專利名稱：重組葡激酶(126)及其基因高效表達工程菌株的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種重組葡激酶(126)及其基因高效表達工程菌株，屬于生物工程技術領域。
背景技術：
心腦血管疾病是一種普遍的多發(fā)病，危害性極大。
葡激酶Sak是來源于金黃色葡萄球菌的一種非酶蛋白。它象鏈激酶SK一樣，與纖溶酶原結合形成復合物，去催化纖溶酶原轉化為纖溶酶，然后對血纖維蛋白進行水解。Sak優(yōu)先選擇與血栓上的纖溶酶原結合，水解其中的血纖維蛋白，當血漿中不存在血栓時，血纖維蛋白溶酶則被血漿中的(α-AP)中和，不降低凝血系統(tǒng)中的纖維蛋白原，不易引起全身性溶血。具有分子量小、滲透性好、溶栓速度快、副作用小等特點。用于心肌梗塞、腦栓塞、肺栓塞等疾病的治療。
成熟的葡激酶分子中含有136個氨基酸，肽鏈中沒有二硫鍵，對溶液中成熟葡激酶分子構象研究表明，分子中有兩個相似大小的結構域，中心距為3.7nm，分子形狀類似一個易變的“啞鈴”。葡激酶在分離過程中經常以三種形式存在成熟SaK，成熟SaK分子N-末端降解6個和10個氨基酸的產物，即Sak-M、SaK-Δ6和Sak-Δ10，Sak-ΔN10分子量更低，在與纖溶酶原作用過程中，效果更好。
已有藥理試驗表明，曾對100名急性心肌梗塞病人的臨床試驗中(52名患者使用r-tPA；48名患者使用r-SAK，其中25名10mg，23名20mg劑量)，比較了r-Sak兩個劑量(10mg和20mg)，20分鐘一次性滴注給藥與r-tPA(商品名Alteplase)治療效果。實驗結果表明，r-Sak動脈早期開通作用明顯。從開通的程度比較r-Sak最適劑量20mg，90分鐘內TIMI-3開通率較r-tPA高。另一項在30名外周動脈栓塞患者使用體內導管引導法進行r-Sak給藥，對r-Sak的溶栓效應，安全性及纖維蛋白專一性和在病人體內的免疫原性進行了研究。結果表明，r-Sak的溶栓有效性及動脈再通的結果非常好，r-Sak具有明顯的纖維蛋白專一性。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種分子量小、蛋白分子均一、抗原性小、專一性高、溶栓速度快、副作用小、性能穩(wěn)定的重組葡激酶(126)基因及高效表達工程菌株。
本發(fā)明所述的重組葡激酶(126)，其基因全DNA序列及其編碼的氨基酸為AAG GGC GAT GAC GCG AGT TAT TTT GAA CCALys Gly Asp Asp Ala Ser Tyr Phe Glu ProACA GGC CCG TAT TTG ATG GTA AAT GTG ACTThr Gly Pro Tyr Leu Met Val Asn Val ThrGGA GTT GAT GGT AAG GGA AAT GAA TTG CTAGly Val Asp Gly Lys Gly Asn Glu Leu LeuTCC CCT CGT TAT GTC GAG TTT CCT ATT AAASer Pro Arg Tyr Val Glu Phe Pro Ile LysCCT GGG ACT ACA CTT ACA AAA GAA AAA ATTPro Gly Thr Thr Leu Thr Lys Glu Lys IleGAA TAC TAT GTC GAA TGG GCA TTA GAT GCGGlu Tyr Tyr Val Glu Trp Ala Leu Asp AlaACA GCA TAT AAA GAG TTT AGA GTA GTT GAAThr Ala Tyr Lys Glu Phe Arg Val Val GluTTA GAT CCA AGC GCA AAG ATC GAA GTC ACTLeu Asp Pro Ser Ala Lys Ile Glu Val ThrTAT TAT GAT AAG AAT AAG