專利名稱：用化學(xué)合成和分子進(jìn)化獲得酵母表達(dá)高比活植酸酶基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物基因工程領(lǐng)域，具體地說利用化學(xué)合成方法及體外重組技術(shù)，改造來源于黑曲霉中的酸性植酸酶基因，使之能在畢赤酵母中高效表達(dá)，表達(dá)的植酸酶比活提高，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。
禾谷類、豆科類及油料作物是人的食品和動物飼料中的主要原料。這些原料中雖含有大量的磷，但其中50％-70％是以植酸磷(六磷酸肌醇)的形式存在(Salunkhe 1982，食品研究進(jìn)展)。單胃動物缺乏分解植酸磷所必需的酶，磷的利用率很低。植酸酶能將植酸磷水解成肌醇和磷酸，在飼料中添加植酸酶可以提高植物性飼料中磷的利用率。
開發(fā)植酸酶的直接原因來源于植酸帶來的磷污染。一方面，植酸中螯合的磷無法吸收利用，另一方面則是必須在飼料和食品中添加大量無機(jī)磷，造成磷源浪費(fèi)和環(huán)境污染(Cromwell 1991，生物技術(shù)在食品工業(yè)中的應(yīng)用進(jìn)展)。隨著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，無機(jī)磷的排泄量大幅度上升，磷污染遍及河流、山川和平原耕作地，直接威脅人類自身的生存。自80年代中期，歐洲就致力于尋找全面解決無機(jī)磷污染的方案(CouncilDirective91/676/EEC)中，著重強(qiáng)調(diào)限制養(yǎng)殖業(yè)的磷排泄量。植酸酶是目前所有使用的添加劑中，具有最直接、最顯著環(huán)保社會效益的酶制劑。由于磷是動物生長過程中的基本元素，為了彌補(bǔ)新陳代謝中磷的消耗，常常需要在食品和飼料中添加無機(jī)磷(Common 1989，自然雜志)。植酸酶將植酸中鰲合的磷釋放出來，從而減少了飼料中磷酸氫鈣等無機(jī)磷的使用量，降低幅度達(dá)50％-70％。在中國，很多養(yǎng)殖區(qū)可以將磷酸氫鈣的用量減少70％以上，雜粕用量較大的蛋雞養(yǎng)殖區(qū)，甚至能夠全部替代磷酸氫鈣。使用植酸酶的飼料，向環(huán)境排泄的磷相應(yīng)減少30％以上(Nelson 1968，畜牧科學(xué))。使用植酸酶在減少飼料中無機(jī)磷添加量的同時，大幅度地減輕甚至完全杜絕了磷酸氫鈣導(dǎo)致的氟和其它重金屬中毒問題。使用植酸酶每年在飼料方面的成本即可減少9200多萬元。在賴以生存的環(huán)境中，植酸酶從污染的源頭輕而易舉地消滅磷污染，比常規(guī)使用的后期治理的方法更為經(jīng)濟(jì)有效。可以預(yù)期，植酸酶將以顯著的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益對整個行業(yè)的可持續(xù)發(fā)展產(chǎn)生巨大促進(jìn)作用。
最新的研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)了植酸酶的潛在營養(yǎng)價值。植酸通過與金屬離子的螯合，降低單胃動物對營養(yǎng)的吸收，植酸酶可以提高動物對磷和鈣的消化吸收，Jongbloed于1993年建立了一個關(guān)于植酸酶活力與飼料中磷酸鹽的當(dāng)量關(guān)系式。在含磷酸鹽的飼料中添加500IU植酸酶相當(dāng)于1g來自于磷酸一鈣的磷或1.1g來自于二水磷酸氫鈣的磷；Ofier等(1992)、Mroz等(1994)報道，植酸酶能夠提高豬禽對氨基酸和氮的回腸消化率。植酸酶通過降低植酸鹽的抗?fàn)I養(yǎng)作用，增加動物對蛋白質(zhì)和一些金屬離子的吸收能力(Wyss1999，應(yīng)用環(huán)境微生物科學(xué))，提高飼料中蛋白質(zhì)的消化利用率。應(yīng)用植酸酶，加大了非常規(guī)原料資源的使用比例，可以大量節(jié)約蛋白質(zhì)飼料。使用植酸酶能直接降低了飼料的原料成本，從而提高產(chǎn)品的價格競爭力。在中國，每生產(chǎn)1噸全價飼料，至少可以因此增加5-10元的凈收益。每生產(chǎn)1噸5％的預(yù)混料，則可以增加收益百元以上。
