專利名稱：使用燒結(jié)金屬膜好氣培養(yǎng)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種在有用物質(zhì)的好氣發(fā)酵中，通過使用燒結(jié)金屬膜供給氧，提高好氣培養(yǎng)生產(chǎn)率的方法。
因而，為了提高對(duì)培養(yǎng)液的氧供給，已經(jīng)檢驗(yàn)了使用氧代替空氣作為供給氣體。然而，問題是需要產(chǎn)生氧的裝置并維護(hù)它們，且排出了相對(duì)于空氣具有較高氧濃度的氣體，這是因?yàn)樯踔潦枪┙o氧時(shí)，用常規(guī)的攪拌通氣方法也不可能獲得充足的氧供給。
此外，為了在通氣攪拌器中微細(xì)地分散所供給的空氣，可通過增加攪拌功率的方法提高供給氧的能力。然而，假如這樣的話，當(dāng)攪拌功率增加到超過限度時(shí)會(huì)發(fā)生空化作用(cavitation)，以致不能有效地利用所施加的功率來供給氧。
此外，通過增加通氣或內(nèi)部壓力來提高氧供給的方法也是已知的，但是該方法伴有的問題是高的壓力影響菌體的代謝，且需要大量的投資來提高壓縮機(jī)的能力。
而且，通過使液體循環(huán)而提高氧供給的裝置也已經(jīng)開始實(shí)際應(yīng)用了，如微細(xì)發(fā)泡泵(例如，JP-A-6-193600和JP-A-6-330888)，靜態(tài)混合器(例如，JP-A-5-15753)，微細(xì)發(fā)泡噴嘴(例如，JP-A-9-201520)。然而，問題是液體在培養(yǎng)罐中的循環(huán)導(dǎo)致循環(huán)管道中的不充分清洗，其引起細(xì)菌污染，且由于工業(yè)規(guī)模培養(yǎng)的循環(huán)量大，需要大的裝置作為循環(huán)泵。且，即使使用放置于內(nèi)部的靜態(tài)混合器或噴嘴，也會(huì)由于不充分的清洗而出現(xiàn)細(xì)菌污染問題，因?yàn)榛旌喜糠质敲芊庠诠艿乐械摹?br> 此外，在使用燒結(jié)金屬元件的培養(yǎng)方法中(JP-A-61-56070)，當(dāng)使用燒結(jié)金屬元件將空氣、富氧空氣或氧氣以微細(xì)氣泡形式分散并供給到培養(yǎng)罐中時(shí)，觀察到氧供給能力大大提高，但存在這樣一個(gè)問題，即在培養(yǎng)過程中，固體物質(zhì)粘附于該膜上，從而由于壓力損耗增加而不能繼續(xù)通氣，甚至是當(dāng)使用燒結(jié)金屬元件代替常規(guī)使用的通氣管道進(jìn)行通氣時(shí)也如此。
通常，在普通好氣培養(yǎng)中，為了用攪拌葉片進(jìn)行有效分散，用于供給氮源和控制pH值的氨氣是通過擴(kuò)散管供給到培養(yǎng)罐中來通氣的(例如，Malcolm V.Bartow，《化學(xué)工程》，July，70(1999)，DanielI.C，Wang等，《發(fā)酵和酶技術(shù)》，230(1979)，和Joji Takahashi著《生物產(chǎn)業(yè)中的裝置和器械》，10，版，日本生物產(chǎn)業(yè)協(xié)會(huì)(1987))。為了避免細(xì)菌污染和pH值不均勻，及由于氨氣的高溶解性所導(dǎo)致的可能出現(xiàn)的培養(yǎng)液在非工作時(shí)間回流的問題，很少通過與用于通氣的擴(kuò)散管不同的其它管單獨(dú)供給氨氣。然而，當(dāng)常規(guī)好氣培養(yǎng)方法所用的擴(kuò)散管變?yōu)闊Y(jié)金屬元件并供給氨，進(jìn)行好氣培養(yǎng)時(shí)，本發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)，由于膜表面粗糙而使固體物質(zhì)粘附，且通氣時(shí)的壓力損耗增加，因而不可能在目前壓縮機(jī)的排出壓力條件下繼續(xù)通氣，且膜的使用應(yīng)當(dāng)在培養(yǎng)當(dāng)中停止。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是完善一種培養(yǎng)裝置和培養(yǎng)方法，通過把燒結(jié)金屬膜作為擴(kuò)散管裝備在目前的通氣攪拌器上，能夠使氧供給速率提高60％或更多，并同時(shí)供給氨，且能夠在沒有膜阻塞和細(xì)菌污染問題的情況下進(jìn)行培養(yǎng)。
