專利名稱：用于膽固醇定量的試樣預(yù)處理方法和以該方法對特定脂蛋白中膽固醇定量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及試樣的預(yù)處理方法，用于以較少試樣通過簡單操作就可以正確、高效地分離定量存在于特定級分中的膽固醇，以及以此測定特定級分中膽固醇的方法。
就是說，從流行病學(xué)方面來說，已知LDL中的膽固醇值與動脈硬化性疾病的發(fā)病頻率呈正相關(guān)，而HDL中的膽固醇值與動脈硬化性疾病的發(fā)病頻率呈免相關(guān)。因此，如今，廣泛進(jìn)行LDL或HDL中的膽固醇測定以預(yù)防或診斷缺血性心臟疾病。
作為LDL或HDL中膽固醇的測定方法，已知有例如將LDL或HDL通過超速離心與其它脂蛋白分離以后，測定膽固醇的方法，或者利用電泳分離之后進(jìn)行脂質(zhì)染色，測定發(fā)色強(qiáng)度的方法。不過這些方法操作都很復(fù)雜，無法處理大量檢品，日常幾乎難以應(yīng)用。
目前，作為HDL中膽固醇的測定方法，臨床應(yīng)用的方法有沉淀法，是向檢品中加入沉淀劑，使HDL以外的脂蛋白凝聚，然后離心去除，測定分離出的只含HDL的上清中的膽固醇。該方法與超速離心法和電泳法相比比較簡便，但因?yàn)榘尤氤恋韯┓蛛x操作，需要比較多的檢品量，而且產(chǎn)生分析誤差的可能性也高，整個分析過程無法自動化。
另外，也討論了以酶分別定量HDL中的膽固醇的方法。例如，在膽汁酸鹽和非離子表面活性劑的存在下，進(jìn)行酶反應(yīng)的方法(特開昭63-126498號)。該方法在反應(yīng)初期的酶反應(yīng)與LDL中的膽固醇濃度成正比，然后的反應(yīng)速度雖然利用于與HDL中的膽固醇濃度成正比的關(guān)系，但是無法區(qū)別HDL中的膽固醇和其它脂蛋白中的膽固醇的反應(yīng)，存在正確性的問題。
已知有將HDL以外的脂蛋白先凝聚了以后，HDL中的膽固醇單獨(dú)發(fā)生酶反應(yīng)，然后酶失活同時再溶解凝聚，測定吸光度的方法(特開平6-242110號)。不過，該方法必須要至少添加3次試劑的操作，只適用于有限的自動分析裝置，有通用性的問題。而且，再溶解沉淀的時候使用高濃度的鹽等，對分析儀器有危害，無法滿足試劑廢棄的要求。
另外，已知有如下的HDL中膽固醇的測定方法，在第1反應(yīng)中，在特殊的表面活性劑存在下，膽固醇氧化酶與膽固醇酯酶作用于HDL以外的脂蛋白，在與這些脂蛋白中的膽固醇優(yōu)先反應(yīng)之后，抑制對HDL以外的膽固醇的反應(yīng)，測定HDL中的膽固醇(特開平9-299號)。但該方法與本發(fā)明有很大差異，表現(xiàn)在第1反應(yīng)中，需要將HDL以外的脂蛋白的游離膽固醇以及酯型膽固醇轉(zhuǎn)移到反應(yīng)體系以外的特殊表面活性劑還有同時需要膽固醇氧化酶和膽固醇酯酶。
再者，日本專利第2600065號公開了組合使用沉淀HDL以外脂蛋白的沉淀試劑和膽固醇測定試劑，測定不沉淀的HDL中的膽固醇(HDL-C)的方法。實(shí)際上可以實(shí)施的方法是使用修飾的酶以及以硫酸化α-環(huán)糊精作為沉淀劑，因?yàn)槌恋韯┑男Ч?，生成的混濁對測定體系有妨礙，在測定精度上是存在問題的。
上述專利方法以論文發(fā)表在《生物試樣分析》第19卷，第5期，305～320頁，其中，報(bào)道了在用修飾的酶進(jìn)行HDL-C測定時，僅修飾酶向反應(yīng)體系中導(dǎo)入，就會造成正誤差(與沉淀法相比，顯示高值)，因此無法測定高脂血癥患者血清中的HDL-C，為避免此現(xiàn)象，以1種聚陰離子硫酸化環(huán)糊精和氯化鎂作為沉淀劑，測定了HDL-C。
為降低上述專利方法中沉淀劑所產(chǎn)生混濁的影響，有使表面活性劑共存的技術(shù)(特開平8-116996號)、使用抗體的技術(shù)(特開平9-96637號)、使用糖化合物(特開平7-301636號)等技術(shù)，上述無論任何一個都含有引起凝聚的試劑作為條件，基本上無法避免使用聚陰離子等沉淀劑。
最近本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)，通過利用只作用于特定脂蛋白的物質(zhì)，不使用沉淀劑也可以正確定量特定級分中膽固醇的方法，提出了專利申請(特愿平9-244821號)。該方法與已有的沉淀法相比，具有極高的相關(guān)性，但是與沉淀法測定值的關(guān)系，與上述《生物試樣分析》中所報(bào)告者具有同樣傾向，為此，在醫(yī)療機(jī)構(gòu)中為了獲得與以往沉淀法有可比性的數(shù)據(jù)，要添加聚陰離子等。
但是，加入聚陰離子等，在測定體系中生成沉淀，有污染測定池等問題或者測定值波動等原因，這是不期望的，強(qiáng)烈要求從體系中排出沉淀物等。另外僅僅為了數(shù)據(jù)的一致而加入從測定原理是不必要的聚陰離子等，經(jīng)濟(jì)上也不合理，也需要解決。