目前生產(chǎn)上采用的植酸酶均來自黑曲霉(Aspergillus niger)。黑曲霉中的植酸酶(PhyA)具有比活高、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。在植酸酶發(fā)展初期，均采用原始菌株發(fā)酵生產(chǎn)，然而，原始菌株表達(dá)量低，生產(chǎn)成本較高，通過化學(xué)誘變或其他誘變方法可以獲得產(chǎn)酶量提高的菌株，然而誘變?nèi)菀讓?dǎo)致菌株其它功能的損失，為了獲得目的基因高表達(dá)且其它功能不受影響的菌株，需要長期觀察篩選，所需時間很長，另外，誘變菌株容易退化。利用生物反應(yīng)器高效表達(dá)植酸酶基因，大幅度提高了植酸酶產(chǎn)量，克服了野生型菌株含量低的缺點(diǎn)。
本發(fā)明從植酸酶基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)出發(fā)，結(jié)合來源不同黑曲霉中高活性的phyA2基因的優(yōu)點(diǎn)，利用化學(xué)合成方法將原始基因改造成高比活，最適pH值范圍為2.5-5.5的酸性植酸酶基因，該基因全部采用酵母偏愛密碼。
本發(fā)明采用基因合成、分子體外重組篩高活性植酸酶基因，通過載體構(gòu)建、酵母電擊轉(zhuǎn)化、高活性菌株篩選、高密度發(fā)酵等步驟來制備高比活植酸酶。
為了提高植酸酶的比活性，首先用PCR擴(kuò)增酸性植酸酶基因。設(shè)計并合成20個寡核苷酸引物，長度為70-90堿基，引物之間連接通過20-30bp重疊序列，Tm值為60-66將所有引物加入反應(yīng)體系，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共進(jìn)行35個循環(huán)，合成酸性植酸酶基因。以合成植酸酶基因?yàn)槟０?，Phyiz1，Phyif1為引物擴(kuò)增植酸酶基因，進(jìn)行DNA分子重排，酶切所有重排DNA分子，構(gòu)建到表達(dá)載體中，電擊入大腸肝菌，再通過植酸酶表達(dá)及活性篩選突變植酸酶基因，最終獲得比活提高的植酸酶基因PhyI。按合成基因的兩端序列設(shè)計出引物，在基因5｀端加入Xhol切點(diǎn)和信號態(tài)切割序列，引物為PHY1Z，在基因3｀端加入Not I切點(diǎn)，引物為PHYIF，擴(kuò)增片段克隆后，Xhol和Not I雙酶切，定向插入pPIC9載體，構(gòu)建成phyI的酵母表達(dá)載體(

圖1)，挑選植酸酶高表達(dá)重組酵母P.Pastoris菌種，進(jìn)行高密度發(fā)酵，表達(dá)的植酸酶具有較高的比活，1克相當(dāng)于1000國際單位(IU)。新的酸性植酸酶phyI的比活為原先phyA2的10倍左右。phyI和phyA2的氨基酸數(shù)相同，但有7個氨基酸發(fā)生了改變。其中包括31Q＞L，34F＞Y，141S＞P，158F＞L221R＞E，280L＞V，388L＞A等。含有植酸酶基因表達(dá)的載體pPPYI 9.4Kb電擊轉(zhuǎn)達(dá)入畢氏酵母菌，該酵母菌不能利用甲醇作碳源生長，該酵母菌中只含一拷貝的植酸酶基因。
10203040506070TTGGCTGTCCCAGCTTCCAGAAACCAGTCCTCTTGTGACACTGTTGATCAAGGTTATCAATGCTTCTCCGAGL A V P A S R N Q S S C D T V D Q G Y Q C F S E8090 100 110 120 130 140ACTTCTCACTTGTGGGGTCTATACGCTCCATACTTTTCCTTGGCTAACGAATCCGTCATCTCTCCAGAAGTTT S H L W GLY A PYF S L A N E S V I S P E V150 160 170 180 190 200 210CCAGCTGGTTGCAGAGTCACCTTCGCTCAGGTCTTGTCCAGACATGGTGCTAGATACCCAACTGACTCCAAAP A G C R V T F A Q V L S R H G A R Y P T D S K220 230 240 250 260 270 