專利名稱：重組長(zhǎng)效胰高血糖素樣肽類(lèi)似物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組融合蛋白，具體涉及重組長(zhǎng)效胰高血糖素樣肽類(lèi)似物及其制備方法。
背景技術(shù)：
糖尿病是一種多病因的代謝性疾病，已成為現(xiàn)代社會(huì)嚴(yán)重危害人類(lèi)健康與生命的主要疾 病。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)提供的數(shù)據(jù)，發(fā)達(dá)國(guó)家糖尿病患病率已高達(dá)5%-10%，在我國(guó) 則為3%左右；到2030年，全世界糖尿病患者人數(shù)將比2000年翻一番。其中2型糖尿病患 者人數(shù)目前約占所有糖尿病患者人數(shù)的90%以上。
胰高血糖素樣肽-1 (glucagon, like p印tide. 1GLP—1)可以與GLP-1受體相結(jié)合， 通過(guò)多種作用控制血糖，包括剌激胰島素分泌、同時(shí)抑制胰高血糖素和胃排空，但是不會(huì)
產(chǎn)生低血糖，對(duì)n型糖尿病的治療具有較好的效果。天然胰高血糖素樣肽-i在體內(nèi)很快被
DPP-IV降解，半衰期只有2-3分鐘，在給藥上具有很大的困難。
腸促胰島素類(lèi)似物(exendin-4)最初由毒蜥屬動(dòng)物唾液中分離，是由基因exendin-4 表達(dá)產(chǎn)生，可激活人體內(nèi)GLP-1受體，可以通過(guò)促進(jìn)胰島素分泌和細(xì)胞再生、抑制食物攝 入而降低血糖。但它不是DIP-IV的底物，因而具有較長(zhǎng)的半衰期和較強(qiáng)的生物活性。 exendin-4注射給藥后，能夠模擬調(diào)控機(jī)體胰島素的激素在體內(nèi)發(fā)揮作用，從而達(dá)到控制血 糖的效果。exendin-4—天注射兩次，優(yōu)點(diǎn)在于不需要根據(jù)糖化血紅蛋白(HbAlc)或血糖 水平來(lái)調(diào)整劑量，在早餐和晚餐前給予固定劑量即可，從而減少患者頻繁監(jiān)測(cè)血糖的不便。 HGS公司的Albugon，它是GLP-1和人血清白蛋白(human serum albumin, HSA)的融合體， 它在猴子體內(nèi)的半衰期為3天，目前已進(jìn)入臨床II期。
人血清白蛋白(HSA)是一種可溶性單體蛋白質(zhì)，構(gòu)成血液中的蛋白質(zhì)總量的一半。白 蛋白作為一種基本載體，攜帶傳遞脂肪酸、類(lèi)固醇和激素分子等，其穩(wěn)定的惰性性質(zhì)是維 持血壓的一個(gè)重要因素。人血清白蛋白是一種球狀非糖基化的，分子量為65Kd的蛋白質(zhì)。 人血清白蛋白的基因位于4號(hào)染色體上，有16961個(gè)堿基對(duì)，分為15個(gè)間隔區(qū)，經(jīng)RNA加 工拼接后形成的mRNA可編碼一個(gè)具有585個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。這一蛋白在經(jīng)過(guò)高爾基體的轉(zhuǎn)化加工，去除分泌信號(hào)而分泌到細(xì)胞外。人血清白蛋白有35個(gè)半胱氨酸，構(gòu)成17個(gè)二 硫鍵的單體(Brown JR， The structure, functional and application of human albumin, Pergamon， NY 1977 )。人血清白蛋白具有多種多態(tài)形及30種不同的遺傳分子(Weika卿， CR， human genomic Annual, 37: 219-226， 1973)。人血清白蛋白分子的三維結(jié)構(gòu)已經(jīng)由 X光衍射法測(cè)定(Carter, Science, 244， 1195-1198， 1989)。人血清白蛋白是血液種的 主要成分，在人體內(nèi)含量為每升血液含40克，半衰期壽命為14-20天。綜上所述，人血清 白蛋白具有極大的優(yōu)勢(shì)使之可抵御生物體內(nèi)酶的作用，并可使治療性蛋白質(zhì)以較高的劑量 使用。
目前用于臨床的人血清白蛋白均是從人血漿中提取的。利用微生物重組表達(dá)白蛋白 (rHSA)的生產(chǎn)專利巳經(jīng)公開(kāi)，EP330451和EP361991。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種長(zhǎng)效胰高血糖素樣肽類(lèi)似物及其制備方法。
本發(fā)明將exendin-4和人血清白蛋白通過(guò)基因工程的方法融合在一起，融合蛋白分子既 保持exendin-4蛋白的生物學(xué)功能，又含有HSA穩(wěn)定的惰性性質(zhì)，極大的延長(zhǎng)了 exendin-4 的半衰期。在臨床使用中可減少注射給藥次數(shù)，減輕患者的痛苦，提高療效并降低醫(yī)療費(fèi) 用。