本發(fā)明此目的和其它目的已經(jīng)通過同時(shí)供給氨和氧的好氣培養(yǎng)方法而實(shí)現(xiàn)，該方法包括通過附著在擴(kuò)散管末端的燒結(jié)金屬膜將空氣、氧或其混合氣體分散并供給到培養(yǎng)罐中，且同時(shí)，通過不同于上述擴(kuò)散管的其它擴(kuò)散管將氨或氨與空氣的混合氣體分散并供給到培養(yǎng)罐中。
圖2顯示比較實(shí)施例1所用的培養(yǎng)裝置圖。
發(fā)明詳述由于對(duì)膜阻塞原因的廣泛研究，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，由于供給氨所導(dǎo)致的固體物質(zhì)對(duì)膜外表面的粘附引起燒結(jié)金屬膜的阻塞。
為了在供給高氧濃度的條件下使用燒結(jié)金屬膜繼續(xù)培養(yǎng)，通過不同于用于供給氧或空氣的擴(kuò)散管的另一支擴(kuò)散管供給氨，避免了燒結(jié)金屬膜的阻塞。因而，本發(fā)明人已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明。
更優(yōu)選地，為了防止氨氣在非工作時(shí)間回流，本發(fā)明涉及一種好氣培養(yǎng)方法，其中通過擴(kuò)散管持續(xù)供給微量的空氣。
本發(fā)明的好氣培養(yǎng)包括氨基酸發(fā)酵、核酸發(fā)酵、酵母發(fā)酵和霉菌發(fā)酵。氨基酸發(fā)酵的實(shí)例包括谷氨酸發(fā)酵、賴氨酸發(fā)酵、精氨酸發(fā)酵等。核酸發(fā)酵的實(shí)例包括肌苷發(fā)酵、鳥苷發(fā)酵等。此外，該培養(yǎng)還可以在普通方法的條件下進(jìn)行。
對(duì)將被培養(yǎng)的菌體沒有特別的限制，只要它們能夠在好氣條件下生長(zhǎng)。實(shí)例包括細(xì)菌、酵母、細(xì)胞等。
為了將所供給的氨有效地分散到培養(yǎng)罐中，優(yōu)選從具有大剪切力的較低葉片下部供給氨氣。通過燒結(jié)金屬膜供給的空氣的通氣量是根據(jù)所需氧量而變化的，但優(yōu)選占總通氣量的10-80％?？諝獾钠溆嗖糠质桥c氨一起通過常規(guī)擴(kuò)散管而供給的。在表1中列出一個(gè)實(shí)施例。
表1常規(guī)的 膜通氣量(Nm3/min) 25 85氨的量(Nm3/min) 50本發(fā)明中使用的燒結(jié)金屬膜具有多孔結(jié)構(gòu)，是這樣制造的，在壓力條件下，使具有均勻粒徑分布的金屬粉末成形，并燒結(jié)它。對(duì)制造燒結(jié)金屬膜的方法沒有特別的限制，且該方法的條件可由普通技術(shù)人員用普通的方法輕松選擇。金屬粉末在高于6,000kg/cm2G的壓力罐中加壓，然后在真空燒結(jié)爐中1,200℃和10-3Torr下燒結(jié)。該燒結(jié)金屬膜的熱阻和強(qiáng)度比聚合物膜和陶瓷膜卓越，因而廣泛地用作石油精煉和化學(xué)工業(yè)中的過濾器。
本發(fā)明所用燒結(jié)金屬膜的材料可選自鎳、不銹鋼、鉻鎳鐵合金、鈦等。觀察到各金屬材料間的氧供給能力沒有差異?？紤]到機(jī)械強(qiáng)度、化學(xué)阻力、熱沖擊阻力和成本的原因，優(yōu)選由不銹鋼制造的膜。
對(duì)燒結(jié)金屬膜的形狀沒有特別的限制，可以是二維結(jié)構(gòu)或三維結(jié)構(gòu)。該形狀的實(shí)例包括扁平的、彎曲的、球形的、類似圓柱狀的、圓錐狀的、立方體的和多面體的形狀等。
對(duì)燒結(jié)金屬膜的厚度沒有特別的限制，只要空氣、氧或其混合氣體能夠穿透該燒結(jié)金屬膜。考慮到膜的強(qiáng)度和由于通氣的壓力降，通常使用1.0至10mm的膜厚度。
