專利名稱：含親水納米鉑顆粒和憎水二氧化硅顆粒的復(fù)合酶功能敏感膜及其制法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于酶生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及高敏度、高穩(wěn)定性含親水納米鉑顆粒和憎水納米二氧化硅顆粒的復(fù)合酶功能敏感膜及其制法和用途。
背景技術(shù)：
利用酶生物工程制造出的產(chǎn)品，廣泛用于人體及工業(yè)中，例如利用葡萄糖氧化酶組裝的葡萄糖生物傳感器，可用于測量人的血糖、工業(yè)廢水、發(fā)酵或飲料中的糖分。生物傳感器具有非常明顯的優(yōu)點，如高專一性、短時低費用分析、對分析物質(zhì)沒有特殊的要求、操作安全、便于現(xiàn)場測定等等，在許多國家已有很多成果。傳感器研究工作者都了解，研制酶生物傳感器，其中是研制以高效率工作的分子識別反應(yīng)的生物傳感器單元，對此追求的目標(biāo)是靈敏、價廉、微型化。但是生物傳感器發(fā)展至今，能進入實際使用的為數(shù)不多。以葡萄糖生物傳感器為例，葡萄糖生物傳感器工作時通常是基于對葡萄糖氧化酶催化氧化葡萄糖時產(chǎn)生的過氧化氫的電流進行檢測。這種方法有如下局限溶氧的濃度不是足夠大時，難以對高含量底物進行測定；而酶用量過多時響應(yīng)電流傳遞效率低。近年來，金屬、金屬氧化物半導(dǎo)體納米顆粒奇特的物理特性引起人們的注意。納米顆粒當(dāng)小到一定尺寸時，具有與其相應(yīng)塊體材料所不具有的新性質(zhì)和新效應(yīng)，如表面效應(yīng)、體積效應(yīng)、隧道效應(yīng)、量子效應(yīng)等。由于其表面效應(yīng)，金屬顆粒表面帶有很高的負電荷，易于通過表面修飾調(diào)控光學(xué)、電學(xué)特性等，引起人們極大的興趣和關(guān)注。其中金屬顆粒導(dǎo)電性較佳，可在酶與電極間傳遞電子。提高固定化酶的催化活性。美國A.L.Crumbliss.等人曾引入親水的金顆粒到生物傳感器中，證明了金顆粒的生物相容性，但他們用的是50納米的親水金顆粒，對酶電極的電流響應(yīng)敏感度沒有幫助，這在《生物技術(shù)和生物工程》雜志，1992年，40卷，483-490頁的文章“適用于作為電沉析法組裝酶電極的一種生物相容性固定介質(zhì)—膠體金”已有報道(A.L.Crumbliss，S.C.Perine，J.Stonehuemer，K.P.Tubergen，Junguo Zhao and R.W.Henkens，Biotechnology and Bioengineering，Vol.40 P.483-490(1992))。
中國專利申請97116989.6中報道了含憎水納米金顆粒的氧化酶功能復(fù)合敏感膜，將通常含葡萄糖氧化酶的酶膜電極電流響應(yīng)靈敏度提高了十幾倍。目前生物傳感器的研究正向著高性能、微型化、走入家庭方向發(fā)展，是一種被普遍認為最有可能形成產(chǎn)業(yè)的高技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于將納米鉑顆粒和納米二氧化硅顆粒引入復(fù)合酶功能敏感膜中，提供一種能夠節(jié)約酶用量、提高酶生物傳感器電流響應(yīng)靈敏度的含親水納米鉑顆粒和憎水納米二氧化硅顆粒的復(fù)合酶功能敏感膜。與一般的高分子復(fù)合酶功能敏感膜不同，這種含納米溶膠的復(fù)合酶功能敏感膜，酶的用量僅是通常用量的幾分之一，而提高酶生物傳感器的電流響應(yīng)敏感度幾十倍。
本發(fā)明的再一目的是提供一種含親水納米鉑顆粒和憎水納米二氧化硅顆粒的復(fù)合酶功能敏感膜制法。
本發(fā)明的另一目的是提供一種含親水納米鉑顆粒和憎水納米二氧化硅顆粒的復(fù)合酶功能敏感膜的用途。
