擬南芥At4g09820基因在植物抗鹽方面的新應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及擬南芥At4g09820基因在培育耐鹽植物新品種方面的應(yīng)用。擬南芥At4g09820基因，又稱TT8基因，其CDS長度為1557bp，編碼518個(gè)氨基酸的蛋白，屬于bHLH(basichelix-loop-helix)型轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)類黃酮合成途徑的原花青素和花青素的生物合成。發(fā)明人通過對(duì)At4g09820基因的在高鹽度逆境中的研究，發(fā)現(xiàn)該基因特異性的調(diào)控NaCl引起的離子毒害反應(yīng)，表現(xiàn)出良好抗鹽特性，因此在植物抗鹽方面具有較為重要的應(yīng)用，通過對(duì)該基因的進(jìn)一步研究和轉(zhuǎn)化，可以培育出優(yōu)良的耐鹽植物品種。
【專利說明】擬南芥At4g09820基因在植物抗鹽方面的新應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及擬南芥At4g09820基因在培育耐鹽植物新品種方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]當(dāng)前，全球水資源短缺日趨加劇，而人類大量使用化肥使土壤鹽潰化日益嚴(yán)重，制約了農(nóng)業(yè)的持續(xù)生產(chǎn)和發(fā)展。隨著分子生物學(xué)和基因工程研究的深入，國際上很多科技工作者也在努力尋找與植物抗鹽相關(guān)的基因，擬通過基因工程技術(shù)改良作物的抗鹽性，但是目前可利用的成果甚少。
[0003]擬南芥屬十字花科鼠耳芥屬植物,又名鼠耳芥、阿拉伯芥、阿拉伯草，是植物遺傳學(xué)、分子生物學(xué)常用的模式植物之一，也常用于植物逆境條件下抗性基因研究。
[0004]現(xiàn)有研究一般認(rèn)為種皮的顏色除作為一個(gè)形態(tài)指示形狀外，也常與植物品質(zhì)有所關(guān)聯(lián)，因此利用模式植物擬南芥開展種皮色素形成調(diào)控機(jī)理的研究也有較多成果。擬南芥種皮中色素主要是類黃酮，確切 的說是花青素中的原花青素和櫟精中的黃酮醇。/7?基因(擬南芥基因組編碼為At4g09820)是調(diào)控?cái)M南芥種皮色素的基因之一，屬于bHLH (basichelix-loop-helix)型轉(zhuǎn)錄因子，其編碼的518個(gè)氨基酸的蛋白，主要用于調(diào)節(jié)類黃酮合成途徑的原花青素和花青素的生物合成。關(guān)于此基因的其他用途尚無有關(guān)研究和報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的在于提供擬南芥At4g09820基因(77?基因)在植物抗鹽特性方面的新應(yīng)用，從而為培育抗鹽植物品種提供新的可能性。
[0006]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下:
擬南芥At4g09820基因在植物抗鹽方面的應(yīng)用。
[0007]所述擬南芥At4g09820基因在植物抗鹽方面的應(yīng)用，該基因用于抗NaCl生長環(huán)境，即該基因的存在可以使植物體如擬南芥在一定濃度的NaCl環(huán)境中正常生長。
[0008]所述擬南芥At4g09820基因在植物抗鹽方面的應(yīng)用，該基因使擬南芥能夠抵抗100 mMNaCl生長環(huán)境。
[0009]所述擬南芥At4g09820基因在植物抗鹽方面的應(yīng)用，轉(zhuǎn)化該基因的植物體用于抗NaCl環(huán)境，即通過基因工程手段將該基因轉(zhuǎn)化進(jìn)入其他植物體后，可以使該植物體在一定濃度的NaCl環(huán)境下正常生長。
[0010]所述擬南芥At4g09820基因在植物抗鹽方面的應(yīng)用，轉(zhuǎn)化該基因并且超表達(dá)的植物體用于抗NaCl環(huán)境，即通過基因工程手段將該基因轉(zhuǎn)化進(jìn)入其他植物體后，該基因在轉(zhuǎn)化后植物體內(nèi)超表達(dá)，可以使該植物體在一定濃度的NaCl環(huán)境下正常生長。
[0011]所述擬南芥At4g09820基因在植物抗鹽方面的應(yīng)用，轉(zhuǎn)化該基因并且超表達(dá)的擬南芥U8-1突變體用于抗100 mMNaCl環(huán)境。[0012]現(xiàn)有研究表明，擬南芥At4g09820基因，又稱77?基因，其⑶S長度為1557bp，編碼518個(gè)氨基酸的蛋白，屬于bHLH (basic helix-loop-helix)型轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)節(jié)類黃酮合成途徑的原花青素和花青素的生物合成，與TTGl和TT2共同控制種皮發(fā)育。而本發(fā)明通過對(duì)At4g09820基因的在高鹽度逆境中的研究，發(fā)現(xiàn)該基因特異性的調(diào)控NaCl引起的離子毒害反應(yīng)，表現(xiàn)出抗鹽特性，因此通過該基因的進(jìn)一步研究和轉(zhuǎn)化，可以培育出優(yōu)良的耐鹽植物品種 。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為萌發(fā)生長在100 mM NaCl和200 mM甘露醇處理下7天的WT和U8-1幼苗；
