專利名稱：新型人死亡抵抗蛋白，其編碼序列及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及新的編碼新型人死亡抵抗蛋白DRP多肽的多核苷酸，以及此多核苷酸編碼的多肽。本發(fā)明還涉及此多核苷酸和多肽的用途和制備。本發(fā)明的DRP多肽是一種新的與細(xì)胞死亡或腫瘤生成密切相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)分子，DRP的高表達(dá)具有抵抗TNF-α誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的功能。
背景技術(shù)：
腫瘤壞死因子α(TNF-α)是由多種細(xì)胞分泌的炎性細(xì)胞因子，能夠誘導(dǎo)多種惡性腫瘤細(xì)胞死亡，包括凋亡和壞死。但是正常細(xì)胞和某些腫瘤細(xì)胞系并不受TNF的影響。這種抵抗作用依賴于某些TNF誘導(dǎo)的保護(hù)蛋白的表達(dá)。TNF誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用是通過許多信號(hào)分子共同參與完成的一個(gè)網(wǎng)絡(luò)工程，其中TRAFs(TNF receptor-associated factor)家族蛋白，尤其是TRAF2，是這一信號(hào)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的中心環(huán)節(jié)。TNFR在與TNF結(jié)合后發(fā)生聚集，并募集TRAF2直接與TNFR2胞內(nèi)段結(jié)合，或通過結(jié)合其他接頭分子與TNFR1間接相連，TRAF2主要通過激活NIK和JNK/SAPK兩個(gè)獨(dú)立的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對(duì)細(xì)胞發(fā)揮凋亡調(diào)節(jié)作用，具有凋亡保護(hù)功能。
L929細(xì)胞是小鼠成纖維細(xì)胞，一般被用來作為檢測(cè)TNF細(xì)胞毒性的細(xì)胞模型。TNF既可以誘導(dǎo)L929細(xì)胞發(fā)生壞死，也可以誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡。以往的研究發(fā)現(xiàn)，介導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生壞死和凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有某些不同。caspases家族主要與凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，而磷脂酶D、C、A2的活化及線粒體活性氧類的產(chǎn)生主要與壞死有關(guān)。因此推測(cè)，兩種不同細(xì)胞死亡方式可能也是分別由不同的死亡抵抗蛋白進(jìn)行調(diào)節(jié)的。
鑒于細(xì)胞死亡相關(guān)蛋白的重要作用，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的細(xì)胞死亡相關(guān)蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的新型人死亡抵抗蛋白DRP蛋白以及其片段、類似物和衍生物。
本發(fā)明的另一目的是提供編碼這些多肽的多核苷酸。
本發(fā)明的另一目的是提供生產(chǎn)這些多肽的方法以及該多肽和編碼序列的用途。本發(fā)明的DRP蛋白是一種TRAF2同源分子。
在本發(fā)明的第一方面，提供新穎的分離出的DRP多肽，該多肽是人源的，它包含具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。較佳地，該多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抵抗TNF-α誘導(dǎo)細(xì)胞死亡功能的由(a)衍生的多肽。
在本發(fā)明的第二方面，提供編碼分離的這些多肽的多核苷酸，該多核苷酸包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70％相同性(a)編碼上述人DRP的多核苷酸；和(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中214-1164位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-3128位的序列。
在本發(fā)明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞或者被上述多核苷酸直接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的第四方面，提供了制備具有人DRP蛋白活性的多肽的方法，該方法包含(a)在適合表達(dá)人DRP蛋白的條件下，培養(yǎng)上述被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有人DRP蛋白活性的多肽。
在本發(fā)明的第五方面，提供了與上述的人DRP多肽特異性結(jié)合的抗體。還提供了可用于檢測(cè)的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中連續(xù)的10-3128個(gè)核苷酸。
在本發(fā)明的第六方面，提供了模擬、促進(jìn)、拮抗人DRP多肽活性的化合物，以及抑制人DRP多肽的表達(dá)的化合物。還提供了篩選和/或制備這些化合物的方法。較佳地，該化合物是人DRP多肽的編碼序列或其片段的反義序列。
在本發(fā)明的第七方面，提供了檢測(cè)樣品中是否存在DRP蛋白的方法，它包括將樣品與DRP蛋白的特異性抗體接觸，觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在DRP蛋白。
在本發(fā)明的第八方面，提供了一種檢測(cè)與人DRP多肽異常表達(dá)相關(guān)的疾病或疾病易感性的方法，該方法包括檢測(cè)編碼所述多肽的核酸序列中是否存在突變。
在本發(fā)明的第九方面，提供了本發(fā)明多肽和編碼序列的用途。例如本發(fā)明多肽可被用于篩選促進(jìn)人DRP多肽活性的激動(dòng)劑，或者篩選抑制人DRP多肽活性的拮抗劑、或者被用于肽指紋圖譜鑒定。本發(fā)明的人DRP蛋白的編碼序列或其片段，可被作為引物用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)，或者作為探針用于雜交反應(yīng)，或者用于制造基因芯片或微陣列。
在本發(fā)明的第十方面，提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明的人DRP多肽或其激動(dòng)劑、拮抗劑以及藥學(xué)上可接受的載體。這些藥物組合物可治療原發(fā)性心肌病、肝功能衰竭等病癥。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術(shù)的公開，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖1顯示了本發(fā)明的人PHDP RT-PCR表達(dá)分析結(jié)果。各泳道如下1.HUT；2.Jurkat；3.Molt-4；4.Ramos；5.Raji；6.Daudi；7.NB4；8.HL-60；9.U937；10.DC；11.單核細(xì)胞；12.T-淋巴細(xì)胞；13.B-淋巴細(xì)胞.
