專利名稱：疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到修飾了的瘧原蟲MSP-1蛋白變體以及他們?cè)谏a(chǎn)抗瘧疾疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明也涉及到合理設(shè)計(jì)適當(dāng)變體的方法。
背景技術(shù)：
瘧疾是一種毀滅性的疾病，它能在許多地區(qū)引起廣泛的發(fā)病和死亡，而這種疾病是是通過瘧蚊來傳播的。在瘧疾的高傳播區(qū)，幼兒和未免疫的游客最容易感染這種由瘧原蟲屬原生動(dòng)物引起的疾病的危險(xiǎn)。在瘧疾的低傳播區(qū)或不穩(wěn)定傳播區(qū)，瘧疾的流行困擾著各個(gè)年齡段的人。最危險(xiǎn)的瘧疾疾病形式可引起更多的發(fā)病了和絕大多數(shù)的死亡，這種形式的瘧疾是由惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)引起的。據(jù)估計(jì)，每年有20億人遭受瘧疾的危險(xiǎn)，有20到30億病例和100萬到200萬人死亡。
這種寄生蟲在他們的人和蚊子宿主中具有復(fù)雜的生活周期。在人體中，生活周期的階段決定了發(fā)生在血液的疾病的臨床癥狀。在這一時(shí)間，寄生蟲主要是藏在宿主的紅細(xì)胞中。在這里寄生蟲開始生長(zhǎng)和繁殖。例如，在紅細(xì)胞中，在48小時(shí)的周期內(nèi)，每一個(gè)惡性瘧原蟲分裂數(shù)次后產(chǎn)生了大約20個(gè)新的個(gè)體。這時(shí)紅細(xì)胞破裂，寄生蟲(在這個(gè)階段稱作裂殖子)釋放到血液中。為了生存和進(jìn)一步的繼續(xù)在血液中的復(fù)制循環(huán)，裂殖子必須進(jìn)入新的紅細(xì)胞中。如果寄生蟲不能進(jìn)入紅細(xì)胞，那么他們就不能存活太久，很快被破壞掉。瘧疾的癥狀如發(fā)熱與周期性的裂殖子釋放及其重新侵入紅細(xì)胞有關(guān)聯(lián)。
因而急切需要能夠抵抗瘧疾的疫苗，但目前又沒有有效的疫苗。此外，人們認(rèn)為通過噴灑有殘留的殺蟲劑來控制蚊子已經(jīng)是或者是沒有效力，或者是不能接受，并且令人很擔(dān)憂的是這些寄生蟲抗藥性的擴(kuò)散?？顾幮匝杆贁U(kuò)散令人擔(dān)憂，是因?yàn)樵谑澜绲脑S多地方，許多化合物如那些廉價(jià)而又曾經(jīng)有效力的氯喹變的不再有效，如果有的話，也已經(jīng)很少有既便宜又有效的新藥物了。而抵抗微生物的疫苗雖然成本很低，但卻是保護(hù)人們免受感染性疾病的一種有效方法。
由于這些寄生蟲有復(fù)雜的寄生生活周期，因而它在人體內(nèi)的許多生長(zhǎng)時(shí)間點(diǎn)就可以成為保護(hù)性免疫反應(yīng)的靶。我們知道，隨著年齡增長(zhǎng)和對(duì)這種疾病接觸的增加，人們就會(huì)對(duì)瘧疾具有免疫，這表明保護(hù)性免疫反應(yīng)是隨著時(shí)間進(jìn)一步提高的。廣義的講，有三種疫苗策略針對(duì)紅血球前階段，無性血液階段，有性階段。紅血球前階段是孢子體，這是在肝臟寄生的的起始發(fā)育階段，這些孢子體是通過吸完血后的感染蚊子注射進(jìn)入的。無性血液階段是指孢子體感染紅細(xì)胞，以及裂殖子從紅細(xì)胞中釋放，它是以循環(huán)方式進(jìn)行的，這個(gè)階段主要與臨床癥狀有關(guān)。在蚊子從血液中攝取了配子進(jìn)入其腸道之后就進(jìn)入了有性階段，這一步開始感染了昆蟲來完成一個(gè)循環(huán)；抗有性階段的疫苗不能保護(hù)個(gè)體，但能減少傳播，從而降低瘧疾在特定人群中的發(fā)病。
在血液中的無性階段中，這些寄生蟲只是短暫的直接暴露于人體免疫體系中，尤其是直接暴露于隨著血液循環(huán)流動(dòng)的抗體中也即當(dāng)裂殖子通過破裂一個(gè)細(xì)胞釋放出來之后和進(jìn)入另外一個(gè)細(xì)胞之前的這段時(shí)間。如果有特異的抗體能結(jié)合到這些寄生蟲的表面，然后這些抗體就有可能干擾這些寄生蟲侵入另一新的紅細(xì)胞的能力。實(shí)際上，已經(jīng)證明，幾種能識(shí)別這些寄生蟲表面蛋白的單個(gè)抗原決定簇的單克隆抗體能夠抑制這些寄生蟲，預(yù)防它們?cè)诩t細(xì)胞中的復(fù)制循環(huán)。
在裂殖子的表面有一種鑒定的最充分的蛋白叫做裂殖子表面蛋白1(MSP-1)。MSP-1是一種大蛋白，它的大小和氨基酸序列在不同的寄生蟲系中不同。它是由細(xì)胞內(nèi)寄生蟲以分子量大約為200kDa的前體分子形式而合成的，定位在寄生蟲的體表。在裂殖子從紅細(xì)胞中釋放和重新侵入紅血球中的過程中，這種蛋白遭受了至少兩種蛋白水解修飾作用。第一種修飾可以叫做初級(jí)加工，前體被裂解為分子量分別為大約83、30、38和42kDa的四個(gè)片段。這四個(gè)片段仍然在裂殖子表面作為一個(gè)復(fù)合體一起存在。這個(gè)復(fù)合體也含有另外兩種起源于其他基因的、分子量為22kDa和36kDa的蛋白。這個(gè)復(fù)合體是通過不同亞單位間的非共價(jià)相互作用來維持的。通過糖基磷脂酰肌醇錨定結(jié)合到分子量為42kDa的蛋白的C-末端，進(jìn)而插入裂殖子的質(zhì)膜中，這種方式使它固著到裂殖子的表面。當(dāng)裂殖子侵入紅血球時(shí)，C-末端42KDa片段是由叫做次級(jí)加工的第二次蛋白水解裂解來裂解的。次級(jí)裂解的結(jié)果是除了C-末端亞片段外的整個(gè)復(fù)合體從裂殖子的表面脫落，而C-末端亞片段僅僅由不到100個(gè)氨基酸組成，并且它在裂殖子的表面被帶入了新侵入的紅血球。
基于序列相似性，已經(jīng)有人提出這個(gè)C-末端小片段(稱作MSP-119)是由兩種表皮生長(zhǎng)因子(EGF)樣結(jié)構(gòu)域組成的(見


圖1的序列)(Blackman et al.，1991)。一種EGF樣基序由一個(gè)含有45-50個(gè)氨基酸、并且含有一個(gè)特殊的二硫鍵結(jié)構(gòu)的序列組成，這些結(jié)構(gòu)域經(jīng)常在動(dòng)物細(xì)胞外模塊蛋白中出現(xiàn)。在MSP-1的C-末端片段中，每一個(gè)基序含有用于形成3個(gè)二硫鍵的6個(gè)半胱氨酸殘基，并且每一個(gè)基序都含有與EGF共有序列部分匹配的序列(見
圖1)。然而，由于相似程度是有限的，并且二硫鍵結(jié)構(gòu)也是未知的，所以設(shè)計(jì)含有EGF樣結(jié)構(gòu)的MSP-1的C-末端片段一直是一種設(shè)想。其他相關(guān)的多種可能的EGF樣蛋白也在瘧原蟲蛋白中出現(xiàn)，但以前的結(jié)構(gòu)確定局限于對(duì)那些從后生動(dòng)物中得到的這種結(jié)構(gòu)的研究(Campbell et al.，1998)。
許多研究暗示MSP-1是保護(hù)性免疫反應(yīng)的靶。雖然我們所做工作的目標(biāo)是尋找一種可用于人類的瘧疾疫苗。出于必要性考慮，我們的實(shí)驗(yàn)工作多數(shù)是在模型動(dòng)物體系或其體外完成的。這些實(shí)驗(yàn)包括對(duì)體外特定抗體對(duì)寄生蟲侵入紅血球的作用的研究、在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)對(duì)嚙齒目瘧疾模型動(dòng)物小鼠的被動(dòng)免疫研究，以及對(duì)嚙齒目動(dòng)物瘧疾和哺乳動(dòng)物瘧疾的模型動(dòng)物進(jìn)行的直接免疫研究，這些免疫研究是利用天然蛋白(源于寄生蟲本身)或異源生物體的部分MSP-1基因表達(dá)的重組蛋白來進(jìn)行的。血清流行病學(xué)研究表明人抗體對(duì)部分MSP-1分子的反應(yīng)和對(duì)臨床疾病的防護(hù)之間有聯(lián)系。我門所做工作的很大一部分，但并非全部工作，是集中到對(duì)C-末端MSP-119的免疫反應(yīng)上的。例如，在體外培養(yǎng)時(shí)，許多能識(shí)別MSP-119D的單克隆抗體能夠保護(hù)紅血球免遭侵襲((Blackman et al..1990)。有趣的是，這些可抑制侵襲的抗體也抑制對(duì)42kDa片段的次級(jí)加工，這表明這些抗體的工作機(jī)制是通過負(fù)責(zé)次級(jí)加工的蛋白酶的空間位阻機(jī)制來作用的(Blackmanet al.，1994)。由于次級(jí)加工在成功侵襲的過程中完成，因此如果它不能發(fā)生就能阻斷侵襲。
上面描述的所有工作表明MSP-I，尤其是基于42 kDa或MSP-119區(qū)的C-末端序列是開發(fā)瘧疾疫苗的優(yōu)選片段。然而，幾項(xiàng)研究也顯示抗體在MSP-119上的抗原決定簇或結(jié)合位點(diǎn)要求正確的多肽三級(jí)結(jié)構(gòu)，但這些研究也表明那些假定為在MSP-1的半胱氨酸殘基間的二硫鍵在處理的過程中被還原，從而破壞了其三級(jí)結(jié)構(gòu)。這種局限性已經(jīng)通過表達(dá)重組蛋白的方式解決了，這些重組蛋白能夠以多種方式允許能識(shí)別天然寄生蟲MSP-1的抗體與其結(jié)合。其他的研究人員也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)MSP-1的其他部分也具有可用在疫苗之中的潛力，然而MSP-1的C末端片段目前是開發(fā)抗血液階段瘧疾寄生蟲的疫苗的首選(Diggs et al..1993；Stoute et al.，1998)。
正如上面所述，每隔大約48小時(shí)，惡性瘧原蟲裂殖子就從已經(jīng)感染的紅血球中釋放出來，然后重新侵入新的紅血球，在此期間，他們是暴露于宿主的免疫體系之中的。因此，問題就產(chǎn)生了，這些寄生蟲是怎樣進(jìn)化為能夠免遭潛在的致死作用，如中和抗體的作用。在其他的感染性微生物中，很明顯在免疫體系和這些微生物之間進(jìn)行著持續(xù)的戰(zhàn)斗，這些微生物發(fā)展了復(fù)雜的機(jī)制來逃避免疫反應(yīng)。例如，抗原變化和抗原多樣性就是其中的兩種機(jī)制，他們可以提供給免疫體系‘一個(gè)移動(dòng)的靶’，這樣即使作用某一種微生物變體的免疫反應(yīng)能夠殺死這種變體，仍然可以產(chǎn)生對(duì)這種免疫反應(yīng)具有部分和全部抗性的新變體。對(duì)瘧疾裂殖子，尤其是對(duì)MSP-1來講，已經(jīng)有另外一種機(jī)制提出，也就是某些抗體(阻斷抗體)的結(jié)合能防止中和抗體的結(jié)合，從而即使在中和抗體存在下也允許寄生蟲成功的侵入紅細(xì)胞(Guevara Patino et al.，1997)。這些阻斷蛋白可能有兩種類型，一種是可以抗某些抗原決定簇的抗體，而這些抗原決定簇由在一級(jí)序列上與那些可作為中和抗體的靶的抗原決定簇較遠(yuǎn)的氨基酸組成；另外一種是抗與中和抗體的抗原決定簇重疊的抗原決定簇的抗體。這代表了一種新穎的機(jī)制，寄生蟲可以通過它來逃避有效的免疫反應(yīng)，與其他基于抗原多態(tài)性或抗原多樣性的機(jī)制不同，這種機(jī)制不依賴于氨基序列多樣性。
某些能結(jié)合到MSP-119上的單克隆抗體(mAbs)可抑制蛋白水解裂解和對(duì)紅血球的侵襲，這表明裂解是侵襲的前提(Blackman et al.，1994)。其他可結(jié)合到MSP-1的C末端片段上的mAbs不抑制加工和侵襲，但卻抑制抑制性中和抗體的結(jié)合。其它可結(jié)合到MSP-119上的抗體不抑制也不阻斷抑制性中和抗體的結(jié)合。在有阻斷性中和抗體存在下，抑制性抗體不發(fā)揮作用，侵襲可以繼續(xù)。由免疫作用誘導(dǎo)的抑制性抗體和阻斷性抗體之間的平衡是決定免疫反應(yīng)在防止侵襲中是否發(fā)揮作用的關(guān)鍵因素(Guevara Patino et al..1997)。
發(fā)明概述因此本發(fā)明的一個(gè)目的就是提供基于瘧原蟲(Plasmodium)MSP-1蛋白變體之上的、可以抗瘧疾寄生蟲的有效疫苗。在設(shè)計(jì)這樣一種疫苗時(shí)，應(yīng)該滿足下列的標(biāo)準(zhǔn)1.用于疫苗的多肽的氨基酸序列應(yīng)該含有不僅可作為中和抗體的靶、而且又可誘導(dǎo)中和抗體的抗原決定簇。2.理想的多肽應(yīng)該不包括僅僅形成阻斷性抗體的抗原決定簇的氨基酸序列。3.如果多肽同時(shí)含有中和抗體和阻斷性抗體的抗原決定簇，那么它應(yīng)該在不影響中和抗體的前提下，經(jīng)過修飾來去除阻斷性抗體的抗原決定簇。
為了輔助設(shè)計(jì)，滿足這三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)候選疫苗的多肽，確定MSP-1C-末端片段的三維結(jié)構(gòu)是很重要的，因?yàn)檫@將幫助確定抗體與這個(gè)片段作用的位點(diǎn)。因此，我們已經(jīng)通過NMR技術(shù)確定了MSP-1C末端在溶液中的結(jié)構(gòu)，包括二硫鍵的類型。
在不影響中和抗體的結(jié)合的前提下，我們已經(jīng)對(duì)MSP-119，序列的氨基酸進(jìn)行了替代，這樣可防止單個(gè)的阻斷性抗體之間的結(jié)合。通過確定MSP-119的三維結(jié)構(gòu)，我們已經(jīng)確定了這些抗體結(jié)合位點(diǎn)在三級(jí)結(jié)構(gòu)上的位置，這樣就允許了利用其他性質(zhì)相似的氨基酸進(jìn)行替代。我們已經(jīng)證明，幾種替代作用，他們每一種替代作用都影響一或多種阻斷性抗體的結(jié)合，可以結(jié)合到一個(gè)分子上。這些經(jīng)過修飾的分子繼續(xù)結(jié)合到中和抗體上，但卻不能與任何阻斷性抗體結(jié)合。當(dāng)利用瘧疾疫苗免疫個(gè)體時(shí)，在誘導(dǎo)保護(hù)性中和抗體反應(yīng)方面，這樣的修飾分子的預(yù)期作用要比天然或野生型蛋白結(jié)構(gòu)的作用要強(qiáng)的多。此外，我們已經(jīng)在分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)方面做了另外的修飾，這些修飾并不影響中和抗體的結(jié)合，但卻有助于增加分子的免疫原性。這些修飾過的MSP-119結(jié)構(gòu)，在單獨(dú)或與載體結(jié)合的條件下，將會(huì)是比沒有經(jīng)過這種方法修飾的相同結(jié)構(gòu)更有效的疫苗，而所用到的載體可含有或不含MSP-1的其他部分以增加其免疫原性(例如修飾過的MSP-119與MSP-142kDa片段的剩余部分相結(jié)合)和提供額外的T細(xì)胞抗原決定簇。
因此，本發(fā)明提供了瘧原蟲裂殖子表面蛋白1(MSP-1)C-末端片段的非天然變體，該變體具有(1)與天然的瘧原蟲MSP-119相比，具有降低了的至少對(duì)第一種抗體親和性，第一種抗體能阻斷第二種抗體的結(jié)合，而第二種抗體是抑制瘧原蟲MSP-142的蛋白酶解裂解(cleavage)的，以及(2)與天然的瘧原蟲MSP-119相比，對(duì)該第二種抗體基本上具有相同的親和性。
優(yōu)選的，瘧原蟲MSP-119和MSP-142是惡性瘧原蟲的MSP-119和MSP-142。
第一種抗體優(yōu)選的是選自mAbs IEI，2.2，7.5，9C8和111.4。第二種抗體優(yōu)選的是選自mAbs 12.8，12.10和5B1。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了瘧原蟲裂殖子表面蛋白1(MSP-1)C-末端片段的非天然變體，該變體含有對(duì)惡性瘧原蟲的MSP-119氨基酸序列的第14、15、27、31、34、43、48和53位氨基酸殘基中的任一氨基酸殘基修飾過的氨基酸，MSP-119的氨基酸序列在SEQ ID.NO.1中有描述，或者該變體含有對(duì)其他瘧原蟲MSP-l19多肽的等價(jià)位置上的氨基酸修飾過的氨基酸。
該修飾作用優(yōu)選的選自Gln14→Arg、Gln14→Gly、Asn15→Arg、Glu27→Tyr、Leu31→Arg、Tyr34→Ser、Tyr34→Ile，、Glu43→Leu、Thr48→Lys及Asn53→Arg間的替代作用，以及選自其他MSP-119蛋白多肽上的等價(jià)氨基酸的替代作用。更加優(yōu)選的替代是幾種替代方式的結(jié)合，這些替代是選自[Glu27→Tyr，Leu31→Arg and Glu43→Leu]，[Glu27-Tyr，Leu31→Arg，Tyr34→Ser和Glu43→Leu]，[Asn15→Arg，Glu27→Tyr，Leu31→Arg和Glu43→Leu]以及選自其他MSP-119蛋白多肽上的等價(jià)氨基酸替代作用。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明中MSP-1多肽的變體進(jìn)一步包括在SEQ ID.NO.1中所示的惡性瘧原蟲MSP-119的氨基酸序列中的Cys12和Cys28發(fā)生突變的的變體。優(yōu)選的修飾是選自Cys12→Ile、Cys28→Trp、Cys12→Ala和Cys28→.Phe的替代作用。
最優(yōu)選的替代作用是幾種替代作用的結(jié)合使用，這些替代作用選自[Cys12→Ile，Asn 15→Arg，Glu27→Tyr，Cys28→Trp，Leu31→Arg，Glu43→Leu]，[Cys12→Ile，Asn 15→Arg，Glu27→Tyr，Cys28→Trp，Leu31→Arg，Glu43→Leu，Asn53→Arg]，[Cys12→Ile，Asn 15→Arg，Glu27→Tyr，Cys28→Trp，Leu31→Arg，Tyr34→Ser，Glu43→Leu，Asn53→Arg]以及其他MSP-119蛋白多肽上的等價(jià)氨基酸的替代作用。
本發(fā)明也提供了生產(chǎn)瘧原蟲MSP-1變體以用于制備疫苗組合物的方法，這種方法包括對(duì)瘧原蟲MSP-1 C-末端片段的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基進(jìn)行修飾，從而使產(chǎn)生的衍生物具有(1)與天然的瘧原蟲MSP-119相比，具有降低了的對(duì)至少第一種抗體的親和性，第一種抗體能阻斷第二種抗體的結(jié)合，而第二種抗體是抑制瘧原蟲MSP-142的蛋白酶解裂解的，以及(2)與該天然的瘧原蟲MSP-119相比，對(duì)該第二種抗體基本上具有相同的親和性。尤其是本發(fā)明的方法優(yōu)選的含有一個(gè)預(yù)備步驟，也即通過三維NMR模型結(jié)構(gòu)來選擇一種候選氨基酸殘基，優(yōu)選的是在表2中所列出的。更具體地講，這種三維模型結(jié)構(gòu)可用于選擇暴露于表面的氨基酸殘基。較為有利的是進(jìn)一步的步驟包括利用計(jì)算機(jī)模擬這些變體的三維結(jié)構(gòu)以排除錯(cuò)誤折疊的多肽。
本發(fā)明也提供了利用本發(fā)明中的方法獲得的非天然瘧原蟲MSP-1變體。
進(jìn)一步，本發(fā)明提供了可編碼本發(fā)明中的變體的多核苷酸，這些多核苷酸可操作地連接到能夠指導(dǎo)該核苷在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的調(diào)節(jié)序列上。這種多核苷酸可能含有已經(jīng)優(yōu)化以在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)的序列。宿主細(xì)胞可以是Pichia pastoris細(xì)胞。本發(fā)明也提供了含有本發(fā)明中的多核苷酸的載體，這些載體包括病毒載體，以及含有本發(fā)明中的核苷或載體的宿主細(xì)胞。
