專利名稱：鼠抗氯霉素單克隆抗體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測(cè)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及抗氯霉素的特異性單克隆抗體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
氯霉素是一種廣譜抗菌素，在臨床中廣泛應(yīng)用于細(xì)菌性疾病控制。由于它對(duì)人類造血系統(tǒng)的毒副作用，尤其是對(duì)兒童的骨髓抑制，已嚴(yán)格控制用于臨床治療。
由于氯霉素的有效性，廉價(jià)性，所以仍被用于對(duì)各種動(dòng)物疾病的控制。但是，它會(huì)殘留在動(dòng)物的組織和分泌液中(例如肉類，雞蛋，蜂蜜，牛奶)，導(dǎo)致人們通過(guò)食物鏈間接攝取氯霉素，危害人體健康。(Domenici.C.et a1.Anti-cap antibodies for appliccation to a tirf immunosensor.Lifechemistry Reports.1994，Vol 11 P 409；Everest，S.J.et al.Development of an ELISA for the detection of chlortetracycline，oxytetracyline and tetracycline residues.Food &AgriculturalImmunology(1994)6，55-61.)近幾年，各國(guó)對(duì)進(jìn)口食品中氯霉素的殘留量均有嚴(yán)格控制標(biāo)準(zhǔn)。歐美各國(guó)要求食品中氯霉素殘留量在10ng/g以下，傳統(tǒng)的檢測(cè)手段已經(jīng)達(dá)不到所需要求，酶聯(lián)免疫測(cè)定法基本可以滿足這一要求，而我國(guó)全部依賴于進(jìn)口，且價(jià)格昂貴，限制了企業(yè)的使用，影響我國(guó)獸禽類食品的出口。(Thacker，D.J.et al.Immunoassays(ELISA) for Rapid，quantitative analysis in the food-processing industry.J.Agric Food chem，1996，44，2680-2685)。
由于越來(lái)越多的國(guó)家對(duì)進(jìn)出口食品中殘留藥物的檢測(cè)越來(lái)越嚴(yán)格，開(kāi)發(fā)靈敏的檢測(cè)方法已成為當(dāng)務(wù)之急。目前我國(guó)對(duì)CAP殘留的檢測(cè)技術(shù)，從已公布的技術(shù)看，有杯碟法，氣相色譜法和液相色譜法三種。其測(cè)定低限分別為100ppb及10ppb，均達(dá)不到要求。近年多克隆抗體酶聯(lián)免疫技術(shù)的應(yīng)用，可測(cè)到10ng/ml以下，檢測(cè)低限可達(dá)1ng/ml，基本滿足了要求。但是多克隆抗體酶聯(lián)免疫技術(shù)靈敏度，特異性較差，因此，本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)特異性抗氯霉素的單克隆抗體，以及檢測(cè)氯霉素的有效方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的提供一種特異性抗氯霉素的單克隆抗體。
本發(fā)明的另一目的是提供一種特異性檢測(cè)氯霉素的試劑盒。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種免疫球蛋白，其特征在于，它是特異性地結(jié)合于氯霉素的單克隆抗體。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，所述的免疫球蛋白來(lái)自鼠。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，所述的免疫球蛋白是單克隆抗體6A3和1D1。
在本發(fā)明的另一實(shí)例中，所述的免疫球蛋白由小鼠雜交瘤細(xì)胞系6A3，CCTCC No.C200118所產(chǎn)生。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，它是小鼠雜交瘤細(xì)胞系6A3，CCTCC No.C200118。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種檢測(cè)氯霉素的試劑盒，它含有上述的免疫球蛋白或免疫偶聯(lián)物，或其活性片段。較佳地，所述的試劑盒還含有氯霉素與下列物質(zhì)的偶聯(lián)物蛋白質(zhì)、酶、天然或合成高分子多聚物，該偶聯(lián)物可與本發(fā)明的免疫球蛋白特異性地結(jié)合。
在本發(fā)明的第四方面，提供了本發(fā)明鼠抗氯霉素單克隆抗體的用途，它被用于檢測(cè)氯霉素殘留量。


圖1顯示了氯霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)多年研究發(fā)現(xiàn)，用半琥珀酸氯霉素(CAP-HS)與BSA偶連成CAP-HS-BSA，并以此作為免疫原，免疫Balb/c小鼠，其脾細(xì)胞與SP2/0融合，獲得分泌抗CAP抗體的兩株細(xì)胞株(1D1、6A3)。腹水經(jīng)Separose-4B-CAP親和層析純化。用純化的抗體包被聚苯乙烯板，以CAP-HRP與CAP或待測(cè)樣品作競(jìng)爭(zhēng)ELISA，結(jié)果顯示，檢測(cè)靈敏度為0.001ng/ml；與4種常用抗生素交叉反應(yīng)率＜0.01％，與氯霉素衍生物甲砜霉素交叉反應(yīng)率＜0.03％；氯霉素添加回收試驗(yàn)表明重復(fù)性、準(zhǔn)確性好。