因此，本發(fā)明的課題是提供本質(zhì)上不必要聚陰離子等，通過簡便的操作即可正確且高效率的定量測定特定級分中的膽固醇、適合各種自動分析裝置的方法。
就是說，本發(fā)明提供了一種定量膽固醇用試樣的預(yù)處理方法，其特征在于，在測定試樣中特定脂蛋白中存在的膽固醇之前，用以含有脂蛋白的試樣中的游離型膽固醇為底物的酶作用。
另外，本發(fā)明提供了一種特定脂蛋白膽固醇的定量法，其特征在于，在以含有脂蛋白的試樣中的游離型膽固醇為底物的酶作用以后，利用只作用于特定脂蛋白的物質(zhì)測定特定脂蛋白中存在的膽固醇。
圖3表示實(shí)施例5中反應(yīng)促進(jìn)物質(zhì)的效果。
作為以游離型膽固醇為底物的酶，例如只要是膽固醇脫氫酶、膽固醇氧化酶等以游離型膽固醇為底物的酶即可。上述可以是來源于微生物、動物、植物等任何來源，而且也可以是通過基因工程制成的。此外有無化學(xué)修飾均可。上述酶用量一般為0.001單位～100單位/毫升，優(yōu)選0.1單位～100單位/毫升。
對試樣以含有脂蛋白的試樣中的游離型膽固醇為底物，用酶作用的條件沒有限制，只要是該酶的推薦條件即可。不過，在對試樣以含有脂蛋白的試樣中的游離型膽固醇為底物，用酶作用的階段，應(yīng)注意不發(fā)生酯型膽固醇轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x型膽固醇的反應(yīng)。就是說，雖然有無膽固醇酯酶并非問題，但是應(yīng)維持使其實(shí)際上不發(fā)生作用的條件。
以上述游離型膽固醇為底物的酶，如有必要，可以使用輔酶，作為輔酶，例如可以使用煙酰胺腺嘌呤二核苷酸等。上述酶可以單獨(dú)使用或2種以上組合使用，其使用量因酶而異，沒有特別限制，不過使用量為0.001單位～100單位/毫升，優(yōu)選0.1單位～100單位/毫升。
本發(fā)明中使用的以游離型膽固醇為底物的酶，如上所述對其來源沒有限制，濃度等可按照滿足期望性能、操作性等適當(dāng)選擇。因此，例如為在一定時間內(nèi)完成預(yù)處理，可以增加酶的量，反之，為了節(jié)約酶，延長預(yù)處理時間即可。
不過，在以自動分析儀進(jìn)行測定的前提下的檢查試劑的情況，需要同時滿足兩種要求。也就是說，有時候要求利用少量酶在短時間內(nèi)結(jié)束預(yù)處理。在這種情況下，通過使選自以下組的反應(yīng)促進(jìn)物質(zhì)共存，使用以游離型膽固醇為底物的酶進(jìn)行預(yù)處理，無需延長預(yù)處理時間，就可以降低酶的量，獲得期望的性能。
為達(dá)到上述目的而利用的反應(yīng)促進(jìn)物質(zhì)例如，氟滅酸、甲滅酸、2，2′，6′，2″-三聯(lián)吡啶、惕各酸、梭鏈孢酸、醋酸倍他米松、莫能菌素、洛伐他汀等(反應(yīng)促進(jìn)物質(zhì)的鹽或反應(yīng)促進(jìn)物質(zhì)的金屬衍生物(鋁衍生物等)存在時與其一樣)。其中，氟滅酸和甲滅酸為已知非甾體抗炎藥，梭鏈孢酸和莫能菌素是已知抗生素。
上述化合物作為反應(yīng)促進(jìn)物質(zhì)使用時，應(yīng)分別考慮其性質(zhì)，測定體系的pH、離子強(qiáng)度、混在物的種類、濃度等，適當(dāng)選擇濃度等。
反應(yīng)促進(jìn)劑的使用濃度可以通過與測定體系的條件相同的實(shí)驗(yàn)加以確定，一般來說，氟滅酸的時候，為0.01～100mM左右，梭鏈孢酸的情況下，為0.01～10mM左右，甲滅酸、2，2′，6′，2″-三聯(lián)吡啶、醋酸倍他米松的情況下，0.01～5mM左右，莫能菌素、洛伐他汀的情況下0.01～1mM左右，惕各酸的情況下，1～500mM左右。
通過使用上述反應(yīng)促進(jìn)劑，可以將以游離型膽固醇為底物的酶的用量降低到幾分之一到幾十分之一。而且也可以在同一酶量下縮短反應(yīng)時間。
上述以游離型膽固醇為底物的酶(以及必要時的反應(yīng)促進(jìn)劑)進(jìn)行的預(yù)處理時，以不損害進(jìn)一步測定的特異性、調(diào)整酶的作用為目的，或者在特定脂蛋白不發(fā)生凝聚的范圍內(nèi)，可以使用其它酶(對脂蛋白有實(shí)際影響者除外)或鹽、用于調(diào)整pH的緩沖劑、表面活性劑(對脂蛋白有實(shí)際影響者除外)、防腐劑、白蛋白等蛋白質(zhì)、抗體、抗生素、皂甙、凝集素、聚陰離子等對特定脂蛋白具有親和性的試劑。
因此，本發(fā)明中，作為用于測定試樣中特定脂蛋白中存在的膽固醇的預(yù)處理劑，可以利用含有以下構(gòu)成成分者。
(必要成分)例如膽固醇脫氫酶、膽固醇氧化酶等以游離型膽固醇為底物的酶。
(任意成分)例如氟滅酸、甲滅酸、2，2′，6′，2″-三聯(lián)吡啶、惕各酸、梭鏈孢酸、醋酸倍他米松、莫能菌素、洛伐他汀等反應(yīng)促進(jìn)物質(zhì)。