280GGTAAGAAGTATTCTGCTTTGATCGAGGAGATCCAGCAGAACGCTACCACCTTCGATGGTAAGTACGCTTTCG K K Y S A L I E E I Q Q N A T T F D G K Y A F290 300 310 320 330 340 350 360TTGAAGACCTACAACTACTCCTTGGGTGCTGACGACTTGACTCCATTCGGTGAGCAGGAGTTGGTCAACTCTL K T Y N Y S L G A D D L T P F G E Q E L V N S370 380 390 400 410 420 430GGTATCAAGTTCTACCAGAGATACGAATCCTTGACCAGAAACATCGTTCCATTCATCAGACCCTCTGGTTCCG I K F Y Q R Y E S L T R N I V P F I RPS G S440 450 460 470 480 490 500TCCAGAGTCATCGCTTCTGGTAAGAAGTTCATCGAGGGTCTCCAATCCACCAAGTTGAAGGACCCAAGAGCCS R V I A S G K K F I E GLQ S T K L K D P R A510 520 530 540 550 560 570CAACCAGGTCAATCCTCTCCAAAGATCGACGTCGTCATCTCTGAGGCTTCCTCTTCCAATAACACCTTGGACQ P G Q S S P K I D V V I S E A S S S N N T L D580 590 600 610 620 630 640CCTGGTACTTGTACTGTCTTTGAAGACTCCGAATTGGCTGACACTGTCGAGGCTAACTTCACTGCTACCTTCP G T C T V F E D S E L A D T V E A N F T A T F650 660 670 680 690 700 710 720GTTCCATCCATCGAGCAGAGATTGGAGAACGACTTGTCTGGTGTCACCTTGACCGATACCGAAGTTACCTACV P S IEQ R L E N D L S G V T L T D T E V T Y730 740 750 760 770 780 790TTGATGGACATGTGCTCCTTCGACACCATCTCCACCTCCACTGTTGACACTAAGTTGTCTCCATTCTGCGACL M D M C S F D T I S T S T V D T K L S P F C D800 810 820 830 840 850 860TTGTTCACCCATGACGAATGGATCAACTACGACTACTTGCAATCCGTGAAGAAGTACTACGGTCATGGTGCTL F T H D E W I N Y D Y L Q SVK K Y Y G H G A870 880 890 900 910 920 930GGTAATCCATTGGGTCCAACTCAAGGTGTTGGTTACGCTAACGAATTGATTGCTAGATTGACCCACTCCCCAG N P L G P T Q G V G Y A N E L I A R L T H S P940 950 960 970 980 990 1000GTCCATGACGACACCTCTTCCAACCACACCTTGGACTCCTCTCCAGCTACCTTCCCATTGAACTCCACCTTGV H D D T S S N H T L D S S P A T F P L N S T L1010 1020 1030 1040 1050 1060 1070 1080TACGCTGACTTCTCTCACGACAATGGTATCATCTCCATCTTGTTCGCTTTGGGTTTGTACAATGGTACTAAGY A D F S H D N G I I S I L F A L G L Y N G T K1090 1100 1110 1120 1130 1140 1150CCTTTGTCCACCACCACTGTCGAAAACATCACCCAAACCGACGGTTTCTCCTCTGCTTGGACTGTTCCATTCP L S T T T V E N I T Q T D G F S S A W T V P F1160 1170 1180 1190 1200 1210 