以往不同基因融合表達(dá)中，在考慮兩個(gè)蛋白生物學(xué)活性上，兩個(gè)基因之間往往需要連接 肽(linker)連接，而連接肽在臨床治療中可能造成高的免疫原性。本發(fā)明在研究exendin-4 蛋白和人血清白蛋白構(gòu)象和活性中心后，充分利用兩個(gè)不同蛋白N端和C端的序列特征， 使兩個(gè)基因直接相連融合表達(dá)，避免了免疫原性的擔(dān)憂，同時(shí)保留了 exendin-4的降糖活 性。本發(fā)明在獲得了表達(dá)長(zhǎng)效胰高血糖素樣肽類(lèi)似物的基因工程菌的基礎(chǔ)上，又對(duì)其發(fā)酵 和純化工藝進(jìn)行了選擇及優(yōu)化，在保證產(chǎn)物活性的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步提高了蛋白表達(dá)效率及 純化產(chǎn)物得率。
本發(fā)明一方面公開(kāi)了一種長(zhǎng)效胰高血糖素樣肽類(lèi)似物，是由腸促胰島素類(lèi)似物 exendin-4與人血清白蛋白(human serum albumin)直接連接獲得的多肽，exendin-4與 人血清白蛋白(human serum albumin)之間沒(méi)有連接肽。較佳的，上述exendin-4具有SEQ ID N0:1的序列，人血清白蛋白具有SEQ ID N0:2的 序列，exendin-4在人血清白蛋白的N端。
本發(fā)明第二方面公開(kāi)了一種多核苷酸序列，該序列編碼上述長(zhǎng)效胰高血糖素樣肽類(lèi)似 物。較佳的，該多核苷酸序列為針對(duì)酵母表達(dá)優(yōu)化過(guò)的序列。最佳的，上述多核苷酸序列 為SEQ ID N0:3。該序列的獲得可通過(guò)全基因合成獲得。
本發(fā)明第三方面，公開(kāi)了一種載體，其含有前述多核苷酸序列。
本發(fā)明第四方面，公開(kāi)了一種基因工程畢赤酵母菌株，它是被前述載體所轉(zhuǎn)化的畢赤酵 母菌株。
本發(fā)明第五方面，公開(kāi)了一種長(zhǎng)效胰高血糖素樣肽類(lèi)似物的制備方法，將長(zhǎng)效胰高血糖 素樣肽類(lèi)似物通過(guò)帶有長(zhǎng)效胰高血糖素樣肽類(lèi)似物基因的工程酵母發(fā)酵表達(dá)，長(zhǎng)效胰高血 糖素樣肽分泌表達(dá)于培養(yǎng)基中。含有胰高血糖素樣肽的培養(yǎng)上清通過(guò)藍(lán)色染料親和層析進(jìn) 行粗純化，再經(jīng)過(guò)疏水層析中純化和離子交換層析精純化獲得純度大于95%的胰高血糖素 樣肽精制品。
長(zhǎng)效胰高血糖素樣肽類(lèi)似物的制備方法具體包括下列步驟
1) 在發(fā)酵罐中接種前述基因工程畢赤酵母菌種；
2) 在適合表達(dá)前述長(zhǎng)效胰高血糖素樣肽類(lèi)似物的條件下，發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基因工程 畢赤酵母菌種；
3) 發(fā)酵液離心并收集上清；
4) 發(fā)酵液上清液中長(zhǎng)效人胰高血糖素樣肽類(lèi)似物的分離純化發(fā)酵液上清經(jīng)藍(lán)色染 料親和層析進(jìn)行粗純化，再經(jīng)疏水層析中純化，再經(jīng)離子交換層析精純化后獲得 純度大于95%的產(chǎn)物。
上述步驟2)的發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)條件為采用基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基，控制溶解氧大于30%，溫 度最優(yōu)為3(TC， pH最優(yōu)為6.0，培養(yǎng)16-20小時(shí)后，補(bǔ)加甘油溶液，再培養(yǎng)4-6小時(shí)；甘油 培養(yǎng)階段結(jié)束后，以向發(fā)酵罐中補(bǔ)加甲醇，發(fā)酵約45-80小時(shí)后結(jié)束發(fā)酵。
上述步驟2)中，在酵母中表達(dá)融合蛋白時(shí)，通過(guò)分泌到酵母細(xì)胞外的培養(yǎng)液中完成。 進(jìn)一步的，本發(fā)明還對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的發(fā)酵及純化工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化
7對(duì)前述步驟1，先將基因工程畢赤酵母菌種以YPD培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)14小時(shí)一24小時(shí)后 接種發(fā)酵罐。
對(duì)前述步驟2，包括下述幾方面的工藝條件優(yōu)化
1. 所述基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中加微量元素添加劑PTM1 4-10ml /L培養(yǎng)基,優(yōu)選的，微量元素 添加劑PTM1的添加量為6 ml /L培養(yǎng)基。
