一種明日葉查爾酮合成酶基因的序列的制作方法
【專利摘要】一種明日葉類黃酮合成途徑限速酶—查爾酮合成酶基因的序列，該基因的序列具有SEQ ID NO.1中從第1-1413位所示的核苷酸序列以及SEQ ID NO.2中從第1-1194位所示的核苷酸序列，其序列編碼的多肽具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。查爾酮合成酶是植物體內(nèi)類黃酮代謝途徑中的第一個關鍵酶，本發(fā)明利用同源克隆方法結(jié)合RACE技術獲得的明日葉查爾酮合成酶基因可用于調(diào)控明日葉及其他植物內(nèi)黃酮類化合物的合成，具有較大的經(jīng)濟價值和應用前景，尤其在醫(yī)療、保健領域使得明日葉能夠獲得更廣泛的應用。
【專利說明】-種明日葉查爾酮合成酶基因的序列

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及的是一種植物基因工程領域的基因序列，具體涉及一種明日葉類黃酮 化合物合成關鍵基因的查爾酮合成酶基因的DNA、cDNA開放閱讀框全長序列及編碼蛋白的 氨基酸序列。

【背景技術】
[0002] 明日葉，傘形科當歸屬草本植物，原產(chǎn)自日本八丈島，因島民多食用明日葉，均較 長壽，因此明日葉又名長壽菜。明日葉具有抗癌、防止細胞老化、提高機體免疫力、抗血栓、 降血壓等保健功能，被譽為"21世紀的健康食品"。研究發(fā)現(xiàn)，明日葉富含一種特有成分 查爾酮，屬黃酮類化合物，而此黃酮類化合物具有很高的藥用價值（藥食兼用植物明日葉 的研究進展及應用劉暢，王正武等，食品與藥品2013, 15 (3) 205-209)(周先麗，梁成欽， 徐慶，等.明日葉的化學成分[J].中國實驗方劑學雜志，2012, 18 (3): 103-105)，孟揚 等在關于查爾酮抑制小鼠癌細胞的研究中證明了查爾酮的藥用功能（孟揚，鐘進義，孫 赫.明日葉查爾酮對小鼠肝癌細胞Caspase-3和Bax蛋白表達的影響[J].癌變.畸變.突 變，2011，23(1) :50-53)。因此明日葉的藥用及保健功能與其富含查爾酮有著必然聯(lián)系。黃 酮類化合物是一類重要的植物次生代謝物質(zhì)，指基本母核為苯基色原酮類化合物，現(xiàn)在則 泛指兩個具有酚羥基的苯環(huán)通過中央三碳原子相互連接的一系列化合物。黃酮類化合物合 成途徑中，主要是由多個結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因來完成的，通過苯丙氨酸代謝途徑，從苯丙氨 酸經(jīng)過三步酶促反應生成香豆酰輔酶A，再在查爾酮合成酶的作用下，與丙二酸輔酶A縮合 生成查爾酮，然后在查爾酮異構(gòu)酶（CHI)、二氫黃酮醇還原酶（DFR)和異黃酮合酶（IFS)等 催化下合成黃酮、異類黃酮、花青素類等化合物（蔣明，曹家樹.查爾酮合成酶基因[J]. 細胞生物學雜志，2007, 29(4) :525-529)。因此，查爾酮合成酶（CHS)在苯丙氨酸代謝途徑 中扮演著極其重要的角色，是類黃酮合成途徑中的關鍵酶和限速酶。因此明日葉查爾酮合 成酶基因 CHS可應用于明日葉類黃酮化合物合成的調(diào)控。目前，國內(nèi)外關于查爾酮合成酶 的報道較多，主要集中在十字花科的擬南芥、禾本科的稻、玉米、豆科的大豆、苜蓿、豌豆、葡 萄科的葡萄、菊科植物等，但未曾見任何公開報道傘形科當歸屬明日葉查爾酮合成酶基因 的克隆及DNA、cDNA開放閱讀框全長序列和編碼蛋白的氨基酸序列，同時對于UV-C照射處 理對明日葉CHS基因表達的影響和查爾酮含量調(diào)控研究也未見報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種明日葉查爾酮合成酶基因 DNA 全序列、開放閱讀框ORF序列以及該基因編碼的氨基酸序列，并且在獲得高查爾酮含量明 日葉品種中得到應用，為調(diào)控明日葉黃酮類化合物合成及在轉(zhuǎn)基因植物中的應用提供有效 的技術手段。
[0004] 本發(fā)明的技術方案是：
[0005] -種明日葉查爾酮合成酶基因的序列，其具有SEQ ID NO. 1中從第1-1413位所示 的核苷酸序列以及SEQ ID NO. 2中從第1-1194位所示的核苷酸序列。
[0006] 進一步地，所述的序列編碼的多膚具有SEQ ID NO. 3所不的氣基酸序列。
[0007] 本發(fā)明的另一技術方案是：
[0008] -種所述的明日葉查爾酮合成酶基因在獲得高查爾酮含量明日葉品種中的應用。
[0009] 本發(fā)明所述的明日葉查爾酮合成酶基因 CHS全長的克隆，依次通過以下步驟實 現(xiàn)：