1220GCTTCCAGAGCGTACGTCGAAATGATGCAATGCCAAGCTGAACAGGAGCCATTGGTCAGAGTCTTGGTCAACA S RAY V E M M Q C Q A E Q E P L V R V L V N1230 1240 1250 1260 1270 1280 1290GATAGAGTCGTCCCATTGCATGGTTGTCCAGTCGATGCTTTGGGTAGATGTACTAGAGACTCCTTCGTCAGAD R V V P L H G C P V D A L G R C T R D S F V R1300 1310 1320 1330 1340GGTTTGTCCTTCGCTAGATCCGGTGGTGACTGGGCTGAATGCTTCGCTTAAG L S F A R S G G D W A E C F A -比較來源于黑曲霉(A.niger)原始基因phyA2和突變基因phyI的核苷酸序列，去除基因5’分泌信號肽序列，結(jié)構(gòu)基因部分的核苷酸數(shù)目均為1347。同源序列為1052，同源性為78％。在突變基因中，全部采用酵母偏愛密碼。如精氨酸用AGA，賴氨酸采用AAA，半胱氨酸采用TGC，天冬氨酸采用AAC等等。PHYA-CTGGCAGTCCCCGCCTCGAGAAATCAATCCAGTTGCGATACGGTCGATCAGGGGT -55**** ***** ** ** ***** 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*****PHYI-TCCAGAGCGTACGTCGAAATGATGCAATGCCAAGCTGAACAGGAGCCATTGGTCA -1210PHYA-GTGTCTTGGTTAATGATCGCGTTGTCCCGCTGCATGGGTGTCCGGTTGATGCTTT -1265* ******** ** *** * ** ***** ******* ***** ** ********PHYI-GAGTCTTGGTCAACGATAGAGTCGTCCCATTGCATGGTTGTCCAGTCGATGCTTT -1265PHYA-GGGGAGATGTACCCGGGATAGCTTTGTGAGGGGGTTGAGCTTTGCTAGATCTGGG -1320*** ******** * ** *** ** ** ** *** *** ******** **PHYI-GGGTAGATGTACTAGAGACTCCTTCGTCAGAGGTTTGTCCTTCGCTAGATCCGGT -1320PHYA-GGTGATTGGGCGGAGTGTTTTGCTTAG -1347***** ***** ** ** ** *****PHYB-GGTGACTGGGCTGAATGCTTCGCTTAA -1347
2.4有引物PCR(Primer PCR)進(jìn)行PrimerPCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)體系5μl Primerless PCR產(chǎn)物+phyiZ10.2ng+phyiF1 0.2ng+10×PCR Buffer 5μl+2.5mmol/L dNTPs 4μl+Taq2U+ddH2O to 50μl。反應(yīng)程序?yàn)?4℃30s，70℃30s，72℃2.0min，共35個循環(huán)，1％Agrose電泳檢測，回收1.4kp基因片段。2.5高活性植酸酶篩選回收1.4kb的重排植酸酶基因片段，經(jīng)BamH I和SacI雙酶切后，構(gòu)建入原核表達(dá)載體pG251(CN1338515)啟動子和t1t2終止子之間，該載體帶有氨芐青霉素抗性基因。電擊法轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5α獲得突變體表達(dá)文庫，庫容達(dá)到107，進(jìn)行高比活植酸酶的篩選。
取1μl細(xì)菌稀釋96倍，等量加入96孔細(xì)菌培養(yǎng)板(12×8)，在每一個孔中加入150μl的LB培養(yǎng)液至OD600＝0.4-0.6，從培養(yǎng)板的孔中取出10μl菌液轉(zhuǎn)移到試管中培養(yǎng)，同一行的12個孔和同一列的8個孔中的細(xì)菌放置同一根試管中培養(yǎng)，共20根試管，每管加入帶氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液3mL，培養(yǎng)8-12小時后，離心回收菌體，超聲破碎細(xì)胞，離心取上清100μl，加入植酸鉀鈉底物，37℃反應(yīng)30分鐘，加入鉬藍(lán)顯色劑(鉬酸胺，硫酸亞鐵，濃硫酸)顯色。