(其它成分)例如NAD等輔酶、過氧化物酶、過氧化氫酶、心肌黃酶、抗壞血酸氧化酶等其它酶；膽酸等酸、鹽，用于調(diào)節(jié)pH的緩沖劑，對脂蛋白沒有實(shí)際影響的表面活性劑，防腐劑，白蛋白等蛋白質(zhì)，抗體，抗生素，皂甙，凝集素、聚陰離子，4-氨基安替比林等偶合劑，Trinder試劑等氫供給體等氧化體系發(fā)色試劑，吩嗪偏硫酸鹽等電子受體類，硝基藍(lán)四唑等還原體系發(fā)色試劑。
本發(fā)明中，通過上述預(yù)處理消耗了脂蛋白中的游離型膽固醇以后，可以測定試樣中特定脂蛋白中存在的膽固醇。
作為測定試樣中特定脂蛋白中存在的膽固醇的方法，只要是可以只作用于特定脂蛋白的物質(zhì)、測定該脂蛋白中存在的膽固醇的方法，可以利用任何方法。
該方法例如特開平11-56295號公開的以選自聚氧乙烯亞烷基苯基醚和聚氧乙烯亞烷基三芐基苯基醚的表面活性劑作為只作用于特定脂蛋白的物質(zhì)，在其存在下，添加測定膽固醇用酶試劑，測定脂蛋白之中，高密度脂蛋白中的膽固醇優(yōu)先與膽固醇測定用試劑反應(yīng)的時間內(nèi)該膽固醇的反應(yīng)量。
其中，前者的聚氧乙烯亞烷基苯基醚的市售品的例子有EmulgenA-60(花王公司)等，后者聚氧乙烯亞烷基三芐基苯基醚的市售品例如Emulgen B66(花王公司)。
另外，作為其他方法，可以使用《生物試樣分析》，19卷，第5期第305頁～320頁公開的使用修飾酶作為只作用于特定脂蛋白的物質(zhì)的方法。該文獻(xiàn)的方法中，為抑制HDL以外脂蛋白級分的反應(yīng)，需要使用硫酸化α-環(huán)糊精和氯化鎂，不過利用本發(fā)明的預(yù)處理方法，無需使用這些物質(zhì)。
測定特定脂蛋白中存在的膽固醇的方法，除利用只作用于特定脂蛋白的物質(zhì)以外，也可以采用常規(guī)膽固醇的測定方法用的試劑。作為所用的試劑中所含的成分，例如，膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶、膽固醇脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶、心肌黃酶、過氧化物酶等酶，發(fā)色劑，輔酶，電子受體，蛋白質(zhì)(白蛋白等)，防腐劑，表面活性劑，鹽，酸，調(diào)節(jié)pH的緩沖劑等。
上述成分中，作為表面活性劑，可以使用離子型或者非離子型表面活性劑，例如聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯聚氧丙烯縮合物、聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽、烷基苯磺酸鹽、膽酸鹽類等。該表面活性劑的用量因化合物而異，沒有特別限制，優(yōu)選0.0001～5％、更優(yōu)選0.001～5％。
作為緩沖劑，沒有限制，可以使用Good′s緩沖劑、磷酸、Tris、鄰苯二甲酸鹽等常規(guī)物質(zhì)。另外，其用量沒有特別限制，為0.005M～2M，優(yōu)選0.01～1M。
根據(jù)本發(fā)明定量測定特定脂蛋白級分中膽固醇的方法，典型的，首先向測定試樣中添加只作用于游離型膽固醇的預(yù)處理劑，然后，添加膽固醇定量試劑(以下稱為定量試劑)，包括只作用于特定脂蛋白的物質(zhì)以及常規(guī)膽固醇測定方法所用的試劑，混合，測定特定脂蛋白級分中的膽固醇量。
其具體例，例如有在檢品中混合膽固醇脫氫酶和輔酶(NAD)，然后添加含有膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶等的膽固醇測定試劑的方法；在檢品中混合膽固醇脫氫酶和NAD，然后添加含有膽固醇酯酶等的膽固醇測定試劑的方法；檢品和膽固醇酯酶與過氧化物酶、4-氨基安替比林或者過氧化氫酶等混合之后，添加含有膽固醇脂酶等的膽固醇測定試劑的方法；檢品和膽固醇氧化酶與過氧化物酶、4-氨基安替比林等混合之后，添加含有膽固醇脂酶、膽固醇脫氫酶、NAD等的膽固醇測定試劑的方法；但不限于此。
作為測定特定脂蛋白級分中膽固醇的方法，可以采用任何公知的酶測定法，例如組合使用酶試劑膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶的方法，組合使用膽固醇酯酶和膽固醇脫氫酶的方法等。
本發(fā)明中，預(yù)處理反應(yīng)第1反應(yīng)中所使用的酶與定量方法第2反應(yīng)測定膽固醇中所用的酶可以相同也可以不同。或者第1反應(yīng)中使用過量酶，將其用于第2反應(yīng)也可以。重要的是消耗指蛋白表面存在的少量游離型膽固醇(第1反應(yīng)，預(yù)處理反應(yīng))，然后在只作用于所要測定的特定脂蛋白的酶作用的狀態(tài)下，定量測定構(gòu)成該脂蛋白的大部分膽固醇(游離型膽固醇+酯型膽固醇)即可。
另外，添加上述測定膽固醇用酶試劑后，最終檢測膽固醇的方法沒有特別限制，例如可以利用過氧化物酶與色原體、心肌黃酶或電子受體與還原系發(fā)色試劑再組合進(jìn)行的吸光度分析，直接檢測輔酶或過氧化氫的方法。輔酶也可以用輔酶循環(huán)系統(tǒng)擴(kuò)增。