圖2顯示了本發(fā)明的人DRP Northern印跡雜交所顯示的分布。左圖為DRP的正常組織分布；右圖為DRP在多種細(xì)胞系內(nèi)的分布。PBL代表人外周血白細(xì)胞。結(jié)果提示DRP是一種廣泛分布的細(xì)胞內(nèi)分子。
圖3顯示了本發(fā)明的人DRP分子抵抗TNF-α對(duì)L929細(xì)胞的殺傷作用。圖3A是不同時(shí)間的細(xì)胞存活曲線；圖3B是不同TNF劑量的細(xì)胞存活曲線。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次分離了新型人死亡抵抗蛋白(death-resistant protein，DRP)。DRP與已知的TRAF2分子具有較高的同源性，將DRP在L929細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，可以顯著抑制TRAF2誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，Northern雜交顯示DRP在正常人體組織內(nèi)廣泛分布，在腫瘤組織中有較高水平的表達(dá)，尤其有意義的是，正常人體T、B淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞并不表達(dá)該基因，而在T、B或單核細(xì)胞來源的腫瘤細(xì)胞，如Jurkat、Molt-4、Raji、Daudi、NB4、HL-60、U937，中卻有較高的表達(dá)，這提示該新分子可能在正常組織細(xì)胞的惡變和腫瘤形成中發(fā)揮了重要作用。因此，可以確定DRP是一種新的在TNF誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用的細(xì)胞內(nèi)分子。DRP可能在腫瘤的診斷、治療等多個(gè)領(lǐng)域具有重要的開發(fā)和應(yīng)用價(jià)值。研究已表明，DRP惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。因此，為治療腫瘤目的研究和開發(fā)新的人死亡抵抗蛋白有重要意義。
在本發(fā)明中，術(shù)語“DRP蛋白”、“DRP多肽”或“死亡抵抗蛋白DRP”可互換使用，都指具有人死亡抵抗蛋白DRP氨基酸序列(SEQ ID NO2)的蛋白或多肽。
如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的DRP蛋白或多肽”是指DRP多肽基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化DRP蛋白?；旧霞兊亩嚯脑诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明還包括人DRP蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然人DRP蛋白相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個(gè)或多個(gè)保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個(gè)化合物(比如延長(zhǎng)多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。
在本發(fā)明中，術(shù)語“人DRP多肽”指具有人DRP蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與人DRP蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括人DRP蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與人DRP DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人DRP多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含人DRP多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長(zhǎng)的多肽外，本發(fā)明還包括了人DRP多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人DRP多肽序列的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供人DRP蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人DRP多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“人DRP蛋白保守性變異多肽”指與SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)，最佳地至多3個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。
表1

本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡(jiǎn)并的變異體。如本文所用，“簡(jiǎn)并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO2的蛋白質(zhì)，但與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
編碼SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術(shù)語“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個(gè)序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴(yán)格條件”是指(1)在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時(shí)加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時(shí)才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物學(xué)功能和活性。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長(zhǎng)度至少含15個(gè)核苷酸，較好是至少30個(gè)核苷酸，更好是至少50個(gè)核苷酸，最好是至少100個(gè)核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼DRP蛋白的多聚核苷酸。
本發(fā)明中的多肽和多核苷酸優(yōu)選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質(zhì)。
本發(fā)明的人DRP核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長(zhǎng)度較短時(shí)。通常，通過先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長(zhǎng)的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science1985；2301350-1354)被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。特別是很難從文庫中得到全長(zhǎng)的cDNA時(shí)，可優(yōu)選使用RACE法(RACE-cDNA末端快速擴(kuò)增法)，用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的序列信息適當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成?？捎贸Ｒ?guī)方法如通過凝膠電泳分離和純化擴(kuò)增的DNA/RNA片段。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或DRP蛋白編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。