AAA AAA GAA GAATyr Tyr Asp Lys Asn Lys Lys Lys Glu GluACG AAG TCT TTC CCT ATA ACA GAA AAA GGTThr Lys Ser Phe Pro Ile Thr Glu Lys GlyTTT GTT GTC CCA GAT TTA TCA GAG CAT ATTPhe Val Val Pro Asp Leu Ser Glu His IleAAA AAC CCT GGA TTC AAC TTA ATT ACA AAGLys Asn Pro Gly Phe Asn Leu Ile Thr LysGTT GTT ATT GAA AAG AAAVal ValIle Glu Lys Lys本發(fā)明所述的重組葡激酶(126)基因的高效表達工程菌株為pBVS126/DH5α菌種己由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)進行了保藏
保藏日期為2001.12.14保藏編號為No.0664分類命名為大腸埃希化菌本發(fā)明葡激酶用于心肌梗塞、腦栓塞、肺栓塞等疾病的治療。
重組葡激酶(126)基因的制備方法采用基因克隆技術，工藝過程如下以纖溶活性高的金黃色葡萄球菌為PCR擴增模板，將擴增出的葡激酶(126)基因片段插入pBV220載體質粒，轉化大腸桿菌，構建成重組葡激酶工程菌株。
其中擴增模板的篩選方法為取得金黃色葡萄球菌，接種于LB的液體培養(yǎng)基中，振蕩過夜，離心、收集上清，用于血纖維蛋白平板，培養(yǎng)，視為纖溶性陽性者，具有SaK活性，選其中纖溶活性最高的一株用作PCR擴增模板。
葡激酶(126)基因擴增方法為取金黃色葡萄球菌單菌落，接種于LB液體試管培養(yǎng)基中，振蕩過夜，離心、收集菌體，加入緩沖液，懸浮，煮沸，室溫下離心分離，上清直接用作PCR反應。
反應所用引物為上游引物(P-1)為5′CACGAATTCATGAAGGGCGATGACGCGAGT下游引物(P-2)為5′CACGGATCCTATTTCTTTTCAATAACAAC.
擴增反應步驟控制為92℃60秒50℃50秒72℃50秒30個循環(huán)，然后72℃延伸12分鐘。
葡激酶(126)基因的構建與鑒定方法為將PCR擴增產物和pUC19質粒載體以相同的內切酶水解，加入連接酶，保溫，轉化大腸桿菌，涂于平板上，培養(yǎng)過夜；取白色菌落，培養(yǎng)過夜，提取質粒，用內切酶雙酶解后，以瓊脂糖凝膠電泳檢查，證明獲得葡激酶pUC-SaK126重組質粒。
葡激酶(126)表達質粒的構建方法為將pUC-SaK126質粒雙酶解，以內切酶酶解的原核表達載體pBV220重組，轉化大腸桿菌DH5α，涂于平板，培養(yǎng)過夜；提取質粒，雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳檢查，視含Sak126基因特征片斷者，為表達質粒pBVS126。
重組葡激酶及其衍生物蛋白質的分離純化方法為細胞破碎，提取粗酶，超濾截流后，進行疏水層析得產品。
即將重組葡激酶或其衍生物發(fā)酵收集菌泥，經用上柱緩沖液懸浮，破碎細胞，離心收集上清，直接用于超濾。以50KD切向流膜包超濾截去約50％的雜蛋白，使粗酶液的純度達到80％以上。濾出液以NaCl溶液稀釋，直接上疏水層析柱，經階段洗脫，SDS-PAGE電泳分析，合并純品，純度可達95％以上，蛋白純品收率在80％以上。
工藝簡單，生產周期短，成本低，效率高，適合大規(guī)模工業(yè)化生產。
本發(fā)明未作說明解釋之處，按常規(guī)操作進行即可。
本發(fā)明重組葡激酶(126)基因分子量小、蛋白分子均一、抗原性小、專一性高、溶栓速度快、副作用小，性能穩(wěn)定，藥用效果好，本發(fā)明還提供了其高效表達工程菌株。本發(fā)明制備方法采用基因克隆技術，簡單易行，操作方便，能獲得高純度產品，生產周期短，效率高，適宜大規(guī)模工業(yè)化生產。