優(yōu)選燒結(jié)金屬膜的孔徑和通氣的線速度分別為1至20μm和0.04至0.11m/s(15至400m/Hr)，如同微細(xì)發(fā)泡型通氣器那樣(JP-A-61-56070等)，更優(yōu)選分別為約5μm和約0.04m/s。
常常將空氣用作好氣培養(yǎng)的氣體，但是當(dāng)需要較高的氧供給能力時(shí)，可使用通過氧發(fā)生裝置等產(chǎn)生的富氧空氣、純氧等。


圖1表示其中已經(jīng)裝有膜的培養(yǎng)裝置，作為培養(yǎng)裝置的一個(gè)實(shí)施例，用于使用本發(fā)明的燒結(jié)金屬膜進(jìn)行好氣培養(yǎng)的高度需氧培養(yǎng)。下面將進(jìn)一步解釋圖1。
圖1是在進(jìn)行下述實(shí)施例時(shí)的培養(yǎng)裝置縱剖圖。在培養(yǎng)罐1中裝有培養(yǎng)液21，且用于擴(kuò)散管的常規(guī)供氣管2位于下部。另一方面，用于排出在培養(yǎng)罐1中形成的氣泡3的排氣管4位于上部。用于控制pH值的氨是通過管14供給的。為了防止氨回流，回流停止閥17位于供給氨的管14和與燒結(jié)金屬膜18連接的管19之間。提供燒結(jié)金屬膜18的位置最好是該膜完全浸在液體中，且該位置應(yīng)盡可能的低。通過管15，將壓縮空氣供給到常規(guī)的擴(kuò)散管2和與燒結(jié)膜連接的擴(kuò)散管19中。用于滅菌的蒸汽管16與常規(guī)的擴(kuò)散管2和燒結(jié)金屬膜的擴(kuò)散管19連接。排氣管4與旋流器5連接，而旋流器5經(jīng)由液體再循環(huán)管11與培養(yǎng)罐連接。而且，排氣管10與旋流器7連接，而旋流器7經(jīng)由再循環(huán)管12與培養(yǎng)罐連接。同時(shí)，液體再循環(huán)管11當(dāng)然可以與再循環(huán)管12連接。6是排氣管，8是攪拌葉片，9是攪拌發(fā)動(dòng)機(jī)，13是消泡劑加入管，20是加入糖類的供給管。
從培養(yǎng)罐1的下部引入的空氣是用攪拌葉片剪切的，且被分散成微細(xì)的氣泡。另一方面，將燒結(jié)金屬膜所供給的空氣供給到微細(xì)分散狀態(tài)的培養(yǎng)液中。在培養(yǎng)過程中，當(dāng)由于菌體代謝或氨基酸形成等原因而使pH值降低時(shí)，可通過常規(guī)的氣體入口管道供給氨，并用攪拌葉片剪切該氣體而控制pH值。
依靠本發(fā)明的培養(yǎng)裝置供給氧，能夠滿足菌體對(duì)氧的需求，還能夠進(jìn)行培養(yǎng)而不會(huì)有細(xì)菌污染的問題。且，通過在高菌體濃度下培養(yǎng)，可顯著地提高有用成分的生產(chǎn)率。
根據(jù)本發(fā)明，可在不降低用于實(shí)際生產(chǎn)的培養(yǎng)罐產(chǎn)量的條件下，大大提高生產(chǎn)率。該培養(yǎng)可在沒有細(xì)菌污染發(fā)生的情況下，以較短的培養(yǎng)周期進(jìn)行。因而，帶來了每個(gè)單位時(shí)間靶物質(zhì)的生產(chǎn)增加，且從而提高了生產(chǎn)率的優(yōu)點(diǎn)。
下面將基于實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的解釋。
表2磷酸二氫鉀3g/L脲4g/L七水合硫酸鎂 0.5g/L七水合硫酸鐵(II) 20mg/L四水合硫酸錳 20mg/L鹽酸硫胺素200μg/L大豆蛋白水解物5mL/L(總氮含量40g/L)生物素30μg/L依靠附著有由SUS 316L制成的燒結(jié)金屬膜的培養(yǎng)裝置進(jìn)行培養(yǎng)。使用孔徑為5μm的燒結(jié)金屬膜，設(shè)置其表面積以保持供給空氣的線速度為0.04m/s。通過控制閥控制通氣分布，以得到常規(guī)管道∶燒結(jié)金屬膜管道＝2∶8的比例。菌體所需的氧在培養(yǎng)開始后立即增加，開始后5小時(shí)，所溶解氧的濃度迅速降低。隨著降低，通過常規(guī)管道供給用于控制pH值的氨。約10小時(shí)后，最初加入的糖被消耗，糖濃度降低至3％或更小，所以開始加入糖。約12小時(shí)后，菌體消耗的氧達(dá)到最大值，然后觀察到其逐漸降低的趨勢(shì)。