通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)(Science，1984；2241431)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來表達(dá)或生產(chǎn)重組的DRP多肽。一般來說有以下步驟(1).用本發(fā)明的編碼人DRP多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；(3).從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
本發(fā)明中，人DRP多核苷酸序列可插入到重組表達(dá)載體中。術(shù)語“重組表達(dá)載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體。在本發(fā)明中適用的載體包括但不限于在細(xì)菌中表達(dá)的基于T7的表達(dá)載體(Rosenberg，et al.Gene，1987，56125)；在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的pMSXND表達(dá)載體(Lee and Nathans，J BioChem.2633521，1988)和在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的來源于桿狀病毒的載體?？傊?，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的一個(gè)重要特征是通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含人DRP編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a LaboratoryManual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。這些啟動(dòng)子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動(dòng)子；λ噬菌體PL啟動(dòng)子；真核啟動(dòng)子包括CMV立即早期啟動(dòng)子、HSV胸苷激酶啟動(dòng)子、早期和晚期SV40啟動(dòng)子、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細(xì)胞或其病毒中表達(dá)的啟動(dòng)子。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。
此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。
宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細(xì)胞；CHO、COS、293細(xì)胞、或Bowes黑素瘤細(xì)胞的動(dòng)物細(xì)胞等。
本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，如果在載體中插入增強(qiáng)子序列時(shí)將會(huì)使轉(zhuǎn)錄得到增強(qiáng)。增強(qiáng)子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個(gè)堿基對(duì)，作用于啟動(dòng)子以增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄?？膳e的例子包括在復(fù)制起始點(diǎn)晚期一側(cè)的100到270個(gè)堿基對(duì)的SV40增強(qiáng)子、在復(fù)制起始點(diǎn)晚期一側(cè)的多瘤增強(qiáng)子以及腺病毒增強(qiáng)子等。
本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和宿主細(xì)胞。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長(zhǎng)期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。
在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
重組的人DRP蛋白或多肽有多方面的用途。這些用途包括(但不限于)直接做為藥物治療DRP蛋白功能低下或喪失所致的疾病，和用于篩選促進(jìn)或?qū)笵RP蛋白功能的抗體、多肽或其它配體。用表達(dá)的重組人DRP蛋白篩選多肽庫可用于尋找有治療價(jià)值的能抑制或刺激人DRP蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本發(fā)明還包括對(duì)人DRP DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于人DRP基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人DRP基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制人DRP蛋白的分子，也包括那些并不影響人DRP蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的人DRP基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國(guó)專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的人DRP基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)人DRP蛋白或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動(dòng)物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人DRP蛋白功能的抗體以及不影響人DRP蛋白功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用人DRP基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人DRP基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而獲得。
抗人DRP蛋白的抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中，檢測(cè)活檢標(biāo)本中的人DRP蛋白。此外，與人DRP蛋白結(jié)合的單克隆抗體也可用放射性同位素標(biāo)記，注入體內(nèi)可跟蹤其位置和分布。這種放射性標(biāo)記的抗體可作為一種非創(chuàng)傷性診斷方法用于腫瘤細(xì)胞的定位和判斷是否有轉(zhuǎn)移。
本發(fā)明中的抗體可用于治療或預(yù)防與人DRP蛋白相關(guān)的疾病。給予適當(dāng)劑量的抗體可以刺激或阻斷人DRP蛋白的產(chǎn)生或活性。
抗體也可用于設(shè)計(jì)成針對(duì)體內(nèi)某一特殊部位的免疫毒素。如人DRP蛋白高親和性的單克隆抗體可與細(xì)菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，紅豆堿等)共價(jià)結(jié)合。一種通常的方法是用巰基交聯(lián)劑如SPDP，攻擊抗體的氨基，通過二硫鍵的交換，將毒素結(jié)合于抗體上，這種雜交抗體可用于殺滅人DRP蛋白陽性的細(xì)胞(例如淋巴結(jié)細(xì)胞等)。
多克隆抗體的生產(chǎn)可用人DRP蛋白或多肽免疫動(dòng)物，如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)，包括但不限于弗氏佐劑等。
利用本發(fā)明蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與DRP蛋白發(fā)生相互作用的物質(zhì)，如配體、抑制劑、激動(dòng)劑或拮抗劑等。
本發(fā)明蛋白及其抗體、抑制劑、激動(dòng)劑、拮抗劑或受體等，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時(shí)，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。
