一種鼠源單克隆抗體cd151 9b及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種鼠源單克隆抗體CD151?9B及其應(yīng)用。所述的鼠源單克隆抗體CD151?9B，其特征在于，由保藏號為CGMCC?No.9156的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生。本發(fā)明通過廣泛而深入的研究，成功獲得了靶向針對人CD151-整合素α6β1復(fù)合物結(jié)合域高特異性的鼠源單克隆抗體CD151?9B。本發(fā)明的鼠源單克隆抗體CD151?9B具有高親和性，能較好表達(dá)肝癌細(xì)胞中CD151表達(dá)和定位。本發(fā)明的鼠源單克隆抗體CD151?9B可以競爭肝癌細(xì)胞CD151-整合素α6β1結(jié)合位點(diǎn)，抑制肝癌細(xì)胞移動、侵襲。因此，本發(fā)明的高親和力、高特異性的鼠源單克隆抗體具有較好的實(shí)驗和臨床應(yīng)用前景。
【專利說明】-種鼠源單克隆抗體CD151 9B及其應(yīng)用 【技術(shù)領(lǐng)域】
[〇〇〇1] 本發(fā)明涉及針對人四跨膜蛋白⑶151-整合素 α 6β 1復(fù)合體結(jié)合域的單克隆抗體 ⑶1519Β及其應(yīng)用。 【背景技術(shù)】
[0002] 肝癌屬基因性疾病，一些關(guān)鍵基因在肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移中起了重要作用。四跨膜 蛋白⑶151(Tetraspanin24，TM4SF24)是四跨膜蛋白家族最重要的成員之一，⑶151基因定 位于人類染色體11ρ15. 5,其編碼蛋白質(zhì)形成四次跨膜分子。CD151在人體細(xì)胞中分布廣 泛，包括上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和血小板等，參與細(xì)胞多種重要生理功能，如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞黏 附、細(xì)胞移動與形態(tài)改變等。
[0003] 多種惡性腫瘤組織包括肝癌中CD151過表達(dá)，其表達(dá)強(qiáng)度與患者預(yù)后密切相關(guān)。 CD151通過與整合素、生長因子結(jié)合或自身相互結(jié)合形成功能復(fù)合體，影響腫瘤細(xì)胞遷移、 病理血管形成和上皮間質(zhì)樣轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT)等多個方 面，參與腫瘤轉(zhuǎn)移。研究證實(shí)，⑶151通過與整合素 α6β1等結(jié)合形成功能復(fù)合體，募集細(xì) 胞內(nèi)憐脂醜肌醇 _3_ 激酶（Phosphatidylinositide3kinases，ΡΙ3Κ)、蛋白激酶 C(Protein kinase C，PKC)、細(xì)胞分裂控制蛋白 42 (Cell division control protein42，Cdc42)、Ras 等 信號分子，促進(jìn)細(xì)胞的代謝、生長、增殖和細(xì)胞內(nèi)肌動蛋白聚合，參與腫瘤細(xì)胞遷移、病理血 管形成和形態(tài)改變等過程促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。⑶151可增強(qiáng)整合素 α6β1與其配體層粘連蛋 白-1之間的結(jié)合，加快細(xì)胞在層粘連蛋白-1基膜上的移動而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷徙。
[0004] 前期系列研究發(fā)現(xiàn)，CD151是影響肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的關(guān)鍵蛋白。我們發(fā)現(xiàn)，（1)肝 癌細(xì)胞中⑶151表達(dá)程度與其侵襲、轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)，⑶151表達(dá)改變可顯著影響肝 癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力；(2)⑶151通過激活ΡΙ3Κ/蛋白激酶B(Akt)/糖原合成酶激 酶 _3 β (Glycogen synthase kinase_3i3 , GSK_3i3)/Snail 信號通路促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶 9(1&11：1^11116七311(^6口1:丨(^869，麗?9)分泌和表達(dá)，促進(jìn)肝癌新生血管形成 ；（3)0)151與整 合素 α 6 β 1在肝癌細(xì)胞表面形成復(fù)合物，過表達(dá)⑶151可選擇性擴(kuò)大整合素 α 6 β 1-PI3K 信號導(dǎo)致核轉(zhuǎn)錄因子Snail (鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail作為EMT過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子在腫瘤 的侵襲轉(zhuǎn)移中起重要作用）的核聚集與激活，從而促進(jìn)肝癌EMT發(fā)生；(4)基于免疫共沉淀 (Co-Immunoprecipitation, coIP)結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS/MS)技術(shù)，肝癌細(xì)胞株HCCLM3細(xì)胞中CD151可與整合素 α 6、β 1等 分子伴侶結(jié)合形成功能復(fù)合。因此，四跨膜蛋白⑶151與整合素 α 6 β 1等結(jié)合所形成的功 能復(fù)合體是抗腫瘤復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移的潛在靶點(diǎn)。
[0005] 目前已有幾種抗人CD151單克隆抗體用于腫瘤治療的實(shí)驗研究，并顯示出一定的 療效。但這些抗體制備時未考慮⑶151功能發(fā)揮依賴于功能復(fù)合體存在這一特征，因此這 些單克隆抗體在抑制腫瘤的侵襲同時也影響其的多種重要生理功能，如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞黏 附、細(xì)胞移動與形態(tài)改變。
[0006] 因此，本領(lǐng)域迫切需要研制具有針對⑶151-整合素α6β 1復(fù)合體結(jié)合域的靶向 單克隆抗體，為臨床治療開發(fā)治療效果更佳、副作用更小的藥物。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種靶向針對人⑶151-整合素 α 6β 1復(fù)合物結(jié)合域的鼠源 單克隆抗體（CD1519B)及其應(yīng)用，新研制的抗體能定位、表達(dá)細(xì)胞、組織（如肝細(xì)胞癌）內(nèi) ⑶151蛋白，一方面不影響⑶151正常的生理功能，另一方面又能競爭性抑制⑶151過表達(dá) 引起的肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移。
[0008] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種靶向人四跨膜蛋白⑶151-整合素 α6β1 復(fù)合體結(jié)合域的鼠源單克隆抗體⑶1519Β，其特征在于，由保藏號為CGMCC No. 9156的雜交 瘤細(xì)胞產(chǎn)生。
[0009] 優(yōu)選地，所述的靶向人四跨膜蛋白⑶151-整合素 α6β 1復(fù)合體結(jié)合域的鼠源單 克隆抗體⑶1519Β包含可與人四跨膜蛋白⑶151-整合素 α6β 1復(fù)合體結(jié)合的功能域，該 功能域包含至少一個輕鏈可變區(qū)和至少一個重鏈可變區(qū)。
[0010] 更優(yōu)選地，所述的功能域選自單克隆抗體，完整抗體，單鏈抗體（scFV)，F(xiàn)ab片段， Fd片段，F(xiàn)v片段，F(xiàn) (ab'）2片段及其功能性衍生物。
[〇〇11] 更優(yōu)選地，所述的功能域是抗體可變區(qū)，其包含一個輕鏈可變區(qū)和一個重鏈可變 區(qū)，編碼輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列為SEQ ID N0 :1，編碼重鏈可變區(qū)的核苷酸序列為SEQ ID NO :2。
[0012] 更優(yōu)選地，所述的功能域是抗體可變區(qū)，其包含一個輕鏈可變區(qū)和一個重鏈可變 區(qū)，所述的輕鏈可變區(qū)具有氨基酸序列SEQ ID N0 :3,所述的重鏈可變區(qū)具有氨基酸序列 SEQ ID N0 :4。
[0013] 本發(fā)明還提供了上述的靶向人四跨膜蛋白⑶151-整合素 α6β 1復(fù)合體結(jié)合域的 鼠源單克隆抗體CD1519B在與其他藥物或標(biāo)記物連接中的應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明還提供了上述的靶向人四跨膜蛋白⑶151-整合素 α6β 1復(fù)合體結(jié)合域的 鼠源單克隆抗體CD1519B在制備治療、預(yù)防或緩解腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明還提供了上述的靶向人四跨膜蛋白⑶151-整合素 α6β 1復(fù)合體結(jié)合域的 鼠源單克隆抗體⑶1519Β在制備檢測細(xì)胞、組織中⑶151表達(dá)和定位試劑中的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，其包含上述的靶向人四跨膜蛋白⑶151-整合 素 α 6 β 1復(fù)合體結(jié)合域的鼠源單克隆抗體⑶1519Β和藥學(xué)可接受的載體。
