專利名稱：一種固定化漆酶及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種高穩(wěn)定性的氧化還原酶——固定化漆酶及其制備方法。
背景技術：
漆酶是一種酚氧化酶(p-diphenol oxidase EC.1.10.3.2)，最早是從漆樹的分泌物中發(fā)現(xiàn)，后來人們發(fā)現(xiàn)許多生物，包括植物，微生物(主要是真菌)，甚至昆蟲體內(nèi)皆存在漆酶。紙漿漂白也就是去除紙漿中的殘余木素，我國傳統(tǒng)的紙漿漂白都是采用氯氣漂白的方法，這種方法帶來了嚴重的環(huán)境污染，氯漂廢水通常不能循環(huán)使用，而且氯漂廢水中含有大量的劇毒物質。近些年來研究發(fā)現(xiàn)漆酶可以通過破壞芳香環(huán)和Cα-Cβ鍵催化木素脫甲基這一降解木素最初的步驟，最終導致木素大分子的破壞分解，去除殘余木素，這樣就可能使這種生物漂白技術代替原有的造成嚴重環(huán)境污染的氯漂。漆酶的研究已經(jīng)越來越引起生物學，環(huán)境學，造紙工業(yè)的重視。但是漆酶的固定化研究相對少得多，在中國更是一項空白，這在一定程度上制約了漆酶的工業(yè)化利用。固定化酶的主要優(yōu)勢就在于其可以反復使用并且穩(wěn)定性較自由酶有很大的提高。將漆酶固定化后，可以制成各種形式的反應器，用于紙漿的漂白，污水的處理，甚至有機或高分子合成反應，這樣既同樣達到生物催化的效果，又可以反復使用酶，降低酶純化的成本，方便酶與反應物的分離。國外采用的技術有物理包埋，但這種方法生物酶和載體物理接觸，容易從載體中滲出。使用化學方法固定漆酶的有意大利的D’Annibale A，其利用環(huán)氧活化的聚丙烯酸載體EupergitC固定化漆酶，并將這種固定化酶用于污水處理，有效的去除廢水中的酚類有害物質，但該固定化漆酶價格較昂貴。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新型的穩(wěn)定性高、活性高，而價格相對低廉的固定化漆酶。
本發(fā)明的另一個目的是提供該固定化漆酶的制備方法，該制備方法條件溫和，簡單易行。
本發(fā)明提供的高穩(wěn)定性固定化漆酶是以具有活性酯基的聚乙烯醇為載體，將漆酶通過化學鍵合固定在該載體上。
該固定化漆酶的制備方法包括兩個步驟載體的合成及對漆酶的固定；載體的合成步驟包括(1)將聚合度為1450～2600的聚乙烯醇粉末溶于熱水中，加入雙官能團交聯(lián)劑及強酸，調節(jié)pH＝1～3，均勻混合后攪拌4小時以上得交聯(lián)聚乙烯醇凝膠，其中雙官能團交聯(lián)劑用量為聚乙烯醇重量的34％～57％；(2)將交聯(lián)聚乙烯醇凝膠打散后，洗滌，抽濾，60-80℃烘干，研磨成60～120目的顆粒；(3)向上述制得的顆粒中按1～5mmol/克交聯(lián)聚乙烯醇加入羧酸衍生物及其溶劑，在路易士酸催化劑作用下，在溶劑的沸點下攪拌回流反應12～36小時，將反應后的顆粒分別用丙酮和水洗滌后，干燥，制得的羧基化載體酸價為0.5～2.0mmol/克載體；(4)向經(jīng)(3)制得羧基化載體的顆粒中按0.7～3.5mmol/克羧基化載體加入含N-琥珀酰亞胺基的化合物及其溶劑，在碳二亞胺類催化劑和/或4-二甲氨基吡啶的共同作用下，在冰浴中攪拌反應4～12小時，再將反應后的顆粒用非反應性的有機溶劑洗滌，自然干燥即得載體成品。