2. 補(bǔ)加甘油溶液的濃度為45-55% (v%)，優(yōu)選50%，且甘油溶液中含有8-15ml/L的 PTM1，優(yōu)選12ml/L。此階段培養(yǎng)主要為生物量的增長(zhǎng)階段，使菌體的量在短時(shí)間內(nèi) 得到擴(kuò)增。
3. 補(bǔ)加甲醇的過(guò)程為控制補(bǔ)加甲醇的速度由2-5ml/小時(shí)/升培養(yǎng)基逐步提高到 8-12ml/小時(shí)/升培養(yǎng)基，其中甲醇中含有8-15ml/L甲醇的PTM1。優(yōu)選的，先控制 補(bǔ)加甲醇的速度為3.6ml/小時(shí)/升培養(yǎng)基，其中甲醇中含有12ml/L的PTM1，而后 逐步提高甲醇補(bǔ)料速度到10. 8ml/小時(shí)/升培養(yǎng)基，并以此速度補(bǔ)加甲醇70小時(shí)后 結(jié)束發(fā)酵。
采用上述工藝條件，發(fā)酵液上清液中的長(zhǎng)效胰高血糖素樣肽類(lèi)似物的含量可達(dá)到300mg 一600mg/L。
對(duì)于前述步驟3，包括下述幾方面的工藝條件優(yōu)化
1. 發(fā)酵液上清經(jīng)藍(lán)色染料親和層析進(jìn)行粗純化的步驟為發(fā)酵上清液pH到7.0，上樣 到經(jīng)20mM pH為7. 0的磷酸鹽、500mM NaCl緩沖液平衡的藍(lán)色染料(Blue S印hroase) 親和層析柱，上樣完畢后先用20mM pH為7. 0的磷酸鹽、128rnM KSCN緩沖液沖洗去 未結(jié)合的物質(zhì)，再用20mM pH為7. 0的磷酸鹽、230mM KSCN緩沖液沖洗脫結(jié)合在柱 上的融合蛋白，以紫外280nM吸收檢測(cè)，收集蛋白峰。
2. 疏水層析中純化的步驟為收集的蛋白溶液，調(diào)節(jié)硫酸銨的終濃度為0.46M，調(diào)節(jié) pH到7. 0，此溶液上樣到經(jīng)20mM的磷酸鹽加0. 5M硫酸銨pH為7. 0緩沖液平衡的 Phenyl High Performance層析柱，上樣完畢后先用20rnM的磷酸鹽加0. 3M硫酸銨 pH為7. 0緩沖液沖洗去未結(jié)合的物質(zhì)，使紫外280nm吸收的降回到基線，再用20mM 磷酸鹽加上0. 1M硫酸銨pH7. 0的溶液洗脫結(jié)合在柱上的融合蛋白。3.離子交換層析精純化的步驟為收集的蛋白溶液調(diào)節(jié)pH到5.0，并用水稀釋到電導(dǎo) 率小于3ms/cm，此溶液上樣到經(jīng)20mM的醋酸鈉pH為5. 0緩沖液平衡的CM FF層析 柱，上樣完畢后先用80幽的醋酸鈉pH為6.5緩沖液緩慢洗脫，收集pH為6.2時(shí)的 目標(biāo)峰。
重組長(zhǎng)效胰高血糖素樣肽類(lèi)似物經(jīng)親和層析、疏水層析和離子交換層析后的純度已大于 95%，細(xì)菌內(nèi)毒素、宿主DNA或蛋白殘留等指標(biāo)都能到達(dá)藥典的一般要求，樣品可用于下 一步的制劑或除菌過(guò)濾后于一2(TC凍存。
本發(fā)明的長(zhǎng)效胰高血糖素樣肽類(lèi)似物極大的延長(zhǎng)了 exendin-4的半衰期。在臨床使用中
可減少注射給藥次數(shù)，減輕患者的痛苦，提高療效并降低醫(yī)療費(fèi)用。此外，本發(fā)明制備方
法，工藝條件容易控制，可以獲得具有生物活性的長(zhǎng)效胰高血糖素樣肽類(lèi)似物，且蛋白表 達(dá)效率高及純化產(chǎn)物得率高。


圖1:重組長(zhǎng)效胰高血糖素樣肽類(lèi)似物表達(dá)電泳圖
圖2:藍(lán)色染料親和層析圖譜
圖3:疏水層析圖譜
圖4:離子交換層析圖譜
圖5:純化后的重組長(zhǎng)效胰高血糖素樣肽類(lèi)似物電泳圖
圖6:小鼠口服葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)血糖濃度隨時(shí)間圖
圖7:半衰期測(cè)定圖
具體實(shí)施例方式
以下列舉具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，應(yīng)理解，實(shí)施例并非用于限制本發(fā)明的保護(hù)范
圍，實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法及未說(shuō)明配方的試劑均為按照常規(guī)條件如Sambrook 等人，分子克隆試驗(yàn)手冊(cè)(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) 中所述的條件或者制造商建議的條件進(jìn)行或配置。實(shí)施例1基因工程菌的構(gòu)建