[0017] 本發(fā)明還提供了一種雜交瘤細(xì)胞株，其特征在于，所述的雜交瘤細(xì)胞株為保藏號 為CGMCC No. 9156的雜交瘤細(xì)胞株。
[0018] 本發(fā)明的原理是：四跨膜蛋白⑶151形成四次跨膜的分子結(jié)構(gòu)。⑶151在人體細(xì) 胞中分布廣泛，包括上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和血小板等，參與細(xì)胞多種重要生理功能，如信號 轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞黏附、細(xì)胞移動與形態(tài)改變等。CD151是影響肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的關(guān)鍵蛋白。CD151 通過與整合素 α 6 β 1形成復(fù)合物，參與肝癌細(xì)胞的侵襲、新生血管形成、上皮間質(zhì)樣轉(zhuǎn)化。 既往抗人CD151單克隆抗體未考慮CD151功能發(fā)揮依賴于功能復(fù)合體存在這一特征，因此 這些單克隆抗體在抑制腫瘤的侵襲同時也影響其多種重要生理功能。⑶151的細(xì)胞外區(qū)域 QRD194496對于維持與整合素 α 6 β 1復(fù)合體至關(guān)重要，在肝癌細(xì)胞株HCCLM3細(xì)胞中⑶151可 與整合素 α 6、β 1等分子伴侶結(jié)合形成功能復(fù)合物，⑶151與整合素 α 6 β 1形成復(fù)合物，參 與肝癌進(jìn)展。本發(fā)明新研制的小鼠抗人CD151-整合素 α6β1復(fù)合物結(jié)合域的單克隆抗體 (⑶1519Β)能競爭性抑制⑶151高表達(dá)細(xì)胞（包括肝細(xì)胞癌）移動和侵襲，但不影響⑶151 正常的生理功能；能特異性定位、表達(dá)細(xì)胞、組織（如肝細(xì)胞癌）內(nèi)⑶151蛋白。
[0019] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：
[0020] 本發(fā)明通過廣泛而深入的研究，成功獲得了靶向針對人⑶151-整合素 α6β 1復(fù) 合物結(jié)合域高特異性的鼠源單克隆抗體CD1519B。本發(fā)明的鼠源單克隆抗體CD1519B具有 高親和性，能較好表達(dá)肝癌細(xì)胞中⑶151表達(dá)和定位。本發(fā)明的鼠源單克隆抗體⑶1519Β 可以競爭肝癌細(xì)胞⑶151-整合素 α6β1結(jié)合位點(diǎn)，抑制肝癌細(xì)胞移動、侵襲。因此，本發(fā) 明的高親和力、高特異性的鼠源單克隆抗體具有較好的實(shí)驗和臨床應(yīng)用前景。
[0021] 本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞株（保藏日期2014年4月24日、保藏單位全稱：中國微生物 菌種保藏管理委員會普通微生物中心和保藏編號CGMCC No. 9156)。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0022] 圖1為小鼠抗人⑶1519B單克隆抗體變性蛋白SDS-PAGE電泳圖。
[0023] 圖2為單克隆抗體免疫分型結(jié)果圖；
[0024] 圖3為Western blot實(shí)驗結(jié)果圖；
[0025] 圖4為細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗結(jié)果圖；
[0026] 圖5為免疫組織化學(xué)染色結(jié)果圖；
[0027] 圖6為co-IP實(shí)驗結(jié)果圖；
[0028] 圖7為細(xì)胞劃痕實(shí)驗結(jié)果圖；
[0029] 圖8為Transwell實(shí)驗結(jié)果圖。 【具體實(shí)施方式】
[0030] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不 用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人，分子克?。簩?shí)驗手冊（New York :Cold Spring Harbor laboratory Press， 1989)中所建議的條件，或按照試劑公司所建議的條件。
[0031] 實(shí)施例1.抗原的制備
[0032] 根據(jù) Kazarov AR，Yang X, Stipp CS，Sehgal B，Hemler ME :An extracellular site on tetraspanin CD151determines alpha3and alpha6integrin-dependent cellular morphology. J CellBiol2002 ; 158 (7) :1299-309,設(shè)計需合成的肽段序列為 GQRDHASNIYKVEGGC，按以下步驟合成肽段。
