專利名稱：特異性抗小鼠tigit的單克隆抗體及其制備方法、鑒定及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到一株抗小鼠TIGIT(全稱T cell Ig and ITIM domain)的單克隆抗體。具體地說，涉及到對(duì)TIGIT有特異性的單克隆抗體，本發(fā)明還涉及產(chǎn)生該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，以及所述單克隆抗體的制備方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
天然殺傷細(xì)胞(即，NK細(xì)胞)作為主要的天然免疫細(xì)胞，在機(jī)體殺傷病毒感染細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞方面起著重要的作用，NK細(xì)胞通過其表面不同的活化型受體和抑制型受體來控制NK細(xì)胞的活化、增殖和殺傷等功能。TIGIT (T cell Ig and ITIM domain)分子是2009年新發(fā)現(xiàn)表達(dá)在NK細(xì)胞表面的抑制性受體，主要包含胞外IgV-樣結(jié)構(gòu)域,跨膜區(qū)和胞內(nèi)ITIM基序(Immunoreceptortyrosine-based inhibitor y motif),以高親和力結(jié)合配體 PVR(poliovirus receptor),并通過胞內(nèi)ITIM基序傳遞抑制信號(hào)，從而抑制NK細(xì)胞的殺傷功能，與活化性受體CD226/CD96協(xié)同調(diào)控NK細(xì)胞的活化與功能。在黑色瘤荷瘤小鼠中，TIGIT表達(dá)上調(diào)，腫瘤細(xì)胞又高表達(dá)配體PVR，并且TIGIT結(jié)合PVR的能力遠(yuǎn)高于⑶226/⑶96，這使得NK細(xì)胞活性受到抑制，會(huì)造成腫瘤免疫耐受，導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸。真核表達(dá)mTIGIT-hFc融合蛋白，免疫大鼠，取免疫后大鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤IR983F細(xì)胞融合，篩選出能分泌對(duì)mTIGIT有反應(yīng)的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，且其抗體能高效阻斷mTIGIT與配體mPVR的結(jié)合，從雜交瘤培養(yǎng)上清中或者從腹腔接種雜交瘤細(xì)胞的裸鼠腹水中獲取單克隆抗體。制備mTIGIT阻斷性單克隆抗體，為mTIGIT分子的檢測以及mTIGIT功能的研究提供了基礎(chǔ)，該抗體可廣泛用于分子免疫學(xué)的研究中，并且可作為打破腫瘤免疫耐受的潛在治療工具。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供對(duì)小鼠TIGIT (mTIGIT)有特異性的單克隆抗體。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供產(chǎn)生特異性抗小鼠TIGIT的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供本發(fā)明的單克隆抗體的制備方法。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供本發(fā)明的單克隆抗體用于檢測mTIGIT的應(yīng)用，所述單克隆抗體能夠阻斷mTIGIT與其配體PVR的結(jié)合,能通過用于Western blot、ELISA或FlowCytometry 檢測 mTIGIT。本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種對(duì)mTIGIT有特異性的單克隆抗體以及其制備方法，所述抗體的類型為IgG2a，K，并且能高效阻斷mTIGIT與mPVR的結(jié)合。
本發(fā)明的另外一個(gè)方面涉及一株穩(wěn)定分泌mTIGIT單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，其命名為mTIGIT-mAb-13G6，保藏編號(hào)為CCTCC NO:C201299，于2012年9月25日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(地址:中國武漢，武漢大學(xué)，郵編:430072)。本發(fā)明的另外一個(gè)方面涉及篩選能夠表達(dá)特異性結(jié)合小鼠TIGIT的抗小鼠TIGIT的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株的方法，所述方法包括:mTIGIT與人Fe的融合蛋白mTIGIT-hFc的表達(dá)與純化，用mTIGIT-hFc免疫大鼠，取免疫后大鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤IR983F細(xì)胞融合，篩選雜交瘤細(xì)胞，其分泌的單克隆抗體能特異性高親和mTIGIT-hFc，將篩選得到的細(xì)胞株命名為mTIGIT-mAb-13G6，保藏編號(hào)為CCTCC NO:C201299。