按SEQ ID NO:3全基因合成exendin-4-HSA基因序列，酵母密碼子優(yōu)化。在exendin-4 序列的N端引入甲醇酵母KEX2酶切序列KR及xhol酶切位點(diǎn)，HAS的C端引入Notl位 點(diǎn)。合成片段Xhol和Notl雙酶切，同時(shí)用Xhol和Notl雙酶切處理載體pPICZ a A質(zhì)粒， 分別回收片段后連接轉(zhuǎn)化到DH5 a中，篩選pPICZ a -exendin-4-HSA轉(zhuǎn)化子。測(cè)序鑒定正確 的pPICZ a -exendin-4-HSA用sacl酶切，電轉(zhuǎn)甲醇酵母X33， YPD平板上zeocin抗性篩選， 得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。挑選一單菌落，置于裝有25ml BMGY培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，于30° C， 300 rpm培養(yǎng)至0D600 = 6;室溫下1500rpm離心5min，收集菌體，10ml B顧Y重懸菌體(約 1(T20ml，置于100ml的搖瓶中，30° C， 300 rpm的搖床上繼續(xù)生長(zhǎng)；每12h向培養(yǎng)基中 添加100%甲醇至終濃度為1.0%;分離樣品的上清液10。/。SDS-PAGE鑒定重組蛋白的表達(dá)。 經(jīng)測(cè)序表明蛋白序列正確。
實(shí)施例2基因工程菌的培養(yǎng)和表達(dá)
搖瓶菌種培養(yǎng)5個(gè)容量為1L的三角瓶，裝YPD培養(yǎng)基各200ml，培養(yǎng)基配方為酵母提 取物(1%) 10g、蛋白胨(2%) 20g，葡萄糖(2%) 20g，用去離子水溶解并定容到1L， 115 °。蒸汽滅菌20分鐘。每瓶接實(shí)施例1獲得的甘油菌種lOOul， 30'C搖床300rpni培養(yǎng)24小 時(shí)，此時(shí)菌濃度0D600在6-20之間。
30L罐發(fā)酵培養(yǎng)30L全自動(dòng)發(fā)酵罐(Biostat c-dcu， Sartourius)，具體操作可參照 其使用說(shuō)明書(shū)。30L罐中裝入基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基15L，配方為CaS04 *2H20 0. 93g/l， K2S0418. 2g/l， MgS04 7H20， K0H 4. 13g/l， H3P04 26 . 7ml/l，甘油40g/l用去離子水溶解并定容到15L。 連接好pH電極、溶氧電極，溫度電極等，開(kāi)動(dòng)攪拌500rpm， 121'C在位滅菌30分鐘。滅菌 結(jié)束后，待其溫度降到95'C時(shí)開(kāi)始通氣，繼續(xù)待其冷卻道3(TC時(shí)，加大通氣量到30L每分 鐘，攪拌速度調(diào)到900rpm。調(diào)整溶氧電極讀數(shù)到100，接上氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基pH 到6. 0，加入66ml經(jīng)無(wú)菌過(guò)濾的微量元素添加劑70ml(PTMl :GuS04弧0 6g/1， Nal 0. 08g/l， MnS04'H20 3g/l， CoCl2 0. 5g/l， ZnCl 20g/l， H3B03 0. 02g/l NaMo03 2H20 0. 2g/l， FeS04* 7H20 65g/l， Biotin 0. 2g/l， 6 M H2S04 30ml/l)，加入已培養(yǎng)好的菌種開(kāi)始培養(yǎng)。 培養(yǎng)條件為溫度30。C、溶氧大于30%、 pH用氨水控制在6.0、攪拌速度900rpm、空氣 流量為30L每分鐘。如此培養(yǎng)20小時(shí)后，培養(yǎng)基中的甘油逐漸被耗盡，此時(shí)溶氧開(kāi)始上升。當(dāng)溶氧上升后，開(kāi)始以280ml/小時(shí)的速度向發(fā)酵罐中補(bǔ)加50%的甘油(含12ml/L的PTM1) 溶液，如此再培養(yǎng)6小時(shí)，停止甘油補(bǔ)料。此時(shí)菌體濃度OD600在150左右，開(kāi)始以50ml/ 小時(shí)向發(fā)酵罐中補(bǔ)加甲醇(含12ml/L PTM1)。穩(wěn)定2小時(shí)后提高甲醇補(bǔ)料速度為100m1/ 小時(shí)，此流速再穩(wěn)定2小時(shí)后提高甲醇補(bǔ)料速度到150ml/小時(shí)，以此速度補(bǔ)加甲醇70小時(shí) 后結(jié)束發(fā)酵。取出發(fā)酵液，6000rpm離心10分鐘，收集上清液。共收集上清液22L，上清 液中的目標(biāo)蛋白表達(dá)量在470mg/L，目標(biāo)蛋白測(cè)序符合預(yù)期。重組長(zhǎng)效胰高血糖素樣肽類(lèi)似 物表達(dá)電泳圖如圖1所示。
實(shí)施例3基因工程菌表達(dá)產(chǎn)物的分離純化
藍(lán)色染料親和層析將實(shí)施例2獲得的發(fā)酵上清液用6M NaOH調(diào)節(jié)pH到7. 0，上樣到 經(jīng)20mM pH為7. 0的磷酸鹽、500mMNaCl緩沖液平衡的藍(lán)色染料親和層析柱，柱床直徑100mm， 柱床高度15cm，柱床體積為1000ml。流速肌/小時(shí)，經(jīng)3小時(shí)后上完樣。上樣完畢后先用 20mM pH為7. 0的磷酸鹽、128函KSCN緩沖液沖洗去未結(jié)合的物質(zhì)，再用20mM pH為7. 0 的磷酸鹽、230mM KSCN緩沖液沖洗脫結(jié)合在柱上的融合蛋白。以紫外280nM吸收檢測(cè)，收 集蛋白峰，共收集洗脫液3200ml。藍(lán)色染料親和層析圖譜如圖2所示