圖1、本發(fā)明pUC-126重組質粒的構建圖。
圖2、本發(fā)明pBVS126表達質粒的構建圖。
圖3、葡激酶126序列分析圖。
圖4、葡激酶126氨基酸N末端序列分析圖譜。
圖5、葡激酶126組成分析圖。
圖6、葡激酶126蛋白質等電點分析圖譜。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發(fā)明進一步說明。
本發(fā)明所述的重組葡激酶(126)，其基因全DNA序列及其編碼的氨基酸為AAG GGC GAT GAC GCG AGT TAT TTT GAA CCALys Gly Asp Asp Ala Ser Tyr Phe Glu ProACA GGC CCG TAT TTG ATG GTA AAT GTG ACTThr Gly Pro Tyr Leu Met Val Asn Val ThrGGA GTT GAT GGT AAG GGA AAT GAA TTG CTAGly Val Asp Gly Lys Gly Asn Glu Leu LeuTCC CCT CGT TAT GTC GAG TTT CCT ATT AAASer Pro Arg Tyr Val Glu Phe Pro Ile LysCCTGGG ACT ACA CTT ACA AAA GAA AAA ATTPro Gly Thr Thr Leu Thr Lys Glu Lys IleGAATAC TAT GTC GAA TGG GCA TTA GAT GCGGlu Tyr Tyr Val Glu Trp Ala Leu Asp AlaACAGCA TAT AAA GAG TTT AGA GTA GTT GAAThr Ala Tyr Lys Glu Phe Arg Val Val GluTTAGAT CCA AGC GCA AAG ATC GAA GTC ACTLeu Asp Pro Ser Ala Lys Ile Glu Val ThrTATTAT GAT AAG AAT AAG AAA AAA GAA GAATyr Tyr Asp Lys Asn Lys Lys Lys Glu GluACGAAG TCT TTC CCT ATA ACA GAA AAA GGTThr Lys Ser Phe Pro Ile Thr Glu Lys GlyTTTGTT GTC CCA GAT TTA TCA GAG CAT ATTPhe Val Val Pro Asp Leu Ser Glu His IleAAAAAC CCT GGA TTC AAC TTA ATT ACA AAGLys Asn Pro Gly Phe Asn Leu Ile Thr LysGTTGTT ATT GAA AAG AAAVal Val Ile Glu Lys Lys重組葡激酶(126)基因的高效表達工程菌株為pBVS126/DH5α制備方法如下1、擴增模板的篩選從醫(yī)院外科包扎傷口的繃帶上分離到20株金黃色葡萄球菌，分別接種于LB的液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩過夜，4℃，5000rpm離心，收集上清，取10μl于人血纖維蛋白平板，37℃，培養(yǎng)16h，觀測其周圍是否有溶解圈，有溶解圈的為纖溶活性陽性，纖溶活性大小與溶解圈大小成正比。共獲得5株具有SaK活性，選其中纖溶活性最高的一株(J-7)用作PCR擴增模板。2、引物設計及葡激酶126基因擴增根據已知葡激酶序列，設計一對引物，用該引物擴增出的葡激酶基因片段，為不含信號肽，且在成熟的葡激酶前缺失10個氨基酸殘基的葡激酶基因。
上游引物(P-1)為5′CACGAATTCATGAAGGGCGATGACGCGAGT；
下游引物(P-2)為5′CACGGATCCTATTTCTTTTCAATAACAAC.