本發(fā)明的目的是通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)的本發(fā)明的含親水納米鉑顆粒和憎水二氧化硅顆粒的復(fù)合酶功能敏感膜是由固定化氧化酶的高分子膜基質(zhì)、親水納米鉑顆粒和憎水納米二氧化硅顆粒組成，其中，高分子∶二氧化硅∶鉑的重量比為1∶8.13×10-7∶2.48×10-6～1∶2.0×10-1∶6×10-1，含有氧化酶0.1～120活力單位，納米鉑溶膠粒徑為1～25nm，二氧化硅溶膠粒徑為1～50nm。
所述的納米鉑溶膠粒徑優(yōu)選為1～12nm，二氧化硅溶膠粒徑優(yōu)選為1～30nm。
所述的氧化酶是葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、醇氧化酶或黃嘌呤氧化酶等。
所述的高分子物質(zhì)為醋酸纖維素、聚乙烯醇縮丁醛、聚氨脂、聚乙二醇、聚亞砜、聚脲或乙烯—乙烯醇共聚物等。
本發(fā)明的含納米鉑顆粒和納米二氧化硅顆粒溶膠的復(fù)合酶功能敏感膜的制備方法將納米鉑溶膠和納米二氧化硅溶膠與氧化酶水溶液混合；然后加入到高分子凝膠溶液中，攪拌均勻，再加入戊二醛進行交聯(lián)處理；其中，納米鉑溶膠的摩爾濃度為0.1×10-6～2.5×10-2mol/kg；納米二氧化硅溶膠的摩爾濃度為0.1×10-6～2.5×10-2mol/kg；氧化酶為2.5×103～5×105個活力單位/公斤；高分子的重量百分比濃度為0.5～5％；戊二醛的重量百分比濃度為0.01～2％；將上述混合溶液涂在固體載體上，室溫下，揮發(fā)掉溶劑，在固體載體表面形成一層含親水納米鉑顆粒和憎水納米二氧化硅顆粒的復(fù)合酶功能敏感膜。
其中納米鉑溶膠溶液為親水納米鉑溶膠溶液，二氧化硅溶膠溶液為憎水納米二氧化硅溶膠溶液。納米鉑溶膠粒徑為1～25nm，優(yōu)選為1～12nm，二氧化硅溶膠粒徑為1～50nm，優(yōu)選為1～30nm；氧化酶為葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、醇氧化酶或黃嘌呤氧化酶等；高分子為醋酸纖維素、聚乙烯醇縮丁醛、聚氨脂、聚乙二醇、聚亞砜、聚脲或乙烯—乙烯醇共聚物等；固體載體為鉑絲。
本發(fā)明采用溶膠—凝膠法制備親水納米鉑溶膠溶液(1).分別配制氯鉑酸、還原劑及保護劑的水溶液，其中，氯鉑酸和還原劑的摩爾濃度分別為1×10-6～5×10-1mol/kg和1×10-6～10mol/kg，保護劑的固體含量與水的體積比為0.01～10克/升。
(2).制備親水納米鉑溶膠溶液；在25～90℃下將步驟(1)的氯鉑酸水溶液與保護劑水溶液混合，體積比為1∶0.01～1∶10；再將此混合溶液和步驟(1)的還原劑水溶液分別加入到反應(yīng)容器中混合，其中，氯鉑酸與還原劑的摩爾比為1∶1～1∶70，混合溶液在攪拌下反應(yīng)0.5～2小時，即得到粒徑為1～25nm，優(yōu)選為1～12nm的親水納米鉑溶膠溶液，其摩爾濃度為1×10-6～10-2mol/Kg。
本發(fā)明采用反膠束法制備憎水納米二氧化硅溶膠溶液反膠束是指表面活性劑溶解在非極性有機溶劑中，當(dāng)其濃度超過臨界膠束濃度(CMC)時，形成親水極性頭朝內(nèi)，疏水鏈向外的液體顆粒結(jié)構(gòu)。反膠團的內(nèi)核可增溶大量的水分子和水可溶的電解質(zhì)及不同的化合物，形成的水核是一個很好的“微型反應(yīng)器”。
具體制備方法如下(1)配制表面活性劑的非極性有機溶劑溶液，其摩爾濃度為50～300毫摩爾/千克溶劑；(2)取氨水加入到體積0.01～1升的步驟(1)中配制好的表面活性劑的非極性有機溶劑溶液中，氨水的濃度及用量依據(jù)憎水納米二氧化硅的大小所要求的水與表面活性劑的摩爾比(RW值)來確定，RW值為1～14，得到氨水反膠束溶液。
反膠束內(nèi)的水核尺寸是由增溶水的量決定的，即RW值的大小代表了由表面活性劑所包圍的水核的直徑大小，隨RW值的增大，水核直徑增大，因此在水核內(nèi)進行化學(xué)反應(yīng)制備超細顆粒時，水核的尺寸直接限定顆粒尺寸的大小，是控制顆粒大小的最主要因素。