疏水層析收集的蛋白溶液加入3M的硫酸銨溶液630ml，使溶液中的硫酸銨的終濃度 到0. 46M，調(diào)節(jié)pH到7. 0。此溶液上樣到經(jīng)20mM的磷酸鹽加0. 5M硫酸銨pH為7. 0緩沖液 平衡的Phenyl High Performance層析柱，柱床直徑50咖，柱床高度10cm，柱床體積為300ml 。 流速為1. 2L/小時(shí)，經(jīng)3小時(shí)上樣完畢，然后先用20函的磷酸鹽加0. 3M硫酸銨pH為7. 0 緩沖液沖洗去未結(jié)合的物質(zhì)，使紫外280nm吸收的降回到基線。再用20mM磷酸鹽加上0. 1M 硫酸銨pH7. 0的溶液洗脫結(jié)合在柱上的融合蛋白。共收集蛋白峰780ml。疏水層析圖譜如圖 3所示。
離子交換層析收集的蛋白溶液加入1M醋酸調(diào)節(jié)pH到5. 0，加入1500ml去離子水使 電導(dǎo)率小于3ms/cm。此溶液上樣到經(jīng)20mM的醋酸鈉pH為5. 0緩沖液平衡的CM FF層析柱， 柱床直徑50mm，柱床高度15cm，柱床體積為300ml。流速1. 2L/小時(shí)，上樣完畢后先用80mM 的醋酸鈉pH為6.5緩沖液緩慢洗脫，收集pH為6.2時(shí)的目標(biāo)峰。共收集蛋白溶液820ml。 離子交換層析圖譜如圖4所示。純化后的重組長(zhǎng)效胰高血糖素樣肽類(lèi)似物電泳圖如圖5所 示。實(shí)施例4小鼠的口服葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)
采用實(shí)施例3獲得的蛋白溶液，按常規(guī)配制注射液。
采用8 — 10周的昆明小鼠，購(gòu)買(mǎi)后適應(yīng)性飼養(yǎng)l周，自由采食和飲水。試驗(yàn)前l(fā)天禁食 16 — 18小時(shí)，按體重靜脈注射5mg/Kg人血清白蛋白或上述配置的重組胰高血糖素樣肽類(lèi)似 物白蛋白融合蛋白注射液。給藥后l小時(shí)口服灌注給予1.5mg/g體重的葡萄糖，分別在給 糖前IO分鐘和給糖后的IO、 20、 30、 60、 120分鐘通過(guò)尾靜脈取血并測(cè)定葡萄糖水平。
小鼠口服葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)血糖濃度隨時(shí)間圖如圖6所示。
結(jié)果如下-
時(shí)間HSA組(n=6) mM/LE4/HSA組(n=6) mM/L
給糖前10分鐘4.23.0
給糖后10分鐘9.86. 3
20分鐘10. 26. 5
30分鐘9.66. 1
60分鐘6.24.3
120分鐘5. 53.8
結(jié)果表明本發(fā)明獲得的重組胰高血糖素樣肽類(lèi)似物白蛋白融合蛋白有明顯的降糖活性。 實(shí)施例5小鼠體內(nèi)半衰期測(cè)定實(shí)驗(yàn)
采用8 — 10周的昆明小鼠，購(gòu)買(mǎi)后適應(yīng)性飼養(yǎng)l周，自由采食和飲水。試驗(yàn)前l(fā)天禁食 16 — 18小時(shí)，按體重靜脈注射5mg/Kg上述配置的重組胰高血糖素樣肽類(lèi)似物白蛋白融合蛋 白注射液或exendin-4溶液300ug/Kg。給藥后1小時(shí)后自由采食和飲水，分別在給藥前10 分鐘和給糖后的30、 60分鐘、2、 4、 8、 16、 24小時(shí)通過(guò)尾靜脈取血，離心取血清于-80 。C凍存。以Exendin-4 Assay Kits測(cè)定血清中的exendin-4的濃度，根據(jù)時(shí)間和濃度求出 半衰期。
12結(jié)果表明本發(fā)明獲得的重組胰高血糖素樣肽類(lèi)似物白蛋白融合蛋白在小鼠體內(nèi)的半衰 期約為14小時(shí)，而exendin-4的體內(nèi)半衰期約為60分鐘。所以本發(fā)明獲得的融合蛋白能 顯著延長(zhǎng)exendin-4在小時(shí)體內(nèi)的作用時(shí)間(14倍)，推測(cè)在人體內(nèi)在半衰期在2-4天。序列表
〈110>上海欣百諾生物科技有限公司
〈120〉重組長(zhǎng)效胰高血糖素樣肽類(lèi)似物及其制備方法
<■ 3 <210> 1 〈211〉 39 〈212〉 PRT
<213〉希拉毒晰禾中(力e/oofenaa 5YA pe"Mz ) <220>
〈400> 1
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr 1 5 Glu Ala Val Arg Leu Phe lie 20
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35
<210> 2 〈211〉 585 〈212〉 PRT
<213〉人種(腸o卿j-e/ s)
〈220〉
<400> 1