取金黃色葡萄球菌J-7單菌落，接種于LB液體試管培養(yǎng)基中，37℃振蕩過夜。取菌液100μl，4℃，5000rpm離心5分鐘，收集菌體。加入TE(pH8.0)緩沖液50μl，懸浮，于100℃，煮沸3分鐘，室溫，10000rpm，離心5分鐘，上清直接用作PCR反應ddH2O31μl10×PCR緩沖液5μldNTP(2.5mmol)4μl引物P-1(50pmol) 2μl引物P-2(50pmol) 2μlJ-7(金葡菌)模板 5μl混勻，95℃變性5分鐘，加入1μl(2.5u/μl)的TaqDNA聚合酶，振蕩、離心，放入PCR擴增儀，按以下步驟進行反應92℃ 60秒50℃ 50秒72℃ 50秒共30個循環(huán)，然后72℃延伸12分鐘。取5μl PCR反應物，以1.2％瓊脂糖電泳檢查，出現(xiàn)380bp左右的DNA片斷。
3、葡激酶126基因的構建與鑒定將PCR擴增產物和pUCl9質粒載體以相同的限制性內切酶(EcoRI-BamHI)水解后，加入T4DNA連接酶反應體系，16℃保溫10h，轉化大腸桿菌JM109，涂于Xgal-IPTG-LB(含AmP)平板上，37℃培養(yǎng)過夜。取白色菌落，接入LB(含Ap)的液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，提取質粒，用限制性內切酶(EcoRI-BamHI)雙酶解后，以1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢查，可見380bp左右的DNA片斷出現(xiàn)，證明已獲得葡激酶126重組質粒(pUC-SaK126)。質粒構建如圖1所示。
4、葡激酶126表達質粒的構建將pUC-SaK126質粒以EcoRI-BamHI雙酶解后，以相同的限制性內切酶酶解的原核表達載體pBV220(含PRPL啟動子，CIts857基因等調空元件)重組，轉化大腸桿菌DH5α，涂于LB(含AmP)平板37℃，培養(yǎng)過夜。提取質粒，以EcoRI-BamHI雙酶切，1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢查，似含Sak126基因特征片斷者，為表達質粒pBVS126。并經上海基康生物公司自動分析測序儀3700型測定了核苷酸序列。表達質粒構建如圖2，序列測定如圖3。
5、葡激酶126的分離純化方法將重組葡激酶或其衍生物發(fā)酵液離心收集菌泥后，以濕重菌泥50g加入1000mlPBS(pH7.2)上柱緩沖液懸浮，按常規(guī)超聲破碎或高壓溶漿法破碎細胞，離心收集上清，直接用于PALL Maximate盒式過濾系統(tǒng)。以截流量50KD切向流膜包超濾。其方法如下濾器名稱及型號PALL公司盒式過濾系統(tǒng)Maximate型實驗技術參數(shù)及條件截流分子量50KD膜包介質Omega環(huán)境溫度10-15℃有效過濾面積0.19m2入口壓力30-20psig出口壓力20-15psig濾出液速率50-500ml/min按Maximate盒式過濾系統(tǒng)技術要求，將管道連接好，啟動蠕動泵，視其樣品濃度及粘度，調節(jié)進出口壓力。每塊膜包可允許每次超濾2-50L的樣品，一般5-10L的葡激酶粗酶液，只需1-2h即可超濾完畢。如果樣品量增大，只增加膜包就可以了，因為Maximate盒式過濾系統(tǒng)最多可同時夾6塊膜包，但超濾時間并不會延長，因為膜包與膜包為并聯(lián)通道模式，就葡激酶每次以30-100L的發(fā)酵罐菌泥所提粗酶液均可用此系統(tǒng)。使用起來非常方便。
以截流量50KD切向流膜包超濾截流可去掉約50％的葡激酶雜蛋白，使粗酶液的純度達到80％以上。所以我們用超濾截流的方法不僅達到了純化蛋白的目的，也省去了往常預過濾的煩瑣步驟，可謂一舉兩得。
切向過濾系統(tǒng)可重復地用于加工環(huán)境中，為了保證處理各批物料的效果可靠與穩(wěn)定，必須很恰當?shù)乇ｐB(yǎng)和使用膜包，在每次使用后按說明書要求及時進行清洗和保養(yǎng)。清洗膜的目的是為了將污垢從膜包和系統(tǒng)中去除，使膜的通透性恢復至起初的潔凈狀態(tài)。保證每次使用膜包維持其原有特性，防止細菌等其它微生物的生長。