為使本發(fā)明方法容易實(shí)施，優(yōu)選采用適用本目的的用于定量測定特定脂蛋白中膽固醇的定量用試劑盒。
上述試劑盒可以按照以上說明容易地設(shè)計(jì)，例如以游離型膽固醇為底物的酶，代表性的使用膽固醇氧化酶、膽固醇脫氫酶場合的試劑盒分別表示如下[膽固醇氧化酶時的試劑盒](甲)由以下試劑(1)和(2)構(gòu)成的測定特定脂蛋白中膽固醇的膽固醇定量用試劑盒。
(1)第1試劑，含有膽固醇氧化酶和消耗過氧化氫的物質(zhì)(有時候還含有反應(yīng)促進(jìn)物質(zhì))(2)第2試劑，含有只作用于特定脂蛋白的物質(zhì)，膽固醇酯酶和發(fā)色劑。
(乙)由以下試劑(1)和(2)構(gòu)成的測定特定脂蛋白中膽固醇的膽固醇定量用試劑盒。
(1)第1試劑，含有膽固醇氧化酶、膽固醇酯酶和消耗過氧化氫的物質(zhì)(有時候還含有反應(yīng)促進(jìn)物質(zhì))，(2)第2試劑，含有只作用于特定脂蛋白的物質(zhì)和發(fā)色劑。
(丙)由以下試劑(1)、(2)和(3)構(gòu)成的測定特定脂蛋白中膽固醇的膽固醇定量用試劑盒。
(1)第1試劑，含有膽固醇氧化酶和消耗過氧化氫的物質(zhì)(有時候還含有反應(yīng)促進(jìn)物質(zhì))，(2)第2試劑，含有只作用于特定脂蛋白的物質(zhì)，(3)第3試劑，含有膽固醇酯酶和發(fā)色劑。
上述試劑中，所謂消耗過氧化氫的物質(zhì)，是指消耗膽固醇氧化酶和膽固醇反應(yīng)所得的過氧化氫，使之消失的物質(zhì)。例如，過氧化氫酶、4-氨基安替比林等偶合劑、含有Trinder試劑等氫供體的氧化還原體系發(fā)色試劑等。
其中，4-氨基安替比林和Trinder試劑等氫供體與這些組合，與過氧化氫反應(yīng)發(fā)色，用作上述(2)或(3)的發(fā)色劑。不過，作為本發(fā)明預(yù)處理工序所用的試劑(1)，優(yōu)選只用偶合劑或者氫供體之一，通過非發(fā)色反應(yīng)消耗過氧化氫。當(dāng)然，也可以進(jìn)行發(fā)色反應(yīng)，調(diào)整測定值(從試劑(2)或試劑(3)的發(fā)色值中減去試劑(1)的發(fā)色值，進(jìn)行調(diào)整)。
(丁)由以下試劑(1)和(2)構(gòu)成的測定特定脂蛋白中膽固醇的膽固醇定量用試劑盒。
(1)第1試劑，含有膽固醇脫氫酶和輔酶(有時還含有促進(jìn)反應(yīng)物質(zhì))(2)第2試劑，含有只作用于特定脂蛋白的物質(zhì)，膽固醇酯酶。
(戊)由以下試劑(1)和(2)構(gòu)成的測定特定脂蛋白中膽固醇的膽固醇定量用試劑盒。
(1)第1試劑，含有膽固醇脫氫酶和輔酶(有時還含有促進(jìn)反應(yīng)物質(zhì))(2)第2試劑，含有只作用于特定脂蛋白的物質(zhì)，膽固醇氧化酶、膽固醇酯酶、過氧化物酶和發(fā)色劑。
(己)由以下試劑(1)和(2)構(gòu)成的測定特定脂蛋白中膽固醇的膽固醇定量用試劑盒。
(1)第1試劑，含有膽固醇脫氫酶、輔酶和膽固醇酯酶(有時還含有促進(jìn)反應(yīng)物質(zhì))(2)第2試劑，含有只作用于特定脂蛋白的物質(zhì)。
(庚)由以下試劑(1)和(2)構(gòu)成的測定特定脂蛋白中膽固醇的膽固醇定量用試劑盒。
(1)第1試劑，含有膽固醇脫氫酶、輔酶和膽固醇酯酶(有時還含有促進(jìn)反應(yīng)物質(zhì))(2)第2試劑，含有只作用于特定脂蛋白的物質(zhì)，膽固醇氧化酶、過氧化物酶和發(fā)色劑。
(辛)由以下試劑(1)、(2)和(3)構(gòu)成的測定特定脂蛋白中膽固醇的膽固醇定量用試劑盒。
(1)第1試劑，含有膽固醇脫氫酶和輔酶(有時還含有促進(jìn)反應(yīng)物質(zhì))(2)第2試劑，含有只作用于特定脂蛋白的物質(zhì)(3)第3試劑，含有膽固醇酯酶。
(壬)由以下試劑(1)、(2)和(3)構(gòu)成的測定特定脂蛋白中膽固醇的膽固醇定量用試劑盒。
(1)第1試劑，含有膽固醇脫氫酶和輔酶(有時還含有促進(jìn)反應(yīng)物質(zhì))(2)第2試劑，含有只作用于特定脂蛋白的物質(zhì)(3)第3試劑，含有膽固醇氧化酶、膽固醇酯酶、過氧化物酶和發(fā)色劑。
(癸)由以下試劑(1)和(2)構(gòu)成的測定特定脂蛋白中膽固醇的膽固醇定量用試劑盒。
(1)第1試劑，含有膽固醇脫氫酶、輔酶和消耗輔酶反應(yīng)產(chǎn)物的物質(zhì)(有時還含有促進(jìn)反應(yīng)物質(zhì))(2)第2試劑，含有只作用于特定脂蛋白的物質(zhì)和膽固醇酯酶。
(十一)由以下試劑(1)和(2)構(gòu)成的測定特定脂蛋白中膽固醇的膽固醇定量用試劑盒。
(1)第1試劑，含有膽固醇脫氫酶、輔酶和消耗輔酶反應(yīng)產(chǎn)物的物質(zhì)(2)第2試劑，含有只作用于特定脂蛋白的物質(zhì)，膽固醇酯酶和發(fā)色劑。