本發(fā)明的多肽或其激動(dòng)劑和拮抗劑可直接用于疾病治療，例如，用于腫瘤、炎癥，神經(jīng)系統(tǒng)和心血管病方面的治療。在使用時(shí)，還可同時(shí)使用其他治療劑。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明DRP多肽或其激動(dòng)劑、拮抗劑以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時(shí)，是將安全有效量的DRP蛋白或其拮抗劑、激動(dòng)劑施用于哺乳動(dòng)物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
人DRP蛋白的多聚核苷酸也可用于多種治療目的?；蛑委熂夹g(shù)可用于治療由于DRP蛋白的無表達(dá)或異常/無活性的DRP蛋白的表達(dá)所致的細(xì)胞增殖、發(fā)育或代謝異常。重組的基因治療載體(如病毒載體)可設(shè)計(jì)成表達(dá)變異的DRP蛋白，以抑制內(nèi)源性的DRP蛋白活性。來源于病毒的表達(dá)載體如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒、單純皰疹病毒、細(xì)小病毒等可用于將DRP基因轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。構(gòu)建攜帶DRP基因的重組病毒載體的方法可見于已有文獻(xiàn)(Sambrook，et al.)。另外重組人DRP基因可包裝到脂質(zhì)體中，然后再轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。
抑制人DRPmRNA的寡聚核苷酸(包括反義RNA和DNA)以及核酶也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。核酶是一種能特異性分解特定RNA的酶樣RNA分子，其作用機(jī)制是核酶分子與互補(bǔ)的靶RNA特異性雜交后進(jìn)行核酸內(nèi)切作用。反義的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技術(shù)獲得，如固相磷酸酰胺化學(xué)合成法合成寡核苷酸的技術(shù)已廣泛應(yīng)用。反義RNA分子可通過編碼該RNA的DNA序列在體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄獲得。這種DNA序列已整合到載體的RNA聚合酶啟動(dòng)子的下游。為了增加核酸分子的穩(wěn)定性，可用多種方法對(duì)其進(jìn)行修飾，如增加兩側(cè)的序列長(zhǎng)度，核糖核苷之間的連接應(yīng)用磷酸硫酯鍵或肽鍵而非磷酸二酯鍵。
多聚核苷酸導(dǎo)入組織或細(xì)胞內(nèi)的方法包括將多聚核苷酸直接注入到體內(nèi)組織中；或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質(zhì)粒等)先將多聚核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞中，再將細(xì)胞移植到體內(nèi)等。
能與人DRP蛋白結(jié)合的多肽分子可通過篩選由各種可能組合的氨基酸結(jié)合于固相物組成的隨機(jī)多肽庫而獲得。篩選時(shí)，必須對(duì)人DRP蛋白分子進(jìn)行標(biāo)記。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測(cè)人DRP蛋白水平的診斷試驗(yàn)方法。這些試驗(yàn)是本領(lǐng)域所熟知的，且包括FISH測(cè)定和放射免疫測(cè)定。試驗(yàn)中所檢測(cè)的人DRP蛋白水平，可以用作解釋人DRP蛋白在各種疾病中的重要性和用于診斷DRP蛋白起作用的疾病。
一種檢測(cè)檢測(cè)樣品中是否存在DRP蛋白的方法是利用DRP蛋白的特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)，它包括將樣品與DRP蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在DRP蛋白。
DRP蛋白的多聚核苷酸可用于DRP蛋白相關(guān)疾病的診斷和治療。在診斷方面，DRP蛋白的多聚核苷酸可用于檢測(cè)DRP蛋白的表達(dá)與否或在疾病狀態(tài)下DRP蛋白的異常表達(dá)。如DRPDNA序列可用于對(duì)活檢標(biāo)本的雜交以判斷DRP蛋白的表達(dá)異常。雜交技術(shù)包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術(shù)方法都是公開的成熟技術(shù)，相關(guān)的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達(dá)分析和基因診斷。用DRP蛋白特異的引物進(jìn)行RNA-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)體外擴(kuò)增也可檢測(cè)DRP蛋白的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
檢測(cè)DRP基因的突變也可用于診斷DRP蛋白相關(guān)的疾病。DRP蛋白突變的形式包括與正常野生型DRP DNA序列相比的點(diǎn)突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等?？捎靡延械募夹g(shù)如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測(cè)突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達(dá)，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
本發(fā)明的序列對(duì)染色體鑒定也是有價(jià)值的。簡(jiǎn)而言之，根據(jù)本發(fā)明DRP蛋白的cDNA制備PCR引物(優(yōu)選15-35bp)，可以將序列定位于染色體上。然后，將這些引物用于PCR篩選含各條人染色體的體細(xì)胞雜合細(xì)胞。只有那些含有相應(yīng)于引物的人基因的雜合細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生擴(kuò)增的片段。
一旦序列被定位到準(zhǔn)確的染色體位置，此序列在染色體上的物理位置就可以與基因圖數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。這些數(shù)據(jù)可見于例如，V.Mckusick，MendelianInheritance in Man(可通過與Johns Hopkins University Welch MedicalLibrary聯(lián)機(jī)獲得)。然后可通過連鎖分析，確定基因與業(yè)已定位到染色體區(qū)域上的疾病之間的關(guān)系。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，提供了一種分離的多核苷酸，它編碼具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的多肽。本發(fā)明的多核苷酸是從人樹突狀細(xì)胞cDNA文庫中分離出的。其序列如SEQ ID NO1所示，它包含的多核苷酸序列全長(zhǎng)為3128個(gè)堿基，其開放讀框位于214-1164位，編碼全長(zhǎng)為317個(gè)氨基酸的人DRP蛋白(SEQ ID NO2)。該DRP蛋白屬于細(xì)胞內(nèi)分子，與TRAF2氨基酸序列部分同源，一致性可高達(dá)47％，相似性則可達(dá)65％。此外，DRP蛋白也包含TRAF2保守的鋅指結(jié)構(gòu)和環(huán)指結(jié)構(gòu)。Northern印跡分析表明在組織中廣泛表達(dá)。已進(jìn)行的研究提示，DRP可能為新的與TNF-α受體后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的接頭蛋白。因此，DRP蛋白或其相關(guān)的拮抗劑、激動(dòng)劑等可為治療惡性腫瘤等疾病提供新的治療途徑，因而具有巨大的應(yīng)用前景。