由細(xì)胞株mTIGIT-mAb-13G6分泌的抗小鼠TIGIT單克隆抗體能高效阻斷mTIGIT與mPVR的結(jié)合。另外，本發(fā)明所述的抗小鼠TIGIT單克隆抗體也稱為13G6單克隆抗體。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面涉及制備抗小鼠TIGIT單克隆抗體的方法，所述方法包括從保藏號(hào)為CCTCC NO:C201299的雜交瘤細(xì)胞株mTIGIT-mAb_13G6培養(yǎng)上清中或者從腹腔接種所述雜交瘤細(xì)胞株的裸鼠腹水中獲取所述單克隆抗體。本發(fā)明的另一方面涉及單克隆抗體對(duì)mTIGIT和mPVR結(jié)合的阻斷作用。用本發(fā)明的單克隆抗體檢測阻斷效率，結(jié)果顯示，單克隆抗體能高效的阻斷mTIGIT與mPVR的結(jié)合。本發(fā)明的另一方面涉及單克隆抗體在Western blot檢測mTIGIT中應(yīng)用。用本發(fā)明的單克隆抗體鑒定mTIGIT蛋白的表達(dá)，Western blot實(shí)驗(yàn)顯示:單克隆抗體能在Western blot水平用于檢測mTIGIT-hFc融合蛋白。本發(fā)明的另一方面涉及單克隆抗體在ELISA水平檢測mTIGIT的應(yīng)用。用本發(fā)明的單克隆抗體檢測不同濃度的mTIGIT-hFc，結(jié)果顯示:單克隆抗體能用于ELISA檢測mTIGIT-hFc 蛋白。本發(fā)明的另一方面涉及單克隆抗體能用于Flow Cytometry檢測mTIGIT。用本發(fā)明的單克隆抗體標(biāo)記可以用于標(biāo)記mTIGIT陽性細(xì)胞，而不標(biāo)記mTIGIT陰性細(xì)胞。表明本發(fā)明的單克隆抗體能用于Flow Cytometry檢測mTIGIT的表達(dá)。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的抗小鼠TIGIT的單克隆抗體在制備用于檢測mTIGIT的試劑盒中的應(yīng)用，所述試劑盒利用本發(fā)明所述的抗小鼠TIGIT的單克隆抗體通過Westernblot、ELISA 或 Flow Cytometry 來檢測 mTIGIT。本發(fā)明還涉及一種檢測mTIGIT的試劑盒，所述試劑盒包含本發(fā)明所述的抗小鼠TIGIT的單克隆抗體。本發(fā)明還涉及一種檢測mTIGIT的方法，所述方法包括下述步驟:(I)將本發(fā)明的單克隆抗體與待檢測的分離的細(xì)胞或該細(xì)胞的裂解液孵育，(2)判斷是否有陽性反應(yīng)。其中所述陽性反應(yīng)是指本發(fā)明的特異性抗mTIGIT抗體與待測樣品中mTIGIT的結(jié)合，所述陽性反應(yīng)可以通過免疫印記、ELISA或流式細(xì)胞術(shù)檢測進(jìn)行判斷。本發(fā)明中，術(shù)語“單克隆抗體的特異性”是指單克隆抗體識(shí)別抗原上的特定表位或者抗原決定簇并與之結(jié)合的性質(zhì)。術(shù)語“單克隆抗體的反 應(yīng)性”是指在合適的反應(yīng)條件下，單克隆抗體與抗原結(jié)合的能力。術(shù)語“細(xì)胞株”是指通過篩選或者有限稀釋方法，從原代培養(yǎng)物或者細(xì)胞系獲得的單細(xì)胞培養(yǎng)物。根據(jù)本發(fā)明的公開，選擇mTIGIT-hFc融合蛋白，按照本文描述的方法制備有特異性的單克隆抗體對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的，應(yīng)該視為包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。綜上所述，本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明提供了一種抗小鼠TIGIT的單克隆抗體的制備方法、鑒定及應(yīng)用，該單克隆抗體具有效價(jià)高，特異性好等優(yōu)點(diǎn)，且能高效阻斷mTIGIT與mPVR的結(jié)合，適用于不同標(biāo)本的檢測。本發(fā)明提供的單克隆抗體，可以廣泛用于Western blot、ELISA、f1wCytometry等不同手段檢測mTIGIT蛋白，為研究mTIGIT的功能提供了基礎(chǔ)?？s略語的含義:mTIGIT:小鼠 TIGIT(T cell Ig and ITIM domain)mPVR:小鼠 PVR(poliovirus receptor),小鼠 TIGIT 的配體