上述采用膽固醇脫氫酶的試劑盒中，所謂消耗輔酶反應(yīng)產(chǎn)物的物質(zhì)，是指消耗膽固醇、膽固醇脫氫酶和輔酶(例如NAD)反應(yīng)所得的還原型輔酶(例如NADH)，使之轉(zhuǎn)變?yōu)樽畛醯妮o酶的物質(zhì)。例如，以乳酸脫氫酶和丙酮酸(底物)為例。上述試劑盒中，均添加試劑(1)生成輔酶的反應(yīng)產(chǎn)物，其中，(丁)、(己)、(辛)、(癸)中，不消耗反應(yīng)產(chǎn)物，直接在測定階段測定與添加試劑(1)發(fā)色同樣波長的光，由試劑(2)或(3)所得的發(fā)色值減去添加試劑(1)后的預(yù)處理階段的發(fā)色值，可以對特定脂蛋白中的膽固醇加以定量。另外試劑(1)中，預(yù)先添加消耗反應(yīng)產(chǎn)物的物質(zhì)，消耗了反應(yīng)產(chǎn)物以后，再添加試劑(2)或試劑(3)發(fā)色也可以。這種情況下，最好在試劑(2)或試劑(3)中配合降低消耗反應(yīng)產(chǎn)物的物質(zhì)的作用的物質(zhì)。另外，試劑盒(戊)、(庚)、(壬)、(十一)中，測定的是與預(yù)處理發(fā)色波長不同的發(fā)色，不一定非要從測定值中減去預(yù)處理的發(fā)色值。
應(yīng)予說明，前面所說的氟滅酸、甲滅酸、2，2′，6′，2″-三聯(lián)吡啶、惕各酸、梭鏈孢酸、醋酸倍他米松、莫能菌素、洛伐他汀等反應(yīng)促進(jìn)物質(zhì)的用途并不限于本發(fā)明的預(yù)處理方法(試劑)和利用此方法的本發(fā)明的定量測定特定脂蛋白中膽固醇的方法(試劑盒)。
在使用以游離型膽固醇為底物的酶的膽固醇定量方法中，例如，在組合使用膽固醇氧化酶、過氧化物酶、發(fā)色劑的游離型膽固醇定量方法或者組合使用膽固醇氧化酶、膽固醇酯酶、過氧化物酶、發(fā)色劑的總膽固醇定量方法中，當(dāng)然可以使氟滅酸等反應(yīng)促進(jìn)物質(zhì)等共存，可以獲得降低以游離型膽固醇為底物的酶(在此是膽固醇氧化酶)的使用量、縮短酶反應(yīng)的反應(yīng)時間等效果。
因此，參照本說明書中有關(guān)膽固醇的定量方法的記載(例如，選擇表面活性劑，以特定脂蛋白為測定對象等)，可以更具體地建立期望的定量方法。工業(yè)實(shí)用性根據(jù)本發(fā)明，通過離心分離等機(jī)械預(yù)處理，無需使用聚陰離子等，可以以簡便的操作高效率的定量測定特定級分中的膽固醇。因此，因?yàn)椴粫蚓坳庪x子等產(chǎn)生沉淀，不會污染測定裝置(特別是測定池)，而且測定值的波動也不會發(fā)生，因此與以往的膽固醇測定方法相比為優(yōu)。
如后面的實(shí)施例所示，即使對中性脂肪水平高的檢品，也能獲得與以往沉淀法相關(guān)性高的測定值，從不選擇試樣的方面是好的。
使用反應(yīng)促進(jìn)劑的情況下，可以少使用以預(yù)處理時的游離型膽固醇作為底物的酶。
因此，本發(fā)明的方法，可以以少的試樣、通過簡便的操作，對于廣泛范圍的試樣也可以正確、特異性地測定，適用于各種自動分析裝置，在臨床檢驗(yàn)領(lǐng)域是極為有用的。
實(shí)施例1根據(jù)如下所示的本發(fā)明方法和沉淀法，對含有脂蛋白的30例血清檢品進(jìn)行定量，比較其測定值。
(本發(fā)明方法)向3微升檢品中加入300微升含有0.1單位/毫升的膽固醇脫氫酶(天野制藥)、2.5mM的NAD和0.03％4-氨基安替比林的10mM磷酸鹽緩沖液(第1試劑pH8.5)(預(yù)處理)。約5分鐘后，加入100微升由含有66.1％Emulgen B 66、1.3單位/毫升膽固醇酯酶(旭化成)、2單位/毫升膽固醇氧化酶(旭化成)、5單位/毫升過氧化物酶(東洋紡)和0.04％的二磺基丁基間甲苯胺的100mM MES緩沖液構(gòu)成的膽固醇測定試劑(第2試劑)。
在添加第2試劑之前和添加后5分鐘測定吸光度，根據(jù)其差求出血清檢品中HDL膽固醇的濃度(2點(diǎn)法)。采用已知濃度的膽固醇血清作為校正用物質(zhì)。以上操作使用日立7150型自動分析裝置。
(沉淀法)200微升HDLC2“第1”分級試劑(第1化學(xué)藥品株式會社)與200微升檢品混合。3000rpm離心分離10分鐘。取上清50微升，混合3毫升由含有1％Triton X-100，1單位/毫升膽固醇酯酶、1單位/毫升膽固醇氧化酶、5單位/毫升過氧化物酶和0.04％二磺基丁基間甲苯胺的100mM MES緩沖液(pH 6.5)構(gòu)成的膽固醇測定試劑，37℃溫育10分鐘，于600納米處測定吸光度，測定HDL中的膽固醇濃度。
(結(jié)果)結(jié)果如


圖1和表1所示。
表1

由該結(jié)果可見，本發(fā)明方法即使不使用聚陰離子等也與以往的沉淀法具有良好的相關(guān)性。