另一方面，本發(fā)明提供了一種藥用組合物，這種組合物含有本發(fā)明中的變體、本發(fā)明中的多核苷酸，或含有與藥物上可接受的載體或稀釋液結(jié)合的本發(fā)明中的載體。
優(yōu)選的，這種組合物進(jìn)一步包含有具有免疫原性的瘧原蟲多肽，或其片段，或其衍生物如MSP-133或其可共價(jià)結(jié)合到非天然的MSP-119上的衍生物。優(yōu)選的是不選用野生型MSP-119序列。進(jìn)一步的免疫原性肽段本身可以一種類似于上述的MSP-119的方式進(jìn)行衍生。因此，在不影響中和抗體結(jié)合的情況下，可對(duì)肽段中的抗原決定簇進(jìn)行鑒別和修飾以防止阻斷性抗體的結(jié)合。這些抗原決定簇能夠結(jié)合到與上文描述的第一個(gè)抗體具有相似性質(zhì)，如結(jié)合的親和性的抗體上。進(jìn)一步免疫原性肽可包括在其氨基酸序列上進(jìn)行若干上述修飾。
本發(fā)明也提供了制備抗MSP-1抗體的方法，這種方法包括給哺乳動(dòng)物，典型的是非人類的哺乳動(dòng)物服用本發(fā)明中的多肽變體，或本發(fā)明中的多核苷酸，或本發(fā)明中的載體。
在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)多克隆抗MSP-1抗體的方法，這個(gè)方法包括給哺乳動(dòng)物，典型的是非人類的哺乳動(dòng)物服用本發(fā)明中的多肽變體，或本發(fā)明中的多核苷酸，或本發(fā)明中的載體，并且從該動(dòng)物中收集血清。本發(fā)明還提供了應(yīng)用這種制備方法得到的抗體。
本發(fā)明中的多肽、核苷酸和載體可用于治療和/或預(yù)防由瘧原蟲，尤其是惡性瘧原蟲引起的瘧疾的方法中。因此，本發(fā)明提供了誘導(dǎo)抗由惡性瘧原蟲引起的瘧疾的免疫的方法，這種方法給需要這種免疫的人服用有效劑量的本發(fā)明中的變體、多核苷酸或載體。
本發(fā)明還提供了免疫哺乳動(dòng)物的方法，該方法包括服用有效劑量的本發(fā)明中的變體、多核苷酸或載體。尤其是該哺乳動(dòng)物進(jìn)行的是抗瘧疾的免疫。優(yōu)選的哺乳動(dòng)物是人。
本發(fā)明還提供了治療病人瘧疾感染的方法，這種方法包括給病人服用有效劑量的本發(fā)明中的藥用組合物。
按本發(fā)明，我們進(jìn)一步提供了一種可編碼瘧原蟲MSP-1多肽的核酸，這種核酸已經(jīng)進(jìn)行了優(yōu)化以便于在異源宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。優(yōu)選的異源宿主是Pischia pasforis細(xì)胞。MSP-1多肽可從一組多肽中選取，這組多肽包括含有圖2C和2E中所示序列的MSP-142多肽、含有圖2C中所示序列的MSP-119多肽、含有圖2E中所示序列的MSP-133多肽。經(jīng)過優(yōu)化的核酸可包括選自圖2A、2B、2D的序列。我們進(jìn)一步提供了含有這種核酸的載體、含有這種核酸或載體以及藥物上可接受的載體或稀釋液的可以藥用的組合物。這種藥物上可接受的組合物可進(jìn)一步含有免疫原性瘧原蟲多肽或其片段或其衍生物。發(fā)明詳述一般來講，雖然此處所提到的技術(shù)是本領(lǐng)域中熟知的，但文獻(xiàn)尤其是參考Sambrook等的‘分子克隆’、‘實(shí)驗(yàn)室操作手冊(cè)’和Ausubel等編著、John Wiley & Sons.Inc出版的Current Protocols inMolecular Biology(1995)。A.MSP-1變體的多肽在本發(fā)明中的變體MSP-1多肽方面，我們將結(jié)合惡性瘧原蟲MSP-I的氨基酸序列進(jìn)行描述。然而，應(yīng)該指出的是除非另有說明，所有涉及MSP-1多肽的包括其他瘧原蟲中內(nèi)發(fā)現(xiàn)的MSP-1的同源物，例如感染人類的P.vivax、P.malariae和P.ovale；感染鼠的P.yoelii。
本發(fā)明中的MSP-1多肽變體是基于惡性瘧原蟲MSP-142的C-末端片段之上的，如SEQ ID.Nos.2或3中所示。這些變體包括所有的或部分MSP-119區(qū)(SEQ ID.No1)，優(yōu)選的是至少基本上所有的MSP-119結(jié)構(gòu)域1和/或結(jié)構(gòu)域2的EGF樣序列包括在內(nèi)(大約是SEQ ID.No1中分別是第1到47個(gè)氨基酸和第48到96個(gè)氨基酸)。尤其優(yōu)選的是選用在多數(shù)，更加優(yōu)選的是選用在某一種的所有寄生蟲中都是保守的區(qū)域來增加變體作為針對(duì)多種菌株的疫苗的效用。
本發(fā)明中的變體MSP-1多肽包括有對(duì)他們的氨基酸一級(jí)序列進(jìn)行的修飾，這些修飾可降低阻斷性抗體對(duì)MSP-1多肽的結(jié)合能力。此外，所做的任何修飾作用都要維持可被中和抗體識(shí)別的抗原決定簇，這樣就可使得中和抗體對(duì)MSP-1變體的親和性與對(duì)天然MSP-1的親和性基本相同(例如具有SEQ ID.No.2或3中所示序列的MSP-142多肽)。某些中和抗體結(jié)合的減少是可以接受的，因?yàn)槲覀兊闹饕繕?biāo)是去抑制阻斷性抗體的結(jié)合，并且很有可能阻斷性抗體的有效減少可以彌補(bǔ)由小部分中和抗體結(jié)合減少引起的疫苗總體功效的損失。
本發(fā)明的上下文中提到的中和抗體，是指那些抑制瘧疾寄生蟲復(fù)制的抗體。許多中和抗體，包括單克隆和多克隆抗體在本領(lǐng)域中是已知的，他們包括實(shí)施例中提到的mAbs 12.8、12.10和5B1。中和抗體的活性可以通過多種方法確定，這些方法在本領(lǐng)域中有描述。例如，1994年Blackman等描述的一種方便的檢測(cè)方法中包括利用裂殖子制劑(Blackman等，1993；Mrema等，1982)來測(cè)定由MSP-142到MSP-133和MSP-119的裂解。簡(jiǎn)單來講，新分離的裂殖子要用冰冷的緩沖液沖洗兩次，然后分為含有2×109個(gè)裂殖子的等份。將待測(cè)抗體添加到每一等份中，然后此樣品在37℃下培育1小時(shí)。然后，在非還原性條件下對(duì)樣品進(jìn)行聚丙烯酰氨凝膠濃度為2.5％的SDS-PAGE電泳、WESTERN印跡和對(duì)MSP-133進(jìn)行抗血清印跡探針。在對(duì)照樣品中，可以看到兩條主要的條帶---一條是對(duì)應(yīng)于MSP-142，另一條小分子量的是對(duì)應(yīng)于MSP-133。由于可抑制對(duì)MSP-142的次級(jí)蛋白酶加工，中和抗體會(huì)降低低分子量條帶的數(shù)量。
在被認(rèn)為是阻斷性抗體的抗體存在下，這種方法是評(píng)估中和抗體效用的一種最優(yōu)選的方法。為了檢測(cè)候選多肽與阻斷性抗體的競(jìng)爭(zhēng)，就要按上述方法在與中和抗體的于37℃、培養(yǎng)1小時(shí)之前，對(duì)裂殖子樣品和一種阻斷性抗體在冰上進(jìn)行15分鐘的預(yù)培育。這樣，利用這種檢測(cè)方法，就能很容易的對(duì)阻斷性抗體進(jìn)行鑒別和/或性質(zhì)鑒定。
其他的檢測(cè)方法包括Blackman等在1990年提出的裂殖子侵入抑制檢驗(yàn)。
正如上面所討論的，在本發(fā)明中阻斷性抗體被定義為抑制中和抗體與MSP-1結(jié)合、但他們本身又不抑制瘧疾寄生蟲對(duì)紅血球的侵襲的抗體。這樣他們就阻斷了中和抗體的中和功能。在本領(lǐng)域中，已經(jīng)對(duì)多種抗體進(jìn)行了定性，這些抗體包括實(shí)施例中提到的mAbsIEl，2.2，7.5和111.4。正如上文討論的，通過利用對(duì)中和抗體功能的影響進(jìn)行檢測(cè)的方法就能很方便的對(duì)阻斷性抗體進(jìn)行鑒別和/或定性。
可用于生產(chǎn)本發(fā)明中的MSP-1變體的修飾作用包括替代作用、缺失作用和插入作用。尤其優(yōu)選的是利用替代作用來減少對(duì)多肽二級(jí)和三級(jí)機(jī)構(gòu)的破壞。此外，尤其優(yōu)選的替代是那些利用一類氨基酸來替代另一類氨基酸，例如利用帶電極性殘基來替代脂肪族的非極性殘基。例如，二十種天然氨基酸可分為四個(gè)主要的類(脂肪族非極性)[G、A、P、I、L和V}；極性不帶電荷[C、S、T、M、N和Q]；極性帶電荷[D、E、K和R]以及芳香族氨基酸[H、F、W和Y])，優(yōu)選的是利用一類氨基酸中的一種來替代另一類氨基酸的一種。
其他可能的替代包括用帶負(fù)電荷的側(cè)鏈替代帶正電荷的側(cè)鏈、用有小側(cè)鏈或沒有側(cè)鏈的氨基酸(甘氨酸)來替代有大側(cè)鏈的氨基酸、用帶電荷的極性氨基酸代替極性氨基酸、用有小側(cè)鏈的氨基酸替代芳香性大氨基酸、以及替代包含在二硫鍵內(nèi)的半胱氨酸殘基。
尤其優(yōu)選的修飾是對(duì)SEQ ID NO.1的惡性瘧原蟲MSP-I19氨基酸序列的第14、15、27、31、34、43、48和53位氨基酸殘基的任一個(gè)氨基酸進(jìn)行的修飾，或在其他MSP-119多肽的對(duì)應(yīng)位置上進(jìn)行的修飾。這些殘基幾乎全部在EGF樣結(jié)構(gòu)域1中。我們知道，某些抗體的抗原決定簇含有在EGF樣結(jié)構(gòu)域2中的氨基酸，因此，等價(jià)的修飾也可應(yīng)用于EGF樣結(jié)構(gòu)域2。優(yōu)選的修飾示例包括下述替代作用Gln14→Arg、Gln14→Gly、Asn15→Arg、Glu27→Tyr、Leu31→Arg、Tyr34→Ser、Tyr34→Ile，、Glu43→Leu、Thr48→Lys和/或Asn53→Arg，以及在其他瘧原蟲的MSP-119多肽的相同位置上進(jìn)行的替代作用。
尤其優(yōu)選的是進(jìn)行多個(gè)修飾，也即多種修飾結(jié)合使用，例如對(duì)兩種或三種或更多種修飾進(jìn)行結(jié)合使用。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明中的一種MSP-1變體含有對(duì)選自下列氨基酸替代作用的多種進(jìn)行結(jié)合使用，這些氨基酸替代作用包括[Glu27→Tyr，Leu31→Arg和Glu43→Leu]，[Glu27→Tyr，Leu31→Arg，Tyr34→Ser和Glu43→Leu]，[Asn15→Arg，Glu27→Tyr，Leu31→Arg和Glu43→Leu]以及在其他瘧原蟲MSP-119多肽上的等價(jià)位置進(jìn)行的替代作用。
一種尤其優(yōu)選的結(jié)合使用進(jìn)一步包括對(duì)Cys12和或Cys28(和/或他們?cè)贓GF樣結(jié)構(gòu)域2中的等價(jià)殘基)的修飾來破壞二硫鍵。優(yōu)選的，這種修飾作用是選自Cys12→Ile、Cys28→Trp，、Cys12→Ala和Cys28→Phe的替代作用。
最優(yōu)選的替代作用是多個(gè)替代的結(jié)合使用，這些替代作用是選自，[Cys12→Ile，Asn 15→Arg，Glu27→Tyr，Cys28→Trp，Leu31→Arg，Glu43→Leu，Asn53→Arg]，[Cys12→Ile，Asn 15→Arg，Glu27→Tvr，Cys28→Trp，Leu31→Arg，Tyr34→Ser，Glu43→Leu，Asn53→Arg]以及在其他瘧原蟲MSP-119多肽上的等價(jià)位置進(jìn)行的替代作用。
替代作用并不局限于使用天然氨基酸，也可以使用非天然氨基酸類似物，尤其是在通過固相合成方法來化學(xué)合成變體，而不是通過重組技術(shù)來制備變體的時(shí)候。
對(duì)MSP-1氨基酸序列的修飾可以通過利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如利用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行的定點(diǎn)誘變來完成。另外，也可通過固相合成技術(shù)來獲得變體。
為了確定通過對(duì)其氨基酸一級(jí)序列進(jìn)行修飾制得的MSP-1多肽是否符合上述標(biāo)準(zhǔn)，要對(duì)至少一種中和抗體和至少一種阻斷性抗體對(duì)變體多肽的親和性進(jìn)行檢測(cè)，這種檢測(cè)是以這兩種抗體對(duì)天然MSP-1序列的親和性做對(duì)照的。較為理想的是應(yīng)該使用每一種類型的多種抗體，例如兩或三種。
為了確定抗體對(duì)變體和野生型多肽的結(jié)合能力，就要利用本領(lǐng)域中的多種方法中的一種來確定抗體-抗原決定簇的結(jié)合。在實(shí)施例中有所描述的這樣的一種方法包括，利用以與諸如谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)的蛋白標(biāo)記融合的融合蛋白形式表達(dá)的，MSP-1序列。這些GST融合蛋白一般是固定化到一種固相如谷胱肽等sepharose珠或BIAcore傳感器芯片上的，可以通過標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)，如Western印跡和或通過對(duì)抗體進(jìn)行放射性標(biāo)記如125I標(biāo)記，來確定抗體如單克隆抗體與融合蛋白的結(jié)合。應(yīng)用BIAcore技術(shù)可很容易的對(duì)結(jié)果進(jìn)行定量。
優(yōu)選的，相對(duì)于野生型MSP-1而言，對(duì)至少一種阻斷性抗體的結(jié)合降低50％，更優(yōu)選的是至少降低75％、80％或90％，這些一般來講是通過固定化到BIAcore傳感芯片上的重組表達(dá)的MSP-1來進(jìn)行估算的。相反，對(duì)至少一種中和抗體，例如對(duì)至少兩種或三種被檢測(cè)的中和抗體的結(jié)合，更優(yōu)選地至少對(duì)于一半的被檢測(cè)中的和抗體的結(jié)合，更優(yōu)選的是基本上對(duì)所有被檢測(cè)的中和抗體的結(jié)合也降低了不到50％，更優(yōu)選的是使結(jié)合降低小于25％。為了確定與檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)是否一致而需要進(jìn)行檢測(cè)的中和抗體的數(shù)量一般不超過三到五種(示例中選用了三種)。在一種尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少一種中和抗體的結(jié)合提高了至少10％。
實(shí)施例部分表2中給出的結(jié)果對(duì)熟練的技術(shù)人員提供了部分指導(dǎo)，以此來確定哪些殘基可以進(jìn)行修飾來制備本發(fā)明中的變體MSP-1。然而，本文第一次提供的在MSP-119三維溶液結(jié)構(gòu)方面的信息，進(jìn)一步提供給熟練技術(shù)人員在關(guān)于對(duì)哪些殘基可以進(jìn)行改變方面的詳細(xì)指導(dǎo)。尤其是抗原決定簇是期望暴露于MSP-119片段外部的水相環(huán)境中。因此，本文所提供的精確結(jié)構(gòu)信息講授了暴露的氨基酸在表面的部位，這使得熟練技術(shù)人員能夠靶定那些殘基進(jìn)行修飾。表A/B提供的數(shù)據(jù)已經(jīng)提交給蛋白數(shù)據(jù)庫(PDB序號(hào)為1CEJ)。這使得熟練技術(shù)人員能夠確定單個(gè)氨基酸在三維結(jié)構(gòu)中的精確定位。一般來講，這些數(shù)據(jù)將會(huì)添加到本領(lǐng)域中熟知的合適軟件中，例如Insight II.MOLSCRIPT GRAS P和RASMOL。
此外，知道了在三維結(jié)構(gòu)中的那些影響阻斷性抗體結(jié)合但不影響中和抗體結(jié)合的的修飾的位點(diǎn)，就可能確定在最初經(jīng)過修飾的蛋白表面上和其附近的其他殘基，這樣易于進(jìn)一步提高這些修飾過的蛋白的性能。這些殘基可能在第一個(gè)EGF樣基序或第二個(gè)EGF樣基序上，或者二者中間。既然我們已知一個(gè)抗體結(jié)合位點(diǎn)包含了相應(yīng)于大約5到8個(gè)氨基酸的體積，那很顯然對(duì)這些相鄰氨基酸殘基的修飾也影響到該蛋白與阻斷性抗體的結(jié)合能力。只要相鄰氨基酸經(jīng)過鑒定為可以按上述原則進(jìn)行修飾，那么就能對(duì)這些修飾，單獨(dú)或多種修飾方法結(jié)合使用，對(duì)整體抗原性和免疫原性的貢獻(xiàn)作出評(píng)估。那些能夠降低對(duì)阻斷性蛋白的親和能力，但又基本上不影響中和抗體結(jié)合的改變可以引用到已經(jīng)進(jìn)行過改進(jìn)的蛋白中。這可以是一個(gè)反復(fù)的過程。
此外，3DNMR結(jié)構(gòu)可幫助熟練技術(shù)人員對(duì)MSP-119變體的特定修飾進(jìn)行模型研究，這樣就例如可將那些不能正確折疊的變體拋棄。這將有助于減少需要進(jìn)行檢測(cè)的候選MSP-119變體的數(shù)量。
因此，本發(fā)明也提供了保存有MSP-119NMR結(jié)構(gòu)模型的計(jì)算機(jī)可讀媒介。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該模型是利用表A或B所示的全部或部分NMR數(shù)據(jù)來建立的。
本發(fā)明中的變體可以選擇性的包括額外的MSP-1序列，尤其是MSP-142區(qū)中的MSP-133區(qū)中能提供給變體額外的免疫原性的區(qū)域。此外，那些已知含有和提高T細(xì)胞反應(yīng)的額外序列是優(yōu)先包括在內(nèi)的(也即T細(xì)胞抗原決定簇)。也可通過進(jìn)行其他的修飾方法來提高免疫原性如那些可改變抗原加工和表達(dá)途徑的修飾方法。
本發(fā)明中的多肽變體一般是通過重組方法來制得的，例如下面所描述的。然而，也可以利用通過熟練技術(shù)人員熟知的技術(shù)，如固相合成，通過合成的方式來制備。本發(fā)明中的蛋白也可作為融合蛋白制備，例如，以便有利于提取和純化。融合蛋白配偶體的例子包括谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)、6xHis、GAL-4(DNA結(jié)合或轉(zhuǎn)錄活化區(qū)域)及β-半乳糖苷酶。也可在融合蛋白配偶體和感興趣的蛋白序列之間包括蛋白水解裂解位點(diǎn)，以便可以切除事蛋白序列。優(yōu)選的融合蛋白是不會(huì)干擾MSP-1變體的免疫原性的。
本發(fā)明的多肽可以是基本上以分離形式存在?？梢哉J(rèn)為這些多肽可與不影響多肽既定功能的載體或溶劑混合，這種狀態(tài)的多肽基本上也可認(rèn)為是分離形式的。本發(fā)明中的多肽也可以基本純化的狀態(tài)存在，這種情況下，一般來講，制劑中含有的多肽至少90％，如95％、98％或99％是本發(fā)明中的多肽。B.多核苷酸和載體正如上述討論的，本發(fā)明中的變體可以通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行重組制備。因此，本發(fā)明也提供了編碼本發(fā)明中的MSP-1變體的多核苷酸。本發(fā)明中的多核苷酸可包括DNA或RNA。他們也可以是包括合成的或修飾的核苷酸的多核苷酸。在本領(lǐng)域中，對(duì)寡核苷酸的多種修飾方法是已知的。這些修飾方法包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯主鏈、在分子的3′和/或5′末端添加吖啶或聚賴氨酸鏈。與本發(fā)明的目的相聯(lián)系，我們可以認(rèn)為此處描述的多核苷酸可以通過本領(lǐng)域中已有的技術(shù)來進(jìn)行修飾。進(jìn)行這些修飾的目的是為了提高本發(fā)明中的多核苷酸在體內(nèi)的活性或延長(zhǎng)其壽命。熟練技術(shù)人員都知道，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，多種不同的多核苷酸能編碼同一種多肽。