(3)制備憎水納米SiO2溶膠溶液，室溫下，將硅酸酯[Si(OR)4]加入到步驟(2)中的氨水反膠束溶液中，硅酸酯的濃度及用量依據(jù)憎水納米二氧化硅的濃度所要求的硅酸酯與表面活性劑的摩爾比(RE值)來確定，RE值為0.0001～0.1。攪拌下混合1～24小時，即得到粒徑在1～80納米，優(yōu)選為1～5Onm的憎水納米SiO2溶膠溶液，其摩爾濃度為1×10-5～10-2mol/Kg。
本發(fā)明的高分子凝膠溶液的制備將高分子物質(zhì)溶解在相應(yīng)的有機溶劑或水中，配成重量百分比濃度為0.5～5％的溶液。
所述的還原劑為對苯二胺、硼氫化鈉、檸檬酸、甲酰胺、乙醇或肼等。
所述的保護劑為聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纖維素、羥丙基纖維素或聚丙稀酸等。
所述的表面活性劑為非離子表面活性劑、陰離子表面活性劑或天然表面活性劑。
所述的非離子表面活性劑是烷基酚聚氧乙烯醚(TritonX，分子式為 n＝4-6，烷基R為C7～C9的烷基)系列、山梨醇脂肪酸酯、失山梨醇脂肪酸酯系列或Span80等。
所述的陰離子表面活性劑是二辛基琥珀酸酯磺酸鈉AOT等。
所述的天然表面活性劑是卵磷脂等。
所述的非極性有機溶劑為正己烷、環(huán)己烷、異辛烷或氯仿等。
所述的硅酸酯[Si(OR)4]中R是-CnH2n+1，n＝1～5，優(yōu)選為正硅酸四乙酯[Si(OC2H5)4]。
所述的有機溶劑為丙酮、乙醇或異丙醇等。
本發(fā)明的用途本發(fā)明所制備的含納米鉑顆粒和二氧化硅顆粒的復(fù)合氧化酶功能敏感膜，可用于酶生物傳感器、生物分離膜和生物催化工程。尤其是葡萄糖生物傳感器特別適用于人體中的血糖、工業(yè)廢水、培養(yǎng)液、發(fā)酵及飲料中糖分的測量等。
本發(fā)明的優(yōu)點及效果本發(fā)明所制備出的納米溶膠生物膜，具有常規(guī)有機生物膜不可比擬的優(yōu)越性。這一點從用本發(fā)明的膜做的生物傳感器電極就可看出。
將用上述方法制得的納米溶膠的葡萄糖氧化酶生物膜，涂在鉑絲上制成的電極作為工作電極，Ag/AgCl電極或甘汞電極做為參比電極，組成葡萄糖氧化酶生物傳感器。將葡萄糖氧化酶生物傳感器的雙電極置于pH值為6-7的磷酸鹽緩沖電池里，測其響應(yīng)電流，對應(yīng)于相應(yīng)的葡萄糖濃度(2-35mmol葡萄糖每升)做出電極電流響應(yīng)曲線。
由于此種生物傳感器電極酶膜對葡萄糖具有特征的響應(yīng)，因此它特別適用于人體中的血糖、工業(yè)廢水、發(fā)酵、飲料中糖分的測量等。
由于此種生物傳感器電極所用酶膜含有粒徑1-25納米，特別是1-12納米的溶膠，所以它的電極電流響應(yīng)比未引入納米溶膠的電極電流高幾十倍。且酶用量是通常用量的5～50分之一。如圖1所示曲線A是含納米溶膠的葡萄糖氧化酶電極對葡萄糖濃度做的電極電流響應(yīng)曲線，而曲線B是不含納米溶膠的葡萄糖氧化酶電極對葡萄糖濃度做的電極電流響應(yīng)曲線。曲線A的電流響應(yīng)值較曲線B的電流響應(yīng)值提高了40倍。
由于納米級的憎水二氧化硅溶膠的引入，憎水二氧化硅表面疏水鏈與葡萄糖氧化酶的疏水鏈作用，使葡萄糖氧化酶構(gòu)象變得更加穩(wěn)定，這種疏水作用的結(jié)果，也增加了葡萄糖氧化酶的靈敏度。同時，在與水混溶的高極性有機溶劑，如乙醇、甲醇、丙酮里，它同高分子凝膠共價固定在電極的表面上，仍保持很高的酶活性。而通常，親水的氧化酶在這些高極性有機溶劑里會很快失活，而失去催化活性。含有憎水納米二氧化硅溶膠的葡萄糖傳感器同時增加了氧化酶的吸附量，使其發(fā)揮更大作用，從而減少了葡萄糖氧化酶的用量。引入鉑溶膠，由于鉑溶膠的電子傳遞催化作用，每1ml高分子凝膠中僅用通常酶用量的幾—幾十分之一，即幾十個甚至幾個單位的葡萄糖氧化酶，就可以獲得幾千甚至幾萬納安/厘米2(nA/cm2)的響應(yīng)電流。另外，含納米溶膠的葡萄糖傳感器的穩(wěn)定性也大大提高，實驗連續(xù)測定80次，電極電流響應(yīng)結(jié)果很重復(fù)。而未引入納米溶膠的傳感器僅能重復(fù)測定7、8次左右。