取每行中活性最高和每列中活性最高的交接點(diǎn)，將10μl培養(yǎng)板交接點(diǎn)孔中的細(xì)菌稀釋96倍后，加入另一塊培養(yǎng)板培養(yǎng)，每孔150μlLB培養(yǎng)液，10μl菌液，進(jìn)行新一輪篩選。3-5輪篩選后，取交接點(diǎn)中細(xì)菌稀釋10-100倍涂布在含氨芐抗生素的LB固體培養(yǎng)板上，挑取單菌落進(jìn)行活性比較，獲得高比活的植酸酶基因phyi。
實(shí)施例4酵母表達(dá)植酸酶載體構(gòu)建按合成基因的兩端序列設(shè)計引物，在基因5’端加入xho I切點(diǎn)和信號態(tài)切割序列，引物為PHY1Z(5’-AACTCGAGAAAAGAGAACCTCCGGATTGGCTGTCCCAGCTTCCAGAAACCAGTCC-3’)，在基因3’端加入Not I切點(diǎn)引物為PHY1F(5’-AACGCGGCCGCTTAAGCGAAGCATTCAGCCCAGTCACCACCGGTAC-3’)。擴(kuò)增片段克隆后，Xho I和Not I雙酶切，定向插入pPIC9載體(Invitrogen company產(chǎn)品)，構(gòu)建成phyi的酵母表達(dá)載體pPphyi(圖1)。
實(shí)施例5植酸酶高表達(dá)重組酵母篩選將活化的酵母菌株P(guān)ichia Pastoris 于500ml YPD中30℃培養(yǎng)18hr，至OD600＝1.7，5000r/min離心收集菌體，先后用500，250ml預(yù)冷的無菌水洗菌體，離心去上清夜，用20ml預(yù)冷的1mol/L山梨醇懸浮菌體。離心后菌體再用0.5ml預(yù)冷的山梨醇懸浮，用于電擊感受態(tài)。
大量抽提酵母表達(dá)載體pPphyi，BglII酶切回收小片段，取2μg線性化片段加入50μL感受態(tài)細(xì)胞，冰浴5min，用Bio-Red GenePulser電擊儀電擊，參數(shù)為2.5Kv，25μF。電擊結(jié)束后立即加入1.0ml預(yù)冷的1mol/L山梨醇，取200μL涂布于固體選擇培養(yǎng)基平板(18.6％山梨醇，2％葡萄糖，1.34％YNB，0.005％谷氨酸，0.005％甲硫氨酸，0.005％賴氨酸，0.005％亮氨酸，0.005％異亮氨酸，2％瓊脂糖)，30℃培養(yǎng)直至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。用牙簽將轉(zhuǎn)化子對應(yīng)點(diǎn)種到MM(1.34％YNB，0.00004％生物素，0.5％甲醇，1.5％瓊脂糖)和MD(1.34％YNB，0.00004％生物素，2％葡萄糖，1.5％瓊脂糖)平板上，30℃培養(yǎng)2d，在MD上生長正常而在MM上生長不正?；虿簧L的轉(zhuǎn)化子為陽性克隆。
將重組酵母接種于20ml BMGY(1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB0.000004％生物素，1％甘油)，30℃培養(yǎng)，離心收集菌體，加入20ml誘導(dǎo)培養(yǎng)基BMMY(用0.5％甲醇代替BMGY中的甘油)，30℃下繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)36hr。
以甲醇為唯一碳源的MM培養(yǎng)基和以葡萄糖為碳源的MD培養(yǎng)基進(jìn)行對應(yīng)培養(yǎng)，進(jìn)一步篩選定點(diǎn)整合的重組轉(zhuǎn)化子49個，命名為P.pastohs PHYI1、2、3.....49。