[0033] 1. 1稱取η當(dāng)量樹脂（Sigma)放入反應(yīng)器（上海強(qiáng)耀生物科技有限公司），加入 二氯甲烷（DCM，Sigma)溶脹半小時，然后抽掉DCM，加入一定量配好的六氫吡啶（Sigma)去 Fmoc保護(hù)基。清洗，檢測；
[0034] 1. 2稱取多肽C端的第一個氨基酸〃Fmoc-Cys (Tbu) -0H〃、HBTU、DIEA各三倍當(dāng)量 加入反應(yīng)器，隊鼓泡反應(yīng)半小時，洗掉液體，茚三酮（Sigma)檢測，用吡啶、乙酸酐（Sigma)， 封端。然后洗凈，加入適當(dāng)量的脫帽液去除Fmoc保護(hù)基，去好后洗凈，茚三酮檢測；
[0035] 1. 3稱取多肽C端的第二個氨基酸，HBTU、DIEA (Sigma)各三倍當(dāng)量加入反應(yīng)器， N2鼓泡反應(yīng)半小時，洗掉液體，茚三酮檢測，無色則加入適當(dāng)量的脫帽液去除Fmoc保護(hù)基， 洗凈，檢測；
[0036] 1. 4稱取多肽C端的第三個氨基酸，HBTU、DIEA各三倍當(dāng)量加入反應(yīng)器，N2鼓泡反 應(yīng)半小時，洗掉反應(yīng)液，茚三酮檢測，無色則加入適當(dāng)量的脫帽液去除Fmoc保護(hù)基，洗凈， 檢測；
[0037] 1. 5依次類推，從C端向N端接氨基酸，接到最后一個氨基酸后；
[0038] 1. 6接完后將樹脂拉干，從反應(yīng)柱中取下，樹脂倒入燒瓶中，然后往燒瓶中加一定 量的切割液（上海強(qiáng)耀生物科技有限公司），震蕩2小時（目的是將多肽從樹脂載體上裂解 下來和去除各個保護(hù)基團(tuán)）；
[0039] 1. 7濾掉樹脂，得到濾液，然后向濾液中加入大量乙醚（上海強(qiáng)耀生物科技有限公 司），粗產(chǎn)物會析出，然后離心，清洗即可得到，GQRDHASNIYKVEGGC這個序列的粗產(chǎn)物；
[0040] 1. 8提純：用高效液相色譜（上海強(qiáng)耀生物科技有限公司）將粗品提純至要求純 度 99. 99% ;
[0041] 1. 9純化好的液體放入凍干機(jī)（上海強(qiáng)耀生物科技有限公司）中進(jìn)行濃縮，凍干成 白色粉末；
[0042] 1. 10 稱量 KLH(Sigma)和 BSA(Sigma)分別溶于少量 PBS 中；
[0043] 1. 11將多肽溶于少量MDF (Sigma)中邊攪拌邊加入"1. 10"中的溶液中；
[0044] 1. 12邊攪拌邊加入適量EDC、NHS (上海強(qiáng)耀生物科技有限公司）；
[0045] 1. 13室溫反應(yīng)2小時；
[0046] 1. 14邊攪拌邊加入適量EDC(上海強(qiáng)耀生物科技有限公司）；
[0047] 1. 15室溫反應(yīng)20小時；
[0048] 1. 15 用 0· 01mol/L 的 PBS(PH7. 2)于 4°C充分透析；
[0049] 1. 16 凍干，得到 GQRDHASNIYKVEGGC-KLH 偶聯(lián)物和 GQRDHASNIYKVEGGC-BSA 偶聯(lián)物。 [〇〇5〇] 實(shí)施例2.抗原免疫及雜交瘤篩選
[0051] 2.1重組蛋白免疫：
[0052] 準(zhǔn)備六周齡健康雄性BALB/c小鼠，進(jìn)行初次免疫，稱取一定量的⑶151-整合 素 α 6 β 1-KLH 復(fù)合體蛋白（GQRDHASNIYKVEGGC-KLH)，內(nèi)含 CD151-整合素 α6β1 抗原 量100 μ g/小鼠。溶解后與等量完全弗氏佐劑（Sigma)混合充分乳化，每只小鼠腹腔注射 0. 5ml抗原佐劑混合物。2周后進(jìn)行第一次加強(qiáng)免疫，抗原量同前與不完全弗氏佐劑混合乳 化腹腔注射。間隔2周再行第二次加強(qiáng)免疫，條件同前。二次加強(qiáng)免疫后2周進(jìn)行沖擊免 疫，抗原量是加強(qiáng)免疫的2倍。沖擊免疫后3天處死小鼠，進(jìn)行融合。
[0053] 2. 2抗⑶151-整合素 α 6 β 1雜交瘤細(xì)胞株建立
[0054] (1)細(xì)胞融合
[0055] 融合前24小時制備飼養(yǎng)層細(xì)胞，取免疫同系小鼠腹腔巨噬細(xì)胞鋪成96孔培養(yǎng)板2 塊備用。準(zhǔn)備對數(shù)生長期小鼠骨髓瘤NS-1細(xì)胞系（中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì) 胞庫）融合。沖擊免疫3天處死小鼠，在處死前先眼球取血，以后作陽性對照。在無菌條件 下取脾，分離得到脾細(xì)胞，細(xì)胞活率>95%。分別將NS-1細(xì)胞和脾細(xì)胞洗2次，以10 : 1 比例將脾細(xì)胞和NS-1細(xì)胞混合，離心棄上清，細(xì)胞混勻。將試管直立，取0. 8ml預(yù)熱的5% PEG MN1500 (Roche)，用1分鐘時間慢滴慢搖的加入混合細(xì)胞內(nèi)，然后靜止10分鐘。加入lml 無血清培養(yǎng)液于混合細(xì)胞內(nèi)終止反應(yīng)，持續(xù)1分鐘，在2分鐘內(nèi)加完15ml無血清培養(yǎng)液， 500rpm離心3分鐘，室溫，棄上清，加25ml含10% FBS的HAT (選擇性培養(yǎng)基Sigma)，將細(xì) 胞滴加在已含飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板上培養(yǎng)。
