魯里拉, T·A·霍爾頓, M·Z·米查爾 申請(qǐng)人:國(guó)際花卉開發(fā)有限公司