Asp Ala His Lys Ser Glu Val 1 5 Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val 20
Gin Cys Pro Phe Glu Asp His 35
Ser Asp Leu Ser Lys Gin Met 10
Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly 25 30
Glu Glu 15
Pro Ser
Ala His Arg Phe Lys Asp Leu 10
Leu lie Ala Phe Ala Gin Tyr
25 30 Val Lys Leu Val Asn Glu Val 40 45
Gly Glu 15
Leu Gin Thr GluPhe Ala
50
Ser Leu 65
Arg Glu
Glu Arg
Pro Arg
Asp Asn 130 Arg His 145
Tyr Lys
Cys Leu
Ser Ala
Arg Ala 210 Lys Ala 225
Val His
Arg Als
Ser Lys
Cys lie 290 Heu Ala 305
Glu Ala
Arg His
Tyr Glu
Cys Tyr 370 Gin Asn 385
Lys
His
Thr
Asn
Leu 115 Glu
Pro
Ala
Heu
Lys 195 Phe
Glu
Thr
Asp
Leu 275 Ala
Ala
Lys
Pro
Thr 355 Ala
Leu
Thr
Thr
Tyr
Glu 100
Val
Glu
Tyr
Ala
Pro 180 Gin
Lys
Phe
Glu
Leu 260 Lys
Glu
Asp
Asp
Asp 340 Thr
Lys
lie
Cys
Leu
Gly
85
Cys
Arg
Thr
Phe
Phe 165 Lys
Arg
Ala
Ala
Cys 245 Ala
Glu
Val
Phe
Val 325 Tyr
Leu
Val
Lys
Val
Phe
70
Glu
Phe
Pro
Phe
Tyr 150 Thr
Leu
Leu
Trp
Glu 230 Cys
Lys
Cys
Glu
Ala
55
Gly
Met
Leu
Glu
Leu 135 Ala
Glu
Asp
Lys
Ala 215 Val
His
Tyr
Cys
Asn 295 Val Glu 310
Phe Leu Val Lys
Ser
Glu
Phe
Gin 390
Asp 375 Asn
Asp
Asp
Ala
Gin
Val 120 Lys
Pro
Cys
Glu
Cys 200 Val
Ser
Gly
lie
Glu 280 Asp
Ser
Gly
Val
Cys 360 Glu
Cys
Glu
Lys
Asp
His 105 Asp
L>ys
Glu
Cys
Leu 185 Ala
Ala
Lys
Asp
Cys 265 Lys
Glu
Lys
Met
Leu 345 Cys
Phe
Glu
Ser
Ceu
Cys 90 Lys
Val
Tyr
Leu
Gin 170 Arg
Ser
Arg
Leu
Leu 250 Glu
Pro
Met
Asp
Phe 330 Leu
Ala
Lys
Leu
Ala
Cys 75 Cys
Asp
Met
Leu
Leu 155 Ala
Asp
Leu
Leu
Val 235 Leu
Asn
leu
Pro
Val 315 Leu
Leu
Ala
Pro
Phe 395
Glu 60 Thr
Ala
Asp
Cys
Tyr 140 Phe
Ala
Glu
Gin
Ser 220 Thr
Glu
Gin
Ceu
Ala 300 Cys
Tyr
Arg
Ala
Leu 380 Glu
Asn Cys Asp
Val Ala Thr
Lys Gin Glu 95
Asn Pro Asn
110 Thr Ala Phe 125
Glu lie Ala
Phe
Asp
Gly
Lys 205 Gin
Asp
Cys
Asp
Glu 285 Asp
Lys
Glu
Leu
Asp 365 Val
Gin
Ala Lys Lys
Lys 190 Phe
Arg
Leu
Ala
Ser 270 Lys
Leu
Asn
Tyr
Ala 350 Pro
Glu
Leu
Ala 175 Ala
Gly
Phe
Thr
Asp 255 lie
Ser
Pro
Tyr
Ala 335 Lys
His
Glu
Gly
Lys
Leu 80 Pro
Leu
His
Arg
Arg 160 Ala
Ser
Glu
Pro
Lys 240 Asp
Ser
His
Ser
Ala 320 Arg
Thr
Glu
Pro
Glu 400
15Tyr Lys
Gin Val
Val Gly
Ala Glu 450 Glu Lys 465
Leu Val
Tyr Val
lie Cys
Leu Val 530 Lys Ala 545
Ala Asp
Phe
Ser
Ser 435 Asp
Thr
Asn
Pro
Thr 515 Glu
Val Asp Ala Ala Ser
Gin
Thr 420 Lys
Tyr
Pro
Arg
Lys 500 Leu
Leu
Met
Lys