用Maximate盒式過濾系統(tǒng)，不僅經濟，周期短，達到了預過濾和純化的雙重目的。
6、葡激酶126的鑒定將重組葡激酶126工程菌接種在LB(含Amp)液體培養(yǎng)基30℃振蕩培養(yǎng)5h，42℃繼續(xù)培養(yǎng)4h，取100μl培養(yǎng)液，室溫10000rpm，離心10min，去上清，沉淀加入50μlSDS-PAGE電泳緩沖液100℃煮沸5min，室溫10000rpm，離心10min。對照以大腸桿菌DH5α或誘導前培養(yǎng)液同樣方法處理。點樣10μl，依次為標準品、DH5α、誘導前、誘導后樣品兩組，走SDS-PAGE電泳，電泳結束后，用手術刀將SDS-PAGE電泳凝膠切開。一組用于考馬斯亮藍染色、脫色，可見誘導樣品在分子量14.5KD處有非常濃集的區(qū)帶，而對照樣品DH5α和誘導前培養(yǎng)液幾乎無此區(qū)帶。SDS-PAGE電泳凝膠經掃描分析，SAK126蛋白約占菌體總蛋白的50％。
另一組凝膠放在1.5mm厚的人血纖維蛋白平板上，37℃保溫60min，與考馬斯亮藍染色凝膠對照，可見分子量14.5KD處有非常明顯的透明區(qū)帶，而對照樣品DH5 α和誘導前培養(yǎng)液均無透明區(qū)帶。由此可見重組葡激酶126產物具有纖溶活性。
結果分析(1)蛋白質N末端序列分析檢測標準及技術要求蛋白質N端分析方法，自動Edman降解儀器名稱及型號美國應用生物系統(tǒng)公司491蛋白序列分析儀分析測試結果將葡激酶126樣品上樣分析，得N末端15個氨基酸序列為M-K-G-D-D-A-S-Y-F-E-P-T-G-P-Y。分析圖譜如圖4所示。
(2)氨基酸組成分析檢測標準及技術要求氨基酸組成分析(OPA/FMOC)柱前衍生法儀器名稱及型號美國惠普公司HP1100氨基酸分析儀方法及條件以6N鹽酸于110℃水解24小時，旋轉蒸發(fā)至干，用飽和硼酸緩沖液定容，應用OPA/FMOC自動柱前衍生化方法測定氨基酸組成，外標法定量。其結果如下(單位mol/％)Asp 8.82Glu 11.60Ser 5.87Gly/His 14.58Thr 5.92Ala 7.80Arg 5.30Tyr 4.47
Cys 2.68Met 3.75Val 5.94Phe 5.37Ile 4.64Leu 5.72Lys 7.54氨基酸組成分析如圖5所示。(3)蛋白質等電點的測定檢測標準及技術要求毛細管等點聚焦方法儀器名稱及型號美國Beckman公司P/ACE5000型毛細管電泳儀實驗方法和條件使用Beckman公司的毛細管等點聚焦試劑盒，按照說明書的實驗方法和步驟進行測定。
毛細管50μm(I.D.)X27cm(有效柱長20cm)中性涂層柱，兩性電解質pH3-10。
聚焦陽極液91mmol/L H3PO4Gel液，聚焦陽極液20mmol/L NaOH，聚焦電壓13.75KV，聚焦時間2min檢測波長(UV)280nm，毛細管溫度20℃等電點Marker的pI分別為9.45、5.10、2.75。
實驗結果migration time(min)pI10.51 9.4522.54 sample23.91 smaple25.49 5.1033.96 2.75以標準等電點Marker的遷移時間(migratian time，MT)對等電點(pI)進行線性回歸，得回歸方程y＝a+bx其中a＝12.44，b＝-0.9999(n＝3)，將被測樣品的遷移時間帶入回歸方程計算，得到樣品的等電點為6.0(MT＝22.54min)和5.6(MT＝23.91min)。分析圖譜如圖6所示。