實(shí)施例2將實(shí)施例1中的第1試劑中的膽固醇脫氫酶、NAD和磷酸緩沖液分別用5單位/毫升的膽固醇氧化酶(東洋紡)、5單位/毫升的過氧化物酶(東洋紡)和100mM的MES(pH6)代替，比較測定值。
(結(jié)果)結(jié)果如表2和圖2所示。
表2

由該結(jié)果可見，本發(fā)明方法即使不使用聚陰離子等也與以往的沉淀法具有良好的相關(guān)性。
實(shí)施例3使用實(shí)施例1和實(shí)施例2的試劑，測定中性脂肪水平不同的5個血清檢品，與以往方法的測定值相比較。結(jié)果如表3所示。
表3

由表3所示可見，根據(jù)本發(fā)明，即使對于中性脂肪水平高的檢品也可以獲得與以往方法同水平的測定值。
實(shí)施例4實(shí)施例2的第1試劑中，將5單位/毫升的膽固醇氧化酶改變?yōu)橐韵卤?的濃度和組合，進(jìn)行實(shí)施例1同樣的測定，其測定值與沉淀法和實(shí)施例2的方法(基準(zhǔn)測定體系)進(jìn)行比較。第2試劑使用與實(shí)施例1同樣物質(zhì)。結(jié)果如表5所示。
(試驗(yàn)用試劑組成)表4

(結(jié)果)
表5

由此結(jié)果可見，在比基準(zhǔn)測定體系(實(shí)施例2)相比膽固醇氧化酶減少1/5的時候(實(shí)驗(yàn)體系A(chǔ))，相關(guān)系數(shù)也有一定降低，切片值也有一定增加，在使用反應(yīng)促進(jìn)物質(zhì)的情況下，即使膽固醇氧化酶的用量為基準(zhǔn)測定體系的1/5也可以獲得大致相同的結(jié)果，顯然使用反應(yīng)促進(jìn)物中可以減少膽固醇氧化酶的使用量。
實(shí)施例5調(diào)制如下表6記載的試劑(J～L)，其中均含有1.25單位/毫升的過氧化物酶(東洋紡)、0.01％4-氨基安替比林、0.02％二磺基丁基間甲苯胺、50mM NaCl，其中緩沖液的種類和pH、膽固醇氧化酶(東洋紡)和氟滅酸(Sigma)的濃度不同。
表6

向3微升血清檢品中加入300微升試劑J～L，37℃下反應(yīng)5分鐘，然后于600納米測定吸光度。以上操作采用日立7150型自動分析儀測定。
用試劑J～L測定4例血清檢品。
試劑J～L均以5.0單位/毫升膽固醇氧化酶、0mM氟滅酸試劑下所得吸光度為100。計(jì)算各膽固醇氧化酶、氟滅酸濃度下的相對吸光度。
(結(jié)果)4個檢品的相對吸光度的平均結(jié)果如圖3所示。圖中膽固醇氧化酶以COD表示。
在各pH下，相對吸光度與氟滅酸呈濃度依賴性增加。確認(rèn)，使用反應(yīng)促進(jìn)物質(zhì)可以減少膽固醇氧化酶的用量。
反應(yīng)促進(jìn)物質(zhì)也可以用于使用以游離型膽固醇為底物的酶測定游離型膽固醇的方法或者總膽固醇的測定方法。
權(quán)利要求
1.用于膽固醇定量的試樣的預(yù)處理方法，其特征在于測定試樣中特定脂蛋白中存在的膽固醇之前，先用以游離型膽固醇為底物的酶作用于含有脂蛋白的試樣。
2.用于膽固醇定量的試樣的預(yù)處理方法，其特征在于測定試樣中特定脂蛋白中存在的膽固醇之前，先用以游離型膽固醇為底物的酶和選自氟滅酸、甲滅酸、2，2′，6′，2″-三聯(lián)吡啶、惕各酸、梭鏈孢酸、醋酸倍他米松、莫能菌素、洛伐他汀的反應(yīng)促進(jìn)物質(zhì)作用于含有脂蛋白的試樣。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2記載的預(yù)處理方法，以游離型膽固醇為底物的酶是膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶。
4.特定脂蛋白中膽固醇的定量方法，在對含有脂蛋白的試樣用以游離型膽固醇為底物的酶作用以后，利用只作用于特定脂蛋白的物質(zhì)測定特定脂蛋白中存在的膽固醇。
5.特定脂蛋白中膽固醇的定量方法，在對含有脂蛋白的試樣先用以游離型膽固醇為底物的酶和選自氟滅酸、甲滅酸、2，2′，6′，2″-三聯(lián)吡啶、惕各酸、梭鏈孢酸、醋酸倍他米松、莫能菌素、洛伐他汀的反應(yīng)促進(jìn)物質(zhì)作用以后，利用只作用于特定脂蛋白的物質(zhì)測定特定脂蛋白中存在的膽固醇。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5記載的預(yù)處理方法，以游離型膽固醇為底物的酶是膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求4或6任一項(xiàng)記載的方法，特定的脂蛋白是高密度脂蛋白。
8.用于測定膽固醇的試樣的預(yù)處理劑，含有以游離型膽固醇為底物的酶，實(shí)際上不含作用于脂蛋白的物質(zhì)。
9.用于測定膽固醇的試樣的預(yù)處理劑，含有以游離型膽固醇為底物的酶和選自氟滅酸、甲滅酸、2，2′，6′，2″-三聯(lián)吡啶、惕各酸、梭鏈孢酸、醋酸倍他米松、莫能菌素、洛伐他汀的反應(yīng)促進(jìn)物質(zhì)，實(shí)際上不含作用于脂蛋白的物質(zhì)。