從上述結(jié)果就可看出，本發(fā)明的生物膜特別適用于制造生物工程所用的產(chǎn)品，其效果具有突出的質(zhì)變。
總之，本發(fā)明有如下優(yōu)點1.制備方法簡單易行，不需化學(xué)后處理，易于推廣應(yīng)用。
2.由于納米級的鉑顆粒的引入，使產(chǎn)品的電性能較未引入納米溶膠的產(chǎn)品大大提高，所用酶量也比通常用量大大減少；而憎水二氧化硅納米顆粒的引入能增強產(chǎn)品的穩(wěn)定性，延長產(chǎn)品的使用壽命。綜合這兩者的作用，含納米鉑和二氧化硅溶膠的復(fù)合酶功能敏感膜的成本就大大降低了。
3.在有機溶劑，即使在有與水可混溶的有機溶劑里，仍可保證酶蛋白無損傷固定。


圖中曲線為“含親水納米鉑顆粒和憎水納米二氧化硅顆粒的復(fù)合酶功能敏感膜”。
圖1.電極響應(yīng)電流對應(yīng)于葡萄糖濃度關(guān)系曲線；橫坐標(biāo)—葡萄糖濃度(單位mmol/l)縱坐標(biāo)—響應(yīng)電流(單位nA/cm2)曲線A —含納米溶膠的葡萄糖傳感器對葡萄糖濃度做的電流響應(yīng)曲線曲線B —不含納米溶膠的葡萄糖傳感器對葡萄糖濃度做的電流響應(yīng)曲線圖2.實施例1中電流對應(yīng)于葡萄糖濃度關(guān)系曲線；橫坐標(biāo)—葡萄糖濃度(單位mmol/l)
縱坐標(biāo)—響應(yīng)電流(單位nA/cm2)曲線C —含納米溶膠的葡萄糖傳感器對葡萄糖濃度做的電流響應(yīng)曲線圖3.實施例2中電流對應(yīng)于葡萄糖濃度關(guān)系曲線橫坐標(biāo)—葡萄糖濃度(單位mmol/l)縱坐標(biāo)—響應(yīng)電流(單位nA/cm2)曲線D —含納米溶膠的葡萄糖傳感器對葡萄糖濃度做的電流響應(yīng)曲線圖4.實施例4中電流對應(yīng)于葡萄糖濃度關(guān)系曲線橫坐標(biāo)—葡萄糖濃度(單位mmol/l)縱坐標(biāo)—響應(yīng)電流(單位nA/cm2)曲線E —含納米溶膠的葡萄糖傳感器對葡萄糖濃度做的電流響應(yīng)曲線
具體實施例方式
第二步采用反膠束法制備憎水納米二氧化硅溶膠溶液①配制非離子表面活性劑TritonX-45的環(huán)己烷有機溶劑溶液，其摩爾濃度為200毫摩爾/千克溶劑。
②取氨水加入到體積0.1升的步驟①中的非極性有機溶劑溶液中，氨水的濃度及用量依據(jù)憎水納米二氧化硅的大小所要求的RW值為12。
③制備憎水納米SiO2溶膠溶液室溫下，將正硅酸四乙酯[Si(OC2H5)4]加入到步驟②中的氨水反膠束溶液中，加入量依據(jù)RE值為0.05，攪拌下混合6小時，即得到粒徑在25納米的憎水納米SiO2溶膠溶液，其重量摩爾濃度為5.8×10-3mol/kg。
第三步制備高分子的凝膠溶液將高分子物質(zhì)聚乙烯醇縮丁醛溶解在無水乙醇中，使得溶液的重量百分比濃度為2％；第四步制備含納米鉑顆粒和二氧化硅顆粒的復(fù)合氧化酶功能敏感膜將重量摩爾濃度為7×10-4mol/Kg的納米鉑溶膠溶液2.5ml與重量摩爾濃度為5.8×10-3mol/kg的納米二氧化硅溶膠溶液2.5ml混合，再同濃度為500個活力單位/毫升的氧化酶水溶液0.3ml混合；接著加入重量百分比濃度為2％的高分子凝膠溶液10ml，攪拌均勻，再加入重量百分濃度為1％的戊二醛1.2ml進行交聯(lián)處理；將上述混合溶液涂在固體載體鉑絲上，室溫下?lián)]發(fā)掉溶劑，在固體載體表面形成一層含納米溶膠的復(fù)合氧化酶功能敏感膜。
用Ag/AgCl電極做為參比電極，將雙電極置于5mlpH為6.86的磷酸鹽緩沖液電池里，測其基質(zhì)電流，然后依次加入2.8，5.6，11.1，16.7，22.2，27.8，33.3mmol/l濃度β-D葡萄糖水溶液，測其響應(yīng)電流(Y軸)，對應(yīng)于相應(yīng)的葡萄糖濃度(X軸)做出響應(yīng)曲線。如圖2所示，葡萄糖濃度為33mmol/l，電極響應(yīng)電流可達26679nA/cm2。而不含納米溶膠，但含相同酶用量的葡萄糖氧化酶電極的電極電流響應(yīng)僅1025nA/cm2。