本發(fā)明所述的重組葡激酶(126)，其基因全DNA序列及其編碼的氨基酸為AAG GGC GAT GAC GCG AGT TAT TTT GAA CCALys Gly Asp Asp Ala Ser Tyr Phe Glu ProACA GGC CCG TAT TTG ATG GTA AAT GTG ACTThr Gly Pro Tyr Leu Met Val Asn Val ThrGGA GTT GAT GGT AAG GGA AAT GAA TTG CTAGly Val Asp Gly Lys Gly Asn Glu Leu LeuTCC CCT CGT TAT GTC GAG TTT CCT ATT AAASer Pro Arg Tyr Val Glu Phe Pro Ile LysCCT GGG ACT ACA CTT ACA AAA GAA AAA ATTPro Gly Thr Thr Leu Thr Lys Glu Lys IleGAA TAC TAT GTC GAA TGG GCA TTA GAT GCGGlu Tyr Tyr Val Glu Trp Ala Leu Asp AlaACA GCA TAT AAA GAG TTT AGA GTA GTT GAAThr Ala Tyr Lys Glu Phe Arg Val Val GluTTA GAT CCA AGC GCA AAG ATC GAA GTC ACTLeu Asp Pro Ser Ala Lys Ile Glu Val ThrTAT TAT GAT AAG AAT AAG AAA AAA GAA GAATyr Tyr Asp Lys Asn Lys Lys Lys Glu GluACG AAG TCT TTC CCT ATA ACA GAA AAA GGTThr Lys Ser Phe Pro Ile Thr Glu Lys GlyTTT GTT GTC CCA GAT TTA TCA GAG CAT ATTPhe Val Val Pro Asp Leu Ser Glu His IleAAA AAC CCT GGA TTC AAC TTA ATT ACA AAGLys Asn Pro Gly Phe Asn Leu Ile Thr LysGTT GTT ATT GAA AAG AAAVal Val Ile Glu Lys Lys
權利要求
1.一種重組葡激酶(126)，其特征在于其基因全DNA序列為AAG GGC GAT GAC GCG AGT TAT TTT GAA CCA ACA GGC CCG TAT TTGATG GTA AAT GTG ACT GGA GTT GAT GGT AAG GGA AAT GAA TTG CTATCC CCT CGT TAT GTC GAG TTT CCT ATT AAA CCT GGG ACT ACACTT ACA AAA GAA AAA ATT GAA TAC TAT GTC GAA TGG GCA TTA GATGCG ACA GCA TAT AAA GAG TTT AGA GTA GTT GAA TTA GAT CCA AGCGCA AAG ATC GAA GTC ACT TAT TAT GAT AAG AAT AAG AAA AAA GAAGAA ACG AAG TCT TTC CCT ATA ACA GAA AAA GGT TTT GTT GTC CCAGAT TTA TCA GAG CAT ATT AAA AAC CCT GGA TTC AAC TTA ATT ACAAAG GTT GTT ATT GAA AAG AAA
2.根據權利要求1所述的重組葡激酶(126)基因的高效表達工程菌株為pBVS126/DH5α
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組葡激酶(126)及其基因高效表達工程菌株，屬于生物工程技術領域。重組葡激酶(126)基因分子量小、蛋白分子均一、抗原性小、專一性高、溶栓速度快、副作用小，性能穩(wěn)定，藥用效果好，本發(fā)明還提供了其高效表達工程菌株。用于心肌梗塞、腦栓塞、肺栓塞等疾病的治療。
文檔編號C12N1/21GK1394958SQ0114424
公開日2003年2月5日 申請日期2001年12月14日 優(yōu)先權日2001年12月14日
發(fā)明者趙玉山, 崔維初, 苗得足, 李廣 申請人:山東瑞陽制藥有限公司