Gin 580
Asn 405 Pro
Cys
Leu
Val
Arg 485 Glu
Ser
Val
Asp
Glu 565 Ala
Ala Leu
Thr Leu
Cys Lys
Ser Val 455 Ser Asp 470
Pro Cys
Phe Asn
Glu Lys
Lys His 535 Asp Phe 550
Thr Cys
Leu
Val
His 440 Val
Arg
Phe
Ala
Glu 520 Lys
Ala Phe Ala Leu Gly
Val
Glu 425 Pro
Leu
Val
Ser
Glu 505 Arg
Pro
Ala
Ala
Leu 585
Arg 410
Val
Glu
Asn
Thr
Ala 490 Thr
Gin
Lys
Phe
Glu 570
Tyr Thr
Ser Arg
Ala Lys
Gin Leu 460 Lys Cys 475
Leu Glu
Phe Thr
lie Lys
Ala Thr 540 Val Glu 555
Glu Gly
Lys
Asn
Arg 445 Cys
Cys
Val
Phe
Lys 525 Lys
Lys
Lys
Lys
Leu 430 Met
Val
Thr
Asp
His 510 Gin
Glu
Cys
Lys
Val 415 Gly
Pro
Leu
Glu
Glu 495 Ala
Thr
Gin
Cys
Leu 575
Pro
Lys
Cys
His
Ser ■ Thr
Asp
Ala
Leu
Lys 560 Val
<210> 3 <211> 1878 〈212〉腿 <213>人工序列 〈220〉
〈223〉兩個(gè)基因直接連接 <400> 1
cacggtgaag gtactttcac ttctgacttg ttgttcatcg aatggttg助gaacggtggt gcacacaaga gtgaggttgc tcatagattt ttggtgttga ttgcctttgc tcagtatctt ttagtgaatg aagtaactga atttgcaaaa
tctaagcaaa tggaagaaga eigctgttaga 60 ccatcttctg gtgctccacc accatctgat 120 a肪gatttgg gagaagaaaa tttcaaagcc 180 cagcagtgtc catttgaaga tcatgtaaaa 240 acatgtgttg ctgatgagtc agctgaaaat 300<formula>formula see original document page 17</formula>
權(quán)利要求
1.一種長(zhǎng)效胰高血糖素樣肽類(lèi)似物，是由腸促胰島素類(lèi)似物exendin-4與人血清白蛋白直接連接獲得的多肽，exendin-4與人血清白蛋白(human serum albumin)之間沒(méi)有連接肽，exendin-4在人血清白蛋白的N端。
2. 如權(quán)利要求1所述長(zhǎng)效胰高血糖素樣肽類(lèi)似物，其特征在于，所述exendin-4具有SEQ ID N0:1的序列，人血清白蛋白具有SEQ ID N0:2的序列。
3. —種多核苷酸序列，該序列編碼權(quán)利要求1或2所述長(zhǎng)效胰高血糖素樣肽類(lèi)似物。
4. 如權(quán)利要求3所述多核苷酸序列，其特征在于，所述多核苷酸序列為針對(duì)酵母表達(dá)優(yōu)化 過(guò)的序列。
5. 如權(quán)利要求4所述多核苷酸序列，其特征在于，所述多核苷酸序列為SEQ ID N0:3。
6. —種載體，其含有權(quán)利要求3或4或5所述多核苷酸序列。
7. —種基因工程畢赤酵母菌株，它是被權(quán)利要求6所述載體所轉(zhuǎn)化。
8. 如權(quán)利要求1或2所述長(zhǎng)效胰高血糖素樣肽類(lèi)似物的制備方法，包括下列步驟a) 在發(fā)酵罐中接種權(quán)利要求7所述基因工程畢赤酵母菌種；b) 在適合基因工程畢赤酵母菌種分泌表達(dá)權(quán)利要求1或2所述長(zhǎng)效胰高血糖素樣肽 類(lèi)似物的條件下，發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基因工程畢赤酵母菌種；C)發(fā)酵液離心并收集上清；d)發(fā)酵液上清液中長(zhǎng)效人胰高血糖素樣肽類(lèi)似物的分離純化發(fā)酵液上清經(jīng)藍(lán)色染 料親和層析進(jìn)行粗純化，再經(jīng)疏水層析中純化，再經(jīng)離子交換層析精純化后獲得 純度大于95%的產(chǎn)物。
9. 如權(quán)利要求8所述長(zhǎng)效胰高血糖素樣肽類(lèi)似物的制備方法，其特征在于，所述步驟a為， 先將基因工程畢赤酵母菌種以YPD培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)14小時(shí)一24小時(shí)后接種發(fā)酵罐。