10.用于測定膽固醇的試樣的預(yù)處理劑，含有以游離型膽固醇為底物的酶，實(shí)際上不含膽固醇酯酶。
11.用于測定膽固醇的試樣的預(yù)處理劑，含有以游離型膽固醇為底物的酶和選自氟滅酸、甲滅酸、2，2′，6′，2″-三聯(lián)吡啶、惕各酸、梭鏈孢酸、醋酸倍他米松、莫能菌素、洛伐他汀的反應(yīng)促進(jìn)物質(zhì)，實(shí)際上不含膽固醇酯酶。
12.根據(jù)權(quán)利要求8或10中任一項(xiàng)記載的用于測定膽固醇的試樣的預(yù)處理劑，以游離型膽固醇為底物的酶是膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶。
13.用于定量特定脂蛋白中膽固醇的試劑盒，由以下試劑組成(1)第1試劑含有膽固醇氧化酶和消耗過氧化氫的物質(zhì)；(2)第2試劑含有只作用于特定脂蛋白的物質(zhì)，膽固醇酯酶和發(fā)色劑。
14.用于定量特定脂蛋白中膽固醇的試劑盒，由以下試劑構(gòu)成(1)第1試劑，含有膽固醇脫氫酶和輔酶；(2)第2試劑，含有只作用于特定脂蛋白的物質(zhì)、膽固醇酯酶。
15.用于定量特定脂蛋白中膽固醇的試劑盒，由以下試劑構(gòu)成(1)第1試劑，含有膽固醇脫氫酶和輔酶；(2)第2試劑，含有只作用于特定脂蛋白的物質(zhì)，膽固醇氧化酶、膽固醇酯酶、過氧化物酶和發(fā)色劑。
16.用于定量特定脂蛋白中膽固醇的試劑盒，由以下試劑構(gòu)成(1)第1試劑，含有膽固醇氧化酶、膽固醇酯酶和消耗過氧化氫的物質(zhì)；(2)第2試劑，含有只作用于特定脂蛋白的物質(zhì)和發(fā)色劑。
17.用于定量特定脂蛋白中膽固醇的試劑盒，由以下試劑構(gòu)成(1)第1試劑，含有膽固醇脫氫酶、輔酶和膽固醇酯酶；(2)第2試劑，含有只作用于特定脂蛋白的物質(zhì)。
18.用于定量特定脂蛋白中膽固醇的試劑盒，由以下試劑構(gòu)成(1)第1試劑，含有膽固醇脫氫酶、輔酶和膽固醇酯酶；(2)第2試劑，含有只作用于特定脂蛋白的物質(zhì)，膽固醇氧化酶、過氧化物酶和發(fā)色劑。
19.用于定量特定脂蛋白中膽固醇的試劑盒，由以下試劑構(gòu)成(1)第1試劑，含有膽固醇氧化酶和消耗過氧化氫的物質(zhì)；(2)第2試劑，含有只作用于特定脂蛋白的物質(zhì)，(3)第3試劑，含有膽固醇酯酶和發(fā)色劑。
20.用于定量特定脂蛋白中膽固醇的試劑盒，由以下試劑構(gòu)成(1)第1試劑，含有膽固醇脫氫酶和輔酶；(2)第2試劑，含有只作用于特定脂蛋白的物質(zhì)(3)第3試劑，含有膽固醇酯酶。
21.用于定量特定脂蛋白中膽固醇的試劑盒，由以下試劑構(gòu)成(1)第1試劑，含有膽固醇脫氫酶和輔酶；(2)第2試劑，含有只作用于特定脂蛋白的物質(zhì)(3)第3試劑，含有膽固醇氧化酶、膽固醇酯酶、過氧化物酶和發(fā)色劑。
22.用于定量特定脂蛋白中膽固醇的試劑盒，由以下試劑構(gòu)成(1)第1試劑，含有膽固醇脫氫酶、輔酶和消耗輔酶反應(yīng)產(chǎn)物的物質(zhì)；(2)第2試劑，含有只作用于特定脂蛋白的物質(zhì)和膽固醇酯酶。
23.用于定量特定脂蛋白中膽固醇的試劑盒，由以下試劑構(gòu)成(1)第1試劑，含有膽固醇脫氫酶、輔酶和消耗輔酶反應(yīng)產(chǎn)物的物質(zhì)；(2)第2試劑，含有只作用于特定脂蛋白的物質(zhì)，膽固醇酯酶和發(fā)色劑。
24.用于定量特定脂蛋白中膽固醇的試劑盒，由以下試劑組成(1)第1試劑含有(a)膽固醇氧化酶、(b)選自氟滅酸、甲滅酸、2，2′，6′，2″-三聯(lián)吡啶、惕各酸、梭鏈孢酸、醋酸倍他米松、莫能菌素、洛伐他汀的反應(yīng)促進(jìn)物質(zhì)和(c)消耗過氧化氫的物質(zhì)；(2)第2試劑含有只作用于特定脂蛋白的物質(zhì)，膽固醇酯酶和發(fā)色劑。
25.用于定量特定脂蛋白中膽固醇的試劑盒，由以下試劑構(gòu)成(1)第1試劑，含有(a)膽固醇脫氫酶、(b)選自氟滅酸、甲滅酸、2，2′，6′，2″-三聯(lián)吡啶、惕各酸、梭鏈孢酸、醋酸倍他米松、莫能菌素、洛伐他汀的反應(yīng)促進(jìn)物質(zhì)和(c)輔酶；(2)第2試劑，含有只作用于特定脂蛋白的物質(zhì)、膽固醇酯酶。
26.用于定量特定脂蛋白中膽固醇的試劑盒，由以下試劑構(gòu)成(1)第1試劑，含有(a)膽固醇氧化酶、(b)選自氟滅酸、甲滅酸、2，2′，6′，2″-三聯(lián)吡啶、惕各酸、梭鏈孢酸、醋酸倍他米松、莫能菌素、洛伐他汀的反應(yīng)促進(jìn)物質(zhì)、(c)膽固醇酯酶和(d)消耗過氧化氫的物質(zhì)；(2)第2試劑，含有只作用于特定脂蛋白的物質(zhì)和發(fā)色劑。
27.用于定量特定脂蛋白中膽固醇的試劑盒，由以下試劑構(gòu)成(1)第1試劑，含有(a)膽固醇脫氫酶、(b)輔酶、(c)選自氟滅酸、甲滅酸、2，2′，6′，2″-三聯(lián)吡啶、惕各酸、梭鏈孢酸、醋酸倍他米松、莫能菌素、洛伐他汀的反應(yīng)促進(jìn)物質(zhì)和(d)膽固醇酯酶；(2)第2試劑，含有只作用于特定脂蛋白的物質(zhì)。