[〇〇56] (2)雜交瘤的細(xì)胞篩選
[0057] 每天觀察雜交細(xì)胞生長情況，第4天已有大小不等克隆形成?？寺〖?xì)胞生長至> 50%時，收集上清，篩選陽性克隆。HAT完全培養(yǎng)液培養(yǎng)3周后換成DMEM培養(yǎng)液（Gibco)。 陽性克隆篩選采用酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法， CD151-整合素 α 6β l-BSA(GQRDHASNIYKVEGGC-BSA)連接的抗原 10ug/ml，每孔 lOOul 包 被。檢測到陽性克隆時用有限稀釋法進(jìn)行再克隆化（2塊96孔）。第二天挑選一個細(xì)胞克 隆重點(diǎn)觀察進(jìn)行檢測，反復(fù)3次。挑選到3個穩(wěn)定克隆，其中一個克隆命名為CD151/9B細(xì) 胞株，進(jìn)行培養(yǎng)，該細(xì)胞株保藏在（保藏日期2014年4月24日、保藏單位：中國微生物菌種 保藏管理委員會普通微生物中心、保藏編號CGMCC No. 9156。）
[0058] 實(shí)施例3.單克隆抗體免疫分型檢測
[0059] 收集抗CD151/9B雜交瘤細(xì)胞株（CD151/9B細(xì)胞株）培養(yǎng)上清，用mouse monoclonal antibody/isotyping kit(Roche)進(jìn)行免疫分型鑒定，結(jié)果為 IgGl，如圖 1 所 示。以下實(shí)驗選用CD151/9B雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行。
[0060] 實(shí)施例4.腹水制備和純化
[0061] 4. 1擴(kuò)增CD151/9B雜交瘤細(xì)胞
[0062] 制備腹水前向BALB/C小鼠腹腔注射液體無菌石蠟油0. 5ml，7天后小鼠腹腔注 射0. 5ml實(shí)施例2獲得的含抗CD151/9B雜交瘤細(xì)胞株（CD151/9B細(xì)胞株）的培養(yǎng)液，抗 CD151/9B雜交瘤細(xì)胞數(shù)為8 X 105。接種細(xì)胞后每天觀察小鼠腹腔增大情況，15天后收集腹 水。收集的腹水以4000rpml0分鐘4°C離心，保留上清，分裝，_20°C貯存?zhèn)溆谩８鶕?jù)需要進(jìn) 行純化。
[0063] 4. 2純化靶向人四跨膜蛋白⑶151-整合素 α 6β 1復(fù)合體結(jié)合域的鼠源單克隆抗 體⑶1519Β (小鼠抗人⑶1519Β單克隆抗體）
[0064] 采用protein G親和層析柱（GE Healthcare)。室溫解凍⑶151/9Β腹水，用結(jié)合緩 沖液（20mM sodium phosphate PH7. 0)稀釋 1 倍，0· 45um 濾器過濾備用。將 protein G 柱室 溫復(fù)溫，用10個柱體積的結(jié)合緩沖液平衡和洗柱子，加 CD151/9B腹水，8個柱體積的結(jié)合緩 沖液洗直到無液體流出，加5個柱體積的PH2. 7,0. 1M甘氨酸鹽酸洗脫液洗脫。每個收集管 內(nèi)預(yù)加100ullMTris-HCL(PH9. 0)起中和作用，每管收集流出液lml進(jìn)行蛋白濃度測定，將 有效的流出液透析0. 1M PBS PH7. 0，透析24小時，其間換兩次。將透析液濃縮，測蛋白濃度 (Nanovue plus GE)，得到小鼠抗人OH519B單克隆抗體。然后0· 22um滅菌過濾，分裝-80°C 保存。
[0065] 4. 3SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)
[〇〇66] (1)樣品制備：采用步驟4.1中制備的腹水，將腹水樣品與5X樣品緩沖液 (20ul+5ul)在一個Eppendorf管中混合。放入10(TC加熱10分鐘，取上清點(diǎn)樣；
[0067] (2)分離膠及濃縮膠的制備：將玻璃板、樣品梳、Spacer用洗滌劑洗凈，用 ddH20(碧云天）沖洗數(shù)次，再用乙醇擦拭，晾干；將兩塊洗凈的玻璃板之間加入Spacer，按 照Bio-Rad Mini II/III說明書提示裝好玻璃板；按如下體積配制12%分離膠10. 0ml，混 勻；
[0068] ddH203. 3ml
[0069] 1. 5mol/L Tris-HCl (pH = 8· 8) 2. 5ml
[0070] 30% Acr-Bis4ml
[0071] 10% SDSlOOy 1
[0072] 10% ΑΡΙΟΟμ 1
[0073] TEMED4 μ 1
[0074] 向玻璃板間灌制分離膠，立即覆一層重蒸水，大約20分鐘后膠即可聚合；按如下 體積配制5 %濃縮膠3. 0ml，混勻；
[0075] ddH202. 1ml
[0076] 1. Omol/LTris-HCl (pH = 6. 8) 380ul