對漆酶的固定步驟包括將經(jīng)載體的合成步驟制得的載體成品與漆酶混合，在6～40℃，pH＝2.0～10.0，緩沖溶液濃度0.05～1.5mol/L條件下?lián)u動反應6～72小時得固定化漆酶，再先后用pH＝2.0～10.0的1～2mol/L的無機鹽溶液和與無機鹽溶液相同pH值的緩沖溶液洗滌，直到?jīng)]有游離酶被洗出，再經(jīng)真空干燥制成固定化漆酶成品。
在上述過程中，載體的合成步驟(1)中將聚乙烯醇粉末溶于熱水中，優(yōu)選水的重量是聚乙烯醇的7-20倍。
所述的雙官能團交聯(lián)劑選自雙醛類、醛酸類等水溶性雙官能團物質，如戊二醛、乙醛酸等。
所述的強酸為鹽酸，硫酸，硝酸等一種或多種的混合物。
載體的合成步驟(3)中所述的羧酸衍生物為酸酐、鹵代羧酸、羥基羧酸，如丁二酸酐，鄰苯二甲酸酐，順丁烯二酸酐，3-碘代丁酸，α、β羥基酸等。
所述的羧酸衍生物的溶劑一般選自二氧六環(huán)，環(huán)己烷、正己烷，苯，四氫呋喃等弱極性溶劑。
所述的路易士酸催化劑為吡啶，磷酸，氯化鋅等路易士酸。
載體的合成步驟(4)中所述的含N-琥珀酰亞胺基的化合物為N-羥基琥珀酰亞胺，N-羥基-5-降冰片稀-2，3-酰亞胺等。
所述的含N-琥珀酰亞胺基的化合物的溶劑一般為乙酸乙酯，丙酮等極性溶劑。
所述的的碳二亞胺類催化劑為N，N’-二環(huán)己基碳二亞胺，N，N′-二異丙基碳二亞胺，3，3-二甲氨基碳二亞胺或1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺。
對漆酶的固定步驟中，載體成品和漆酶的加入比例優(yōu)選1克載體成品∶1～10IU的漆酶。
所使用的漆酶是本技術領域人員所熟悉的，其獲得也是通過較常規(guī)的微生物發(fā)酵，如可以取自佛羅里達側耳(Pleurotus.florida)、香菇(Lentinus edodes)、漏斗狀側耳(Pleurotussaju-caju)、雜色云芝(Polystictus versicoloy)等微生物的分泌物。漆酶還可以通過供應商獲得。
所述的非反應性的有機溶劑為無親核反應能力，不能發(fā)生酯交換反應的溶劑，如丙酮，乙醚，乙酸乙酯等。
所述的緩沖溶液為醋酸緩沖溶液，檸檬酸緩沖溶液，磷酸緩沖溶液等。
本發(fā)明通過化學鍵合的方法固定漆酶，采用聚乙烯醇這種較廉價，反應基團多的材料，使之交聯(lián)形成不溶于水及任何有機溶劑的顆粒，通過羧基化，在碳二亞胺類化合物和/或4-二甲氨基吡啶的共同催化下，與含N-琥珀酰亞胺基的化合物反應形成具有活性酯基的聚乙烯醇載體，酶的固定化就可以在很溫和的條件下進行，避免了因反應條件較高而導致的酶的失活，所制得的固定化酶穩(wěn)定性高，尤其在強酸強堿條件下穩(wěn)定性大大提高。該固定化漆酶一般為以ABTS為底物，酶活指標在0.5～5酶活單位(IU)/克載體的范圍。酶活指標是在室溫下取0.2克的固定化酶與3毫升0.5毫摩爾/升的ABTS混合，在pH值3.2下反應，離心分離取清液測定420納米處的吸光度。每分鐘使1微摩爾的ABTS氧化所需的酶量為一個酶活單位IU。
本發(fā)明的固定化酶的優(yōu)良效果在于一、采用化學鍵結合固定化方法，酶不易從載體上滲出，固定化酶穩(wěn)定，可反復使用多次，在經(jīng)過17次重復反應后，酶活還可保留50％。二、固定化酶對強酸強堿環(huán)境的抵抗能力較游離酶大大增強固定化漆酶在pH＝2.0的環(huán)境中經(jīng)45小時活力還保留50％以上，而游離酶在同樣條件下5小時就全部失活了；固定化酶在pH＝13.0的環(huán)境中經(jīng)5小時活力還保留70％以上，而游離酶在同樣的條件下1小時就全部失活了。而且這種固定化酶可制成固定化酶反應器，用于實際生產(chǎn)中。