10. 如權(quán)利要求8所述長(zhǎng)效胰高血糖素樣肽類(lèi)似物的制備方法，其特征在于，步驟b中，發(fā) 酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基因工程畢赤酵母菌種的條件為采用基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基，控制溶解氧大于30 %，培養(yǎng)16-20小時(shí)后，補(bǔ)加甘油溶液，再培養(yǎng)4-6小時(shí)；甘油培養(yǎng)階段結(jié)束后，以向 發(fā)酵罐中補(bǔ)加甲醇，發(fā)酵45-80小時(shí)后結(jié)束發(fā)酵。
11. 如權(quán)利要求10所述長(zhǎng)效胰高血糖素樣肽類(lèi)似物的制備方法，其特征在于，所述溫度為 30°C， pH為6.0。
12. 如權(quán)利要求10所述長(zhǎng)效胰高血糖素樣肽類(lèi)似物的制備方法，其特征在于，所述基礎(chǔ)鹽 培養(yǎng)基中加有微量元素添加劑PTM1 4-10 ml /L培養(yǎng)基。
13. 如權(quán)利要求10所述長(zhǎng)效胰高血糖素樣肽類(lèi)似物的制備方法，其特征在于，所述甘油溶 液的濃度為45-55% (v%)，且甘油溶液中含有8-15ml/L的PTM1。
14. 如權(quán)利要求10所述長(zhǎng)效胰高血糖素樣肽類(lèi)似物的制備方法，其特征在于，所述補(bǔ)加甲 醇的過(guò)程為控制補(bǔ)加甲醇的速度由2-5ml/小時(shí)/升培養(yǎng)基逐步提高到8-12ml/小時(shí)/升 培養(yǎng)基，其中甲醇中含有8-15ml/L的PTM1。
15. 如權(quán)利要求13所述長(zhǎng)效胰高血糖素樣肽類(lèi)似物的制備方法，其特征在于，所述補(bǔ)加甲 醇的過(guò)程為先控制補(bǔ)加甲醇的速度為3.6ml/小時(shí)/升培養(yǎng)基，其中甲醇中含有12ml/L 的PTM1，而后逐步提高甲醇補(bǔ)料速度到10.8ml/小時(shí)/升培養(yǎng)基，并以此速度補(bǔ)加甲醇 70小時(shí)后結(jié)束發(fā)酵。
16. 如權(quán)利要求8所述長(zhǎng)效胰高血糖素樣肽類(lèi)似物的制備方法，其特征在于，步驟c中，所 述發(fā)酵液上清經(jīng)藍(lán)色染料親和層析進(jìn)行粗純化的步驟為發(fā)酵上清液pH到7.0，上樣到 經(jīng)20mMpH為7.0的磷酸鹽、500mM NaCl緩沖液平衡的藍(lán)色染料親和層析柱，上樣完畢 后先用20mM pH為7. 0的磷酸鹽、128raM KSCN緩沖液沖洗去未結(jié)合的物質(zhì)，再用20mM pH 為7.0的磷酸鹽、230mMKSCN緩沖液沖洗脫結(jié)合在柱上的融合蛋白，以紫外280nM吸收 檢測(cè)，收集蛋白峰。
17. 如權(quán)利要求8所述長(zhǎng)效胰高血糖素樣肽類(lèi)似物的制備方法，其特征在于，步驟c中，所 述疏水層析中純化的步驟為收集的蛋白溶液，調(diào)節(jié)硫酸銨的終濃度為0.46M，調(diào)節(jié)pH 到7. 0，此溶液上樣到經(jīng)20mM的磷酸鹽加0. 5M硫酸銨pH為7. 0緩沖液平衡的Phenyl High Performance層析柱，上樣完畢后先用20rnM的磷酸鹽加0, 3M硫酸銨pH為7. 0緩 沖液沖洗去未結(jié)合的物質(zhì)，使紫外280nra吸收的降回到基線，再用20rnM磷酸鹽加上0. 1M 硫酸銨pH7. 0的溶液洗脫結(jié)合在柱上的融合蛋白。
18. 如權(quán)利要求8所述長(zhǎng)效胰高血糖素樣肽類(lèi)似物的制備方法，其特征在于，步驟c中，所 述離子交換層析精純化的步驟為收集的蛋白溶液調(diào)節(jié)pH到5.0,并用水稀釋到電導(dǎo)率小于3ms/cm，此溶液上樣到經(jīng)20mM的醋酸鈉pH為5. 0緩沖液平衡的CM FF層析柱，上 樣完畢后先用80mM的醋酸鈉PH為6. 5緩沖液緩慢洗脫，收集PH為6. 2時(shí)的目標(biāo)峰。
全文摘要
本發(fā)明涉及重組融合蛋白，公開(kāi)了一種重組長(zhǎng)效胰高血糖素樣肽類(lèi)似物及其制備方法，本發(fā)明的長(zhǎng)效胰高血糖素樣肽類(lèi)似物，是由腸促胰島素類(lèi)似物exendin-4與人血清白蛋白直接連接獲得的多肽，exendin-4與人血清白蛋白(human serum albumin)之間沒(méi)有連接肽。本發(fā)明的長(zhǎng)效胰高血糖素樣肽類(lèi)似物極大的延長(zhǎng)了exendin-4的半衰期。在臨床使用中可減少注射給藥次數(shù)，減輕患者的痛苦，提高療效并降低醫(yī)療費(fèi)用。
文檔編號(hào)C12N15/63GK101525387SQ20091000964
公開(kāi)日2009年9月9日 申請(qǐng)日期2009年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月4日
發(fā)明者丁劍鋒, 朱化星, 王英明, 蔡麗君 申請(qǐng)人:上海欣百諾生物科技有限公司