將所有的陽性克隆單獨(dú)接種三角瓶中，30℃培養(yǎng)至OD600＝4-5，利用甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)36hr，每個誘導(dǎo)菌株取5μl上清液進(jìn)行SDS-PAGE檢測，另取10μl上清液稀釋100倍，以植酸鉀鈉為底物進(jìn)行酶活性測定。植酸酶酶活性測定方法采取鉬黃法(BASF Company)。植酸酶酶活性單位(U)定義為在37℃下，每分鐘分解植酸鹽釋放出1nmol/L無機(jī)磷酸所需要的酶量為1U。結(jié)合電泳條帶和酶活力單位，篩選到4株高效表達(dá)植酸酶基因的重組子P.pastoris PHYI11，P.pastoris PHYI19、P.pastoris PHYI25、P.pastoris PHYI42。
實(shí)施例6重組菌株的高密度發(fā)酵挑取植酸酶高表達(dá)重組酵母P.pastoris PHYI19菌株接種200ml YPED培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)至OD600＝3.0，轉(zhuǎn)入B.Braun 5L發(fā)酵罐中進(jìn)行高密度發(fā)酵，以YPED培養(yǎng)重組酵母，利用氨水控制pH值為5.5，發(fā)酵過程中氧含量控制在20％，培養(yǎng)90hr，甘油耗盡，加入0.5％甲醇，30℃誘導(dǎo)培養(yǎng)。
30℃培養(yǎng)6hr后，重組酵母進(jìn)入對數(shù)生長期，氧消耗加快，須充入純氧，氧含量控制在20％，在發(fā)酵過程中，持續(xù)加入氨水調(diào)節(jié)pH值恒定在5.5，發(fā)酵90hr后，OD600＝110，加入0.5％甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)不同時間后取3ul無菌體的誘導(dǎo)培養(yǎng)液進(jìn)行SDS-PAGE檢測。結(jié)果(圖2)，隨著誘導(dǎo)時間的增加，植酸酶的表達(dá)量不斷提高，60h后，上清液中的表達(dá)量保持穩(wěn)定。重組子P.pastoris FPHY34誘導(dǎo)60hr后，植酸酶表達(dá)量高達(dá)1.2mg/ml。表達(dá)的植酸酶分子量大小約為85kD。
在37℃pH5.5的條件下對含表達(dá)產(chǎn)物的培養(yǎng)液進(jìn)行植酸酶活性測定，重組酵母P.pastoris PHYI19培養(yǎng)60hr后，酶活力為1,030,000u/ml，增加誘導(dǎo)表達(dá)時間，植酸酶的表達(dá)量僅緩慢增加。
實(shí)施例7植酸酶性質(zhì)測定將底物分別配制成pH＝1.5；2.5；3.5；4.5；5.5；6.5，以pH＝5.5時的酶活單位為100％，以高密度發(fā)酵上清液測定不同pH條件下植酸酶的相對活力。結(jié)果表明該植酸酶在pH2.5-6.5之間均有酶活力，pH值為2.5和5.5時，植酸酶活性最高，表現(xiàn)出兩個峰值(圖3)。
將上清液用90℃處理不同時間，放置冰上冷卻，加入酶反應(yīng)底物，37℃反應(yīng)30min，以未經(jīng)高溫處理的發(fā)酵液為參比，測定上清液中的殘存酶活性。經(jīng)過80min處理，植酸酶的活性仍保持40％。90℃高溫處理120min，仍有部分活性。
權(quán)利要求
1.一種編碼如下的高比活植酸酶蛋白質(zhì)的基因序列由酵母工程菌發(fā)酵獲得。10203040506070TTGGCTGTCCCAGCTTCCAGAAACCAGTCCTCTTGTGACACTGTTGATCAAGGTTATCAATGCTTCTCCGAGL A V P A S R N Q S S C D T V D Q G Y Q C F S E8090 100 110 120 130 140ACTTCTCACTTGTGGGGTCTATACGCTCCATACTTTTCCTTGGCTAACGAATCCGTCATCTCTCCAGAAGTTT S H L W GLY A PYF S L A N E S V I S P E V150 160 170 180 190 200 210CCAGCTGGTTGCAGAGTCACCTTCGCTCAGGTCTTGTCCAGACATGGTGCTAGATACCCAACTGACTCCAAAP A G C R V T F A Q V L S R H G A R Y P T D S K220 230 240 250 260 270 280GGTAAGAAGTATTCTGCTTTGATCGAGGAGATCCAGCAGAACGCTACCACCTTCGATGGTAAGTACGCTTTCG