實(shí)施例下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1人DRP cDNA的克隆用Trizol(Gibco公司)提取人樹突狀細(xì)胞總RNA。然后，從總RNA中分離poly(A)mRNA。將poly(A)mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA后，用SuperScript II克隆試劑盒(Life Technologies)將cDNA片段定向插入到載體的多克隆位點(diǎn)上，轉(zhuǎn)化DH5 α細(xì)菌形成cDNA質(zhì)粒文庫。用雙脫氧法測(cè)定隨機(jī)挑選克隆的5’末端的序列。將測(cè)定的cDNA序列與已有的公共DNA序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有一個(gè)cDNA克隆的DNA序列為新的全長(zhǎng)cDNA。通過合成一系列引物對(duì)新克隆所含的DNA序列進(jìn)行雙向測(cè)定。計(jì)算機(jī)分析表明，克隆所含的全長(zhǎng)cDNA是一個(gè)新的cDNA序列(如SEQ ID NO1所示)，編碼一個(gè)新的蛋白質(zhì)(如SEQ ID NO2所示)。此蛋白質(zhì)被命名為人DRP，其編碼基因命名為人DRP基因。
序列SEQ ID NO1全長(zhǎng)為3128bp，包括213bp的5’端非編碼區(qū)和1961bp的3’端非編碼區(qū)，編碼含317個(gè)氨基酸的多肽。理論上計(jì)算未糖基化的成熟分子的分子量約為35.9kD。
BLAST分析表明其與已知基因不同，與人TRAF2氨基酸序列高度同源，一致性達(dá)47％，相似性達(dá)65％。此外，在DRP蛋白中也包含2個(gè)TRAFs蛋白的保守鋅指結(jié)構(gòu)和環(huán)指結(jié)構(gòu)，這也進(jìn)一步提示它可能是新的人TNF-α受體后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。
實(shí)施例2用RT-PCR方法克隆人DRP的編碼序列用Trizol(Gibco公司)提取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期B淋巴瘤細(xì)胞株Raji細(xì)胞總RNA，取6mg細(xì)胞總RNA與0.5cgOligo-dT12-18混合，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系為20μl，反應(yīng)結(jié)束后加80μl ddH2O進(jìn)行稀釋。PCR擴(kuò)增所用的引物如下有義引物5’-ATGGGGTAT GATGTAACCCGT-3’(SEQ ID NO3)，反義引物5’-TATCTCTTCCACGCCA TGCG-3’(SEQ ID NO4)。PCR反應(yīng)體積為50μl，其中含反轉(zhuǎn)錄模板10μl、0.4mM引物、0.2mM dNTP和1U ExTaq DNA聚合酶(Takara)，擴(kuò)增參數(shù)為94℃30秒、60℃30秒、72℃45秒，25個(gè)循環(huán)后PCR產(chǎn)物行2％瓊脂糖凝膠電泳初步確認(rèn)。DNA序列分析結(jié)果表明該P(yáng)CR產(chǎn)物的編碼DNA序列與SEQ ID NO1所示的214-1164完全相同。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖1)顯示DRP特異性表達(dá)于人樹突狀細(xì)胞(DC)中，但不表達(dá)于正常人單核細(xì)胞、T細(xì)胞或B細(xì)胞中。在Jurkat、Molt-4、Ramous、Raji、Daudi、NB4、HL-60、U937等造血系腫瘤細(xì)胞中也檢測(cè)到DRP mRNA的表達(dá)。
實(shí)施例3DRP的Northern印跡分析按如下常規(guī)方法進(jìn)行Northern印跡待檢濾膜置于10ml經(jīng)68℃預(yù)熱的雜交液，在雜交爐(Bellco)中于68℃預(yù)雜交30分鐘；將標(biāo)記好的cDNA探針于95～100℃變性2～5分鐘，置冰上迅速冷卻后加入雜交液(cDNA探針終濃度為2～10ng/ml或1～2×106cpm/ml)，充分混勻，于68℃雜交2小時(shí)。雜交結(jié)束后，濾膜用2×SSC、0.05％SDS室溫淋洗數(shù)次，繼振蕩沖洗30～40分鐘，其間更換洗液數(shù)次。隨后用0.1×SSC、0.1％SDS于50℃振蕩沖洗20～40分鐘。最后濾膜用塑料保鮮膜包裹，于-70℃曝光X線膠片24～48小時(shí)。
Northern印跡雜交結(jié)果(圖2)顯示在肝、心臟、骨骼肌、胎盤等許多正常組織中以及Molt-4、Raji等多種細(xì)胞系中均有表達(dá)，這表明DRP蛋白是一種廣泛表達(dá)的蛋白。
實(shí)施例4人DRP原核重組表達(dá)在該實(shí)施例中，以實(shí)施例2中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，用序列如下的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得人DRP DNA作為插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5’端寡核苷酸引物序列為5’-GCGGATCCATGGGGTAT GATGTAACCCGT-3’(SEQ ID NO5)該引物含有BamHI限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)之后是由起始密碼子開始的部分編碼序列；3’端引物序列為5’-GCGAATTCTTATATCTCTTCCACGCCAT-3’(SEQ ID NO6)該引物含有EcoRI限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、翻譯終止子和人DRP的部分編碼序列。
將獲得的PCR產(chǎn)物純化后經(jīng)BamHI/EcoRI酶切再與質(zhì)粒pGEM-3ZF按常規(guī)方法重組并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆鑒定后純化并測(cè)序(ABI公司的377型測(cè)序儀，BigDye Terminator試劑盒，PE公司)。將正確序列的人DRP cDNA SalI/NotI酶切片段克隆至表達(dá)載體Pgex-2T(Pharmacia)，形成載體pGEX-2T-DRP。陽性克隆用BamHI/EcoRI酶切鑒定，酶切產(chǎn)物行2％瓊脂糖凝膠電泳分析。經(jīng)測(cè)序證實(shí)，已插入了完整的DRP編碼序列。
挑表達(dá)DRP的陽性BL21克隆接種于100ml 2×YTA培養(yǎng)基中，37℃300rpm振蕩培養(yǎng)12-15hr，1∶10稀釋于預(yù)熱的2×YTA培養(yǎng)基繼續(xù)振蕩培養(yǎng)1.5hr，加100mM IPTG至0.1mM后30℃誘導(dǎo)2-6hr，5,000g 4℃離心10min去上清，置冰上用50ml 1×PBS(0.14M NaCl，2.7 mM KCl，10.1mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH7.3)重懸，超聲(B.Braun Labsonic U)破碎后再加入20％Triton X-100至1％輕搖30min，然后12,000g 4℃離心10min，上清用0.8μm濾膜過濾后，過1ml 50％谷胱甘肽Sepharose 4B層析柱，1×PBS充分洗滌后，加入500ul谷胱甘肽洗脫緩沖液(10mM谷胱甘肽，50mM Tris-HCl，pH 8.0)室溫靜置30分鐘后收集洗脫液，重復(fù)洗脫2-3次，得到人DRP-GST融合蛋白。融合蛋白的分子量與預(yù)測(cè)值相符。