本發(fā)明中的多核苷酸包括可以引入可復(fù)制的載體的多核苷酸。這些載體可用于在合適的宿主細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制核酸。因此在進(jìn)一步的優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明也提供了制備本發(fā)明中的多核苷酸的方法，這個(gè)方法將本發(fā)明中的多核苷酸引入可復(fù)制的載體中，將此載體引入合適的宿主細(xì)胞中，然后讓宿主細(xì)胞在能進(jìn)行載體復(fù)制的條件下生長(zhǎng)?？梢詮脑撍拗髦谢厥账鲚d體。合適的宿主細(xì)胞包括細(xì)菌如大腸桿菌、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞系以及其他的真核細(xì)胞系，例如昆蟲Sf9細(xì)胞。這種宿主也可以是甲基營養(yǎng)酵母如Pichta pasroris。
可對(duì)天然MSP-1多肽或MSP-1多肽變體(包括本發(fā)明的多肽)的編碼序列進(jìn)行修飾，以優(yōu)化其在宿主細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。例如，通過去除次級(jí)修飾必須的序列，就可以避免進(jìn)行次級(jí)修飾，如N-糖基化。按照宿主細(xì)胞中的優(yōu)化表達(dá)的密碼子的用途，多肽序列可通過另外的方法或附加修飾來修飾。在本領(lǐng)域中，對(duì)序列進(jìn)行誘變處理的方法是已知的，另外，利用重疊合成寡核苷酸進(jìn)行PCR基因裝配可得到經(jīng)過修飾的編碼序列(Stemmer et al.，1995；Withers-Martinez et al.，1999).。
優(yōu)選的，通過宿主細(xì)胞可將包含在載體中的、本發(fā)明的多核苷酸可操作的連接到一個(gè)調(diào)節(jié)序列上，而此調(diào)節(jié)序列是能夠讓宿主表達(dá)該編碼序列的，也即這個(gè)載體是表達(dá)載體。名詞‘可操作的連接‘指的是并置(jutfaposition)，此處描述的這些元件間關(guān)系允許他們以既定的方式行使他們的功能。一種調(diào)節(jié)序列“可操作的連接”到編碼序列上是指他們以這樣的一種方法進(jìn)行連接，這種方式是指在與控制序列相容的條件下編碼序列能夠表達(dá)。
利用上述的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可將這些載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染入合適的宿主細(xì)胞中來提供本發(fā)明中的多肽的表達(dá)。這個(gè)過程包括在特定條件下培養(yǎng)上述利用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化了的宿主細(xì)胞，這種特定條件也是通過可編碼多肽的編碼序列的載體進(jìn)行表達(dá)的條件，并且選擇性地回收表達(dá)的載體。
這些載體可以是，如質(zhì)?；虿《据d體，但這些載體必須含有復(fù)制起點(diǎn)、用于表達(dá)該多核苷酸的隨意的啟動(dòng)子，以及該啟動(dòng)子的隨意一個(gè)調(diào)節(jié)子。這些載體可含有一或多個(gè)可選擇的標(biāo)志基因，例如在細(xì)菌質(zhì)粒中的氨芐青霉素抗性基因，或哺乳動(dòng)物載體中的新霉素抗性基因。這些載體可用于體外，例如用于制備RNA，或用于轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。也可對(duì)這些載體進(jìn)行改造以用于體內(nèi)，例如作為一種基因治療的方法。
我們要選用與那些為之設(shè)計(jì)表達(dá)載體的宿主細(xì)胞相適合的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子和其他表達(dá)調(diào)節(jié)信號(hào)。例如，可選用原核生物啟動(dòng)子，尤其是那些適用于大腸桿菌菌株的啟動(dòng)子(例如大腸桿菌HB101或DH5a)。
當(dāng)本發(fā)明中的多肽是在體內(nèi)或者體外的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)時(shí)，我們就可以選用哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子?？梢赃x用組織特異性啟動(dòng)子。也可選用病毒啟動(dòng)子，例如Moloney murine白血病病毒長(zhǎng)末端重復(fù)(MMLV LTR)，魯斯氏肉瘤病毒LTR啟動(dòng)子、SV40啟動(dòng)子、人細(xì)胞巨化病毒(CMV)IE啟動(dòng)子、皰疹單純病毒啟動(dòng)子或腺病毒啟動(dòng)子。所有這些病毒在本領(lǐng)域中都很易于獲得。C.給藥本發(fā)明中的MSP-1多肽變體和核酸分子可用于治療或預(yù)防動(dòng)物，尤其是人瘧疾。
本發(fā)明中的多肽可利用直接注射的方式給藥。優(yōu)選的是多肽與藥物上可接受的載體或溶劑結(jié)合以產(chǎn)生一種藥物組合物。合適的載體和溶劑包括等滲的鹽溶液，例如磷酸緩沖鹽。這些組合物是制備來進(jìn)行腸胃外、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、眼內(nèi)或經(jīng)皮內(nèi)給藥的。一般來講，每種多肽給藥劑量是0.01-30μg/kg體重，優(yōu)選0.1-10μg/kg體重，更優(yōu)選的是0.1-1.0μg/kg體重。也有可能應(yīng)用通過本發(fā)明中的多肽制備的抗體來治療或預(yù)防瘧原蟲感染，這在下文中有描述。中和抗體或其保留有瘧原蟲抗原特異性的片段可以與本發(fā)明中的多肽類似的方式給藥。
本發(fā)明中的多核苷酸可以裸露的核酸結(jié)構(gòu)直接給藥。當(dāng)表達(dá)盒是以裸露的核酸給藥時(shí)，核酸給藥劑量一般是1μg-10mg，優(yōu)選100μg-1mg。
通過幾種已知的轉(zhuǎn)染技術(shù)如那些技術(shù)包括利用轉(zhuǎn)染劑，可提高哺乳動(dòng)物細(xì)胞對(duì)裸露的核酸結(jié)構(gòu)的吸收。這些轉(zhuǎn)染劑包括陽離子劑(如磷酸鈣和DEAE-右旋糖苷)和脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑(如LipofectamTM和transfectamTM)。一般來講，核酸結(jié)構(gòu)是與轉(zhuǎn)染劑混合來生成一種組合物的。
另外，多核苷酸也可作為核酸載體的部分來給藥的，這些載體包括質(zhì)粒載體或病毒載體，例如牛痘病毒載體。當(dāng)本發(fā)明中的多核昔酸通過本發(fā)明中的病毒載體轉(zhuǎn)入細(xì)胞中時(shí)，給藥的病毒載體數(shù)量是103-1010pfu，優(yōu)選105-108pfu，更優(yōu)選106-107pfu。當(dāng)采用注射給藥時(shí)，一般給藥以1-10μl的病毒，這些病毒是在藥物上可接受的載體上或溶劑中的。
優(yōu)選的，轉(zhuǎn)運(yùn)運(yùn)載體(也即，例如含有多核苷酸的核酸結(jié)構(gòu)或病毒載體)是與一種藥物上可接受的載體或溶劑結(jié)合來產(chǎn)生一種藥物組合物。合適的載體或溶劑包括等滲的鹽溶液，例如磷酸緩沖鹽溶液。這些組合物是制備來進(jìn)行腸胃外、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、眼內(nèi)或經(jīng)皮內(nèi)給藥的。
此處所述的給藥途徑和劑量只是作為一種指導(dǎo)，因?yàn)橛薪?jīng)驗(yàn)的醫(yī)生可以很容易的對(duì)特定的病人和病情確定最適給藥途徑和劑量。D.疫苗的制備可以從本發(fā)明中的一或多種多肽來制備疫苗。這些疫苗可包括本領(lǐng)域中已知的一或多種免疫原性瘧原蟲多肽。因此，本發(fā)明中的一種疫苗可包括本發(fā)明中的一或多種多肽，以及從，例如無性血液階段的蛋白(asexual blood stage protein)頂點(diǎn)裂殖子(apical merozoite)抗原-1、紅血球結(jié)合抗原175、紅血球膜蛋白-1；肝階段蛋白(hepaticstage protein)肝階段抗原(lirer stage protein)-1和3；孢子體階段蛋白瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白、與血小板反應(yīng)素相關(guān)的粘附蛋白；以及有性階段蛋白Pfs25和Pfs28多肽及其免疫原性片段中隨意選出的一或多種多肽。優(yōu)選的，其他這些本領(lǐng)域中已知的瘧原蟲免疫原性多肽是不含有野生型MSP-119序列的。
對(duì)本領(lǐng)域中的熟練技術(shù)人員來講，含有免疫原性多肽作為活性成分的疫苗制劑是熟知的。一般來講，這些疫苗是以溶液或懸浮液等可注射的形式來制備的。也可以制備適于溶解在或懸浮在注射前的液體中的固體形式。這些制劑可進(jìn)行乳化，或者將蛋白包被在脂質(zhì)體中?；钚悦庖咴煞殖３Ｅc賦形劑相混合，而這些賦形劑是藥物上可接受的，但是與活性功能成分相適合的。合適的賦形劑有，如水、鹽、右旋糖、甘油、乙醇等等以及他們的結(jié)合使用。此外，如果需要，疫苗可含有少量的輔助物質(zhì)，如潤濕因子或乳化因子、pH緩沖物質(zhì)、和/或可提高疫苗效用的助劑。有效助劑的例子包括但并不局限于氫氧化鋁、N-乙酰—胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酸鹽(thr-NfDP)、N-乙酰-nor-胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺(CGP 11637，稱為norWIDP)，N-乙酰-胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕櫚酰-sn-甘油酰-3-羥磷酰氧)-乙胺(CGP 19835A，稱為MTP-PE)、以及含有從細(xì)菌中提取得到的三種成分的RIBI，這三種成分為在2％鯊烯/吐溫80乳狀液中的單磷酰脂A、海藻糖dimycolate和細(xì)胞壁骨架(NIPL+TDM+CWS)。助劑的有效性可以通過測(cè)定直接抗免疫原性多肽的抗體的數(shù)量來確定，這些免疫原性多肽是含有MSP-1抗原序列的，這些序列的抗原性又是從對(duì)也含有多種助劑的疫苗的多肽給藥過程中獲得的。
這些疫苗傳統(tǒng)上是以腸胃外、注射如皮下注射或肌肉內(nèi)注射的方式來給藥的。適合于其他方式給藥的額外制劑包括栓劑，有些情況下是口服制劑。對(duì)栓劑來講，傳統(tǒng)上的結(jié)合物和載體包括多亞甲基乙二醇或甘油三酸酯；這些制劑可以從含有0.5％-1.0％活性成分、優(yōu)選1％-2％活性成分的混合物制備得到?？诜苿┌ㄟ@些正常使用的賦形劑如藥用級(jí)的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等等。這些組合物以溶液、懸浮液、片劑、丸劑、膠囊、緩釋制劑或粉劑的形式存在，并且其中含有10％-95％的活性成分，優(yōu)選的是25％-70％。如果疫苗組合物經(jīng)過低壓冷凍干燥，那么干燥后的組合物可在給藥前進(jìn)行再造，例如再造為懸浮液。優(yōu)選的再造是在緩沖液中進(jìn)行的。
用于對(duì)病人進(jìn)行口服的膠囊、片劑和丸劑可以包被有腸衣，這些腸衣可含有，例如Eudragit″S″、Eudragit″L″、醋酸纖維素、醋酸纖維素鄰苯二甲酸鹽或羥丙基甲基纖維素。
本發(fā)明中的多肽可以中性形式或鹽形式制備如疫苗中。藥物上可接受的鹽包括酸加成鹽(與多肽的自由氨基結(jié)合形成)，其中它可與無機(jī)酸如鹽酸、磷酸或有機(jī)酸如乙酸、草酸、酒石酸和馬來酸結(jié)合形成。與自由羧基結(jié)合形成的鹽可以是從無機(jī)堿如鈉、鉀、銨、鈣或氫氧化鐵以及有機(jī)堿如異丙氨、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、組氨酸和脯氨酸衍生而來的。E.疫苗劑量和給藥疫苗是以一種與制劑劑量相適應(yīng)的方式給藥的，在這樣的劑量條件下才具有有效的預(yù)防和治療效果。雖然給藥量一般是5-250μg抗原/劑，但這要依賴于治療對(duì)象、治療對(duì)象免疫系統(tǒng)合成抗體的能力、以及需要達(dá)到的保護(hù)的程度。必須的活性成分的精確量要依賴于醫(yī)生的判斷，對(duì)不同對(duì)象可以不同。
疫苗可以是以單劑量時(shí)間表給藥，也可以是按照復(fù)合劑量時(shí)間表給藥。多劑量時(shí)間表是指疫苗的一個(gè)初級(jí)療程可以包括1-10個(gè)單獨(dú)的劑量，然后在特定要求的時(shí)間段里按照其他劑量給藥來維持或加強(qiáng)免疫反應(yīng)，例如，在1-4月給藥以第二種劑量，并且如果需要幾個(gè)月后再給藥以隨后的劑量。至少在部分程度上，這種劑量方法是由對(duì)象個(gè)體的需要和醫(yī)生的判斷來決定的。
此外，含有免疫原性MSP-1抗原的疫苗可與其他免疫調(diào)節(jié)藥物如免疫球蛋白聯(lián)合給藥。F.制備抗本發(fā)明中的多肽的抗體按上述方法制備的MSP-1多肽變體可適用于制備抗體，包括單克隆抗體和多克隆抗體。如果需要單克隆抗體，那就要對(duì)所選動(dòng)物(如小鼠、兔子、馬等)進(jìn)行含有MSP-1抗原決定簇的免疫原性多肽的免疫。收集從免疫動(dòng)物采集的血清，并且利用已知的方法進(jìn)行處理。如果含有抗MSP-1抗原決定簇的多克隆抗體的血清也含有抗其他抗原的抗體，那該多克隆抗體就可以通過免疫吸附色譜進(jìn)行純化。制備和處理多克隆抗血清的方法在本領(lǐng)域中是已知的。
本領(lǐng)域中的熟練技術(shù)人員可以很容易的制備得到直接抗本發(fā)明中的多肽所含的MSP-1抗原決定簇的單克隆抗體。通過雜交瘤細(xì)胞來制備單克隆抗體的一般方法在本領(lǐng)域中是熟知的。無限增殖抗體產(chǎn)生細(xì)胞系可以通過細(xì)胞融合來獲得，也可以通過其他技術(shù)如利用瘤原性DNA來轉(zhuǎn)化B淋巴細(xì)胞或轉(zhuǎn)染Epstein-Barr病毒。制備得到的系列單克隆抗體可以根據(jù)多種特性進(jìn)行篩選，即同種型和抗原決定簇親和性。
利用克隆在噬菌體展示庫內(nèi)的免疫球蛋白重鏈和輕鏈的可變區(qū)，優(yōu)選的是選自曾經(jīng)經(jīng)受瘧疾感染的人中的免疫球蛋白，可通過本發(fā)明中的多肽來篩選人單克隆抗體。
直接抗MSP-1抗原決定簇的單克隆抗體和多克隆抗體在診斷上尤其有用，并且其中的中和抗體在被動(dòng)免疫治療中是有用的。尤其是單克隆抗體可用于誘導(dǎo)抗個(gè)體基因型抗體的出現(xiàn)?？箓€(gè)體基因型抗體是一類免疫球蛋白，它攜帶有感染性物質(zhì)的‘內(nèi)部影象’，這種保護(hù)是我們非常想要的。
誘導(dǎo)抗個(gè)體基因型抗體的技術(shù)在本領(lǐng)域中是已知的。這些抗個(gè)體基因型抗體在治療瘧原蟲的感染中是有效的，并且對(duì)闡述MSP-1抗原的免疫原性區(qū)也是有用的。也有可能對(duì)上述的抗體片段，如F(ab’)2，、Fab、Facb和scFv片段進(jìn)行利用。
我們應(yīng)該明白上述的本發(fā)明的各個(gè)部分、方面和實(shí)施方案的特征有也同樣適用于適當(dāng)修改以后的其他部分、方面和實(shí)施方案。
現(xiàn)在本發(fā)明將會(huì)進(jìn)一步的通過示例進(jìn)行描述，我們并不是想讓它們來限制本發(fā)明的范圍，只是利用它們來幫助本領(lǐng)域中的一般技術(shù)人員來完成本發(fā)明的操作。這些示例中提到一些附圖。在這些圖中附圖詳述
圖1-按照EGF樣基序的共有序列對(duì)MSP-1序列進(jìn)行排序。頂端序列P.falciparum(SWISS-PROT MSP1 PLAFW).第二個(gè)序列P.Vivax Belem菌株(PIR A45604).第三個(gè)序列人EGF(PDB legf).第四個(gè)序列EGF樣的結(jié)構(gòu)域的共有序列(Prosite EGF 1).底端序列EGF核心區(qū)的14個(gè)殘基，在6中用于結(jié)構(gòu)排比。加黑的部分表明EGF樣結(jié)構(gòu)域的保守殘基。黑影表示在P.falciparum的EGF組件對(duì)接觸面上的疏水殘基，以及在P.vivax序列上的相應(yīng)保守殘基。
圖2-多維異核核糖核酸NOESY實(shí)驗(yàn)的樣品表明含有與MSP-1 C-末端片段Lys35 NH質(zhì)子的NOE連接的平面。上部從4D-[13C]-HMQC-NOESY-[15N]-HSQC實(shí)驗(yàn)得到的13C(D4)和1H(D3)平面，這個(gè)實(shí)驗(yàn)是在15N(D2)和1H(D1)的Lys35 NH的化學(xué)漂移值下進(jìn)行的。.底部從在Lys35 NH的1H化學(xué)漂移值(垂直軸.D1)下進(jìn)行的3D[15N)-NOESY-HSQC實(shí)驗(yàn)得到條帶，而這個(gè)化學(xué)漂移值是在它的15N(D3)值下得到的。這個(gè)水平的1H軸是與頂部的光譜對(duì)齊的。沒有在4D光譜上相應(yīng)出現(xiàn)在3D光譜的3.72和3.01ppm處的弱交聯(lián)峰，這是因?yàn)楹笳哂懈偷男旁氡取，F(xiàn)在已經(jīng)將這些峰定為在Lys35 NH和Asn44Hβ2(2.72ppm)、及Cys30 Hβ3和/或Cys41 Hβ2(3.01PPm)之間的交聯(lián)峰。
圖3-立體圖表明在最后的系綜中的32精確結(jié)構(gòu)的C、N、Ca主鏈。結(jié)構(gòu)域1在左面(紅色)，而結(jié)構(gòu)域2在右面(綠色)，C-末端和N-末端都接近底部。
圖4-系綜中最具代表性的模型的MOLSCRIPT圖，它表明Cα痕跡主鏈(backbone Cαfrace)反平行β-折疊片以及二硫橋(黃色的Sγ原子)。結(jié)構(gòu)域-1，紅色；結(jié)構(gòu)域-2，綠色。
圖5-利用14個(gè)氨基酸的‘簡(jiǎn)化核‘共有序列(Bersch et al.，1998)(見
圖1)，通過fitpdb程序?qū)Φ湫偷腅GF樣家族成員進(jìn)行排列。在每個(gè)結(jié)構(gòu)中經(jīng)過排列的主鏈片段是白色的。這些結(jié)構(gòu)是與最具代表性的基團(tuán)結(jié)構(gòu)(因子Xa)相對(duì)比進(jìn)行排列的。從左到右序列差異百分比逐漸增加。數(shù)字表明進(jìn)行過排列的C、N、Ca原子的rmsd值。PDB鑒定代碼因子Xa(晶體結(jié)構(gòu))，1hcg；互補(bǔ)Clr元件，lapq(14th模型)；人EGF，legf(11th模型)；原纖蛋白-1，結(jié)構(gòu)域-32和-33_lemn(最小化的一般結(jié)構(gòu))；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α，2tgf(最小化的一般結(jié)構(gòu))；MSP-1結(jié)構(gòu)域-1和-2，本研究。