第二步采用反膠束法制備憎水納米二氧化硅溶膠溶液
①配制陰離子表面活性劑二辛基琥珀酸鈉(AOT)的環(huán)己烷有機溶劑溶液，其摩爾濃度為100毫摩爾/千克溶劑；②取氨水加入到體積0.1升的步驟①中的非極性有機溶劑溶液中，氨水的濃度及用量依據(jù)憎水納米二氧化硅的大小所要求的RW值為4。
③制備憎水納米SiO2溶膠溶液，在25℃下將正硅酸四乙酯[Si(OC2H5)4]加入到步驟②中的氨水反膠束溶液中，加入量依據(jù)RE值為0.5，攪拌下混合10小時，即得到粒徑在50納米的憎水納米SiO2溶膠溶液，其摩爾濃度為2.9×10-2mol/kg。
第三步制備高分子的凝膠溶液將高分子物質(zhì)聚乙烯醇縮丁醛溶解在無水乙醇中，使得溶液的重量百分比濃度為2％；第四步制備含納米鉑顆粒和二氧化硅顆粒的復(fù)合氧化酶功能敏感膜將摩爾濃度為7×10-4mol/Kg的納米鉑溶膠溶液2ml與摩爾濃度為2.9×10-2mol/kg的納米二氧化硅溶膠溶液2ml混合，再同濃度為500個活力單位/毫升的氧化酶水溶液0.3ml混合；接著加入重量百分比濃度為2％的高分子凝膠溶液10ml，攪拌均勻，再加入重量百分濃度為1％的戊二醛2ml進行交聯(lián)處理；將上述混合溶液涂在固體載體鉑絲上，室溫下?lián)]發(fā)掉溶劑，在固體載體表面形成一層含納米溶膠的復(fù)合氧化酶功能敏感膜。
按實施例1的方式測其響應(yīng)電流，對應(yīng)于相應(yīng)的葡萄糖濃度做出響應(yīng)曲線D。如圖3所示，葡萄糖濃度為33mmol/l，電流極響應(yīng)電流可達59375nA/cm2。
第二步采用反膠束法制備憎水納米二氧化硅溶膠溶液①配制卵磷脂的氯仿有機溶劑溶液，其重量摩爾濃度為100毫摩爾/千克溶劑；②取氨水加入到體積0.1升的步驟①中的非極性有機溶劑溶液中，氨水的濃度及用量依據(jù)憎水納米二氧化硅的大小所要求的RW值為3。
③制備憎水納米SiO2溶膠溶液室溫下將正硅酸四乙酯[Si(OC2H5)4]加入到步驟②中的氨水反膠束溶液中，加入量依據(jù)RE值為0.01，攪拌下混合8小時，即得到粒徑在42納米的憎水納米SiO2溶膠溶液，其重量摩爾濃度為5.8×10-4mol/kg。
第三步制備高分子的凝膠溶液將高分子物質(zhì)聚氨脂溶解在還氧六烷中，使得溶液的重量百分比濃度為1％；第四步制備含納米鉑顆粒和二氧化硅顆粒的復(fù)合氧化酶功能敏感膜將摩爾濃度為7×10-4mol/Kg的納米鉑溶膠溶液5ml與摩爾濃度為5.8×10-4mol/kg的納米二氧化硅溶膠溶液5ml混合，再同濃度為500個活力單位/毫升的氧化酶水溶液0.6ml混合，接著加入重量百分比濃度為1％的高分子凝膠溶液10ml，攪拌均勻，再加入重量百分濃度為1％的戊二醛1ml進行交聯(lián)處理；將上述混合溶液涂在固體載體鉑絲上，室溫下?lián)]發(fā)掉溶劑，在固體載體表面形成一層含納米溶膠的復(fù)合氧化酶功能敏感膜。
按實施例1的方式測其響應(yīng)電流，葡萄糖濃度為33mmol/l，電流極響應(yīng)電流可達40097nA/cm2。
第二步采用反膠束法制備憎水納米二氧化硅溶膠溶液①配制陰離子表面活性劑二辛基琥珀酸鈉(AOT)的環(huán)己烷有機溶劑溶液，其摩爾濃度為200毫摩爾/千克溶劑；②取氨水加入到體積0.1升的步驟①中的非極性有機溶劑溶液中，氨水的濃度及用量依據(jù)憎水納米二氧化硅的大小所要求的RW值為6。
③制備憎水納米SiO2溶膠溶液在25℃-35℃下，將正硅酸四乙酯[Si(OC2H5)4]加入到步驟②中的氨水反膠束溶液中，加入量依據(jù)RE值為0.05，攪拌下混合5小時，即得到粒徑在35納米的憎水納米SiO2溶膠溶液，其摩爾濃度為5.8×10-3mol/kg。