本發(fā)明包括具有抗氯霉素單克隆抗體(如6A3)的相應(yīng)氨基酸序列的單克隆抗體、具有抗氯霉素單克隆抗體6A3可變區(qū)鏈的單克隆抗體，以及具有這些鏈的其他蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)偶聯(lián)物及融合表達(dá)產(chǎn)物。具體地，本發(fā)明包括具有含超變區(qū)(互補(bǔ)決定區(qū)，CDR)的輕鏈和重鏈的任何蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)偶聯(lián)物及融合表達(dá)產(chǎn)物(即免疫偶聯(lián)物及融合表達(dá)產(chǎn)物)，只要該超變區(qū)與本發(fā)明的輕鏈和重鏈的超變區(qū)相同或至少90％同源性，較佳地至少95％同源性。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，免疫偶聯(lián)物及融合表達(dá)產(chǎn)物包括藥物、毒素、細(xì)胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他診斷或治療分子與抗氯霉素單克隆抗體或其片段結(jié)合的而形成的偶聯(lián)物。本發(fā)明還包括與抗氯霉素單克隆抗體或其片段結(jié)合的細(xì)胞表面標(biāo)記物或抗原。
對(duì)于本發(fā)明抗氯霉素單克隆抗體重鏈和輕鏈序列，可以用常規(guī)方法測(cè)定。抗氯霉素單克隆抗體V鏈的超變區(qū)或互補(bǔ)決定區(qū)(complementarity determiningregion，CDR)特別令人感興趣，因?yàn)樗鼈冎兄辽俨糠稚婕敖Y(jié)合抗原。因此，本發(fā)明包括那些具有帶CDR的免疫球蛋白輕鏈和重鏈可變鏈的分子，只要其CDR與抗氯霉素單克隆抗體CDR具有90％以上(較佳地95％以上)的同源性。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆抗體，還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab或(Fab’)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈。
本發(fā)明還提供了上述免疫球蛋白或其片段的DNA分子。這些DNA分子的序列可以如上用常規(guī)技術(shù)，利用小鼠雜交瘤細(xì)胞系6A3(CCTCC No.C200118)獲得。此外，還可將輕鏈和重鏈的編碼序列融合在一起，形成單鏈抗體。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來(lái)大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來(lái)合成有關(guān)序列，尤其是片段長(zhǎng)度較短時(shí)。通常，通過(guò)先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長(zhǎng)的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過(guò)化學(xué)合成來(lái)得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過(guò)化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
本發(fā)明還涉及包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體。這些載體可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。
宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長(zhǎng)期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔，脂質(zhì)體包裝等。
獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。
在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過(guò)各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超聲處理、超離心、分子篩層析(凝膠過(guò)濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