具體實施例方式
下面給出實施例，并通過實施例作出進一步的說明。
實施例1(1)在250毫升園底燒瓶中加入質量百分比濃度為10％的聚乙烯醇溶液300克，質量百分比濃度為5％的戊二醛溶液227克，滴加鹽酸使pH＝1-2，劇烈攪拌反應5小時，洗滌，烘干，研磨成60-120目的顆粒。
(2)在裝有磁力攪拌器，球型冷凝管，溫度計的250毫升三口燒瓶中，加入5克上述制得的顆粒。將2.5克丁二酸酐(羧基化物)溶于80毫升環(huán)己烷與二氧六環(huán)體積比為10∶1的混合溶劑中，倒入上述三口燒瓶中，再加入吡啶0.25毫升，回流攪拌反應，反應溫度為82℃。反應24小時后倒出并分別用40毫升的丙酮，水，丙酮連續(xù)洗滌，自然干燥至恒重。制得酸價為1.78的羧基化聚乙烯醇顆粒。
(3)將1.1克N-羥基琥珀酰亞胺溶解于乙酸乙酯，和制得的小球顆粒加入帶有溫度計，滴液漏斗的250毫升園底燒瓶中，將2.1克二環(huán)己基碳二亞胺溶于乙酸乙酯中滴加進入，在5℃下磁力攪拌反應4小時，用浮選法傾出反應產(chǎn)生的細小顆粒，剩余顆粒用丙酮洗滌，自然干燥至恒重。
(4)0.2克制得的固定化載體在25℃下與1毫升漆酶(酶活1IU，)混合，加入4毫升pH＝3.2，0.05M的醋酸緩沖溶液，攪拌固定化反應24小時。
(5)用0.05M、pH＝5.0的醋酸緩沖溶液配制的2M氯化鈉溶液，水，0.05M、pH＝5.0的醋酸緩沖溶液分別洗滌固定化漆酶，直到?jīng)]有漆酶被洗出。真空干燥。其酶活為2.1IU/克載體。
(2)在同實施例1(2)的三口燒瓶中，加入5克上述制得的顆粒，3.7克鄰苯二甲酸酐(羧基化物)，80毫升正己烷∶二氧六環(huán)為8∶2的混合溶劑，磷酸0.3毫升，回流攪拌反應。反應36小時后倒出并分別用40毫升的丙酮，水，丙酮連續(xù)洗滌，干燥至恒重。制得酸價為1.50的羧基化聚乙烯醇顆粒。
(3)將0.9克N-羥基琥珀酰亞胺，0.03克4-二甲氨基吡啶溶解于乙酸乙酯，和制得的小球顆粒加入同實施例1(3)的圓底燒瓶中，將0.9克N，N′-二異丙基碳二亞胺溶于乙酸乙酯中滴加進入，在2℃下磁力攪拌反應8小時，用浮選法傾出反應產(chǎn)生的細小顆粒，剩余顆粒用丙酮洗滌，自然干燥至恒重。
(4)0.2克制得的固定化載體在40℃下與1毫升漆酶(酶活1.6IU)混合，加入4毫升pH＝3.2，0.05M的檸檬酸鈉-磷酸氫二鈉的緩沖溶液，攪拌固定化反應12小時。
(5)同實施例1(5)。其酶活為3.3IU/克載體。
實施例3(1)同實施例1(1)。
(2)在同實施例1(2)的三口燒瓶中，加入5克上述制得的顆粒，3克丁二酸酐(羧基化物)，80毫升環(huán)己烷與二氧六環(huán)體積比為8∶2的混合溶劑，吡啶0.3毫升，回流攪拌反應。反應36小時后倒出并分別用40毫升的丙酮，水，丙酮連續(xù)洗滌，干燥至恒重。制得酸價為2.12的羧基化聚乙烯醇顆粒。
(3)同實施例2(3)。
(4)0.2克制得的固定化載體在40℃下與1毫升漆酶(酶活0.5IU)混合，加入4毫升pH＝4.0，0.10M的檸檬酸鈉-磷酸氫二鈉的緩沖溶液，攪拌固定化反應12小時。
(5)同實施例1(5)。其酶活為0.8IU/克載體。
權利要求
1.一種高穩(wěn)定性固定化漆酶，是以具有活性酯基的聚乙烯醇為載體，將漆酶通過化學鍵合固定在該載體上。