圖6-原纖蛋白-1相對(duì)于MSP-1的EGF樣組件對(duì)的排序觀察。原纖蛋白-1(lemn)青色(結(jié)構(gòu)域-32)和紅紫色(結(jié)構(gòu)域-33)(Downing et al..1996)MSP-t結(jié)構(gòu)域-1(黃色)和結(jié)構(gòu)域-2(綠色).利用每個(gè)組件對(duì)的結(jié)構(gòu)域的N-末端的核心共有序列對(duì)這些結(jié)構(gòu)進(jìn)行排序，如圖6中所示。原纖蛋白-1中的Ca2+結(jié)構(gòu)的范圍是用紅紫色的球形表示的。
圖7-對(duì)MSP-1組件對(duì)的靜電勢(shì)面的觀察，a和b(繞y軸旋轉(zhuǎn)大約180°)，利用GRASP進(jìn)行計(jì)算。紅色代表負(fù)電荷，蘭色代表正電荷，白色代表中性。視圖方向在鄰近的小圖表中有示。
圖8-MSP-1 C-末端的CPK模型，它表明影響單克隆抗體結(jié)合的一些突變的位點(diǎn)。結(jié)構(gòu)域-1是朝向右上方，而結(jié)構(gòu)域-2是朝向左下方。
圖9-通過Western印跡檢測(cè)的MSP-1與單克隆抗體結(jié)合的示例。每種單克隆抗體與蛋白的結(jié)合是基于野生型序列之上的，并且也對(duì)單克隆抗體與含有修飾序列的蛋白進(jìn)行了示例。單克隆抗體如上部所示。左面示例的是蛋白WT，野生型序列；22，Leu22→Arg；26，Glu26→Ile；15，Asn15→Arg；27，Glu27→Tyr；31，Leu31→Arg；43，Glu43→Leu；27+31+43，Glu27→Tyr及Leu.31→Arg以及Glu43→Leu；15+27+31+43，Asn15→Arg及Glu27→Tyr及Leu31→Arg以及GIu43→Leu。
圖10-利用BIAcore分析方法進(jìn)行檢測(cè)的單克隆抗體與GST-MSP-119的結(jié)合，它是通過BIAcore分析方法進(jìn)行檢測(cè)分析的。在野生型序列的基礎(chǔ)之上，將每個(gè)單克隆抗體與的結(jié)合都規(guī)范化為100％，然后單克隆抗體與含有修飾序列的蛋白的結(jié)合是以他們的百分比來表示的。WT，野生型序列；15，Asn15→Arg；26，Glu26→Ile；27，Glu27→Tyr；31，Leu31→Arg；34，Tyr34→Ser；43 Glu43→Leu。
圖11-利用BIAcore分析方法進(jìn)行檢測(cè)的單克隆抗體與含有多重修飾的GST-MSP-119的結(jié)合。在野生型序列的基礎(chǔ)之上，將每個(gè)單克隆抗體與的結(jié)合都規(guī)范化為100％，然后單克隆抗體與含有修飾序列的蛋白的結(jié)合是以他們的百分比來表示的。WT，野生型序列；在每一位點(diǎn)上含有3種突變[27+31+43)、或4種突變[27+31+34+43]和[15+27+31+43)的結(jié)合，這些改變是如
圖10中所示。
圖12-通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合檢測(cè)法和固定化野生型GST-MSP-119來對(duì)阻斷性抗體進(jìn)行檢測(cè)。通過BIAcore分析方法來檢測(cè)抗體與mAbs12.8和12.10競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合到GST-MSP-119上的能力。單獨(dú)的抗體(X-軸)結(jié)合到抗原之上，然后就可對(duì)mAbs 12.8和12.10(抑制性mAb)隨后的結(jié)合進(jìn)行定量。所有的結(jié)合數(shù)量是以其與12.8或12.10在沒有與另外一種抗體進(jìn)行預(yù)培育時(shí)的結(jié)合總量的百分比來表示的。
圖13-檢測(cè)經(jīng)修飾過的重組MSP-119的免疫作用誘導(dǎo)的抗體抑制次級(jí)加工的能力。對(duì)沖洗過的3D7裂殖子在不經(jīng)培育(0h)的情況下直接進(jìn)行檢測(cè)，或在以1mM PMSF作為整個(gè)抑制過程的對(duì)照但沒有血清(無血清)、正常兔血清(正常血清)、或經(jīng)15+27+31+43修飾過的蛋白免疫的兔血清(免疫血清)存在條件下37℃培育1小時(shí)，所有這些血清都是在反應(yīng)緩沖液中按照1∶10的比例進(jìn)行稀釋。MSP-133釋放到上清液中的水平作為次級(jí)加工的結(jié)果，這可通過ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，其值以在492nm波長(zhǎng)的吸收來表示。
圖14-用于輸入CODOP程序的Pichia pasroris密碼子優(yōu)選表。
圖15-優(yōu)化的合成MSP-142基因的DNA或蛋白質(zhì)序列。A設(shè)計(jì)來最優(yōu)化密碼子用途和其在Pichia pasroris中表達(dá)的完整序列。B在表達(dá)載體pPIC9K-Hxa中的的合成MSP-119結(jié)構(gòu)的序列。大寫字母載體序列，包括H136標(biāo)記和因子Xa裂解位點(diǎn)(IEGR)。小寫字母合成MSP-119的編碼序列。定位于pPIC9K序列的SnaBI限制性位點(diǎn)的克隆序列。C合成MSP-119結(jié)構(gòu)表達(dá)的蛋白序列。所示序列是緊隨在kex2/STE13加工位點(diǎn)之后的，它是以pPIC9Kα-因子分泌信號(hào)的融合蛋白的形式來制備的。合成的MSP-119是用粗體來表示的。DMSP-133結(jié)構(gòu)序列。這個(gè)克隆序列位于pUCll8載體的SmaI位點(diǎn)。E合成MSP-133結(jié)構(gòu)翻譯后產(chǎn)物的預(yù)測(cè)蛋白序列。
圖16-適合于MSP-133序列和MSP-119序列的基因裝配PCR反應(yīng)。反應(yīng)110μl等份的裝配反應(yīng)。反應(yīng)220μl等份的放大反應(yīng)。隨后將N-末端和中間片段剪接到一起形成MSP-133合成結(jié)構(gòu)。C-末端片段合成反應(yīng)產(chǎn)生了最優(yōu)化的MSP-119結(jié)構(gòu)。
圖17.合成MSP-119蛋白在Pichia pasroris中的表達(dá)。1-6道；經(jīng)三氯乙酸沉淀的、培養(yǎng)上清液中的分泌蛋白，但沒有對(duì)它進(jìn)行進(jìn)一步的純化(5μl/道)。三種獨(dú)立的轉(zhuǎn)化體的相同培養(yǎng)物樣品。8、9道從最初的惡性瘧原蟲序列制備的純化的、脫糖基化的MSP-119。7、10道NOVEX分子量標(biāo)準(zhǔn)物。
圖18.A最優(yōu)化的合成MSP-119基因表達(dá)的蛋白(3.5mM)的{1H/15N}-HSQC光譜。B由最初惡性瘧原蟲序列表達(dá)的、脫糖基化蛋白(2.2mM)的對(duì)照{(diào)1H/15N}-HSQC光譜(morgan et al.，1999)。
實(shí)施例材料和方法蛋白表達(dá)和穩(wěn)定同位素標(biāo)記NMR通過Vent多聚酶(New England Biolabs)進(jìn)行的PCR反應(yīng)，從含有惡性瘧原蟲菌株T9/94片段的質(zhì)粒(Blackman et al.，1991)克隆到了MSP-1 C-末端底片段的編碼序列。PCR反應(yīng)使用的引物包括6個(gè)N-末端His標(biāo)記的密碼子(CACCATCATCATCATCAC)，然后將此引物插入到pPIC9K載體(Invitrogen)的SnaBI限制性位點(diǎn)。這個(gè)序列相應(yīng)于SWISS-PROT目錄MSP1 PLAFW(accession number P04933)的第1526-1621號(hào)殘基。這樣就制得了一個(gè)含有序列…KR/EA/EA/YHHHHHHNlSQ....SSSN的α-因子融合蛋白，此處的省略號(hào)代表kex2和STEl3加工位點(diǎn)。通過對(duì)高G418抗性篩選，我們就分離到了高拷貝數(shù)甲基營養(yǎng)酵母Komagataella(Pichia)pastoris蛋白酶缺陷型菌株SD1168(his4 pep4)(Clare et al.，1995)。
Mut-轉(zhuǎn)化體在29.4℃下、在含有緩沖過的基礎(chǔ)介質(zhì)(100mM磷酸鉀，pH6.0，酵母堿基氮(034w/vol)(DIFCOYNB不含氨基酸、不含硫酸銨，但含有生物素(4×10-5％ w/vol)、Sigma抗泡沫劑289(0.01％ vol/vol)以及下述的碳源和氮源的振動(dòng)培養(yǎng)器中生長(zhǎng)。未標(biāo)記的樣品開始是在含有1％ w/vol硫酸銨和1％ w/vol甘油的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，通過將其轉(zhuǎn)移到含有0.5％的CH3OH作為碳源的培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)。標(biāo)記的樣品開始是在含有0.2％ w/vol[15N]-(NH4)2SO4(Isotech)和0.5％ w/vol葡萄糖或[13C6]-葡萄糖(Isotech)的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，通過將其轉(zhuǎn)移到含有0.5％w/vol CH3OH或[13C]-CH3OH(Isotech)作為碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)來進(jìn)行誘導(dǎo)。起始培養(yǎng)物從150ml生長(zhǎng)至密度大約為10 OD600，然后進(jìn)行收獲，并且重新懸浮在甲醇中，體積為1.5L，密度為1 OD600。甲醇誘導(dǎo)的培養(yǎng)物培養(yǎng)時(shí)間為4天，每天添加7.5ml CH3OH或[13C]-CH3OH，直至最終濃度為大約18OD600.通過這種方法在最后階段制備得到了24mg/L純化的、13C/14N均勻標(biāo)記的蛋白(見下文).對(duì)于生產(chǎn)MSP-1 C-末端片段來講，基于YNB的培養(yǎng)基的產(chǎn)量要比FM22培養(yǎng)基的產(chǎn)量高大約3倍(Laroche etal.，1994)。
通過低速離心將細(xì)胞去除，然后添加蛋白酶抑制劑(COMPLETETM片劑、Boehringer-Mannheim1片/500ml上清液)，并且對(duì)上清液進(jìn)行過濾滅菌。在4℃下，在攪拌小室中通過超濾將上清液濃縮大約20倍(Amicon.YM3膜)。利用KOH將pH調(diào)節(jié)為7.25，并且在37℃下利用5000U的PNGaseF(New England Biolabs)對(duì)N-糖基化的MSP-1片段進(jìn)行72小時(shí)的部分去糖基化。將碳水化合物全部去除掉(通過電泳和質(zhì)譜來進(jìn)行檢驗(yàn))，估計(jì)在這個(gè)過程中Asn 1殘基也被轉(zhuǎn)化為了Asp。通過低速離心將上清液澄清，將5M的NaCI添加到其中使其終濃度變?yōu)?M，然后將樣品通過2ml的Ni-NTA親和層析柱(QIAGEN)。沖洗，在使用手冊(cè)指導(dǎo)下用250ml咪唑來洗脫。洗脫液分別用50mM磷酸鈉(pH6.6)、50mM NaCI透析，然后將其通過1ml的Hi-Trap Q陰離子交換樹脂(Pharmacia)來去除錯(cuò)誤折疊的MSP-I，這些錯(cuò)誤折疊的MSP-I能夠結(jié)合到柱子上。通過Westem印跡和電噴射質(zhì)譜(數(shù)據(jù)沒有展示出)來對(duì)MSP-1片段進(jìn)行定性。相應(yīng)于所期望的片段，我們觀察到兩個(gè)主要的分子量11067和11807Da，也觀察到含有額外的N-末端Glu-Ala二肽的片段，這個(gè)二肽是由于對(duì)α-因子分泌信號(hào)的不完全STE13加工造成的。
用于NMR實(shí)驗(yàn)的樣品是在含有0.01％ W/vol NaN3的90％ H2O/10％D2O中或100％ D2O、50mM磷酸鈉、100mM NaCI、pH6.5(由于氘同位素影響，pH沒有校正)的溶液中，濃度為2.1-2.6mM，體積為0.6ml。蛋白濃度通過在280nm的UV吸收進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算出的摩爾消光系數(shù)為5220Lmol-1cm-1。通過在293K對(duì)0.12mM樣品進(jìn)行平衡超速離心證明其是單體，他們?cè)谄胶獬匐x心時(shí)是在緩沖液上部。
NMR實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)處理絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)是在298K下進(jìn)行的，使用的是Varian Unity和Unity-Plus分光光度計(jì)，分別在600MHZ和500MHZ下進(jìn)行。表A/B給出了用于共振排布和結(jié)構(gòu)確定的詳細(xì)的獲得參數(shù)和多維實(shí)驗(yàn)(Clore & Gronenbom，1998)，并且已經(jīng)將他們提交給了蛋白數(shù)據(jù)庫(PDB Accession No lCEJ)。
所有光譜都經(jīng)過Felix 95.0或97.0(Biosym/MSI)的90度或72度漂移sinebell-squared視窗功能。維數(shù)、zero-filling以及線性預(yù)測(cè)的細(xì)節(jié)都總結(jié)在表A/B和對(duì)BioMagResBank的提交物中。四維的和交叉存取的光譜是在Felix中利用macros written in-house進(jìn)行處理的。
信號(hào)排布主要基于通過在均一的13C/15N標(biāo)記的蛋白上進(jìn)行的CBCA(CO)NH和CBCANH實(shí)驗(yàn)建立的連續(xù)性，我們進(jìn)行了連續(xù)排布。側(cè)鏈旋轉(zhuǎn)體系排布是在從與15N/1H-TOCSY-HSQC和15N/1H-NOESY-HSQC.以及HNHA和HNHB實(shí)驗(yàn)信息相關(guān)的13C/’1H-HCCH-TOCSY實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上極性排布的。能夠得到對(duì)98％的側(cè)鏈和96％主鏈氨基化合物基團(tuán)的1H、16N和脂肪族13C的排布。排布列表在表A/B和對(duì)蛋白數(shù)據(jù)庫的提交物(PDB Accession No lCEJ)中已經(jīng)給出。按照前面所述進(jìn)行15N{1H}異核核糖核酸NOE實(shí)驗(yàn)(kay et al..1989；Polshakovet al..1997)。
距離限制主要從3D15N-NOESY-HSQC、15N-ROESY-HSQC和4D13C-HMQC-NOESY-15N-HSQC實(shí)驗(yàn)獲得了在主鏈和側(cè)鏈氨基化合物質(zhì)子間的NOE和ROE衍生的距離限制。脂肪族和脂肪族質(zhì)子間的距離限制是從4D13C-HMQC-NOESY-13CHSQC實(shí)驗(yàn)獲得的。在D2O中進(jìn)行的3D13C-HMQC-NOESY實(shí)驗(yàn)用于確定脂肪族和芳香族質(zhì)子的NOE，而在其中的2D NOESY實(shí)驗(yàn)可用于確定芳香族質(zhì)子和芳香族質(zhì)子之間的NOE。通過適合于2D和3D實(shí)驗(yàn)和4D13C-HMQC-NOESY-15N-HSQC實(shí)驗(yàn)的Felix中進(jìn)行體積積分，以及從4D13C-HMQC-NOESY-15N-HSQC光譜上測(cè)量得到的峰高就可對(duì)交聯(lián)峰進(jìn)行量化。交聯(lián)峰分為強(qiáng)、中等和弱三種類型，他們的距離限制(distance restraints)分別為0-2.8、0-3.6和0-5.5。從主鏈氨基化合物信號(hào)產(chǎn)生的限制最初是用這種方法進(jìn)行處理的，隨后通過將3D15N-HMQC-NOESY數(shù)據(jù)分為最大距離為2.6、3.1、3.6和4.1的四類進(jìn)行更加精確的重新計(jì)算。等價(jià)位基團(tuán)或非立體構(gòu)象質(zhì)子的限制是通過r-6求和來處理的。絕大多數(shù)的殘基內(nèi)距離(HN-Hβ和Hα-Hβ)都轉(zhuǎn)化為下述的χ1角距離限制，這些限制沒有包括在最終的表中。
二面角限制利用格柵搜尋(grid-search)程序AngleSearch，與偶聯(lián)常數(shù)和殘基內(nèi)ROE距離限制信息(Polshakov et al.，1995)結(jié)合獲得了χ1角和β-亞甲基質(zhì)子的立體特異排布。偶聯(lián)常數(shù)信息是通過3J(HN-Hβ)和3J(CO-Hβ)的HNHB和HN(CO)HB光譜強(qiáng)度獲得的，而殘基內(nèi)距離(HN-Hβ，Hα-Hβ)是從3D15N-ROESY-HSQC和2D ROESY(D2O)實(shí)驗(yàn)獲得的。.3J(CO-Hα)偶聯(lián)常數(shù)是從HNHA實(shí)驗(yàn)獲得的。具有正的φ角(ca.-60度)是通過在HN(CO)HB實(shí)驗(yàn)中的大的內(nèi)殘基Hα交聯(lián)峰的強(qiáng)度來確定的，y角與HNNB實(shí)驗(yàn)中的強(qiáng)Hα(1-1)交聯(lián)峰相距接近-60度。Ile和Leu的χ2角以及Leuδ的立體排布是從LRCH實(shí)驗(yàn)獲得的。40度(χ1，χ2)和50度(φ，φ)的最小范圍可用來說明其偏差和對(duì)偶聯(lián)常數(shù)的局部動(dòng)力學(xué)效用。
二硫鍵模式選用了大約550個(gè)明確的NOE衍生的距離限制、36個(gè)x1和φ二面角限制，但沒有選用氫鍵和二硫鍵限制來模擬退火，以這種方式計(jì)算了最初一組20個(gè)結(jié)構(gòu)。在這些結(jié)構(gòu)中，檢驗(yàn)了Cys-Cys Sγ距離，目的是來確定一個(gè)有可能的鍵模式。在進(jìn)行計(jì)算之前，通過觀察這些二硫鍵殘基對(duì)間的Hβ-HβNOE在很大程度上確定了四個(gè)4Cys殘基(Cys12-Cys28，Cys78-Cys92)間二硫橋的構(gòu)成。對(duì)起始結(jié)構(gòu)的檢驗(yàn)確定了這些二硫橋并且也表明在殘基Cys30和Cys41之間有另外一個(gè)二硫橋存在。雖然NMR數(shù)據(jù)還不能很好的確定其N-末端結(jié)構(gòu)，但已經(jīng)默認(rèn)了在結(jié)構(gòu)域-1中的第三個(gè)二硫橋(Cys7-Cys18)的存在。在總X-PLOR能量和違背方面最好的6個(gè)結(jié)構(gòu)表明在每個(gè)結(jié)構(gòu)域中的二硫鍵模式[1-3，2-4，5-6]的Cys-Cys Sγ距離是最小的，并且只有這樣的結(jié)合才允許所有的Cys殘基與其配偶體在小于3.5的距離內(nèi)構(gòu)成聯(lián)系。因此，對(duì)兩個(gè)結(jié)構(gòu)域來講，這種二硫鍵模式是與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)最接近的，并且在隨后的計(jì)算(開始是以NOE型距離限制來計(jì)算的)中證明其有極大可能。[1-3，2-4，5-6]模式是EGF樣結(jié)構(gòu)域所期望的那種。