[0077] 30% Acr-Bis500y 1
[0078] 10% SDS30y 1
[0079] 10% ΑΡ30μ 1
[0080] TEMED3 μ 1
[0081] 將上層重蒸水傾去，濾紙吸干，灌制濃縮膠，插入樣品梳；
[0082] (3)裝好電泳系統(tǒng)，加入電極緩沖液，上樣20μ 1 ;穩(wěn)壓200V，溴酚藍(lán)剛跑出分離膠 時，停止電泳，約需45分鐘-1小時；
[0083] (4)卸下膠板，剝離膠放入考馬斯亮藍(lán)G250染色液中，室溫染色2小時；加入脫色 液，置于80rpm脫色搖床上，每20分鐘更換一次脫色液（10ml冰乙酸；45ml乙醇；45ml蒸餾 水）至完全脫凈，攝片，結(jié)果如圖2所示。
[0084] 實(shí)施例5.抗⑶151-整合素 α 6 β 1復(fù)合體結(jié)構(gòu)域單克隆抗體可變區(qū)測序
[0085] 提取實(shí)施例2獲得的ΟΗ51/9Β細(xì)胞株的總RNA(Invitrogen)、逆轉(zhuǎn)錄（Promega)。 利用5'-race技術(shù)（TAKARA)擴(kuò)增抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)。然后將抗體重鏈及輕鏈可變區(qū) 克隆到T載體（TAKARA)，測序。PubmedBlast IgBlast數(shù)據(jù)庫對比序列，找出雜交瘤單克隆 細(xì)胞株重鏈輕鏈可變區(qū)（附序列）。確定CD151/9B重鏈及輕鏈可變區(qū)至恒定區(qū)的序列：具 體方法按照5'-RACE試劑盒（TAKARACode :D315)說明書進(jìn)行實(shí)驗。具體方法如下：
[0086] 5. 1抗⑶151/9B雜交瘤細(xì)胞總RNA的提?。?br> [0087] 抗⑶151/9B雜交瘤細(xì)胞于5% C02 , 37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將抗⑶151/9B雜交瘤細(xì) 胞收集于離心管中，室溫，l，〇〇〇rpm離心5分鐘，棄上清。PBS (Corning)洗漆細(xì)胞2次。每 1〇6細(xì)胞加 lml Trizol (Invitrogen)，充分裂解細(xì)胞；按每毫升Trizol加0· 2ml的比例加入 氯仿（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），劇烈振蕩15秒，室溫靜置孵育5分鐘；4°C，12, OOOrpm 離心15分鐘；將無色上清液移入RNAasefree EP管中，按每毫升Trizol加0. 5ml異丙醇（國 藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），室溫靜置10分鐘，12, 000rpm，4°C離心10分鐘；棄上清，70% RNAase free乙醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）洗漆，4°C，12, OOOrpm離心5分鐘；室溫 干燥RNA10分鐘。隨后用DEPC處理后的RNAase free H20(生物工程上海有限公司）溶解。 分光光度計法定量RNA濃度。
[0088] 以下 5. 2-5. 7 為 5' -RACE 實(shí)驗步驟（試劑盒，TAKARA Code :D315)
[0089] 5· 2去磷酸化處理
[0090] 使用Alkaline Phosphatase (CIAP)對總RNA裸露的Y磷酸基團(tuán)進(jìn)行去磷酸反 應(yīng)。按下列組份配制去磷酸反應(yīng)液：
[0091] Total RNA(1 μ g/ μ 1) 1 μ 1
[0092] RNase Inhibitor (40U/ μ 1) 1 μ 1
[0093] 10XAlkaline Phosphatase Buffer(MgC12Free) 5μ 1
[0094] Alkaline Phosphatase (Calf intestine) (16U/ μ 1) 0. 6 μ 1
[0095] 加 RNase Free 去離子水至 5〇 μ 1。
[0096] 上述反應(yīng)體系于50°C反應(yīng)1小時。隨后向上述反應(yīng)液中加入20 μ 1濃度為3mol 0130)0似(?!15.2)和13(^18似86?代6去離子水，充分混勻。加入20(^1苯酚/氯仿/異戊 醇（25 : 24 : 1)，充分混勻，13, OOOrpm室溫離心5分鐘，將上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中。 加入200 μ 1氯仿，充分混勻，13, OOOrpm室溫離心5分鐘，將上層水相轉(zhuǎn)移至新Microtube 中。加入2 μ 1 ΝΑ Carrier后均勻混合。加入200 μ 1異丙醇，充分混勻后，冰上冷卻10分 鐘。13, 000rpm4°C離心20分鐘，棄上清。加入500 μ 170%冷乙醇（RNase Free去離子水配 制）漂洗，13, 000rpm4°C離心5分鐘，棄上清后干燥。加入7 μ 1 RNase Free去離子水溶解 沉淀，得到 CIAP-treated RNA。