培養(yǎng)24小時(shí)后，當(dāng)培養(yǎng)液的量達(dá)到培養(yǎng)罐容積的76-80％時(shí)，終止培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，加入糖的速度未趕上消耗的速度，因而所溶解氧的濃度總是3ppm或更多。培養(yǎng)液最終的量達(dá)到240kL，并得到86g/L的谷氨酸。在培養(yǎng)過程中，觀察到系統(tǒng)外的發(fā)泡現(xiàn)象，但該發(fā)泡可用常規(guī)的消泡方法來抑制，以至于能夠進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)液不會(huì)從置于培養(yǎng)罐排出口的旋流器中流出。此外，不需要通過攪拌葉片剪切所供給的氣體，因此，僅為常規(guī)方法所需的約60％的攪拌功率就可進(jìn)行培養(yǎng)。比較實(shí)施例1為了與實(shí)施例1進(jìn)行比較，使用圖2所示沒有安裝燒結(jié)金屬膜的培養(yǎng)裝置進(jìn)行培養(yǎng)。所有通氣均是通過常規(guī)管道進(jìn)行的。用相同濃度的糖蜜，在與實(shí)施例1相同的培養(yǎng)條件下進(jìn)行乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC 13869的培養(yǎng)。同實(shí)施例1一樣，大約在培養(yǎng)開始后5小時(shí)，所溶解的氧迅速減少。培養(yǎng)10小時(shí)后，開始加入糖。為了將所溶解氧的濃度控制在1.6ppm，糖的加入速度低于實(shí)施例1的速度。約12小時(shí)之后，氧的需求達(dá)到最大值，但其值是實(shí)施例1值的60％。培養(yǎng)40小時(shí)后，當(dāng)培養(yǎng)液的量達(dá)到培養(yǎng)罐容積的78％時(shí)，終止培養(yǎng)。培養(yǎng)液的最終量達(dá)到240kL，并得到84g/L的谷氨酸。
表3表示在實(shí)施例1和比較實(shí)施例1中所得結(jié)果的概述。
表3
本申請(qǐng)基于2000年12月26日提交的日本申請(qǐng)No.2000-396200，其全部?jī)?nèi)容均引用在此作為參考。
已經(jīng)詳細(xì)地并參考其具體的實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，在不背離本發(fā)明精神和范圍的情況下，其中各種變化和修改對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說均是顯而易見的。在這里引證的所有參考文獻(xiàn)均是全文引用的。
權(quán)利要求
1.一種同時(shí)供給氨和氧的好氣培養(yǎng)方法，包括通過附著在擴(kuò)散管末端的燒結(jié)金屬膜將空氣、氧或其混合氣體分散并供給到培養(yǎng)罐中，且同時(shí)，通過不同于上述擴(kuò)散管的擴(kuò)散管將氨或氨與空氣的混合氣體分散并供給到培養(yǎng)罐中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中燒結(jié)金屬膜是選自鎳、不銹鋼、鉻鎳鐵合金和鈦的金屬燒結(jié)膜。
全文摘要
一種同時(shí)供給氨和氧的好氣培養(yǎng)方法,包括:通過附著在擴(kuò)散管末端的燒結(jié)金屬膜將空氣、氧或其混合氣體分散并供給到培養(yǎng)罐中,且同時(shí),通過不同于上述擴(kuò)散管的擴(kuò)散管將氨或氨和空氣的混合氣體分散并供給到培養(yǎng)罐中。
文檔編號(hào)C12N1/20GK1362512SQ0114475
公開日2002年8月7日 申請(qǐng)日期2001年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月26日
發(fā)明者岡田篤, 寺谷貴孝, 門田尚洋, 伊藤壽夫, 佐藤一博 申請(qǐng)人:味之素株式會(huì)社