[0010] 1)根據(jù)菊科植物查爾酮合成酶基因保守序列設計兼并引物，以明日葉葉片CDNA 為模板，擴增明日葉查爾酮合成酶基因的保守區(qū)域；
[0011] 2)基于獲得的明日葉查爾酮合成酶基因的保守區(qū)域設計基因特異引物，進行3'、 5' race克隆，分別得到明日葉CHS基因的3'、5'端序列，通過拼接得到明日葉CHS基因的 ORF序列，并命名為Ak-CHS ;
[0012] 3)根據(jù)明日葉CHS基因 ORF設計基因全長引物，以明日葉cDNA為模板進行PCR擴 增，驗證獲得的CHS基因 ORF全長序列，并以DNA為模板，以上述設計全長特異引物進行PCR 擴增獲得基因 DNA全長。
[0013] 4)根據(jù)獲得的ORF序列設計Ak-CHS熒光定量引物，以actin為內(nèi)參基因設計其熒 光定量引物，通過UV-C照射處理明日葉葉片不同時間，以不同時間提取的明日葉葉片RNA 反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進行q-PCR，并測定不同時間明日葉葉片查爾酮提取量。
[0014] 本發(fā)明具有如下的有益效果：
[0015] 由于查爾酮合成酶是植物體內(nèi)類黃酮代謝途徑中的第一個關鍵酶，因此本發(fā)明提 供的查爾酮合成酶基因可用于調(diào)控明日葉及其他植物內(nèi)黃酮類化合物的合成，具有較大的 經(jīng)濟價值和應用前景，尤其使得明日葉在醫(yī)療、保健領域中獲得更廣泛的應用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1為明日葉葉片RNA電泳結(jié)果圖。
[0017] 圖2為CHS基因3'端PCR擴增產(chǎn)物電泳圖；
[0018] 圖中，M- DL2000，1-CHS基因3'端PCR擴增產(chǎn)物。
[0019] 圖3為CHS基因5'端PCR擴增產(chǎn)物電泳圖；
[0020] 圖中，M- DL2000, 2- CHS基因5'端PCR擴增產(chǎn)物。
[0021] 圖4為CHS基因 ORF、DNA全長驗證電泳圖；
[0022] 圖中，M- DL2000, 3- CHS基因 ORF全長的PCR擴增產(chǎn)物，4一CHS基因 DNA全長的 PCR片擴增產(chǎn)物。
[0023] 圖5為UV-C照射處理AK-CHS基因相對表達量分析圖。
[0024] 圖6為UV-C照射處理查爾酮提取量變化圖。
[0025] 圖7為查爾酮含量測定標準曲線圖。

【具體實施方式】
[0026] 本發(fā)明利用同源克隆方法結(jié)合RACE技術獲得明日葉類黃酮合成途徑限速酶一查 爾酮合成酶的基因全長序列，該基因 DNA全長1413bp，含兩個外顯子和一個內(nèi)含子，開放閱 讀框（ORF)全長為1194bp，編碼397個氨基酸。
[0027] 下面結(jié)合具體的實施例進一步闡述本發(fā)明的【具體實施方式】。這些實施例僅用于說 明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0028] 下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，詳見[美]J.莎姆 布魯克（2005)編著的《分子克隆實驗指南》第三版中所述的條件，或按照試劑盒制造廠商 所建議的條件。實驗所用的高保真Taq酶（Premix Taq)、pMD18 - T載體、PrimeScript?lst Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒和突光定量試劑盒購自TaKaRa公司， SMARTer?RACE cDNA Amplification Kit 試劑盒購自 Clontech 公司，RNAprep Pure 植物總 RNA提取試劑盒購于天根生化科技（北京）有限公司，大腸桿菌DH5ci由實驗室保存。
[0029] 實施例1
[0030] 明日葉查爾酮合成酶基因的克隆，步驟如下：
[0031] 1.明日葉葉片RNA的提取
[0032] a)勻漿處理：
[0033] 稱取50-100mg鮮嫩明日葉葉片在液氮中迅速研磨成粉末，加入450 μ I RL，渦旋 劇烈震蕩混勻。
[0034] b)將所有溶液轉(zhuǎn)移至過濾柱CS上（過濾柱CS放在收集管中），12000rpm離心 2-5min，小心吸取收集管中的上清至RNase-Free的離心管中，吸頭盡量避免接觸收集管中 的細胞碎片沉淀。