第三步制備高分子的凝膠溶液將高分子物質(zhì)聚乙烯醇縮丁醛溶解在異丙醇中，使得溶液的重量百分比濃度為1％；第四步制備含納米鉑顆粒和二氧化硅顆粒的復(fù)合氧化酶功能敏感膜將摩爾濃度為3.5×10-4mol/Kg的納米鉑溶膠溶液10ml與摩爾濃度為5.8×10-3mol/kg的納米二氧化硅溶膠溶液10ml混合，再同濃度為500個活力單位/毫升的氧化酶水溶液1ml混合；接著加入重量百分比濃度為1％的高分子凝膠溶液10ml，攪拌均勻，再加入重量百分濃度為1％的戊二醛2ml進行交聯(lián)處理；將上述混合溶液涂在固體載體鉑絲上，室溫下?lián)]發(fā)掉溶劑，在固體載體表面形成一層含納米溶膠的復(fù)合氧化酶功能敏感膜。
按實施例1的方式測其響應(yīng)電流，對應(yīng)于相應(yīng)的葡萄糖濃度做出響應(yīng)曲線D。如圖4所示，葡萄糖濃度為33mmol/l，電流極響應(yīng)電流可達44465nA/cm2。
第二步采用反膠束法制備憎水納米二氧化硅溶膠溶液①配制非離子表面活性劑TritonX-45的己烷有機溶劑溶液，其摩爾濃度為300毫摩爾/千克溶劑；②取氨水加入到體積0.2升的步驟①中的非極性有機溶劑溶液中，氨水的濃度及用量依據(jù)憎水納米二氧化硅的大小所要求的RW值為16。
③制備憎水納米SiO2溶膠溶液在35℃下，將正硅酸四乙酯[Si(OC2H5)4]加入到步驟②中的氨水反膠束溶液中，加入量依據(jù)RE值為0.1，攪拌下混合18小時，即得到粒徑在9納米的憎水納米SiO2溶膠溶液，其摩爾濃度為3.5×10-2mol/kg。
第三步制備高分子的凝膠溶液將高分子物質(zhì)醋酸纖維素溶解在丙酮中，使得溶液的重量百分比濃度為1％；第四步制備含納米鉑顆粒和二氧化硅顆粒的復(fù)合氧化酶功能敏感膜將摩爾濃度為4.9×10-3mol/Kg的納米鉑溶膠溶液2ml與摩爾濃度為3.5×10-2mol/kg的納米二氧化硅溶膠溶液2ml混合，再同濃度為500個活力單位/毫升的氧化酶水溶液0.26ml混合；接著加入重量百分比濃度為1％的高分子凝膠溶液10ml，攪拌均勻，再加入重量百分濃度為1％的戊二醛2ml進行交聯(lián)處理；將上述混合溶液涂在固體載體鉑絲上，室溫下?lián)]發(fā)掉溶劑，在固體載體表面形成一層含納米溶膠的復(fù)合氧化酶功能敏感膜。
按實施例1的方式測其響應(yīng)電流，葡萄糖濃度為33mmol/l，電流極響應(yīng)電流可達31847nA/cm2。
分別配制氯鉑酸，檸檬酸鈉及聚乙烯吡咯烷酮的水溶液，氯鉑酸和檸檬酸鈉的摩爾濃度分別為1×10-5mol/Kg和7.9×10-4mol/Kg，聚乙烯吡咯烷酮的重量與溶劑的體積比為1克/升。30℃將氯鉑酸水溶液與羥丙基纖維素水溶液混合，體積比為1∶0.02，再將此混合溶液和檸檬酸鈉水溶液分別加入反應(yīng)容器中，其中氯鉑酸、水溶液及檸檬酸鈉水溶液的摩爾比為1∶15，混合溶液在攪拌下反應(yīng)1小時，即得到粒徑為10nm親水納米鉑溶膠溶液，其重量摩爾濃度為8.7×10-6mol/Kg。
第二步采用反膠束法制備憎水納米二氧化硅溶膠溶液①配制壬基酚聚氧乙烯醚(n＝6)的環(huán)己烷有機溶劑溶液，其摩爾濃度為50毫摩爾/千克溶劑；②取氨水加入到體積0.1升的步驟①中的非極性有機溶劑溶液中，氨水的濃度及用量依據(jù)憎水納米二氧化硅的大小所要求的RW值為10。
③制備憎水納米SiO2溶膠溶液室溫下將正硅酸四乙酯[Si(OC2H5)4]加入到步驟②中的氨水反膠束溶液中，加入量依據(jù)RE值為0.005，攪拌下混合16小時，即得到粒徑在15納米的憎水納米SiO2溶膠溶液，其重量摩爾濃度為1.5×10-4mol/kg。
第三步制備高分子的凝膠溶液將高分子物質(zhì)聚乙烯醇縮丁醛溶解在無水乙醇中，使得溶液的重量百分比濃度為2％；第四步制備含納米鉑顆粒和二氧化硅顆粒的復(fù)合氧化酶功能敏感膜將摩爾濃度為8.7×10-6mol/Kg的納米鉑溶膠溶液15ml與摩爾濃度為1.5×10-4mol/kg的納米二氧化硅溶膠溶液15ml混合，再同濃度為500個活力單位/毫升的氧化酶水溶液5ml混合；接著加入重量百分比濃度為2％的高分子凝膠溶液100ml，攪拌均勻，再加入重量百分濃度為10％的戊二醛2ml進行交聯(lián)處理；將上述混合溶液涂在固體載體鉑絲上，室溫下?lián)]發(fā)掉溶劑，在固體載體表面形成一層含納米溶膠的復(fù)合氧化酶功能敏感膜。