圖2為萌發(fā)生長在100 mM NaCl、KCl或NaNO3處理下7天的WT和tt8_l幼苗；
圖3為萌發(fā)生長在0.1、0.5和I μ M ABA處理下7天的WT和tt8_l幼苗；
圖4為萌發(fā)生長在100 mM NaCl處理下7天的WT和tt8_l功能回補(bǔ)幼苗。
【具體實(shí)施方式】
[0014]下面介紹實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的解釋說明。
[0015]實(shí)施例1
為證明At4g09820基因與植物抗鹽作用相關(guān)，發(fā)明人進(jìn)行了對(duì)比分析實(shí)驗(yàn)。
[0016]下述tt8_l突變體為從擬南芥資源中心獲得的At4g09820基因T-DNA插入突變體(CS111)，該突變體的At4g09820基因失活，不能正確編碼相關(guān)蛋白質(zhì)，進(jìn)一步驗(yàn)證可以發(fā)現(xiàn)At4g09820基因與植物抗鹽功能相關(guān)。
[0017]具體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證過程如下:
(I)驗(yàn)證At4g09820基因特異調(diào)節(jié)NaCl引起的離子毒害反應(yīng)將擬南芥野生型(WT)和U8-1突變體種子播種于0.6%瓊脂的MS培養(yǎng)基和含有100mMNaCl或200 mM甘露醇的MS培養(yǎng)基上。生長環(huán)境為:光/暗周期為8/16h，溫度22°C，黑暗溫度18°C，相對(duì)濕度70%，光照強(qiáng)度90 μ mo I.m_2.s'待擬南芥種子萌發(fā)并生長I周后，進(jìn)行具體觀察。
[0018]實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，可以發(fā)現(xiàn)在含100 mM NaCl的培養(yǎng)基上，tt8_l突變體種子只萌發(fā)，生長受到嚴(yán)重抑制，而野生型(WT)種子能夠正常萌發(fā)并生長，即在鹽脅迫條件下U8-1突變體種子萌發(fā)和生長能力顯著弱于野生型(WT);而在正?；?00 mM甘露醇(與100mM NaCl等滲透)處理?xiàng)l件下，二者生長狀況無任何區(qū)別，即等滲透的甘露醇處理情況下，野生型(WT)和tt8_l突變體在萌發(fā)和生長表現(xiàn)上沒有明顯差異。
[0019]此結(jié)果表明，At4g09820基因(77?基因)特異調(diào)節(jié)NaCl引起的離子毒害反應(yīng)，而并不參與滲透脅迫調(diào)節(jié)。
[0020](2)驗(yàn)證At4g09820基因特異調(diào)節(jié)Na+造成的脅迫反應(yīng)
為進(jìn)一步證明At4g09820基因(JT8基因)調(diào)節(jié)NaCl造成的離子毒害，是Na+還是Cl_，實(shí)驗(yàn)分別用100 mM KCl和KNO3處理野生型(WT)和U8-1突變體的種子。處理和培養(yǎng)條件為:擬南芥野生型(WT)和tt8-l突變體種子播種于0.6%瓊脂的MS培養(yǎng)基和分別含有100mM NaClUOO mM KCl或100 mM NaN03的MS培養(yǎng)基上。生長環(huán)境為:光/暗周期為8/16h，溫度22°C，黑暗溫度18°C，相對(duì)濕度70%，光照強(qiáng)度90 μ mo I.m_2.s'待擬南芥種子萌發(fā)并生長I周后，進(jìn)行具體觀察。
[0021]實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，可以發(fā)現(xiàn)100 mM NaN03處理可以獲得100 mM NaCl處理的脅迫表型，而100 mM KCl處理，野生型和突變體沒有表型差異，從而可以證實(shí)At4g09820基因(JT8基因)特異調(diào)節(jié)Na+造成的脅迫反應(yīng)。
[0022](3)驗(yàn)證At4g09820基因特異調(diào)節(jié)Na+造成的脅迫反應(yīng)是否依賴ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 為進(jìn)一步證明At4g09820基因(JT8基因)調(diào)節(jié)Na+造成的脅迫反應(yīng)，是否依賴于ABA
信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，發(fā)明人用ABA處理了野生型(WT)和U8-1突變體，具體培養(yǎng)和處理?xiàng)l件為:擬南芥野生型(WT)和突變體(tt8-l)種子播種于0.6%瓊脂的MS培養(yǎng)基和分別含有0.1、
0.5和I μ M ABA的MS培養(yǎng)基上。生長環(huán)境為:光/暗周期為8/16h，溫度22°C，黑暗溫度18°C，相對(duì)濕度70%，光照強(qiáng)度90μπιΟ1.π2 待擬南芥種子萌發(fā)并生長I周后，進(jìn)行具體觀察。