實(shí)施例5抗人DRP抗體的產(chǎn)生將實(shí)施例4中獲得的重組蛋白人DRP用來免疫動(dòng)物以產(chǎn)生抗體，具體方法如下。重組分子用層析法進(jìn)行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進(jìn)行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對(duì)小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原，對(duì)小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進(jìn)行腹膜內(nèi)注射以加強(qiáng)免疫。每隔14天進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，至少進(jìn)行三次。獲得的抗血清的特異反應(yīng)活性用它在體外沉淀人DRP基因翻譯產(chǎn)物的能力加以評(píng)估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗體可特異性地與本發(fā)明蛋白發(fā)生結(jié)合。
實(shí)施例6 人DRP真核重組表達(dá)在該實(shí)施例中，以實(shí)施例2中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，用序列如下的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得人DRP DNA作為插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5’端寡核苷酸引物序列為5’-GCGAATTCATGGGGTAT GATGTAACCCGT-3’(SEQ ID NO7)該引物含有EcoR I限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)之后是由起始密碼子開始的部分編碼序列；3’端引物序列為5’-GCGGATCCTATCTCTTCCACGCCAT-3’(SEQ ID NO8)該引物含有BamHII限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)和人DRP除翻譯終止子的部分編碼序列。
將獲得的PCR產(chǎn)物純化后經(jīng)EcoRI/BamHI酶切再與質(zhì)粒pGEM-3ZF按常規(guī)方法重組并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆鑒定后純化并測(cè)序(ABI公司的377型測(cè)序儀，BigDye Terminator試劑盒，PE公司)。將正確序列的人DRP cDNA SalI/NotI酶切片段克隆至pcDNA3.1/Myc-His(-)A真核表達(dá)載體，形成載體pcDNA-DRP。陽性克隆用EcoRI/BamHI酶切鑒定，酶切產(chǎn)物行2％瓊脂糖凝膠電泳分析。經(jīng)測(cè)序證實(shí)，已插入了完整的DRP編碼序列。
實(shí)施例7DRP的生物學(xué)活性將實(shí)施例6中所獲得的含DRP全長(zhǎng)編碼序列的pcDNA-DRP質(zhì)粒DNA以用脂質(zhì)體導(dǎo)入L929細(xì)胞內(nèi)，用600μg/ml G418進(jìn)行篩選，獲得穩(wěn)定表達(dá)克隆。其中，穩(wěn)定表達(dá)DRP的細(xì)胞以L929-DRP表示，空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以L929-neo表示?？筸yc抗體做Western印跡分析證實(shí)在細(xì)胞內(nèi)有實(shí)際分子量為約38KDa(含myc和His)的蛋白產(chǎn)生，與理論分子量一致。
通過MTT法和臺(tái)盼藍(lán)染色法，分析了不同劑量和不同作用時(shí)間下TNF-α對(duì)經(jīng)過篩選的L929-DRP和L929-neo細(xì)胞的殺傷作用，發(fā)現(xiàn)L929-DRP細(xì)胞對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡有顯著的抵抗作用(圖3A)。另外，還通過雙標(biāo)記熒光染料碘化丙啶(PI)和羅丹明(rhodamine123)以流式細(xì)胞儀分析了TNF-α/CHX作用4小時(shí)時(shí)兩組細(xì)胞的死亡率，獲得了與MTT法一致的結(jié)果，即L929-DRP細(xì)胞死亡率明顯低于L929-neo細(xì)胞(圖3B)。通過光鏡和Hoechst33258核特異熒光染料染色后熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)TNF-α作用后靶細(xì)胞呈現(xiàn)3種不同的形態(tài)一種呈正常細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞貼壁，胞膜完整，大小中等，熒光分布均勻；一種呈凋亡細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞體積變小，細(xì)胞核固縮，但胞膜仍完整，細(xì)胞表面可見泡狀突起，熒光亮度高；第三種為壞死細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞體積變大，腫脹，熒光不均勻，由于細(xì)胞核膜和細(xì)胞膜破裂，DNA外溢而使熒光呈條索型的不規(guī)則狀態(tài)，熒光亮度低。在三種細(xì)胞中凋亡細(xì)胞數(shù)量較少，且在兩組細(xì)胞間無顯著差異。L929-neo細(xì)胞組大量細(xì)胞呈壞死狀態(tài)，而L929-DRP組壞死細(xì)胞數(shù)量明顯少于L929-neo組。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110> 第二軍醫(yī)大學(xué)免疫學(xué)研究所<120> 新型人死亡抵抗蛋白，其編碼序列及用途<130> 024970<160> 8<170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 3128<212> DNA<213> 智人(Homo sapiens)<220><221> CDS<222> (214)..(1164)<223><400> 1gggcgagtac tcctgattgt gacatcacat tcatcccctg ggcgatggag cttgtcactg 60ggaaggaata ctcagtcgga gaatagccaa caagatgggt tactgggaga atctcttcag120tggcactgag tggaggcatc agggggttgg agccttgtga acagggaacc tgccccccaa180cacttggaag gacctgggtt tcagtgatga gac atg ggg tat gat gta acc cgt 234Met Gly Tyr Asp Val Thr Arg1 5ttc cag ggg gat gtt gac gaa gat ctt atc tgc cct att tgc agt gga 282Phe Gln Gly Asp Val Asp Glu Asp Leu Ile Cys Pro Ile Cys Ser Gly10 15 20gtc ttg gag gag cca gta cag gca cct cat tgt gaa cat gct ttc tgc 330Val Leu Glu Glu Pro Val Gln Ala Pro His Cys Glu His Ala Phe Cys25 30 35aac gcc tgc atc acc cag tgg ttc tct cag caa cag aca tgt cca gtg 378Asn Ala Cys Ile Thr Gln Trp Phe Ser Gln Gln Gln Thr Cys Pro Val40 45 50 55gac cgt agt gtt gtg acg gtc gcc cat ctg cgc cca gta cct cgg atc 426Asp Arg Ser Val Val Thr Val Ala His Leu Arg Pro Val Pro Arg Ile60 65 70atg cgg aac atg ttg tca aag ctg cag att gcc tgt gac aac gct gtg 474Met Arg Asn Met Leu Ser Lys Leu Gln Ile Ala Cys Asp Asn Ala Val75 80 85ttc ggc tgt agt gcc gtt gtc cgg ctt gac aac ctc atg tct cac ctc 522Phe Gly Cys Ser Ala Val Val Arg