K K Y S A L I E E I Q Q N A T T F D G K Y A F290 300 310 320 330 340 350 360TTGAAGACCTACAACTACTCCTTGGGTGCTGACGACTTGACTCCATTCGGTGAGCAGGAGTTGGTCAACTCTL K T Y N Y S L G A D D L T P F G E Q E L V N S370 380 390 400 410 420 430GGTATCAAGTTCTACCAGAGATACGAATCCTTGACCAGAAACATCGTTCCATTCATCAGACCCTCTGGTTCCG I K F Y Q R Y E S L T R N I V P F I RPS G S440 450 460 470 480 490 500TCCAGAGTCATCGCTTCTGGTAAGAAGTTCATCGAGGGTCTCCAATCCACCAAGTTGAAGGACCCAAGAGCCS R V I A S G K K F I E GLQ S T K L K D P R A510 520 530 540 550 560 570CAACCAGGTCAATCCTCTCCAAAGATCGACGTCGTCATCTCTGAGGCTTCCTCTTCCAATAACACCTTGGACQ P G Q S S P K I D V V I S E A S S S N N T L D580 590 600 610 620 630 640CCTGGTACTTGTACTGTCTTTGAAGACTCCGAATTGGCTGACACTGTCGAGGCTAACTTCACTGCTACCTTCP G T C T V F E D S E L A D T V E A N F T A T F650 660 670 680 690 700 710 720GTTCCATCCATCGAGCAGAGATTGGAGAACGACTTGTCTGGTGTCACCTTGACCGATACCGAAGTTACCTACV P S I E Q R LEN D L S G V T L T D T E V T Y730 740 750 760 770 780 790TTGATGGACATGTGCTCCTTCGACACCATCTCCACCTCCACTGTTGACACTAAGTTGTCTCCATTCTGCGACL M D M C S F D T I S T S T V D T K L S P F C D800 810 820 830 840 850 860TTGTTCACCCATGACGAATGGATCAACTACGACTACTTGCAATCCGTGAAGAAGTACTACGGTCATGGTGCTL F T H D E W I N Y D Y L Q SVK K Y Y G H G A870 880 890 900 910 920 930GGTAATCCATTGGGTCCAACTCAAGGTGTTGGTTACGCTAACGAATTGATTGCTAGATTGACCCACTCCCCAG N P L G P T Q G V G Y A N E L I A R L T H S P940 950 960 970 980 990 1000GTCCATGACGACACCTCTTCCAACCACACCTTGGACTCCTCTCCAGCTACCTTCCCATTGAACTCCACCTTGV H D D T S S N H T L D S S P A T F P L N S T L1010 1020 1030 1040 1050 1060 1070 1080TACGCTGACTTCTCTCACGACAATGGTATCATCTCCATCTTGTTCGCTTTGGGTTTGTACAATGGTACTAAGY A D F S H D N G I I S I L F A L G L Y N G T K1090 1100 1110 1120 1130 1140 1150CCTTTGTCCACCACCACTGTCGAAAACATCACCCAAACCGACGGTTTCTCCTCTGCTTGGACTGTTCCATTCP L S T T T V E N I T Q T D G F S S A W T V P F1160 1170 1180 1190 1200 1210 