按實施例1的方式測其響應(yīng)電流，葡萄糖濃度為33mmol/l，電流極響應(yīng)電流可達21253nA/cm2。
權(quán)利要求
1.一種含親水納米鉑顆粒和憎水二氧化硅顆粒的復(fù)合酶功能敏感膜，其特征是膜是由固定化氧化酶的高分子膜基質(zhì)、親水納米鉑顆粒和憎水納米二氧化硅顆粒組成，其中，高分子∶二氧化硅∶鉑的重量比為1∶8.13×10-7∶2.48×10-6～1∶2.0×10-1∶6×10-1，含有氧化酶0.1～120活力單位，納米鉑溶膠粒徑為1～25nm，二氧化硅溶膠粒徑為1～50nm。
2.如權(quán)利要求1所述的復(fù)合酶功能敏感膜，其特征是所述的納米鉑溶膠粒徑為1～12nm，二氧化硅溶膠粒徑為1～30nm。
3.如權(quán)利要求1所述的復(fù)合酶功能敏感膜，其特征是所述的氧化酶是葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、醇氧化酶或黃嘌呤氧化酶。
4.如權(quán)利要求1所述的復(fù)合酶功能敏感膜，其特征是所述的高分子物質(zhì)為醋酸纖維素、聚乙烯醇縮丁醛、聚氨脂、聚乙二醇、聚亞砜、聚脲或乙烯—乙烯醇共聚物。
5.一種如權(quán)利要求1-4任意一項所述的含納米鉑顆粒和納米二氧化硅顆粒溶膠的復(fù)合酶功能敏感膜的制備方法，其特征是將親水納米鉑溶膠和憎水納米二氧化硅溶膠與氧化酶水溶液混合；然后加入到高分子凝膠溶液中，攪拌均勻，再加入戊二醛進行交聯(lián)處理；其中，親水納米鉑溶膠的摩爾濃度為0.1×10-6～2.5×10-2mol/kg；憎水納米二氧化硅溶膠的摩爾濃度為0.1×10-6～2.5×10-2mol/kg；氧化酶為2.5×103～5×105個活力單位/公斤；高分子凝膠的重量百分比濃度為0.5～5％；戊二醛的重量百分比濃度為0.01～2％；將上述混合溶液涂在固體載體上，室溫下?lián)]發(fā)掉溶劑，在固體載體表面形成一層含親水納米鉑顆粒和憎水納米二氧化硅顆粒的復(fù)合酶功能敏感膜。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征是所述的親水納米鉑溶膠是由下面方法得到的(1).分別配制氯鉑酸、還原劑及保護劑的水溶液，其中，氯鉑酸和還原劑的摩爾濃度分別為1×10-6～5×10-1mol/kg和1×10-6～10mol/kg，保護劑的固體含量與水的體積比為0.01～10克/升；(2).在25～90℃下將步驟(1)的氯鉑酸水溶液與保護劑水溶液混合，體積比為1∶0.01～1∶10；再將此混合溶液和步驟(1)的還原劑水溶液分別加入到反應(yīng)容器中混合，其中，氯鉑酸與還原劑的摩爾比為1∶1～1∶70，混合溶液在攪拌下反應(yīng)0.5～2小時，即得到粒徑為1～25nm的親水納米鉑溶膠溶液，其摩爾濃度為1×10-6～10-2mol/Kg。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征是所述的憎水納米二氧化硅溶膠是由下面方法得到的(1)配制表面活性劑的非極性有機溶劑溶液，其摩爾濃度為50～300毫摩爾/千克溶劑；(2)取氨水加入到體積為0.01～1升的步驟(1)的表面活性劑的非極性有機溶劑溶液中，氨水的濃度及用量依據(jù)憎水納米二氧化硅的大小所要求的水與表面活性劑的摩爾比RW值來確定，RW值為1～14，得到氨水反膠束溶液；(3)制備憎水納米二氧化硅溶膠溶液，室溫下，將硅酸酯加入到步驟(2)中的氨水反膠束溶液中，硅酸酯的濃度及用量依據(jù)憎水納米二氧化硅的濃度所要求的硅酸酯與表面活性劑的摩爾比RE值來確定，RE值為0.0001～0.1；攪拌下混合，即得到粒徑在1～80納米的憎水納米二氧化硅溶膠溶液，其摩爾濃度為1×10-5～10-2mol/Kg。