28.用于定量特定脂蛋白中膽固醇的試劑盒，由以下試劑構(gòu)成(1)第1試劑，含有(a)膽固醇脫氫酶、(b)輔酶、(c)選自氟滅酸、甲滅酸、2，2′，6′，2″-三聯(lián)吡啶、惕各酸、梭鏈孢酸、醋酸倍他米松、莫能菌素、洛伐他汀的反應(yīng)促進(jìn)物質(zhì)和(d)膽固醇酯酶；(2)第2試劑，含有只作用于特定脂蛋白的物質(zhì)，膽固醇氧化酶、過氧化物酶和發(fā)色劑。
29.用于定量特定脂蛋白中膽固醇的試劑盒，由以下試劑構(gòu)成(1)第1試劑，含有(a)膽固醇氧化酶、(b)選自氟滅酸、甲滅酸、2，2′，6′，2″-三聯(lián)吡啶、惕各酸、梭鏈孢酸、醋酸倍他米松、莫能菌素、洛伐他汀的反應(yīng)促進(jìn)物質(zhì)和(c)消耗過氧化氫的物質(zhì)；(2)第2試劑，含有只作用于特定脂蛋白的物質(zhì)，(3)第3試劑，含有膽固醇酯酶和發(fā)色劑。
30.用于定量特定脂蛋白中膽固醇的試劑盒，由以下試劑構(gòu)成(1)第1試劑，含有(a)膽固醇脫氫酶(b)選自氟滅酸、甲滅酸、2，2′，6′，2″-三聯(lián)吡啶、惕各酸、梭鏈孢酸、醋酸倍他米松、莫能菌素、洛伐他汀的反應(yīng)促進(jìn)物質(zhì)和(c)輔酶；(2)第2試劑，含有只作用于特定脂蛋白的物質(zhì)(3)第3試劑，含有膽固醇酯酶。
31.用于定量特定脂蛋白中膽固醇的試劑盒，由以下試劑構(gòu)成(1)第1試劑，含有(a)膽固醇脫氫酶(b)選自氟滅酸、甲滅酸、2，2′，6′，2″-三聯(lián)吡啶、惕各酸、梭鏈孢酸、醋酸倍他米松、莫能菌素、洛伐他汀的反應(yīng)促進(jìn)物質(zhì)和(c)輔酶；(2)第2試劑，含有只作用于特定脂蛋白的物質(zhì)(3)第3試劑，含有膽固醇氧化酶、膽固醇酯酶、過氧化物酶和發(fā)色劑。
32.用于定量特定脂蛋白中膽固醇的試劑盒，由以下試劑構(gòu)成(1)第1試劑，含有(a)膽固醇脫氫酶、(b)輔酶、(c)選自氟滅酸、甲滅酸、2，2′，6′，2″-三聯(lián)吡啶、惕各酸、梭鏈孢酸、醋酸倍他米松、莫能菌素、洛伐他汀的反應(yīng)促進(jìn)物質(zhì)和(d)消耗輔酶反應(yīng)產(chǎn)物的物質(zhì)；(2)第2試劑，含有只作用于特定脂蛋白的物質(zhì)和膽固醇酯酶。
33.用于定量特定脂蛋白中膽固醇的試劑盒，由以下試劑構(gòu)成(1)第1試劑，含有(a)膽固醇脫氫酶、(b)輔酶、(c)選自氟滅酸、甲滅酸、2，2′，6′，2″-三聯(lián)吡啶、惕各酸、梭鏈孢酸、醋酸倍他米松、莫能菌素、洛伐他汀的反應(yīng)促進(jìn)物質(zhì)和(d)消耗輔酶反應(yīng)產(chǎn)物的物質(zhì)；(2)第2試劑，含有只作用于特定脂蛋白的物質(zhì)，膽固醇酯酶和發(fā)色劑。
34.以游離型膽固醇為底物的酶的反應(yīng)促進(jìn)物質(zhì)，選自氟滅酸、甲滅酸、2，2′，6′，2″-三聯(lián)吡啶、惕各酸、梭鏈孢酸、醋酸倍他米松、莫能菌素、洛伐他汀。
35.根據(jù)權(quán)利要求34記載的反應(yīng)促進(jìn)物質(zhì)，以游離型膽固醇為底物的酶是膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶。
36.游離型膽固醇的定量方法，其特征在于用以游離型膽固醇為底物的酶和反應(yīng)活性物質(zhì)作用，反應(yīng)活性物質(zhì)選自氟滅酸、甲滅酸、2，2′，6′，2″-三聯(lián)吡啶、惕各酸、梭鏈孢酸、醋酸倍他米松、莫能菌素和洛伐他汀。
37.總膽固醇的定量方法，其特征在于至少用以游離型膽固醇為底物的酶和反應(yīng)活性物質(zhì)作用，反應(yīng)活性物質(zhì)選自氟滅酸、甲滅酸、2，2′，6′，2″-三聯(lián)吡啶、惕各酸、梭鏈孢酸、醋酸倍他米松、莫能菌素和洛伐他汀。
全文摘要
用于膽固醇定量的試樣的預(yù)處理方法,其特征在于,在測定試樣中特定脂蛋白中存在的膽固醇之前,先用以游離型膽固醇為底物的酶和必要時加入的反應(yīng)促進(jìn)物質(zhì)作用于含有脂蛋白的試樣;利用該預(yù)處理方法的特定脂蛋白中膽固醇的定量方法;使用該定量方法的用于膽固醇的試劑盒。根據(jù)該定量方法,基本上不必使用聚陰離子等,通過簡便操作即可正確、高效率的定量測定特定級分中的膽固醇,適用于各種自動分析裝置。
文檔編號C12N9/04GK1357052SQ00809286
公開日2002年7月3日 申請日期2000年6月14日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月21日
發(fā)明者中村光浩, 谷口由利子, 真鍋滿久, 山本光章 申請人:第一化學(xué)藥品株式會社