此外，本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)氯霉素的試劑盒，它含有上述的免疫球蛋白或免疫偶聯(lián)物，或其活性片段。一種氯霉素診斷試劑盒，檢測(cè)低限可達(dá)0.01ng/g。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于靈敏度高，特異性強(qiáng)，簡(jiǎn)便快捷。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例材料(A)試劑半琥珀酸氯霉素(CAP-HS)，BSA，N-羥基琥珀酰亞胺，N.，N.-二環(huán)己碳二亞胺，二甲基甲酰胺，羊抗小鼠IgG-HRP，PEG均系SIGMA產(chǎn)品，HAT為GIBCO產(chǎn)品。
(B)動(dòng)物雌性Balb/c小鼠，6-8周令，體重20克左右，購(gòu)自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
實(shí)施例1抗氯霉素單抗的制備和純化(A)免疫抗原，檢測(cè)抗原，氯霉素酶標(biāo)記物的制備按照Domenici.C.et al.Anti-cap antibodies forappliccation to a tirf immunosensor.Life chemistry Reports.1994，Vol 11 P 409中所述的方法，將半琥珀酸氯霉素分別與BSA，兔IgG，HRP按碳二亞胺活化脂法進(jìn)行偶聯(lián)，從而制得CAP-HS-BSA作為免疫抗原，CAP-HS-IgG作為檢測(cè)抗原，CAP-HS-HRP作為氯霉素酶標(biāo)記物。
(B)抗CAP雜交瘤細(xì)胞株的建立每只小鼠以50μg量的抗原乳化后腹內(nèi)和頸背注射，共免疫8次，然后將小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0融合。免疫BALB/c小鼠血清效價(jià)達(dá)1∶15000，細(xì)胞融合率為95％以上，共篩選出46個(gè)陽(yáng)性克隆，陽(yáng)性率為8.2％?？寺』?，選出兩株分泌高效價(jià)抗體的細(xì)胞(1D1，6A3)。經(jīng)4個(gè)月的傳代，腹腔接種，液氮凍存，復(fù)蘇，兩株雜交瘤細(xì)胞均能穩(wěn)定分泌mAb。分泌抗CAP抗體的這兩株細(xì)胞株分別命名為1D1和6A3。
(C)單克隆抗體的制備按常規(guī)雜交瘤技術(shù)制備腹水，腹水經(jīng)Separose-4B-CAP親和層析純化后，獲得單克隆抗體1D1和6A3。
實(shí)施例2單克隆抗體的特性鑒定(A)亞型鑒定采用常規(guī)的雙夾心ELISA法進(jìn)行亞型篩選鑒定。
(B)親和常數(shù)的測(cè)定按Friguet B，et alMeasurement of the true affinity constantin solution of antigen-antibody by enzyme-linked immunosorbent assay.J immunol Meth 1985；77305所述的方法進(jìn)行親和常數(shù)測(cè)定。
Ig亞型和親合常數(shù)鑒定結(jié)果列于表1。
表1 Ig亞類及親和常數(shù)測(cè)定結(jié)果

(C)競(jìng)爭(zhēng)ELISA的建立和回收試驗(yàn)競(jìng)爭(zhēng)ELISA的建立分別取50μl CAP標(biāo)準(zhǔn)液(55，25，10，5，1，0.1ng/ml)，和50ul CAP-HRP酶標(biāo)記物(1∶10000)與包被聚苯乙烯板條上的抗CAP單抗進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)，TMB-H2O2顯色，測(cè)450nm吸收值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
回收試驗(yàn)取CAP標(biāo)準(zhǔn)品液(55，25，10，5，2.5，1ng/ml)1ml加入勻漿后的10g雞肉中，混勻。按英國(guó)Randox公司試劑盒說(shuō)明書的淬取方法提取CAP，用競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定CAP的量，在同步的標(biāo)準(zhǔn)曲線上查其回收量。
結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)曲線和靈敏度采用CAP標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)定檢測(cè)范圍為0.1-55ng/ml，結(jié)果顯示隨濃度遞增光密度呈遞減，標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。其檢測(cè)限可達(dá)0.001ng/ml.見(jiàn)表2。
表2 氯霉素檢測(cè)最低濃度(ng/ml)

重復(fù)性試驗(yàn)重復(fù)標(biāo)準(zhǔn)曲線4次，每次每標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)3復(fù)孔。經(jīng)計(jì)算得批內(nèi)CV是4.5-8.9％，平均6.7％，批間是5.6-10.7％，平均8.2％。
回收試驗(yàn)提取的CAP與CAP-HRP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)果見(jiàn)表3。1D1回收率在83.3-94.4％，平均為88.9％，6A3回收率在84.8-97.9％，平均為91.4％，實(shí)際測(cè)得CAP濃度與添加濃度接近，表明方法的準(zhǔn)確性很好。