氫鍵通過在100％的D2O溶液中檢測(cè)的樣品的光譜，確定了包含在穩(wěn)定氫鍵中的非交換氨基化合物基團(tuán)。利用Insight II and HBPIus(MeDonald et al..1994)程序，通過對(duì)最初構(gòu)件系綜的檢測(cè)確定了相應(yīng)的氫鍵受體，而氫鍵距離限制是包括在隨后的計(jì)算之內(nèi)的。通過相似的方法利用重復(fù)計(jì)算確定了其他的氫鍵。在反平行β折疊片中只有10個(gè)主鏈氫鍵是用于進(jìn)行限制的。兩個(gè)距離限制用于一個(gè)氫鍵，從質(zhì)子到受體是1.7-2.3，從供體氮原子到受體是3.0-3.6。
結(jié)構(gòu)計(jì)算在一臺(tái)Graphics Origin 200計(jì)算機(jī)上利用X-PLOR的3.843版本，按照從一條擴(kuò)展鏈進(jìn)行ab initio模擬退火的方法來計(jì)算所有的結(jié)構(gòu)。最初的計(jì)算所用起始溫度為1000K，在限制性的分子動(dòng)力學(xué)階段就進(jìn)行了9000步5fs。在距離限制中使用了soft-squarepotential。在分子動(dòng)力學(xué)階段中使用了SHAKE(Ryckaert et al.，1977)運(yùn)算法則來維持正確的鍵長(zhǎng)。利用a square well potential對(duì)這些限制進(jìn)行進(jìn)一步精確化，然后從2000K開始進(jìn)行了每步4fs的30000步緩慢冷卻。在對(duì)Arg和Pro以及氫鍵的參數(shù)進(jìn)行修飾時(shí)使用了已經(jīng)做過修改的″parallhdg.pro″力場(chǎng)參數(shù)集(Polshakov etal.，1997)。包括氫鍵在內(nèi)的所有距離限制的力常數(shù)為50kcal mol-1A-2，二面角限制的力常數(shù)是200 kcal mol-1rad-2。包括載體編碼殘基和(His)6標(biāo)記在內(nèi)的N-末端序列是排除在結(jié)構(gòu)計(jì)算之外的。所有的肽鍵都是反式的。5個(gè)Pro殘基的NOE數(shù)據(jù)表明強(qiáng)Hα(i-1)-ProHα交聯(lián)峰與反式肽段構(gòu)型相一致。
如上所述的最初結(jié)構(gòu)計(jì)算確定了二硫鍵的模式。隨后的計(jì)算完全重復(fù)NOE衍生的距離和二面角限制，只是添加了6個(gè)代表二硫橋的距離限制(1.92-3.12)。獲得了50個(gè)新的結(jié)構(gòu)，從中又選出了20個(gè)最好的結(jié)構(gòu)。用于進(jìn)行選擇的標(biāo)準(zhǔn)是這些結(jié)構(gòu)低于總X-PLOR能量和rms NOE差值的中值，并且與二面角沒有任何違背。最終的結(jié)構(gòu)具有很好的幾何形狀，并且在0和兩個(gè)＞0.5 的NOE違背之間。這些結(jié)構(gòu)可用于對(duì)前述的不確定的NOE賦值，也可用來確定上述的氫鍵。
最終的結(jié)構(gòu)計(jì)算和精確化是通過應(yīng)用包括氫鍵、額外的二面角限制、β-亞甲基的立體排布和Leuδ信號(hào)，以及更加精確校正ROE數(shù)據(jù)(見表1)在內(nèi)的擴(kuò)展的限制表。利用這個(gè)表獲得了含有100個(gè)結(jié)構(gòu)的組，其中0-2NOE違背＞0.5 和二面角違背＞5°的38個(gè)結(jié)構(gòu)是可以接受的。通過上述的緩慢冷卻方法對(duì)這38個(gè)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了精確化，獲得了最后的32個(gè)可接受的結(jié)構(gòu)，他們沒有NOE違背＞0.5 ，也沒有二面角違背＞5°。通過這些選擇標(biāo)準(zhǔn)獲得了一組結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)一直延伸到總勢(shì)能連續(xù)的末端，這樣做是為了能夠?qū)⒕哂写笠?guī)模相關(guān)運(yùn)動(dòng)的結(jié)構(gòu)包括在內(nèi)(Abseher et al.，1998)。對(duì)最終系綜進(jìn)行的統(tǒng)計(jì)在表1中列出。這32個(gè)精確化結(jié)構(gòu)的坐標(biāo)已經(jīng)保存在Brookhaven Protein Data Bank(坐標(biāo)ID編碼1cej；NMR限制ID編碼r1cejmr)。
在計(jì)算過程中利用X-PLOR 3.8(Nilges et al.，1991)、PROCHEK-NMR/AQUA(Laskowski et al.，1996)，以及Insight II對(duì)包括實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、精度、幾何形狀和能量在內(nèi)的吻合性質(zhì)進(jìn)行了分析。模型是與InsightII和fitpdb.相結(jié)合的，并且通過Insight II，MOLSCRIPT來展示(Nicholls et al.，1991)及GRASP(Nicholls et al.，1991)。
表1A限制摘要計(jì)算的構(gòu)象體數(shù)目100接受的構(gòu)象體數(shù)目32接受標(biāo)準(zhǔn)沒有距離違背＞0.5沒有二面角違背＞5°NOE/ROE距離限制內(nèi)部殘基73序列；222中程(2-4)90 長(zhǎng)程(＞4)185總共570二面角限制phi25 psi33 chi-122 chi-25總共85氫鍵10 二硫鍵6B結(jié)構(gòu)性質(zhì)平均 +/-s.d總X-YPLOR能量(kcal mol-1) 168 20NOE X-YPLOR能(kcal mol-1) 21 8rmsd NOE 0.026 0.005rmsd 面角0.236 0.095rmsd 鍵長(zhǎng)0.0029 0.0002rmsd 鍵角0.357 0.023rmsd 不正確的0.266 0.018構(gòu)建區(qū)主鏈rmsd(69殘基)總體上 1.050.28結(jié)構(gòu)域-1 0.810.32結(jié)構(gòu)域-2 0.830.35Ramacbandran結(jié)構(gòu)性質(zhì)(pbi/psi角)最想要的49.5％額外允許的 42.1％一般允許的 5.6％不允許的2.7％
單克隆抗體(mAbs)在本發(fā)明中選用的抗MSP-119單克隆抗體有鼠IgG mAbs 1E1，1E8，2F10，111.2，111.4 2.2，5.2，7.5，9C8，12.8，12.10，12D11，117.2，8A12(Holder et al..1985；McBride & Heidrich，1987；Blackman etal..1987；Guevara Patino et al..1997)；和鼠IgM mAb 5B1(Pirson & Perkins，1985)。在這些抗體中，mAbs 12.8、12.10和5B1是中和、抑制性抗體，1E1、2.2、7.5、9C8和111.4是阻斷性抗體。一些抗體如111.2既不是抑制性也不是阻斷性抗體。構(gòu)建修飾的MSP-119克隆已經(jīng)將編碼惡性瘧原蟲(T9-94/Wellcome菌株)MSP-1的野生型MSP-119結(jié)構(gòu)域的DNA克隆到表達(dá)載體pGEX-3X中，通過它來制備融合到存在于大腸桿菌中Schisrosoma japonicum谷胱甘肽(GST)的羧基末端的MSP-119(Burghaus & Holder，1994)。MSP-119DNA序列的定點(diǎn)誘變是通過兩種途徑實(shí)現(xiàn)的。
第一種方法是Perrin & Gilliland(1990)方法的改進(jìn)方法，這種方法是進(jìn)行多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性誘變。以質(zhì)粒為模板，利用一段寡核苷酸從外部的MSP-119序列引入點(diǎn)突變和5′引物，這樣對(duì)DNA進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物通過瓊脂糖電泳進(jìn)行純化，隨后利用質(zhì)粒模板和從外部的MSP-119序列引入3′引物進(jìn)行第二次擴(kuò)增。第二次擴(kuò)增產(chǎn)物通過限制性內(nèi)切酶EcoRl和BamHl來消化，然后將由修飾MSP-119編碼序列組成的產(chǎn)物插回到pGEX-3X中，這是的產(chǎn)物才用于轉(zhuǎn)化DH5a細(xì)胞。
第二種方法使用的是Stratagene的QuikChangeTM定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?。?jiǎn)單的講，利用質(zhì)粒pGEX-MSP-119作為模板，設(shè)計(jì)了兩個(gè)含有所需要的定點(diǎn)突變的互補(bǔ)合成寡核苷酸引物，然后在酶Pfu DNA聚合酶存在下，利用溫度循環(huán)使其在模板上延伸。通過這樣引入寡核苷酸的方法就產(chǎn)生了在DNA修列上含有交錯(cuò)缺口的突變質(zhì)粒。隨著溫度循環(huán)，將產(chǎn)物用DpnI核酸內(nèi)切酶處理，這種酶將甲基化的DNA母鏈消化掉，但卻不影響含有突變的新合成的DNA鏈。然后將結(jié)合有所需要的突變的DNA轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，在那里缺口被修復(fù)。
通過對(duì)限制性酶消化進(jìn)行分析來篩選克隆，通過PCR篩選插入基因。按照使用指導(dǎo)，利用PerkinElmer Applied Biosystems ABI 377全自動(dòng)測(cè)序儀來所確定特定突變體克隆的DNA序列。GST-MSP-119融合蛋白的表達(dá)在大腸桿菌菌株TOPP 1(Stratagene)中，通過1mM異丙基-(β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG；Melford Laboratories)對(duì)GST-MSP-119的表達(dá)進(jìn)行1小時(shí)的誘變。然后通過離心來回收這些細(xì)胞，將細(xì)胞沉淀重新懸浮在細(xì)胞裂解緩沖液(50mM Tris-HCl/1mM含有0.2％(v/v)Nonidet P40(NP40；BDH)的EDTA pH8.0)中。將溶解在異丙醇中的苯甲磺酰氯(PMSF；Sigma)添加到其中使其最終濃度為1mM。利用VibraCell超聲波發(fā)生器(Sonics & Materials)，在50％的額定功率下對(duì)細(xì)胞懸浮物進(jìn)行3分鐘的超聲波降解(6個(gè)30秒，每2個(gè)30秒之間由30秒的的間隔)。細(xì)胞裂解物在4℃下、65000xg離心1小時(shí)。含有可溶性GST-融合蛋白的上清液過谷胱甘肽-瓊脂糖柱(Sigma)，用5mM的還原性谷胱甘肽洗提GST-融合蛋白。洗提出的谷胱甘肽-融合蛋白在4℃下的磷酸緩沖液(PBS)中進(jìn)行充分的透析。SDS-PAGE和Western印跡通過十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對(duì)蛋白進(jìn)行分析。在沒有還原性物質(zhì)的條件下，將樣品溶解在SDS-PAGE緩沖液中，然后在12.5％的連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行分離。標(biāo)記物是Bio-Rad的、預(yù)先經(jīng)過染色的低分子量標(biāo)記物(24-102kDa)。如果需要，經(jīng)SDS-PAGE分離的多肽可用考馬斯亮藍(lán)250(CBB；Sigma)進(jìn)行染色，或者將其電泳轉(zhuǎn)移到Optitran BA-S 83強(qiáng)化硝酸纖維素(Schleicher &；Schull，0.2um孔徑)上來進(jìn)行Western印跡分析。在室溫下，利用在溶解在PBS(PBS-T)中的5％BSA和0.5％的 Tween20處理2小時(shí)以阻斷印跡，然后用PBS-T沖洗。以第一個(gè)抗體為探針，在室溫下與印跡雜交2小時(shí)，PBS-T沖洗3次，然后在室溫下，在與綿羊抗鼠IgG(H+L)(ICN immunobiologicals)或山羊抗鼠IgM(u鏈)(Sigma)共軛的辣根過氧化物酶(HRP)的1/1000稀釋液中培育1小時(shí)。然后用PBS-T將印跡沖洗3次，并且以Super SignalSubstrate(Pierce)作為HRP底物顯色1分鐘。隨后將印跡放置在塑料包裝紙中，對(duì)X-光膠片(XB-200.X-ograph影相體系)進(jìn)行曝光。然后利用Agfa Gevamatic60膠片處理器(Aegfa)對(duì)此膠片進(jìn)行處理。利用BIAcore分析儀對(duì)抗體-抗原相互作用進(jìn)行分析按照下述的方法，將含有野生型序列或多種修飾序列的GST-MSP-119包被到一個(gè)羧甲基右旋糖酐氫感受器芯片上。GST-MSP-119的結(jié)合是利用EDC/NHS化學(xué)法、經(jīng)由氨基基團(tuán)來完成的。利用氨基化合物偶連試劑盒(Pharmacia BlAcore)來進(jìn)行固定化。利用50μl 200mM1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺(EDC)和5mM N-羥基琥珀酰胺(NHS)來活化10分鐘。然后利用溶解在包被緩沖液(0.01M醋酸鈉緩沖液，pH3.5)中的50μl濃度為100 ug ml-1的溶液固定10分鐘，使其偶連到BIAcore感受器表面。沒有反應(yīng)的羧基通過添加pH8.5的50μl 1M乙醇胺來阻斷，時(shí)間為10分鐘。用20μl pH2.8的10mM的甘氨酸-鹽酸沖洗兩次，總共8分鐘，來去除沒有共價(jià)結(jié)合的蛋白。整個(gè)固定化過程中的流速是5μl min-1?？乖?抗體作用的測(cè)定是在BIAcore 2000分析儀上進(jìn)行的。結(jié)果例1-共振排布，NMR限制和結(jié)構(gòu)確定對(duì)利用13C/16N均一標(biāo)記的的蛋白進(jìn)行了一系列的多維異核核糖核酸實(shí)驗(yàn)，從中得到了這些共振排布和NMR限制，這在材料與方法中已經(jīng)有描述。3D和4D實(shí)驗(yàn)展示了與Lys35主鏈氨基化合物NH質(zhì)子的NOE連接，其光譜解決的問題和明確賦予的值在圖2中有示。用于最終結(jié)構(gòu)集計(jì)算的距離限制、二面角限制和氫鍵限制在表1中總結(jié)?？偣灿?70個(gè)明確賦值的距離限制，85個(gè)二面角限制，和10個(gè)氫鍵限制在最終組中選用。表A所示的排布和賦值已經(jīng)提交給BioMagResBank數(shù)據(jù)庫。在材料與方法描述的對(duì)NMR數(shù)據(jù)進(jìn)行的初步計(jì)算基礎(chǔ)之上，通過實(shí)驗(yàn)確定了每個(gè)結(jié)構(gòu)域中的具有[1-3.2--4.5-6]模式的3個(gè)二硫鍵。他們也包括在經(jīng)過精確化后的最終結(jié)果之中。利用強(qiáng)加在代表構(gòu)件Srep的主鏈上這些限制對(duì)最終的32個(gè)模型進(jìn)行了計(jì)算和精確化。表1表明所有的這32個(gè)模型都具有良好的幾何形狀，并且與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中的沒有NOE違背＞0.5和也沒有二面角違背＞5°很好的吻合。良好構(gòu)建區(qū)的(殘基15-64，74-92)主鏈原子的原子rmsd值是1.05(見表1)。在N-末端(直到Cys12)、在Glu65-Lys73環(huán)，以及隨后的C-末端Cys92的局部主鏈的rmsd值最高。Ramachandran樣方性質(zhì)對(duì)于其他EGE結(jié)構(gòu)來講也是典型的。結(jié)構(gòu)描述EGF結(jié)構(gòu)域通過PROCHECK-NMR對(duì)最終系綜進(jìn)行分析的結(jié)果表明正如對(duì)一個(gè)類似EGF折疊期望的那樣，每個(gè)結(jié)構(gòu)域中都含有主要為反平行β-折疊片的片段，這段片段含有每個(gè)結(jié)構(gòu)域中的第3和第4個(gè)Cys殘基。這與我們對(duì)一個(gè)類似EGF的折疊所期望的一樣，另外在結(jié)構(gòu)域-1的C-末端也含有額外的小反平行折疊片，這與一些(并非全部)EGF家族的成員相似。在圖4中列出了這些次級(jí)結(jié)構(gòu)的特征和二硫鍵模式。每個(gè)結(jié)構(gòu)域中也含有一個(gè)已經(jīng)確定的二型緊密轉(zhuǎn)角，它含有一個(gè)在Tyr 34NH質(zhì)子與Leu.31的羧基氧形成的氫鍵。在結(jié)構(gòu)域-1中，在緊密轉(zhuǎn)角處的正常保守EGF共有序列的Gly殘基由具有正φ二面角的的殘基(Asn33)取代，雖然這種情況下有保守的芳香族殘基存在(Tyr34)。在Leu 3lNH質(zhì)子和Asn15羧基氧之間估計(jì)有一個(gè)氫鍵存在。在主要的β-折疊之前，在結(jié)構(gòu)域-2中含有兩個(gè)轉(zhuǎn)角(Asn53-Cys56，Asp57-Ala60)，從Leu86-Phe91開始有一個(gè)最后的彎曲，并且在Asp57 NH質(zhì)子與Ile90或Gly89.羰基氧之間有一個(gè)氫鍵。雖然這個(gè)芳香族殘基不是保守的，但暴露在表面的、從Pro81到Pro85之間的環(huán)替代了這個(gè)緊密轉(zhuǎn)角。在主要的β-折疊末端的大環(huán)(Glu65-Lys73)相對(duì)無序，并且經(jīng)過主鏈氨基化合物15N{1H}異核NOE測(cè)定確定了Gly68-Gly71片段具有高活動(dòng)性(Barbato et al.，1992)。對(duì)于在這些區(qū)域的殘基，其異核NOE值顯著降低。在N-末端與其他的蛋白相比，具有相應(yīng)于高活動(dòng)性的低NOE強(qiáng)度。Pro45到Pro47的結(jié)構(gòu)域間連接區(qū)與其他類似EGF的組件對(duì)是不同的。結(jié)構(gòu)域-1中Cys30-Cys41間的二硫橋的構(gòu)象，以及結(jié)構(gòu)域-2中的三個(gè)Cys-Cys鍵都是右手螺旋的(Richardson，1981)。在Cys30-Cys41、Cys56-Cys76及Cys78-Cys92處的二硫橋尤其與血液凝集因子Xa結(jié)構(gòu)(1hcg)中的同等區(qū)域接近。還沒有對(duì)結(jié)構(gòu)域-1相對(duì)無序的N-末端片段中的最開始的兩個(gè)二硫橋進(jìn)行確定。