Leu Asp Asn Leu Met Ser His Leu90 95 100agc gac tgt gag cac aac ccg aag cgg cct gtg acc tgt gaa cag ggc 570Ser Asp Cys Glu His Asn Pro Lys Arg Pro Val Thr Cys Glu Gln Gly105 110 115tgt ggc ctg gag atg ccc aaa gat gag ctg ccc aac cat aac tgc att 618Cys Gly Leu Glu Met Pro Lys Asp Glu Leu Pro Asn His Asn Cys Ile120 125 130 135aag cac ctg cgc tca gtg gta cag cag cag cag aca cgc atc gca gag 666Lys His Leu Arg Ser Val Val Gln Gln Gln Gln Thr Arg Ile Ala Glu140 145 150ctg gag aag acg tca gct gaa cac aaa cac cag ctg gcg gag cag aag 714Leu Glu Lys Thr Ser Ala Glu His Lys His Gln Leu Ala Glu Gln Lys155 160 165cga gac atc cag ctg cta aag gca tac atg cgt gca atc cgc agt gtc 762Arg Asp Ile Gln Leu Leu Lys Ala Tyr Met Arg Ala Ile Arg Ser Val170 175 180aac ccc aac ctt cag aac ctg gag gag aca att gaa tac aac gag atc 810Asn Pro Asn Leu Gin Asn Leu Glu Glu Thr Ile Glu Tyr Asn Glu Ile185 190 195cta gag tgg gtg aac tcc ctt cag cca gca aga gtg acc cgc tgg gga 858Leu Glu Trp Val Asn Ser Leu Gin Pro Ala Arg Val Thr Arg Trp Gly200 205 210 215ggg atg atc tcg act cct gat gct gtg ctc cag gct gta atc aag cgc 906Gly Met Ile Ser Thr Pro Asp Ala Val Leu Gln Ala Val Ile Lys Arg220 225 230tcc ctg gtg gag agt ggc tgt cct gct tct att gtc aac gag ctg att 954Ser Leu Val Glu Ser Gly Cys Pro Ala Ser Ile Val Asn Glu Leu Ile235 240 245gaa aat gcc cac gag cgt agc tgg ccc cag ggt ctg gcc aca cta gag 1002Glu Asn Ala His Glu Arg Ser Trp Pro Gln Gly Leu Ala Thr Leu Glu250 255 260act aga cag atg aac cga cgc tac tat gag aac tac gtg gcc aag cgc 1050Thr Arg Gln Met Asn Arg Arg Tyr Tyr Glu Asn Tyr Val Ala Lys Arg
265 270 275atc cct ggc aag cag gct gtt gtc gtg atg gcc tgt gag aac cag cac 1098Ile Pro Gly Lys Gln Ala Val Val Val Met Ala Cys Glu Asn Gln His280 285 290 295atg ggg gat gac atg gtg caa gag cca ggc ctt gtc atg ata ttt gcg 1146Met Gly Asp Asp Met Val Gln Glu Pro Gly Leu Val Met Ile Phe Ala300 305 310cat ggc gtg gaa gag ata taagagaact cgactggcta tcaggaagag1194His Gly Val Glu Glu Ile315atggaaatca gaaaatccca tcactccagc agctgggacc tgagtcctac ccaccattct 1254taatactgtg gcttatacct gagccacaca tctccctgcc cttctggcac tgaagggcct 1314tggggtagtt tgctcagcct ttcaggtggg aaacccagat ttcctccctt tgccatattc 1374ccctaaaatg tctataaatt atcagtctgg gtgggaaagc ccccacctcc atccattttc 1434ctgcttaggg tccctggttc cagttatttt cagaaagcac aaagagattc aatttccctg 1494gaggatcagg acagaggaag gaatctctaa tcgtccctct cctccaaaac cagggaatca 1554gagcagtcag gcctgttgac tctaagcagc agacatcctg aagaaatggt aagggtggag 1614ccaaatctct agaaataagt agtgaggccg ttaattggcc atcactgatg gcccttaggg 1674aaagactgga cctctgtgcc aagcagtatc cctgttcagc ccaccttaaa ggtgtaggca 1734cccactgggt ctaccagtat gcaggttggg atactgaaaa tttccagatg agctcttctt 1794tcctacaagt tttcataatt agggaatgcc agggtttagg gtaggggtta atctgttggg 1854ggttgatgtg tttagcaaga agctactcct agcttttgct aaaatatggt tggcactgcc 1914tcttgtggca caggccataa ttgttccata gacccctctc tagccctgtg actgtagtta 1974gttactttga tgattttctt tggccattgt ttgtttatat ttcacaaact ccacctactg 2034cccccccccc tctttttttt aagaatggcc tgatcatggc tatctcagcc acattgttgg 2094caatttaatt tatttacttc cttttttttt tttaagaaag gaaaaaagaa aaaaaaatca 2154aacttgaaac ttttcttttg atgttcctat tgtgggggtt ctggataggg tgggacaggg 2214atgggggtgt gttttatatt ttttcctttt cagcacaacc tttggcttta atataggaag 2274agccaaggga gtcctcggct gaacttacga tatctgcccc aaacctctgt aaccccaact 2334gaaatgagga gcttcctctc ttcctgtgaa ggatatgaca gtccagcatc gatgcctgtg 2394ccctctggaa aaatttcctc ctagcccttc cagggcctta tcataaaact ctggatttag 2454agtattcatt ttgaaggcaa ctcccccttc cccaagtttc cttggagctg tatagctggg 2514ttctaagctt caccatgcaa atcagaaatt ttatctctaa gtacaggctg tgccgtgtct 2574cacccacacc cccctgggga cttcagttcc atttcaggtt acctggggta taccttgatc 2634cctagagtga ctggcagagt aagagaaggg gagagataat aggtgtgatt attttaatat 2694gaaggtggag tgtggttgga gatagaaagg ctcctcccca ccatgtaatg gcttcctctc 2754agaattttat