[0097] 5.3"去帽子"反應(yīng)：
[0098] 使用 Tobacco Acid Pyrophosphatase (TAP)去掉 mRNA 的 5'帽子結(jié)構(gòu)，保留一個 磷酸基團(tuán)。按下列組份配制"去帽子"反應(yīng)液：
[0099] CIAP-treated RNA 7 μ 1
[0100] RNase Inhibitor (40 U/ μ 1) 1 μ 1
[0101] 1 OX TAP Reaction Buffer 1 μ 1
[0102] Tobacco Acid Pyrophosphatase (0. 5 U/ μ 1) 1 μ 1
[0103] 總體積10μ 1。37°C反應(yīng)1小時。得到的反應(yīng)液為CIAP/TAP-treated RNA。取 5μ 1用于Y -RACE Adaptor連接反應(yīng)，剩余的5μ 1保存于-80°C備用。
[0104] 5. 4 5 ' RACE Adaptor 的連接。
[0105] 首先配制下列溶液：
[0106] CIAP/TAP-treated RNA 5 μ 1
[0107] 5' RACEAdaptor(15yM) 1μ 1
[0108] RNase Free dH20 4 μ 1
[0109] 于65°C孵育5分鐘后冰上放置2分鐘，然后加入下列試劑：
[0110] RNase Inhibitor (40 U/ μ 1) 1 μ 1
[0111] 5 XRNA Ligation Buffer 8μ1
[0112] 40%PEG#6000 20 μ 1
[0113] T4 RNALigase (40 U/ μ 1) 1 μ 1
[0114] 反應(yīng)體系于16°C孵育1小時。向上述反應(yīng)液中加入20 μ 1的3 mol的CH3C00Na(PH 5. 2)和140 μ 1 RNase Free去離子水后，充分混勻。加入200 μ 1苯酚/氯仿/異戊醇 (25 : 24 : 1)，充分混勻后于13, OOOrpm室溫離心5分鐘，將上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管 中。加入200 μ 1氯仿，充分混勻后于13, OOOrpm室溫離心5分鐘，將上層水相轉(zhuǎn)移至新的 離心管中。加入2 μ 1 NA Carrier后均勻混合。加入200 μ 1異丙醇，充分混勻后，冰上冷卻 10分鐘。13,000rpm4°C離心20分鐘，棄上清。加入500μ1預(yù)冷的70%乙醇（RNaseFree 去離子水配制）漂洗，13, OOOrpm 4°C離心5分鐘，棄上清后干燥。加入6 μ 1 RNase Free去 離子水溶解沉淀，得到Ligated RNA。
[0115] 5.5反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
[0116] 按下列組份配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液：
[0117] LigatedRNA 6 μ 1
[0118] Random9mers (50 μ Μ) 0. 5 μ 1
[0119] 5XM-MLV Buffer 2 μ 1
[0120] dNTP (10mM each) 1 μ 1
[0121] RNase Inhibitor (40U/ μ 1) 0. 25 μ 1
[0122] Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H-) (200U/ μ 1) 0. 25 μ 1
[0123] 加 RNase Free去離子水至10 μ 1。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下：30°C 10分鐘，42°C 1小 時，70°C 15分鐘。反應(yīng)結(jié)束后可以進(jìn)行下一步實(shí)驗，或?qū)⒎磻?yīng)液保存于_20°C。
[0124] 5. 60uterPCR 反應(yīng)
[0125] PCR反應(yīng)使用TaKaRa LA Taq? (TaKaRa)，按下列組份配制Outer PCR反應(yīng)液：
[0126] 上述的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液2 μ 1
[0127] 1 X cDNA Dilution Buffer II 8 μ 1
[0128] 10 X LA PCR Buffer 11 (Mg2+Free) 4 μ 1
[0129] MgCl2 (25mM) 3 μ 1
[0130] TaKaRa LA Taq (5U/ μ 1) 0· 25 μ 1
[0131] mlgGfOUter Primer (10 μ Μ) 2 μ 1
[0132] 5' RACE Outer Primer (10 μ Μ) 2μ1