通過fitpdb程序，與幾種蛋白中EGF樣結(jié)構(gòu)域的典型示例相對(duì)照，圖5展示了兩種MSP-1 C-末端片段結(jié)構(gòu)域主鏈的C、N、Cα等原子的排列。成對(duì)排序表明MSP-1的兩個(gè)主要結(jié)構(gòu)域更接近于因子Xa的結(jié)構(gòu)，其與Clr的緊密關(guān)系比與檢測(cè)過的其他結(jié)構(gòu)的關(guān)系都要緊密。相對(duì)于因子Xa，MSP-1結(jié)構(gòu)域的rsmd值可與那些有較遠(yuǎn)關(guān)系的結(jié)構(gòu)原纖蛋白-1和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-a相當(dāng)。
雖然存在二者的EGF共有序列(C(5)xxGα)，其中此處的α是一個(gè)Phe或Tyr殘基，之間有分歧，但在第五個(gè)Cys殘基之后的轉(zhuǎn)角基本相同，因此MSP結(jié)構(gòu)域的整體折疊與一典型的EGF族成員是相似。就象非交換主鏈酰氨顯示的，雖然一些外部環(huán)是無序的，但其骨架還是相當(dāng)穩(wěn)定的(細(xì)節(jié)見上文和Protein Data Bank/BioMagResBank提交的材料)。
與許多EGF結(jié)構(gòu)域如原纖蛋白-1不同，MSP-1 C-末端片段缺少保守EGF Ca2+結(jié)合序列，現(xiàn)在也沒有任何MSP-1 C-末端片段與Ca2+結(jié)合的證據(jù)。在有和沒有20mM CaCI2存在的情況下，2D1H-NOESY光譜其實(shí)是完全相同的，這表明任何可能的結(jié)合對(duì)整體結(jié)構(gòu)最多只有很小的影響。結(jié)構(gòu)域接觸面和表面MSP-1 C-末端片段結(jié)構(gòu)中最顯著的特征是結(jié)構(gòu)域間的接觸面，它是由幾個(gè)通過疏水相互作用連接在一起的非極性氨基酸(phe19，Leu31，Leu32，Leu86，phe87，Ile90和phe91)組成的。這些殘基通過結(jié)構(gòu)域-2中86-91個(gè)殘基處的最后彎曲與結(jié)構(gòu)域-1中的主要β-折疊和緊密轉(zhuǎn)角的堿基相連接。與觀察到的其他EGF結(jié)構(gòu)域?qū)Φ慕Y(jié)構(gòu)不同，結(jié)構(gòu)域間的這種相互作用使得兩個(gè)結(jié)構(gòu)域形成了一種U形結(jié)構(gòu)(Downing et al.，1996Brandstetter et al.，1995)。例如，在原纖蛋白-1中，EGF結(jié)構(gòu)域32和33之間的接觸面在很大程度上通過一個(gè)共有的Ca2+連接位點(diǎn)形成的，整體結(jié)構(gòu)象一個(gè)堅(jiān)硬的桿，其C-末端和N-末端間隔很遠(yuǎn)。這與MSP-1形成了對(duì)比，后者的EGF樣結(jié)構(gòu)域相互緊密折疊，從而他們的末端相對(duì)較為靠近。原纖蛋白-1和MSP-1 EGF組件對(duì)之間的比較在圖6中有示。雖然MSP-1的兩個(gè)C-末端界際有些雜亂，但卻觀察到在兩個(gè)末端的核之間有NOE接觸。C-末端和N-末端位置的接近可能具有顯著意義，因?yàn)檫@表明C-末端96個(gè)氨基酸片段組成的蛋白水解加工位點(diǎn)與在或接近96個(gè)殘基的GPI膜結(jié)合位點(diǎn)是很接近的。這種接近性與膜結(jié)合瘧原蟲蛋白酶負(fù)責(zé)次級(jí)加工的觀點(diǎn)相一致。
MSP-1 C-末端的靜電勢(shì)面在圖7中的兩個(gè)視圖中有示。圖7a中的表面是高度帶電的，尤其是在突出環(huán)區(qū)23-27、35-40和64-66。圖7b中的表面含有更多的中性、親水殘基和接近表面中心的Pro85-Phe87處的小疏水塊。將來，這樣的信息將有助于理解不同的面是怎樣與其他MSP-1前體、進(jìn)行加工的蛋白酶、在裂殖子表面的其他蛋白或紅血球表面的其他靶、或液泡膜表面寄生蟲進(jìn)行相互作用的。一級(jí)保守序列
圖1顯示了包含在惡性瘧原蟲疏水結(jié)構(gòu)域接觸面上的氨基酸殘基，也顯示了在較弱毒的人瘧疾寄生蟲P.Vivax的MSP-1上的相應(yīng)氨基酸殘基(Del Portillo et al.，1991Gibson et al..1992)。接觸面殘基的廣泛保守性(具有保守替代)表明P.Vivax和其他瘧原蟲中可能相似的U形EGF組件對(duì)排列。P.Vivax的另外一個(gè)特征就是在第一個(gè)EGF樣結(jié)構(gòu)域中單個(gè)的二硫鍵缺乏，這種現(xiàn)象也可在其他瘧原蟲種中見到，這是由缺乏與惡性瘧原蟲Cys12和Cys28等價(jià)的的半胱氨酸殘基。P.falciparum的二態(tài)位點(diǎn)已經(jīng)從不同P.falciparum分離物的MSP-119C-末端片段中觀察到5個(gè)二態(tài)位點(diǎn)(Qari et al.，1998)。關(guān)于這些位點(diǎn)在MSP-1結(jié)構(gòu)上的位置已經(jīng)做了多次觀察。兩個(gè)位點(diǎn)Gln14/Glu14和Lys61/Thr61在暴露于表面的親水或帶電側(cè)鏈上，它涉及到構(gòu)建相對(duì)良好的區(qū)的殘基。一對(duì)含有變體序列Asn70-Gly71/Ser70-Arg71的相鄰位點(diǎn)出現(xiàn)在結(jié)構(gòu)域-2的無序環(huán)區(qū)，已經(jīng)證明它所在的片段(殘基68-71)具有高度的活動(dòng)性。從Glu65到Lys73這個(gè)區(qū)似乎是不同瘧原蟲種的最可變區(qū)(Daly et al.，1992；Holder et al.，1992)。最后，第五個(gè)位點(diǎn)在疏水殘基間有替代作用(Leu86/Phe86)。這個(gè)部分暴露的側(cè)鏈位于疏水結(jié)構(gòu)域接觸面上，這個(gè)保守替代與其在這種相互作用中的任務(wù)相一致。例2-突變和單克隆抗體結(jié)合研究作為邁向理解抗體與MSP-1C-末端相互作用的第一步，我們研究了工程點(diǎn)突變(在結(jié)構(gòu)域-1中)對(duì)抗體結(jié)合的影響。進(jìn)行了由基團(tuán)改變組成的氨基酸替代作用。這些集團(tuán)改變包括，例如，一種帶電極性殘基替代了脂肪族殘基、一種負(fù)電荷側(cè)鏈替代了正電荷側(cè)鏈、帶有小的或沒有側(cè)鏈的氨基酸(甘氨酸)替代了帶有大側(cè)鏈的氨基酸、、帶電極性氨基酸替代了極性氨基酸、芳香族氨基酸替代了極性氨基酸、帶有小側(cè)鏈的氨基酸替代了大的芳香族氨基酸、以及替代二硫鍵中的半胱氨酸殘基。
圖8中顯示了8個(gè)單獨(dú)氨基酸的替代作用，每種替代作用完全破壞了一或多種mAbs與突變體片段的結(jié)合，這是通過Western印跡檢測(cè)到的。用青色表示的Glu26突變與在Asnl的N-末端蛋白水解加工位點(diǎn)(紅紫色)最接近，也是這組便突變里面唯一的一個(gè)可影響加工抑制抗體結(jié)合的突變，也即一個(gè)能夠防止對(duì)體外紅血球入侵和對(duì)MSP-1前體蛋白水解加工的突變。其他三種突變能破壞阻斷性抗體與原始C-末端片段的結(jié)合，并且干擾加工抑制性抗體的結(jié)合。
在免疫化學(xué)分析和分子三級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)之上進(jìn)行了額外的誘變，通過Western印跡和BIAcore分析來估定mAbs的結(jié)合。在表2中有結(jié)果總結(jié)。通過Western印跡檢測(cè)選出的mAbs與修飾蛋白的結(jié)合，結(jié)果自如圖9所示，通過BIAcore進(jìn)行分析的結(jié)果如
圖10所示。有的單個(gè)氨基酸改變對(duì)任何檢測(cè)的mAbs的結(jié)合沒有影響(例如Leu22用Arg替代)。其他的替代作用影響了一或多個(gè)mAbs的結(jié)合。
尤其有趣的是那些可防止阻斷性抗體的結(jié)合、但又不影響抑制性抗體的結(jié)合的改變。例如，利用Arg替代了Asn15防止了mAb 7.5的結(jié)合，利用Tyr替代Glu27防止了mAb 2.2的結(jié)合，利用Arg替代Leu31防止了mAb IEl的結(jié)合，利用Ser替代Tyr34防止了mAb 7.5的結(jié)合，利用Leu替代Glu43防止了mAb 111.4的結(jié)合。
在單獨(dú)的蛋白中可進(jìn)行幾種替代作用的結(jié)合，這些組合可防止阻斷性抗體的結(jié)合但又不影響抑制性抗體的結(jié)合(見圖2和
圖11)。首先是GIu27→Tyr.Leu31→Arg及Glu43→Leu之間結(jié)合使用，其次是GIu27→Tyr.Leu31→Arg.Tyr34→Ser及Glu43→Leu之間結(jié)合使用，第三是Asn15→Arg，GIu27→Tyr，Leu31→Arg及Glu43→Leu結(jié)合使用。這些修飾蛋白中沒有一種與一種阻斷性抗體結(jié)合，但繼續(xù)與抑制性抗體進(jìn)行結(jié)合，我們認(rèn)為突變體蛋白誘導(dǎo)了一種多克隆反應(yīng)，這種多克隆反應(yīng)比野生型蛋白誘導(dǎo)的多克隆反應(yīng)更具抑制性。
修飾的重組蛋白也可用于利用親和力從收集的血清中來選擇抗體，這些血清是從遭受瘧疾的人身上取得的。我們推測(cè)修飾蛋白會(huì)比野生型蛋白選擇較少的阻斷性抗體，因此這些選出的抗體在體外抑制寄生蟲侵入和次級(jí)加工方面更有效。
在嚙齒目動(dòng)物、靈長(zhǎng)目動(dòng)物以及P.Vivax的瘧疾寄生蟲MSP-1第一個(gè)EGF樣結(jié)構(gòu)域中沒有半胱氨酸2和4。我們已經(jīng)將惡性瘧原蟲蛋白中的半胱氨酸對(duì)(Cys12 and Cys28)替代掉了。這看來對(duì)抑制性抗體的結(jié)合沒有任何影響，但它確實(shí)破壞了阻斷性抗體mAb 2.2的結(jié)合。我們認(rèn)為其他瘧疾寄生蟲的蛋白具有更高的免疫原性的一個(gè)原因是T細(xì)胞識(shí)別更有效，或者通過抗原加工細(xì)胞進(jìn)行的加工是利用了另外一種不同的降解途徑，使得抗體反應(yīng)良好的特異性朝向一個(gè)更加高產(chǎn)的方向(見示例，Egan et al.，1997)。去除半胱氨酸對(duì)可提高修飾蛋白的免疫原性，這要通過檢測(cè)在沒有這兩個(gè)半胱氨酸存在下的惡性瘧原蟲蛋白誘導(dǎo)的抗體的水平和檢測(cè)野生型蛋白誘導(dǎo)的抗體的水平來進(jìn)行評(píng)估。
表2-氨基酸序列改變的定位以及它們對(duì)單克隆抗體結(jié)合的影響
++＝強(qiáng)結(jié)合，+＝結(jié)合，-＝不結(jié)合表2(續(xù))
++＝強(qiáng)結(jié)合，+＝結(jié)合，-＝不結(jié)合表A##13-10-98#裂殖子表面蛋白-1(MSP-1)Plasmodium falciparum(C-末端片段)#參考1HDSS＝0.000 二氧六環(huán)＝3.755(內(nèi)部)#15N間接#13C間接#25C pH6.5 50mM NaPO4 100mM NaCl 90％H2O/10％D2O#--FORMAT--#輸入的最初序列是##The original sequence entered was#NISQHQCVKKQCPQNSGCFRHLDEREECKCLLNYKQEGDKCVENPNPTCNENNGGCDADAKCTEEDSGSNGKKITCECTKPDSYPLFDGIFCSSSN##在NMR-STAR中表達(dá)后，這個(gè)序列為_Mol_residue_sequence；NISQHQCVKKQCPQNSGCFRHLDEREECKCLLNYKQEGDKCVENPNPTCNENNGGCDADAKCTEEDSGSNGKKITCECTKPDSYPLFDGIFCSSSN；環(huán)-_Residue_seq_code_Residue_author_seq_code_Residue_label1 @ ASN 2 @ ILE 3 @ SER4 @ GLN 5 @ HIS6 @ GLN 7 @ CYS 8 @ VAL9 @ LYS 10 @ LYS11 @ GLN 12 @ CYS 13 @ PRO 14 @ GLN 15 @ ASN16 @ SER 17 @ GLY 18 @ CYS 19 @ PHE 20 @ ARG21 @ HIS 22 @ LEU 23 @ ASP 24 @ GLU 25 @ ARG26 @ GLU 27 @ GLU 28 @ CYS 29 @ LYS 30 @ CYS31 @ LEU 32 @ LEU 33 @ ASN 34 @ TYR 35 @ LYS36 @ GLN 37 @ GLU 38 @ GLY 39 @ ASP 40 @ LYS41 @ CYS 42 @ VAL 43 @ GLU 44 @ ASN 45 @ PRO46 @ ASN 47 @ PRO 48 @ THR 49 @ CYS 50 @ ASN51 @ GLU 52 @ ASN 53 @ ASN 54 @ GLY 55 @ GLY56 @ CYS 57 @ ASP 58 @ ALA 59 @ ASP 60 @ ALA61 @ LYS 62 @ CYS 63 @ THR 64 @ GLU 65 @ GLU66 @ ASP 67 @ SER 68 @ GLY 69 @ SER 70 @ ASN71 @ GLY 72 @ LYS 73 @ LYS 74 @ ILE 75 @ THR76 @ CYS 77 @ GLU 78 @ CYS 79 @ THR 80 @ LYS81 @ PRO 82 @ ASP 83 @ SER 84 @ TYR 85 @ PRO86 @ LEU 87 @ PHE 88 @ ASP 89 @ GLY 90 @ ILE91 @ PHE 92 @ CYS 93 @ SER 94 @ SER 95 @ SER96 @ ASNstop_
########################################################### 化學(xué)漂移下明確編碼定義 #### 編碼定義 ####1唯一 ##2偕原子不明確或偕甲基質(zhì)子基團(tuán)不明確 ####3環(huán)對(duì)應(yīng)端的芳香族原子(如Tyr HE1和HE2質(zhì)子)###4殘基內(nèi)不明確，(e.g.Lys HG和HD質(zhì)子) ####5殘基內(nèi)不明確，(Lys 12vs.Lsy27) ##9模糊的，特異的不明確未指出 ##############################################################使用說明#1)用適當(dāng)?shù)闹堤娲鶣符號(hào)#2)在文章中有對(duì)這些排布的文字說明#3)如果需要可任意在此表中添加或刪除行#行序號(hào)(-原子-漂移-排布-ID值)將由BMRB來重新賦值##本序列選取的原子表如下環(huán)__Atom_shift_assign_ID_Residue_seq_code_Residue_labet_Atom_name_Atom_type_Chem_shift_value_Chem_shift_value_error_Chem_shift_ambiguity_code#表A1.增補(bǔ)表MSP-1 C-末端片段的1H，13C和15N化學(xué)漂移排布原子漂移殘基序號(hào) 殘基名稱 原子名稱 原子類型漂移/誤差/ 不明確編號(hào)排布 ppm ppm1 1 ASN HH 8.29 0.0212 1 ASN HA H 4.60 0.0213 1 ASN HB2 H 2.86 0.0224 1 ASN HB3 H 2.75 0.0225 1 ASN HD21 H ？ ？ ？6 1 ASN HD22 H ？ ？ ？7 1 ASN CC ？ ？ ？8 1 ASN CA C 55.5 0.6 19 1 ASN CB C 40.9 0.6 111 1 ASN NN 125.80.3 112 1 ASN ND2 N ？ ？ ？13 1 ILE HH 8.29 0.021142ILE HA H 4.25 0.02 1152ILE HB H 1.97 0.02 1162ILE HG12H 1.39 0.02 2172. ILE HG13H 1.19 0.02 2182ILE HG2 H 0.92 0.02 1192ILE HD1 H 0.81 0.02 1202ILE C C 173.8 0.61212ILE CA C 62.2 0.61222ILE CB C 38.7 0.61232ILE CG1 C 27.5 0.61242ILE CG2 C 18.2 0.61252ILE CD1 C 13.7 0.61262ILE N N 121.1 0.31273SER H H 8.47 0.02 1283SER HA H 4.20 0.02 1293SER HB2 H 3.90 0.02 1303SER HB3 H 3.90 0.02 1323SER C C ？ ？ ？333SER CA C 60.9 0.61343SER CB C 63.3 0.61353SER N N 119.3 0.31364GLN H H 8.32 0.02 1374GLN HA H 4.02 0.02 1384GLN HB2 H 1.88 0.02 1394GLN HB3 H 1.88 0.02 1404GLN HG2 H 1.75 0.02 1414GLN HG3 H 1.75 0.02 1424GLN HE21H ？ ？ ？434GLN HE22H ？ ？ ？444GLN C C ？ ？ ？454GLN CA C 57.7 0.61464GLN CB C 27.9 0.61474GLN CG C 32.7 0.61494GLN N N 121.6 0.31504GLN NE2 N ？ ？ ？515HIS H H 7.76 0.02 9525HIS HA H 5.09 0.02 1535HIS HB2 H 2.70 0.02 1545HIS HB3 H 2.70 0.02 1565HIS HD2 H 6.87 0.02 1575HIS HE1 H 7.92 0.02 1595HIS C C 175.7 0.61605HIS CA C 54.8 0.61615HIS CB C 29.2 0.61655HIS N N 113.6 0.39686GLN H H 7.42 0.02 9696GLN HA H 4.43 0.02 1706GLN HB2 H 2.05 0.02 1716GLN HB3 H 2.05 0.02 1726GLN HG2 H 2.42 0.02 1736GLN HG3 H 2.42 0.02 1746GLN HE21H 7.59 0.02 5756GLN HE22H 6.92 0.02 5766GLN C C 175.7 0.61776GLN CA C 55.1 0.61786GLN CB C 28.8 0.61796GLN CG C 33.8 0.61816GLN N N 122.5 0.3982 6GLN NE2N 112.6 0.3583 7CYS H H 9.18 0.02 184 7CYS HA H 4.09 0.02 185 7CYS HB2H 3.31 0.02 286 7CYS HB3H 3.11 0.02 288 7CYS C C 174.4 0.6189 7CYS CA C 56.6 0.6190 7CYS CB C 42.3 0.6191 7CYS N N 124.5 0.3192 8VAL H H 10.42 0.02 193 8VAL HA H 4.33 0.02 194 8VAL HB H 2.15 0.02 195 8VAL HG1H 0.84 0.02 296 8VAL HG2H 0.82 0.02 297 8VAL C C 176.6 0.6198 8VAL CA C 62.5 0.6199 8VAL CB C 34.4 0.611008VAL CG1C 21.5 0.621018VAL CG2C 19.7 0.621028VAL N N 119.1 0.311039LYS H H 9.42 0.02 11049LYS HA H 4.51 0.02 11059LYS HB2H 1.81 0.02 41069LYS HB3H 1.81 0.02 41079LYS HG2H 1.41 0.02 41089LYS HG3H 1.41 0.02 41099LYS HD2H ？ ？ ？1109LYS HD3H ？ ？ ？1119LYS HE2H 3.33 0.02 11129LYS HE3H 3.33 0.02 11149LYS C C ？ ？ ？1159LYS CA C 57.7 0.611169LYS CB C ？ ？ ？1179LYS CG C ？ ？ ？1189LYS CD C ？ ？ ？1199LYS CE C ？ ？ ？1209LYS N N 124.1 0.03 112210 LYS H H 8.94 0.02 112310 LYS HA H 4.06 0.02 112410 LYS HB2H 1.86 0.02 112510 LYS HB3H 1.86 0.02 112610 LYS HG2H 1.29 0.02 112710 LYS HG3H 1.29 0.02 112810 LYS HD2H 1.70 0.02 212910 LYS HD3H 1.59 0.02 213010 LYS HE2H 3.04 0.02 113110 LYS HE3H 3.04 0.02 113310 LYS C C ？ ？ ？13410 LYS CA C 57.1 0.6113510 LYS CB C 34.3 0.6113610 LYS CG C 25.6 0.6113710 LYS CD C 29.6 0 6113810 LYS CE C 42.4 0.6113910 LYS N N 122.4 0.3114111 GLN H H ？ ？ ？14211 GLN HA H 4.47 0.02 114311 GLN HB2H 2.03 0.02 214411 GLN HB3H 1.89 0.02 214511GLNHG2H2.280.02114611GLNHG3H2.280.02114711GLNHE21 H7.450.02214811GLNHE22 H6.840.02214911GLNC C？ ？ ？15011GLNCA C54 40.6 115111GLNCB C28.70.6 115211GLNCG C33.80.6 115411GLNN N？ ？ ？15511GLNNE2N112.9 0.3 115612CYSH H？ ？ ？15712CYSHA H5.090.02115812CYSHB2H3.490.02215912CYSHB3H2.340.02216112CYSC C？ ？ ？16212CYSCA C52.40.6 116312CYSCB C37.20.6 116412CYSN N？ ？ ？16513PROHA H4.550.02116613PROHB2H2.450.02116713PROHB3H1.940.02116813PROHG2H1.730.02216913PROHG3H2.040.02217013PROHD2H3.430.02217113PROHD3H3.800.02217213PROC C176.4 0.6 117313PROCA C62.60.6 117413PROCB C33.00.6 117513PROCG C27.50.6 117613PROCD C50.60.6 117814GLNH H8.480.02117914GLNHA H4.010.02118014GLNHB2H1.940.02118114GLNHE3H1.940.02118214GLNHG2H2.420.02118314GLNHG3H2.420.02118414GLNHE21 H7.590.02518514GLNHE22 H6.920.02518614GLNC C176.6 0.6 118714GLNCA C57.40.6 118814GLNCB C28.60.6 118914GLNCG C33.80.6 119114GLNN N120.5 0.3 119214GLNNE2N112.6 0.3 519315ASNH H8.930.02119415ASNHA H3.770.02119515ASNHB2H2.580.02119615ASNHB3H1.090.02119715ASNHD21 H6.970.02119815ASNHD22 H7.120.02119915ASNC C171.9 0.6 120015ASNCA C54.60.6 120115ASNCB C36.30.6 120315ASNN N115.8 0.3 120415ASNND2N115.4 0.3 120516SERH H7.340.02120616SERHA H4.930.02120716SERHB2H3.620.02220816SERHB3H3.520.02221016SERC C173.5 0.6 121116SERCA C57.50.6 121216SERCB C67.90.6 121316SERN N109.9 0.3 121417GLYH H8.920.02121517GLYHA2H3.830.02121617GLYHA3H2.060.02121717GLYC C？ ？ ？21817GLYCA C42.60.6 121917GLYN N108.5 0.3 122018CYSH H7.010.02122118CYSHA H5.630.02122218CYSHB2H3.010.02122318CYSHB3H3.010.02122518CYSC C172.5 0.6 122618CYSCA C55.80.6 122718CYSCB C43.20.6 122818CYSN N120.5 0.3 122919PHEH H9.120.02123019PHEHA H4.430.02123119PHEHB2H1.700.02223219PHEHB3H0.620.02223319PHEHD1H6.120.02123419PHEHD2H6.120.02123519PHEHE1H6.300.02123619PHEHE2H6.300.02123719PHEHZ H6.370.02123819PHEC C172.3 0.6 123919PHECA C57.00.6 124019PHECB C41.70.6 124719PHEN N132.0 0.6 124820ARGH H7.760.02124920ARGHA H4.830.02125020ARGHB2H1.260.02225120ARGHB3H0.990.02225220ARGHG2H1.590.02225320ARGHG3H1.420.02225420ARGHD2H3.350.02225520ARGHD3H3.100.02225620ARGHE H7.180.02125720ARGHH11 H6.230.02525820ARGHH12 H6.230.02525920ARGHH21 H6.230.02526020ARGHH22 H6.230.02526120ARGC C174.7 0.6 126220ARGCA C54.30.6 126320ARGCB C32.30.6 126420ARGCG C28.00.6 126520ARGCD C44.10.6 126720ARGN N129.4 0.3 126820ARGNE N. 85.00.3 126920ARGNH1N70.10.3 527020ARGNH2N70.10.3 527121HISH H9.300.02127221HISHA H4.500.02127321HISHB2H3.520.02227421HISHB3H3.440.02227621HIS HD2 H 7.02 0.02 127721HIS HE1 H 8.44 0.02 127921HIS CC 177.6 0.6 128021HIS CA C 56.4 0.6 128121HIS CB C 32.2 0.6 128521HIS NN 125.9 0.3 128822LEU HH 9.30 0.02 128922LEU HA H 4.11 0.02 129022LEU HB2 H 1.87 0.02 129122LEU HB3 H 1.65 0.02 129222LEU HG H 1.87 0.02 129322LEU HD1 H 0.77 0.02 229422LEU HD2 H 0.98 0.02 229522LEU CC 177.7 0.6 129622LEU CA C 57.7 0.6 129722LEU CB C 40.8 0.6 129822LEU CG C 27.6 0.6 129922LEU CD1 C 22.6 0.6 230022LEU CD2 C 25.3 0.6 230122LEU NN 122.0 0.3 130223ASP HH 7.86 0.02 130323ASP HA H 4.52 0.02 130423ASP HB2 H 3.10 0.02 130523ASP HB3 H 2.53 0.02 130623ASP CC 176.8 0.6 130723ASP CA C 53.6 0.6 130823ASP CB C 39.7 0.6 131023ASP NN 116.9 0.3 131124GLU HH 8.01 0.02 131224GLU HA H 3.63 0.02 131324GLU HB2 H 2.57 0.02 231424GLU HB3 H 2.17 0.02 231524GLU HG2 H 2.14 0.02 131624GLU HG3 H 2.14 0.02 131724GLU CC 176.1 0.6 131824GLU CA C 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7.39 0.021100583SERHA H 447 0.021100683SERHB2H 3.55 0.022100783SERHB3H 3.50 0.022100983SERC C 175.4 0.6 1101083SERCA C 57.4 0.6 1101183SERCB C 65.9 0.6 1101283SERN N 112.9 0.3 1101384TYRH H 8.72 0.021101484TYRHA H 5.01 0.021101584TYRHB2H 2.93 0.022101684TYRHB3H 2.75 0.022101784TYRHD1H 6.92 0.021101884TYRHD2H 6.92 0.021101984TYRHE1H 6.69 0.021102084TYRHE2H 6.69 0.021102284TYRC C ？？ ？102384TYRCA C 54.6 0.6 1102484TYRCB C 39.7 0.6 1103184TYRN N 122.2 0.3 1103285PROHA H 5.09 0.021103385PROHB2H 2.25 0.022103485PROHB3H 1.72 0.022103585PROHG2H 2.22 0.021103685PROHG3H 2.22 0.021103785PROHD2H 3.85 0.021103885PROHD3H 3.85 0.021103985PROC C 176.9 0.6 1104085PROCA C 62.9 0.6 1104185PROCB C 32.8 0.6 1104285PROCG C 27.3 0.6 1104385PROCD C 50.6 0.6 1104586LEUH H 8.51 0.021104686LEUHA H 4.77 0.021104786LEUHB2H 1.76 0.021104886LEUHB3H 1.76 0.021104986LEUHG H 1.85 0.021105086LEUHD1H 1.00 0.021105186LEUHD2H 1.00 0.021105286LEUC C 177.9 0.6 1105386LEUCA C 54.5 0.6 1105486LEUCB C 44.8 0.6 1105586LEUCG C 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1110490ILECG2C 16.9 0.6 1110590ILECD1C 14.9 0.6 1110690ILEN N 113.3 0.3 1110791PHEH H 7.43 0.021110891PHEHA H 5.15 0.021110991PHEHB2H 2.40 0.021111091PHEHB3H 2.40 0.021111191PHEHD1H 7.00 0.021111291PHEHD2H 7.00 0.021111391PHEHE1H 6.95 0.021111491PHEHE2H 6.95 0.021111591PHEHZ H 7.06 0.021111691PHEC C 175.1 0.6 1111791PHECA C 56.5 0.6 1111891PHECB C 44.3 0.6 1112591PHEN N 114.0 0.3 1112692CYSH H 7.86 0.021112792CYSHA H 5.18 0.021112892CYSHB2H 2.57 0.021112992CYSHB3H 3.08 0.021113192CYSC C 174.1 0.6 1113292CYSCA C 54.1 0.6 1113392CYSCB C 44.7 0.6 1113492CYSN N 119.0 0.3 1113593SERH H 9.26 0.021113693SERHA H 4.23 0.021113793SERHB2H 3.90 0.021113893SERHB3H 3.90 0.021114093SERC C ？？ ？114193SERCA C 60.4 0.6 1114293SERCB C 63.7 0.6 1114393SERN N 118.3 0.3 1114494SERH H 8.04 0.021114594SERHA H 4.59 0.021114694SERHB2H 3.91 0.021114794SERHB3H 3.91 0.021114994SERC C ？？ ？115094SERCA C 58.7 0.6 1115194SERCB C 64.0 0.6 1115294SERN N 114.2 0.3 1115395SERH H ？？ ？115495SERHA H 4.71 0.021115595SERHB2H 402 0.022115695SERHB3H 3.94 0.022115895SERC C ？？ ？115995SERCA C 58.4 0.6 1116095SERCB C 64.5 0.6 1116195SERN N ？？ ？116296ASNH H ？？ ？116396ASNHA H 4.61 0.021116496ASNHB2H 2.75 0.022116596ASNHB3H 2.60 0.022116696ASNHD21 H ？？ ？116796ASNHD22 H ？？ ？116896ASNC C ？？ ？116996ASNCA C 54.3 0.6 1117096ASNCB C 41.8 0.6 1117296ASNN N ？？ ？117396ASNND2N ？？ ？stop_
#下列環(huán)是用來定義原子漂移排布組ID的，而這些ID代表了與取自上述化學(xué)漂移賦值表有關(guān)的不明確排布，。此組中的每個(gè)組分應(yīng)該用逗號(hào)來隔開，就象下面示例中所示的那樣，并且每個(gè)化學(xué)漂移排布都有一個(gè)排布ID，這些ID已經(jīng)被賦予了不明確編號(hào)4或5。每組排布表明觀察到的化學(xué)漂移與定義的原子相關(guān)，但沒有對(duì)組中的特定原子賦予明確的值。
loop__Atom_shift_assign_ID_ambiguity## Sets of Atom-shift Assignment Ambiguities## -------------------------------#Example5，4，7#@stop_################################################################################### ---- 備注 ---- #################################################################################### ########## 保護(hù)的主鏈酰胺基團(tuán)# (SLOWLY EXCHANGING IN D2O)FOR RESIDUES# GLY17，PHE19，GLU27，LYS29，LEU31，# TYR34，LYS35，VAL42，CYS56，ASP57，# ALA60，LYS61，THR63，THR75，GLU77，# LEU86，GLY89，ILE90，PHE91## BROAD HN SIGNALS IN[15-N]-HSQC OBSERVED FOR RESIDUES# VAL8，LYS9，LYS10，CYS18，ARG20## TWO BACKBONE HN CROSSPEAKS OBSERVED FOR RESIDUES# HIS 57.78，113.8/7.74，113.5# GLN 67.44，122.6/7.40，122.4##TWO AVERAGED NH*/HH*SIGNALS OBSERVED FOR RESIDUES# ARG20，ARG25NOT SPECIFICALLY ASSIGNED# TO INDIVIDUAL ARGININES## LYS29 NZ/HZ*SIGNALTENTATIVELY ASSIGNED TO# LYS29(BURIED LYSINE SIDE CHAIN)# BASED ON GREATER PROTECTION FROM H2O EXCHANGE# THAN OTHER LYSINE NZ/HZ*SIGNALS## 天門冬酰胺側(cè)鏈酰胺基團(tuán)信號(hào)# PROBABLE OVERLAPPING CROSSPEAKS～112PPM[15N]# FOR ASN1，ASN70，ASN96#################################################################################### ##################################################################################表A2.