表3氯霉素回收率(％)CAP 1D1 6A3(ng/ml)測(cè)量值回收率測(cè)量值回收率(ng/ml) (％) (ng/ml) (％)55 49.5 90.2 46.65 84.825 20.83 83.3 22.83 91.310 9.03 90.3 9.79 97.95 4.52 90.4 4.68 93.62.52.27 90.8 2.37 94.81 0.944 94.4 0.96 95.6(D)特異性分析將4種常用抗生素和氯霉素的衍生物(甲砜-CAP，HS-CAP)分別與CAP-HRP進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)，觀察單抗與其交叉反應(yīng)率。
結(jié)果表明，本發(fā)明mAb與CAP的衍生物及4種常用抗生素(1mg/ml)與CAP-HRP競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)，結(jié)果顯示交叉反應(yīng)率均＜0.03和＜0.01％(見(jiàn)表4)，說(shuō)明CAPELISA法特異性強(qiáng)。
表4.Mab與常用抗生素及CAP衍生物的交叉反應(yīng)率抗生素 交叉反應(yīng)率1D1 6A3HS-CAP 232.2 189.2CAP 100 100甲砜氯霉素-CAP＜0.03 ＜0.03盤尼西林 ＜0.01 ＜0.01磺胺嘧啶 ＜0.01 ＜0.01鏈霉素 ＜0.01 ＜0.01四環(huán)素 ＜0.01 ＜0.01本發(fā)明人首次研制的抗氯霉素的單克隆抗體，能與氯霉素專一性地結(jié)合，與氯霉素衍生物以及常用抗生素?zé)o交叉反應(yīng)，其交叉反應(yīng)率＜0.01％，靈敏度高，檢測(cè)低限可達(dá)0.01-0.001ng/g，添加回收和批內(nèi)、批間試驗(yàn)表明方法的重復(fù)性，準(zhǔn)確性符合農(nóng)畜食品產(chǎn)品的監(jiān)控標(biāo)準(zhǔn)。
單克隆抗體ELISA不但檢測(cè)CAP的殘留濃度是可行，而且與多克隆抗體比較，前者的靈敏度高，穩(wěn)定性好。本發(fā)明人研制的氯霉素殘留量檢測(cè)方法，完全能夠滿足我國(guó)進(jìn)出口食品檢測(cè)的需求。
生物材料的保藏一種陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞為雜交瘤細(xì)胞系6A3，該雜交瘤細(xì)胞系于2001年12月20日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，中國(guó)，武漢市)，保藏號(hào)為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，中國(guó)，武漢市)No.C200118。
此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種免疫球蛋白，其特征在于，它是特異性地結(jié)合于氯霉素的單克隆抗體。
2.如權(quán)利要求1所述的免疫球蛋白，其特征在于，所述的免疫球蛋白來(lái)自鼠。
3.如權(quán)利要求1所述的免疫球蛋白，其特征在于，它是單克隆抗體6A3和1D1。
4.如權(quán)利要求1所述的免疫球蛋白，其特征在于，它由小鼠雜交瘤細(xì)胞系6A3，CCTCC No.C200118所產(chǎn)生。
5.一種產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，其特征在于，它是小鼠雜交瘤細(xì)胞系6A3，CCTCC No.C200118。
6.一種檢測(cè)氯霉素殘留量的試劑盒，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的免疫球蛋白。
7.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，還含有氯霉素與下列物質(zhì)形成的偶聯(lián)物蛋白質(zhì)、酶、天然或合成高分子多聚物。
8.一種權(quán)利要求1所述免疫球蛋白的用途，其特征在于，它被用于檢測(cè)氯霉素殘留量。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種抗氯霉素的特異性單克隆抗體6A3。該單克隆抗體具有與氯霉素結(jié)合的特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。本發(fā)明還提供了6A3免疫球蛋白、及其片段和免疫偶聯(lián)物。本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)氯霉素殘留量的檢測(cè)試劑盒。
文檔編號(hào)C12N5/18GK1429845SQ0114528
公開(kāi)日2003年7月16日 申請(qǐng)日期2001年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月30日
發(fā)明者魏萬(wàn)貴, 陳登鴻, 羅榮生, 金玫蕾, 胡泰山, 趙國(guó)屏 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生物工程研究中心