[0023]實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，結(jié)果顯示沒有表型差異，表明At4g09820基因(77?基因)調(diào)節(jié)Na+造成的脅迫不依賴于ΑΒΑ。
[0024](4)核實(shí)U8-1突變體對(duì)Na+的敏感反應(yīng)是At4g09820基因突變引起的 為進(jìn)一步核實(shí)tt8-l突變體對(duì)Na+的敏感反應(yīng)，確實(shí)是At4g09820基因(77?基因)突
變引起的，本發(fā)明構(gòu)建了 At4g09820基因(77?基因)超表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化U8-1突變體，具體超表達(dá)及轉(zhuǎn)化過程如下:
(I)從擬南芥網(wǎng)站(http://www.arabidopsis.0rg)獲得 At4g09820 基因的 CDS 序列，根據(jù)超表達(dá)載體super-1300(花椰菜病毒35S啟動(dòng)子，能有效表達(dá)外源基因，含有潮霉素抗性基因)酶切位點(diǎn)，利用primer5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，以擬南芥基因組cDNA為模板，PCR擴(kuò)增出⑶S全長序列，經(jīng)過酶切鏈接把目的片段鏈接到super-1300載體上，經(jīng)過測序驗(yàn)證與Ji4g09820⑶S序列一致，即獲得含有目的基因的超表達(dá)載體。
[0025](2)將上述含有目的基因的超表達(dá)載體重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞。
[0026](3)在擬南芥U8-1突變體幼苗花序長至5-10 cm高時(shí)，進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，即將擬南芥花序浸沒在菌液中，每株浸花30 S，將浸花過的苗盆平放在托盤中，以塑料膜覆蓋保持濕度，避光放置16-24 h后取出，正常培養(yǎng)；5-7天后,重復(fù)侵染一次。
[0027](4)將上述農(nóng)桿菌侵染的擬南芥收獲的種子,撒種于含25 mg/L潮霉素的MS培養(yǎng)基平板上，4°C春化3 d，移到材料室培養(yǎng)，陽性植株對(duì)潮霉素有抗性，可正常生長，陰性植株對(duì)潮霉素敏感，不能正常生長最后死亡。
[0028](5)將篩選出的陽性幼苗移栽到營養(yǎng)土中，成熟后收種子，所得種子繼續(xù)用潮霉素篩選并做進(jìn)一步分子鑒定，并將陽性苗進(jìn)一步擴(kuò)大繁殖，獲得目的基因穩(wěn)定表達(dá)的純合體。
[0029]實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，可以發(fā)現(xiàn)經(jīng)轉(zhuǎn)化U8-1突變體恢復(fù)了野生型表型。
[0030]綜上所述，經(jīng)過一些列驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，發(fā)明人證明了 At4g09820基因在植物抗鹽方面有著巨大的潛在的功能，通過將該基因超表達(dá)并轉(zhuǎn)化進(jìn)植物體，可以獲得忍受鹽潰脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)基因植物，實(shí)現(xiàn)植物的抗鹽功能，本發(fā)明為培育抗鹽的轉(zhuǎn)基因作物新品種奠定了理論和生產(chǎn)實(shí)踐基礎(chǔ)。
【權(quán)利要求】
1.擬南芥At4g09820基因在植物抗鹽方面的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述擬南芥At4g09820基因在植物抗鹽方面的應(yīng)用，其特征在于，該基因用于抗NaCl生長環(huán)境。
3.如權(quán)利要求2所述擬南芥At4g09820基因在植物抗鹽方面的應(yīng)用，其特征在于，轉(zhuǎn)化該基因的植物體用于抗NaCl環(huán)境。
4.如權(quán)利要求3所述擬南芥At4g09820基因在植物抗鹽方面的應(yīng)用，其特征在于，轉(zhuǎn)化該基因并且超表達(dá)的植物體用于抗NaCl環(huán)境。
5.如權(quán)利要求4所述擬南芥At4g09820基因在植物抗鹽方面的應(yīng)用，其特征在于，轉(zhuǎn)化該基因并且超表達(dá)的擬南芥U8-1突變體用于抗100 mMNaCl環(huán)境。
【文檔編號(hào)】C12N15/82GK103540607SQ201310453523
【公開日】2014年1月29日 申請(qǐng)日期:2013年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月29日
【發(fā)明者】張驍, 趙翔, 王琳丹, 王進(jìn) 申請(qǐng)人:河南大學(xué)