2.一種制備權利要求1中所述固定化漆酶的方法，該方法包括兩個步驟載體的合成及對漆酶的固定；其中載體的合成步驟包括(1)將聚合度為1450～2600的聚乙烯醇粉末溶于熱水中，加入雙官能團交聯(lián)劑及強酸，調節(jié)pH＝1～3，均勻混合后攪拌4小時以上得交聯(lián)聚乙烯醇凝膠，其中雙官能團交聯(lián)劑用量為聚乙烯醇重量的34％～57％；(2)將交聯(lián)聚乙烯醇凝膠打散后，洗滌，抽濾，60-80℃烘干，研磨成60～120目的顆粒；(3)向上述制得的顆粒中按1～5mmol/克交聯(lián)聚乙烯醇加入羧酸衍生物及其溶劑，在路易士酸催化劑作用下，在溶劑的沸點下攪拌回流反應12～36小時，將反應后的顆粒分別用丙酮和水洗滌后，干燥，制得的羧基化載體酸價為0.5～2.0mmol/克載體；(4)向經(jīng)(3)制得羧基化載體的顆粒中按0.7～3.5mmol/克羧基化載體加入含N-琥珀酰亞胺基的化合物及其溶劑，在碳二亞胺類催化劑和/或4-二甲氨基吡啶的共同作用下，在冰浴中攪拌反應4～12小時，再將反應后的顆粒用非反應性的有機溶劑洗滌，自然干燥即得載體成品；對漆酶的固定步驟包括將經(jīng)載體的合成步驟制得的載體成品與漆酶混合，在6～40℃，pH＝2.0～10.0，緩沖溶液濃度0.05～1.5mol/L條件下?lián)u動反應6～72小時得固定化漆酶，再先后用pH＝2.0～10.0的1～2mol/L的無機鹽溶液和與無機鹽溶液相同pH值的緩沖溶液洗滌，直到?jīng)]有游離酶被洗出，再經(jīng)真空干燥制成固定化漆酶成品。
3.根據(jù)權利要求2中所述的方法，其特征在于載體的合成步驟(1)中所述的雙官能團交聯(lián)劑選自雙醛類、醛酸類雙官能團物質。
4.根據(jù)權利要求2或3中所述的方法，其特征在于所述雙官能團交聯(lián)劑為戊二醛或乙醛酸。
5.根據(jù)權利要求2中所述的方法，其特征在于載體的合成步驟(3)中所述的羧酸衍生物選自酸酐、鹵代羧酸、羥基羧酸。
6.根據(jù)權利要求5中所述的方法，其特征在于所述的羧酸衍生物選自如丁二酸酐，鄰苯二甲酸酐，順丁烯二酸酐，3-碘代丁酸，α、β羥基酸。
7.根據(jù)權利要求2或3中所述的方法，其特征在于載體的合成步驟(4)中所述的含N-琥珀酰亞胺基的化合物為N-羥基琥珀酰亞胺或N-羥基-5-降冰片稀-2，3-酰亞胺。
8.根據(jù)權利要求2或3中所述的方法，其特征在于載體的合成步驟(4)中所述的的碳二亞胺類催化劑為N，N’-二環(huán)己基碳二亞胺，N，N′-二異丙基碳二亞胺，3，3-二甲氨基碳二亞胺或1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺。
9.根據(jù)權利要求2或3中所述的方法，其特征在于對漆酶的固定步驟中，載體成品和漆酶的加入比例為1克載體成品∶1～10IU的漆酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種高穩(wěn)定性的氧化還原酶——固定化漆酶及其制備方法。該固定化漆酶是以具有活性酯基的聚乙烯醇為載體,將漆酶通過化學鍵合固定在該載體上。其制備方法包括兩個步驟:載體的合成及對漆酶的固定;載體的合成是聚乙烯醇交聯(lián)后,打散,洗滌,研磨;再經(jīng)與羧酸衍生物、含N－琥珀酰亞胺基的化合物反應制得載體成品。對漆酶的固定是將載體成品與漆酶混合,在6～40℃,pH=2.0～10.0的緩沖溶液中搖動反應得固定化漆酶,洗滌,干燥得固定化漆酶成品。本發(fā)明提供了一種新型的使用化學方法制備的固定化漆酶,該酶穩(wěn)定性高、活性高,而價格相對低廉。
文檔編號C12N11/00GK1374403SQ0211512
公開日2002年10月16日 申請日期2002年4月22日 優(yōu)先權日2002年4月22日
發(fā)明者刁穎輝, 付時雨 申請人:中國科學院廣州化學研究所