1220GCTTCCAGAGCGTACGTCGAAATGATGCAATGCCAAGCTGAACAGGAGCCATTGGTCAGAGTCTTGGTCAACA S RAY V E M M Q C Q A E Q E P L V R V L V N1230 1240 1250 1260 1270 1280 1290GATAGAGTCGTCCCATTGCATGGTTGTCCAGTCGATGCTTTGGGTAGATGTACTAGAGACTCCTTCGTCAGAD R V V P L H G C P V D A L G R C T R D S F V R1300 1310 1320 1330 1340GGTTTGTCCTTCGCTAGATCCGGTGGTGACTGGGCTGAATGCTTCGCTAAG L S F A R S G G D W A E C F A
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的能產(chǎn)生植酸酶基因的酵母工程菌，其特征在于構(gòu)建成的含有PHY I的酵母表達(dá)載體pPhy I整合進(jìn)酵母菌中。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的能產(chǎn)生植酸酶基因的酵母工程菌，其特征在于與原始基因有7個氨基酸位點(diǎn)變化。
4.一種具有酵母高表達(dá)的權(quán)利要求1所述的高比活植酸酶基因工程菌發(fā)酵制備植酸酶的方法，其特征在于植酸酶基因a、采用連續(xù)延伸PCR方法化學(xué)合成具有酵母偏愛密碼的酸性植酸酶基因；b、以上述合成植酸酶基因?yàn)槟０?，利用DNA分子重排技術(shù)，對合成基因進(jìn)行體外重組，PhyIZ1、PhyIF1為引物擴(kuò)增重排的植酸酶基因，回收1.4Kb重排的植酸酶基因片段，構(gòu)建到原核表達(dá)載體中，電擊法轉(zhuǎn)達(dá)入大腸桿菌菌株獲得突變體表達(dá)文庫，進(jìn)行高比活植酸酶篩選，獲得高比活性的植酸酶基因Phy I。c、采用合成基因兩端序列設(shè)計引物，在基因5｀端加入Xhol切點(diǎn)和信號態(tài)切割序列，引物為Phyl Z，(5’-AACTCGAGAAAAGAGAACCTCCGGATTGGCTGTCCCAGCTTCCAGAAACCAGTCC-3’)，在基因3｀端加入Not I切點(diǎn)，引物為PHY1F(5’-AACGCGGCCGCTTAAGCGAAGCATTCAGCCCAGTCACCACCGGTAC-3’)。擴(kuò)增片段克隆后，Xho I和Not I雙酶切，定向插入pPIC9載體，構(gòu)建成phy I的酵母表達(dá)載體pPhy I；d、植酸酶基因高表達(dá)重組酵母篩選；e、將重組酵母菌株高密度發(fā)酵。
5.根椐權(quán)利要求4所述的制備具有酵母高表達(dá)比活性植酸酶基因的工程菌發(fā)酵制備植酸酶的方法，其特征在于構(gòu)建的酵母表達(dá)載體pPhy I，含有權(quán)利要求1所述高比活性植酸酶基因序列。
6.根椐權(quán)利要求4所述的制備具有酵母高表達(dá)比活植酸酶基因的方法，其特征在于合成的植酸酶基因采用引物為Phyl Z和Phyl F擴(kuò)增片段克隆后，在Xho I和Not I雙酶切，定向插入pPIC9載體，構(gòu)建成phy I的酵母表達(dá)載體pPhy I。
全文摘要
本發(fā)明公開一種利用化學(xué)合成和分子進(jìn)化獲得適于酵母表達(dá)高比活植酸酶基因，以合成基因?yàn)槌霭l(fā)基因，進(jìn)行體外重組篩選，獲得比活高的植酸酶基因phy I，在原核表達(dá)質(zhì)粒上構(gòu)建突變植酸酶基因文庫，利用植酸酶原核表達(dá)質(zhì)粒庫轉(zhuǎn)化大腸肝菌，高活性菌株篩選、高密度發(fā)酵等制備方法，獲得適于酵母表達(dá)的高比活植酸酶基因。
文檔編號C12N1/19GK1475565SQ02136530
公開日2004年2月18日 申請日期2002年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月16日
發(fā)明者姚泉洪, 彭日荷, 熊愛生 申請人:上海永業(yè)農(nóng)科生物工程有限公司, 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心