[0133] 加滅菌去離子水至50 μ 1。PCR反應(yīng)條件：94°C 3分鐘；[94°C 30秒，55°C 30秒， 72°C 1分]X20個循環(huán)；72°C 10分鐘。
[0134] 5. 7InnerPCR 反應(yīng)
[0135] 按下列組份配制Inner PCR反應(yīng)液：
[0136] OuterPCR 反應(yīng)液 1 μ 1
[0137] 10 X LAPCR BufferII (Mg2+Free) 5 μ 1
[0138] MgCl2 (25mM) 5 μ 1
[0139] dNTP Mixture (2. 5mM each) 8 μ 1
[0140] TaKaRa LATaq (5U/ μ 1) 0· 5 μ 1
[0141] mlgGfinner (10 μ Μ) 2 μ 1
[0142] 5' RACE Inner Primer (10 μ M) 2 μ 1
[0143] 加滅菌去離子水至50μ 1。PCR反應(yīng)條件如下：94°C 3分鐘，[94°C 30秒，55°C 30 秒，72°C lmin] X25 個循環(huán)；72°C 10 分鐘。
[0144] 5. 8瓊脂糖凝膠電泳
[0145] 反應(yīng)結(jié)束后，取5 μ 1 PCR反應(yīng)液進(jìn)行1 %的瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。 然后將PCR擴(kuò)增得到的抗體重鏈及輕鏈可變區(qū)分別鏈接到pGEM?-T載體（PromegaCode : A3610)，連接反應(yīng)體系如下：
【權(quán)利要求】
1. 一種靶向人四跨膜蛋白⑶151-整合素α6β1復(fù)合體結(jié)合域的鼠源單克隆抗體 ⑶1519Β，其特征在于，由保藏號為CGMCC No. 9156的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生。
2. 如權(quán)利要求1所述的靶向人四跨膜蛋白CD151-整合素α6β1復(fù)合體結(jié)合域的鼠源 單克隆抗體⑶1519Β，其特征在于，包含可與人四跨膜蛋白⑶151-整合素α6β 1復(fù)合體結(jié) 合的功能域，該功能域包含至少一個輕鏈可變區(qū)和至少一個重鏈可變區(qū)。
3. 如權(quán)利要求2所述的靶向人四跨膜蛋白CD151-整合素α6β1復(fù)合體結(jié)合域的鼠源 單克隆抗體CD 1519Β，其特征在于，所述的功能域是抗體可變區(qū)，其包含一個輕鏈可變區(qū)和 一個重鏈可變區(qū)，編碼輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列為SEQ ID NO :1，編碼重鏈可變區(qū)的核苷酸 序列為 SEQ IDN0 :3。
4. 如權(quán)利要求2所述的靶向人四跨膜蛋白CD151-整合素α 6 β 1復(fù)合體結(jié)合域的鼠源 單克隆抗體CD1519B，其特征在于，所述的功能域是抗體可變區(qū)，其包含一個輕鏈可變區(qū)和 一個重鏈可變區(qū)，所述的輕鏈可變區(qū)具有氨基酸序列SEQ ID NO :2,所述的重鏈可變區(qū)具有 氨基酸序列SEQ IDN0 :4。
5. 權(quán)利要求1-4中任一項所述的靶向人四跨膜蛋白⑶151-整合素α6β 1復(fù)合體結(jié)合 域的鼠源單克隆抗體CD1519B在與其他藥物或標(biāo)記物連接中的應(yīng)用。
6. 權(quán)利要求1-4中任一項所述的靶向人四跨膜蛋白⑶151-整合素α6β 1復(fù)合體結(jié)合 域的鼠源單克隆抗體CD1519B在制備治療、預(yù)防或緩解腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
7. 權(quán)利要求1-4中任一項所述的靶向人四跨膜蛋白⑶151-整合素α6β 1復(fù)合體結(jié)合 域的鼠源單克隆抗體⑶1519Β在制備檢測細(xì)胞、組織中⑶151表達(dá)和定位試劑中的應(yīng)用。
8. -種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1 _4中任一項所述的靶向人四跨膜蛋白⑶151 -整 合素α 6β 1復(fù)合體結(jié)合域的鼠源單克隆抗體CD1519B和藥學(xué)可接受的載體。
9. 一種雜交瘤細(xì)胞株，其特征在于，所述的雜交瘤細(xì)胞株為保藏號為CGMCCNo. 9156的 雜交瘤細(xì)胞株。
【文檔編號】A61K39/395GK104059145SQ201410204122
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年5月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月15日
【發(fā)明者】樊嘉, 施國明, 柯愛武, 周儉, 胡美玉, 張鵬飛, 蔡加彬, 董兆如, 張馳 申請人:復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院