8.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征是所述的高分子的凝膠溶液是由下面方法制備得到的將高分子物質(zhì)溶解在有機溶劑或水中，配成重量百分比濃度為0.5～5％的溶液。
9.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征是所述的親水納米鉑溶膠粒徑為1～12nm。
10.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征是所述的憎水納米二氧化硅溶膠粒徑為1～50nm。
11.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征是所述的氧化酶為葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、醇氧化酶或黃嘌呤氧化酶；所述的固體載體為鉑絲。
12.如權(quán)利要求5或8所述的方法，其特征是所述的高分子為醋酸纖維素、聚乙烯醇縮丁醛、聚氨脂、聚乙二醇、聚亞砜、聚脲或乙烯—乙烯醇共聚物。
13.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征是所述的還原劑為對苯二胺、硼氫化鈉、檸檬酸、甲酰胺、乙醇或肼；所述的保護劑為聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纖維素、羥丙基纖維素或聚丙稀酸。
14.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征是所述的有機溶劑為丙酮、乙醇或異丙醇。
15.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征是所述的表面活性劑為非離子表面活性劑、陰離子表面活性劑或天然表面活性劑。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征是所述的非離子表面活性劑是烷基酚聚氧乙烯醚系列、山梨醇脂肪酸酯、失山梨醇脂肪酸酯系列或Span80；所述的陰離子表面活性劑是二辛基琥珀酸酯磺酸鈉；所述的天然表面活性劑是卵磷脂；所述的非極性有機溶劑為正己烷、環(huán)己烷、異辛烷或氯仿。
17.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征是所述的硅酸酯的分子式是Si(OR)4，其中R是-CnH2n+1，n＝1～5。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征是所述的硅酸酯是正硅酸四乙酯。
19.一種如權(quán)利要求1-4任意一項所述的含親水納米鉑顆粒和憎水二氧化硅顆粒的復(fù)合酶功能敏感膜的用途，其特征是所述的復(fù)合氧化酶功能敏感膜用于酶生物傳感器、生物分離膜和生物催化工程。
全文摘要
本發(fā)明屬于酶生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及高敏度、高穩(wěn)定性含親水納米鉑顆粒和憎水納米二氧化硅顆粒的復(fù)合酶功能敏感膜及其制法和用途。將親水納米鉑溶膠和憎水納米二氧化硅溶膠與氧化酶水溶液混合；然后加入到高分子凝膠溶液中，攪拌均勻，再加入戊二醛進行交聯(lián)處理；將上述混合溶液涂在固體載體表面上，在固體載體表面形成一層含親水納米鉑顆粒和憎水納米二氧化硅顆粒的復(fù)合酶功能敏感膜。本發(fā)明的酶膜能使生物產(chǎn)品酶用量減少，性能提高。用于生物傳感器，還可廣泛用于酶生物催化工程等。
文檔編號C12Q1/26GK1427074SQ0114456
公開日2003年7月2日 申請日期2001年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月21日
發(fā)明者唐芳瓊, 任湘菱, 孟憲偉 申請人:中國科學(xué)院理化技術(shù)研究所