從下面結(jié)合附圖的詳細(xì)描述中，本發(fā)明的上述特征和優(yōu)點(diǎn)將更明顯，其中:圖1，載體 pcDNA3-mTIGIT_hFc 的構(gòu)建。圖2，mTIGIT-hFc融合蛋白表達(dá)、純化及鑒定，其中:圖2A，mTIGIT-hFc融合蛋白純化的鑒定結(jié)果；圖2B, mTIGIT-hFc 融合蛋白的 Western blot 鑒定結(jié)果；圖3，本發(fā)明的單克隆抗體純度鑒定結(jié)果。圖4，本發(fā)明的單克隆抗體特異性鑒定結(jié)果，其中:圖4A, Flow cytometry方法鑒定單克隆抗體對(duì)mTIGIT特異性的結(jié)果；l)293T-mTIGIT/hTIGIT/mCD226/mCD96 陽性率檢測2)本發(fā)明的單克隆抗體不識(shí)別細(xì)胞表面的hTIGIT/⑶226/⑶96分子圖4B，間接ELISA法驗(yàn)證單克隆抗體對(duì)mTIGIT的特異性的結(jié)果；圖4C, Western blot方法鑒定單克隆抗體對(duì)mTIGIT特異性的結(jié)果。圖5，本發(fā)明的單克隆抗體阻斷功能的鑒定結(jié)果，其中:圖5A，293T-mPVR轉(zhuǎn)染效率檢測；圖5B，本發(fā)明的單克隆抗體高效阻斷293T-mPVR和mTIGIT-hFc蛋白的結(jié)合；圖6,本發(fā)明的單克隆抗體用于Western blot檢測mTIGIT的結(jié)果。圖7，本發(fā)明的單克隆抗體用于ELISA檢測mTIGIT的結(jié)果。圖8，本發(fā)明的單克隆抗體用于FACS檢測mTIGIT的結(jié)果。A.本發(fā)明的單克隆抗體檢測293A-mTIGIT細(xì)胞表面的mTIGIT ；

B.商品化的流式抗體(Ant1-Mouse TIGIT Alexa IHliOrCR' 647, eBioscience, Cat.N0.50-9501)檢測 293A-mTIGIT 細(xì)胞表面的 mTIGIT。保藏說明分泌特異性抗小鼠TIGIT的單克隆抗體的大鼠雜交瘤細(xì)胞株mTIGIT-mAb-13G6于2012年9月25日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(地址:中國武漢，武漢大學(xué)，郵編:430072)，保藏編號(hào)為 CCTCC NO:C201299。
序列表說明
權(quán)利要求
1.一種特異性抗小鼠TIGIT的單克隆抗體，所述抗體由保藏號(hào)為CCTCC N0:C201299的大鼠雜交瘤細(xì)胞株mTIGIT-mAb-13G6分泌產(chǎn)生。
2.按照權(quán)利要求1所述的抗體,其亞型為IgG2a，K。
3.按照權(quán)利要求1所述的抗體，其能高效阻斷mTIGIT與mPVR的結(jié)合。
4.產(chǎn)生權(quán)利要求1所述單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株mTIGIT-mAb-13G6，其保藏號(hào)為CCTCC NO:C201299o
5.制備權(quán)利要求1所述的單克隆抗體的方法，所述方法包括從保藏號(hào)為CCTCCC201299的雜交瘤細(xì)胞株mTIGIT-mAb-13G6培養(yǎng)上清中或者從腹腔接種所述雜交瘤細(xì)胞株的裸鼠腹水中獲取所述單克隆抗體。
6.權(quán)利要求1的單克隆抗體在制備用于檢測mTIGIT的試劑盒中的應(yīng)用，所述試劑盒利用權(quán)利要求1的單克隆抗體通過Western blot、ELISA或Flow Cytometry來檢測mTIGIT。
7.一種檢測mTIGIT的試劑盒，所述試劑盒包含權(quán)利要求1所述的抗小鼠TIGIT的單克隆抗體。
8.一種檢測mTIGIT的方法，所述方法包括下述步驟:(1)將權(quán)利要求1所述的單克隆抗體與待檢測的分離的細(xì)胞或該細(xì)胞的裂解液孵育；(2)判斷是否有陽性反應(yīng)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述陽性反應(yīng)通過免疫印記、ELISA或流式細(xì)胞術(shù)檢測進(jìn)行判斷。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗小鼠TIGIT的單克隆抗體，本發(fā)明還涉及生產(chǎn)該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株mTIGIT-mAb-13G6(保藏編號(hào)CCTCC NOC201299)，本發(fā)明還涉及該單克隆抗體的制備方法及應(yīng)用，本發(fā)明的單克隆抗體能高效阻斷mTIGIT與mPVR的結(jié)合，可以用于Western blot、ELISA、Flow Cytometry檢測mTIGIT分子。
文檔編號(hào)G01N33/577GK103073644SQ201210590618
公開日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2012年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月31日
發(fā)明者孫汭, 畢嘉成, 張清, 鄭曉東, 田志剛, 魏海明 申請(qǐng)人:中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)