tccaggctag cttgctgcag gtctgggtag ttggatcatg gctccactgg 2814gattggggtg gaaagcttga ggggagtagg gttccagctc tgggacattg tgctcaggaa 2874tttgaaaacg ctgctatact tactctggtt actacatttc ttccactccc ctttccccta 2934cctgccttaa ccaaggctca tactgtcctg tccttaccct cagatggagc caggaagctc 2994agtgaaaggc ttccctaccc tttgcactag tgtctctgca ggttgctggt tgtgttgtat 3054gtgctgttcc atggtgttga ctgcactaat aataaacctt ttactcaact ctctaaaaaa 3114aaaaaaaaaa aaaa 3128<210>2<211>317<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>2Met Gly Tyr Asp Val Thr Arg Phe Gln Gly Asp Val Asp Glu Asp Leu1 5 10 15Ile Cys Pro Ile Cys Ser Gly Val Leu Glu Glu Pro Val Gln Ala Pro20 25 30His Cys Glu His Ala Phe Cys Asn Ala Cys Ile Thr Gln Trp Phe Ser35 40 45Gln Gln Gln Thr Cys Pro Val Asp Arg Ser Val Val Thr Val Ala His50 55 60Leu Arg Pro Val Pro Arg Ile Met Arg Asn Met Leu Ser Lys Leu Gln65 70 75 80Ile Ala Cys Asp Asn Ala Val Phe Gly Cys Ser Ala Val Val Arg Leu85 90 95Asp Asn Leu Met Ser His Leu Ser Asp Cys Glu His Asn Pro Lys Arg100 105 110Pro Val Thr Cys Glu Gln Gly Cys Gly Leu Glu Met Pro Lys Asp Glu115 120 125Leu Pro Asn His Asn Cys Ile Lys His Leu Arg Ser Val Val Gln Gln130 135 140Gln Gln Thr Arg Ile Ala Glu Leu Glu Lys Thr Ser Ala Glu His Lys145 150 155 160His Gln Leu Ala Glu Gln Lys Arg Asp Ile Gln Leu Leu Lys Ala Tyr165 170 175Met Arg Ala Ile Arg Ser Val Asn Pro Asn Leu Gln Asn Leu Glu Glu180 185 190Thr Ile Glu Tyr Asn Glu Ile Leu Glu Trp Val Asn Ser Leu Gln Pro195 200 205Ala Arg Val Thr Arg Trp Gly Gly Met Ile Ser Thr Pro Asp Ala Val210 215 220Leu Gln Ala Val Ile Lys Arg Ser Leu Val Glu Ser Gly Cys Pro Ala225 230 235 240Ser Ile Val Asn Glu Leu Ile Glu Asn Ala His Glu Arg Ser Trp Pro245 250 255Gln Gly Leu Ala Thr Leu Glu Thr Arg Gln Met Asn Arg Arg Tyr Tyr260 265 270Glu Asn Tyr Val Ala Lys Arg Ile Pro Gly Lys Gln Ala Val Val Val275 280 285Met Ala Cys Glu Asn Gln His Met Gly Asp Asp Met Val Gln Glu Pro290 295 300Gly Leu Val Met Ile Phe Ala His Gly Val Glu Glu Ile305 310 315<210>3<211>21<212>DNA<213>引物<400>3atggggtatg atgtaacccg t 21<210>4<211>20<212>DNA<213>引物<400>4tatctcttcc acgccatgcg20<210>5<211>29<212>DNA<213>引物<400>5gcggatccat ggggtatgat gtaacccgt 29<210>6<211>28<212>DNA<213>引物<400>6gcgaattctt atatctcttc cacgccat 28<210>7<211>29<212>DNA<213>引物<400>7gcgaattcat ggggtatgat gtaacccgt 29<210>8<211>25<212>DNA<213>引物<400>8gcggatccta tctcttccac gccat 2權(quán)利要求
1.一種分離的人蛋白激酶DRP多肽，其特征在于，它包含具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，該多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抵抗TNF-α誘導(dǎo)細(xì)胞死亡功能的由(a)衍生的多肽。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70％相同性(a)編碼如權(quán)利要求1和2所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。
4.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的多肽。
5.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸的序列選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中214-1164位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-3128位的序列。
6.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求3所述的多核苷酸。
7.一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求6所述的載體。
8.一種具有人蛋白激酶DRP多肽活性的多肽的制備方法，其特征在于，該方法包含(a)在適合表達(dá)人蛋白激酶DRP多肽的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有人蛋白激酶DRP多肽活性的多肽。
9.一種能與權(quán)利要求1所述的人蛋白激酶DRP多肽特異性結(jié)合的抗體。
10.一種藥物組合物，其特征在于，它含有安全有效量的權(quán)利要求1所述的多肽以及藥學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新型人死亡抵抗蛋白(death－resistant protein，DRP)。本發(fā)明還提供編碼此蛋白分子的多核苷酸和經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生這種蛋白分子的方法。本發(fā)明還公開了這種新型死亡抵抗蛋白分子及其多核苷酸編碼序列的用途。本發(fā)明證實(shí)了DRP的高表達(dá)具有抵抗TNF－α誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的功能。本發(fā)明還公開了抗此蛋白分子用于疾病的診斷及治療的策略，特別是可用于惡性腫瘤的診斷和治療。
文檔編號(hào)C12N15/52GK1475568SQ0213652
公開日2004年2月18日 申請(qǐng)日期2002年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月16日
發(fā)明者張嘉, 李楠, 曹雪濤, 張 嘉 申請(qǐng)人:第二軍醫(yī)大學(xué)免疫學(xué)研究所