[0035] c)緩慢加入0. 5倍上清體積的無水乙醇，混勻，將得到的溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)入吸 附柱CR3中，12000rpm離心30-60sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR3放回收集管中。
[0036] d)向吸附柱CR3中加入350μ 1去蛋白液RWl，12000rpm離心30-60sec，倒掉收集 管中的廢液，將吸附柱CR3放回收集管中。
[0037] e) DNase I工作液的配制：取10 μ I DNase I儲存液放入新的RNase-Free離心管 中，加入70 μ I RDD溶液，輕柔混勻。
[0038] f)向吸附柱CR3中央加入80 μ 1的DNase I工作液，室溫放置15min。
[0039] g)向吸附柱CR3中加入350μ 1去蛋白液RWl，12000rpm離心30-60sec，倒掉收集 管中的廢液，將吸附柱CR3放回收集管中。
[0040] h)向吸附柱CR3中加入500 μ 1漂洗液RW，室溫靜置2min，12000rpm離心 30-60sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR3放回收集管中。
[0041] i)重復步驟h)。
[0042] j) 12000rpm離心2min，倒掉廢液，將吸附柱CR3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干 吸附材料中殘余的漂洗液。
[0043] k)將吸附柱CR3放入一個新的RNase-Free離心管中，向吸附膜的中間部位懸空 滴加 30-100 μ I RNase-Free ddH20,室溫放置 2min，12000rpm 離心 2min，得到 RNA 溶液，一 70°C保存。
[0044] 1)用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，明日葉葉片總RNA電泳結(jié)果見圖 1，由圖1可以看到28S和18S清晰的兩條帶，且28S條帶的亮度約為18S的2倍；說明R NA 提取完整，無降解，滿足后續(xù)試驗需要，分光光度計下檢測RNA濃度。
[0045] 2. cDNA第一條鏈的合成
[0046] 根據(jù) PrimeScript?lst Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒說明，將一 70°C保存 的RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈，反轉(zhuǎn)錄后的cDNA保存于-20°C冰箱中備用。
[0047] 3. CHS基因 cDNA開放閱讀框全長克隆及DNA全長的獲得
[0048] a)根據(jù)菊科植物查爾酮合成酶基因保守序列設計兼并引物CHS-F、CHS_R(見下列 表1)，以反轉(zhuǎn)錄的明日葉cDNA為模板，擴增明日葉查爾酮合成酶基因的保守區(qū)域；PCR反應 條件為：94°C 5min ;94°C 30s，55°C 30s，72°C lmin，32 個循環(huán)；72°C IOmin ;4°C保存。將回 收的PCR產(chǎn)物連接至pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5a，在選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)（氨芐青 霉素）后，挑選單克隆搖菌后進行PCR檢測，檢測獲得的陽性結(jié)果送至上海華大基因進行測 序，測序獲得長度為959bp的保守區(qū)域片段。
[0049] 表1本發(fā)明所用引物
[0050]

【權利要求】
1. 一種明日葉查爾酮合成酶基因的序列，其特征在于，具有SEQ ID NO. 1中從第 1-1413位所示的核苷酸序列以及SEQ ID NO. 2中從第1-1194位所示的核苷酸序列。
2. 根據(jù)權利要求1所述的明日葉查爾酮合成酶基因的序列，其特征在于，所述的序列 編碼的多肽具有SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列。
3. -種權利要求2所述的明日葉查爾酮合成酶基因在獲得高查爾酮含量明日葉品種 中的應用。
【文檔編號】C12N9/10GK104313040SQ201410558045
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月20日 優(yōu)先權日:2014年10月20日
【發(fā)明者】周麟筆, 劉峰, 曹越平 申請人:上海交通大學