增補(bǔ)表NMR實(shí)驗(yàn)詳述實(shí)驗(yàn) 維 核Complex光譜寬 獲得時(shí)間載體頻率 儀器1H頻率 溶劑 溫度 大小 數(shù)字區(qū)分 混合時(shí)間 總時(shí)間Points 最終數(shù)據(jù) 辨率[after LP](points)(Hz) (ms)(ppm) (MHz) (C) (points) (Hz/ (ms) (hr)point)2D NOESYt11H400 8000 50 4.74 600 D2O 25 10247.8 75-150 22t21H20488000 256 4.74 20483.92D NOESYt11H360 8000 45 4.74 600 H2O 25 10247.8 75 23t21H20488000 256 4.74 20483.92D ROESYt11H260 6000 43 4.74 500 D2O 25 10245.9 60 16t21H20486000 341 4.74 20482.92D ROESYt11H360 7000 54 4.74 500 H2O 25 10246.8 60 62t21H20487000 293 4.74 20483.43D[15N]-NOESY-HSQt115N 36[64] 2500 14.4 121.5 500 H2O 25 128 19.5125 64t21H180 7000 26 4.74 512 13.7t31H512 7000 73 4.74 512 13.73D[15N]-ROESY-HSQCt115N 32 2500 12.8 121.5 500 H2O 25 128 19.560 87t21H180 7000 26 4.74 512 13.7t31H512 7000 73 4.74 512 13.73D[13C]-HMQC-NOESYt11H160 7200 22 4.74 600 D2O 25 512 14.1125 89t213C 96 10000 9.6 41.0 256 39.1t31H384 7200 53 4.74 10247.04D[13C]-HMQC-NOESY-[13C]-HSQCt113C 18[24] 3360 5.4 40.2 600 D2O 25 64 52.5125 105t21H74 3600 21 3.00 256 14.1t313C 18[24] 3360 5.4 40.2 64 52.5t41H256 4500 57 3.00 256 17.6實(shí)驗(yàn)維核Complex 光譜寬 獲得時(shí)間 載體頻率 儀器1H頻率溶劑 溫度 大小數(shù)字區(qū)分 混合時(shí)間 總時(shí)間{Reference} Points 最終數(shù)據(jù) 辨率[after LP](points) (Hz)(ms)(ppm) (MHz) (℃) (points) (Hz/point) (ms)(hr)4D[13C]-HMQC-NOESY-[15N]-HSQCt113C14[24]33604.2 40.2600 H2O 2564 52.5125 96t21H 56360015.63.00 128 28.1t315N14[24]18007.8 118.964 28.1t41H 256 740034.64.74 256 29.02D DQF-COSYt11H 1000 6000167 4.74500 D2O 254096 1.5 31t21H 2048 6000341 4.74 8192 0.73D HNHAt115N35250014 121.5 500 H2O 25128 19.5 41t21H 80350023 4.74 256 13.7t31H 512 700073 4.74 512 13.73D HNHBt115N24[48]25009.6 119.1 600 H2O 25 128 19.5 60t21H 90800011.34.74 256 31.3t31H 512 800064 4.74 1024 7.83D HN(CO)HBt115N28[48]1800156 118.9 600 H2O25 128 14.1 108t21H 128 800016 4.74 512 15.6t31H 512 800064 4.74 512 15.62D[15N]-[13Cγ] Spin-echo HSQCt115N80180044.4118.9 600 H2O25 256 7.0 13t21H 1312 8000149 4.74 2048 3.92D[13C]-[13Cγ]Spin-echo HSQCt115N78180043.3118.9 600 H2O25 256 7.0 26t21H 1216 8000152 4.74 2048 3.93D LRCHt113C34301711.317.9600 D2O25 256 11.8 84t21H 57480011.92.25 256 18.8131H 384 400096 2.25 1024 3.9實(shí)驗(yàn)維核 Complex 光譜寬 獲得時(shí)間 載體頻率儀器1H頻率溶劑溫度 大小 數(shù)字區(qū)分 混合時(shí)間 總時(shí)間{Reference} Points 最終數(shù)據(jù) 辨率[after LP](points) (Hz) (ms) (ppm)(MHz) (℃)(points)(Hz/point) (ms)(hr)2D TOCSYt11H 360 8000 45 4.74 600 H2O 25 1024 7.866 18t21H 2048 8000 256 4.74 2048 3.92D[15N]-HSQCt115N 360 4400 82 119.6600 H2O 25 2048 2.114t21H 1216 8000 152 4.74 4096 2.02D[13C]-HSQCt113C 400 12000 33.3 41.3 600 H2O 25 1024 11.7 2.7t21H 1216 8000 152 4.74 4096 203D[15N]-TOCSY-HSQt115N 38[64]2500 15.2 119.0600 H2O 25 128 19.5 56 43t21H 180 8000 22.5 4.74 512 15.6t31H 512 8000 64 4.74 512 15.63D HCCH-TOCSYt11H 134 5500 24.4 4.74 500 D2O 25 512 10.7 17 65t213C 128 8049 15.9 41.9 512 15.7t31H 416 5500 76 4.74 512 10.73D CBCA(CO)NHt113C 38[64]10000 3.8 41.3 600 H2O 25 128 78.1 21t215N 26[36]1800 14.4 118.9 128 14.1t31H 512 8000 64 4.74 512 15.63D CBCANHt113C 63[128] 10000 6.3 41.3 600 H2O 25 512 19.5 5t215N 26[52]1800 14.4 118.9 128 14.1t31H 512 8000 64 4.74 256 31.33D HNCOt115N 32[48]1800 17.8 118.9600 H2O 25 128 14.1 43t213C 641811 35.3 176.0 256 7.1t31H 512 8000 64 4.74 512 15.6
表B！裂殖子表面蛋白-1(MSP-1)P.falclparum C-末端片段！X-PLOR format！09-11-98！---noes+roes--approximate--570 total！ 發(fā)程 135！ 中程 30！ 序列 222！ 殘基內(nèi) 73！ 氫效率 10(20 restraints)！pseudoatom corrections not used--for R-6 averaging/summation！AVERAGING！class rt6s SUM！class nsam SUM！class sing！class hbnd！types！arom_aromatic pair！meth_methyl！dgnm_degenerate methylene！nsam_non-stereospecifically-assigned methylene！sing_single proton！_l long-range(j-i＞4)！_m medium-range (j-i＝2-4)！_s sequential(j-i＝1)！_i intraresidue！hbnd hydrogen_bonds！ <residue-atom 1> <residue-atom 2> <dist-minus-plus><type>class rt6sassign(resid 5 and name hb#) (resid 19 and name hd#)3.6 3.6 0.0 ！arom_lassign(resid 5 and name hb#) (resid 19 and name he#)3.6 3.6 0.0 ！arom_lassign(resid 15 and name ha) (resid 34 and name hd#)3.6 3.6 0.0 ！arom_lassign(resid 15 and name ha) (resid 34 and name he#)3.6 3.6 0.0 ！arom_lassign(resid 17 and name ha#) (resid 87 and name hd#)5.5 5.5 0.0 ！arom_lassign(resid 17 and name ha#) (resid 87 and name he#)5.5 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name hd#) 3.6 3.6 0.0 ！nsam_iassign(resid 20 and name hg#) (resid 21 and name hn) 3.6 3.6 0.0 ！nsam_sassign(resid 20 and name hg#) (resid 24 and name ha) 3.6 3.6 0.0 ！nsam_massign(resid 21 and name hb#) (resid 22 and name hn) 5.5 5.5 0.0 ！nsam_sassign(resid 21 and name hb#) (resid 23 and name hn) 5.5 5.5 0.0 ！nsam_massign(resid 22 and name hb2) (resid 23 and name hn) 3.6 3.6 0.0 ！sing_sassign(resid 24 and name hb#) (resid 25 and name hn) 5.5 5.5 0.0 ！nsam_sassign(resid 25 and name hn)(resid 25 and name hg#) 3.6 3.6 0.0 ！nsam_iassign(resid 25 and name hg#) (resid 26 and name hn) 3.6 3.6 0.0 ！nsam_sassign(resid 26 and name hn)(resid 26 and name hg#) 3.6 3.6 0.0 ！nsam_iassign(resid 26 and name ha)(resid 26 and name hg#) 3.6 3.6 0.0 ！nsam_iassign(resid 27 and name ha)(resid 27 and name hg#) 2.8 2.8 0.0 ！nsam_iassign(resid 27 and name hb#) (resid 28 and name hn) 2.8 2.8 0.0 ！nsam_sassign(resid 27 and name hg#) (resid 28 and name hn) 2.8 2.8 0.0 ！nsam_sassign(resid 28 and name hn)(resid 28 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2assign(resid 52 and name n) (resid 52 and name ca)(resid 52 and name cb) (resid 52 and name cg) 1.0 60.0 40.0 2assign(resid 53 and name n) (resid 53 and name ca)(resid 53 and name cb) (resid 53 and name cg) 1.0 180.0 40.0 2assign(resid 56 and name n) (resid 56 and name ca)(resid 56 and name cb) (resid 56 and name sg) 1.0 -60.0 40.0 2assign(resid 62 and name n) (resid 62 and name ca)(resid 62 and name cb) (resid 62 and name sg) 1.0 180.0 40.0 2assign(resid 74 and name n) (resid 74 and name ca)(resid 74 and name cb) (resid 74 and name cg1) 1.0 -60.0 40.0 2assign(resid 76 and name n) (resid 76 and name ca)(resid 76 and name cb) (resid 76 and name sg) 1.0 -60.0 40.0 2assign(resid 78 and name n (resid 78 and name ca)(resid 78 and name cb) (resid 78 and name sg) 1.0 -60.0 40.0 2assign(resid 87 and name n) (resid 87 and name ca)(resid 87 and name cb) (resid 87 and name cg) 1.0 -60.0 40.0 2assign(resid 92 and name n) (resid 92 and name ca)(resid 92 and name cb) (resid 92 and name sg) 1.0 -60.0 40.0 2！phi restraintsassign(resid 14 and name c) (resid 15 and name n)(resid 15 and name ca) (resid 15 and name c)1.0 60.0 50.0 2 ！HN(CO)HBassign(resid 18 and name c) (resid 19 and name n) -(resid 19 and name ca) (resid 19 and name c)1.0 -120.0 50.0 2 ！HNHA 8.9 Hzassign(resid 27 and name c) (resid 28 and name n)(resid 28 and name ca) (resid 28 and name c)1.0 -120.0 70.0 2 ！HNHA 7.6 Hzassign(resid 29 and name c) (resid 30 and name n)(resid 30 and name ca) (resid 30 and name c)1.0 -78.0 50.0 2assign(resid 31 and name c) (resid 32 and name n)(resid 32 and name ca) (resid 32 and name c)1.0 -84.0 50.0 2assign(resid 32 and name c) (resid 33 and name n)(resid 33 and name ca) (resid 33 and name c)1.0 60.0 50.0 2 ！HN(CO)HBassign(resid 33 and name c) (resid 34 and name n)(resid 34 and name ca) (resid 34 and name c)1.0 -120.0 50.0 2 ！HNHA 8.2 Hzassign(resid 34 and name c) (resid 35 and name n)(resid 35 and name ca) (resid 35 and name c)1.0 -120.0 50.0 2 ！HNHA 8.45 Hzassign(resid 36 and name c) (resid 37 and name n)(resid 37 and name ca) (resid 37.and name c)1.0 -120.0 50.0 2 ！HNHA 8.6 Hzassign(resid 38 and name c) (resid 39 and name n)(resid 39 and name ca) (resid 39 and name c)1.0 -120.0 50.0 2 ！HNHA 8.6 Hzassign(resid 39 and name c) (resid 40 and name n)(resid 40 and name ca) (resid 40 and name c)1.0 -120.0 50.0 2 ！HNHA 8.3 Hzassign(resid 40 and name c) (resid 41 and name n)(resid 41 and name ca) (resid 41 and name c)1.0 -120.0 50.0 2 ！HNHA 8.8Hzassign(resid 41 and name c) (resid 42 and name n)(resid 42 and name ca) (resid 42 and name c)1.0 -120.0 50.0 2 ！HNHA 8.5Hzassign(resid 49 and name c) (resid 50 and name n)(resid 50 and name ca) (resid 50 and name c)1.0 -75.0 50.0 2assign(resid 50 and name c) (resid 51 and name n)(resid 51 and name ca) (resid 51 and name c)1.0 -120.0 50.0 2 ！HNHA 8.5Hzassign(resid 52 and name c) (resid 53 and name n)(resid 53 and name ca) (resid 53 and name c)1.0 60.0 50.0 2 ！HN(CO)HBassign(resid 55 and name c) (resid 56 and name n)(resid 56 and name ca) (resid 56 and name c)1.0 -60.0 50.0 2 ！HNHA 5.0Hzassign(resid 58 and name c) (resid 59 and name n)(resid 59 and name ca) (resid 59 and name c)1.0 -120.0 50.0 2 ！HNHA 8.8Hzassign(resid 59 and name c) (resid 60 and name n)(resid 60 and name ca) (resid 60 and name c)1.0 -120.0 50.0 2 ！HNHA 8.2Hzassign(resid 60 and name c) (resid 61 and name n)(resid 61 and name ca) (resid 61 and name c)1.0 -120.0 50.0 2 ！HNHA 8.1Hzassign(resid 61 and name c) (resid 62 and name n)(resid 62 and name ca) (resid 62 and name c)1.0 -150.0 70.0 2 ！HNHA 7.9Hzassign(resid 62 and name c) (resid 63 and name n)(resid 63 and name ca) (resid 63 and name c)1.0 -120.0 50.0 2 ！HNHA 8.7Hzassign(resid 73 and name c) (resid 74 and name n)(resid 74 and name ca) (resid 74 and name c)1.0 -120.0 50.0 2assign(resid 74 and name c) (resid 75 and name n)(resid 75 and name ca) (resid 75 and name c)1.0 -120.0 50.0 2 ！HNHA 9.15Hzassign(resid 76 and name c) (resid 77 and name n)(resid 77 and name ca) (resid 77 and name c)1.0 -120.0 50.0 2 ！HNHA 8.2Hz！psi restraintsassign(resid 15 and name n) (resid 15 and name ca)(resid 15 and name c) (resid 16 and name n)1.0 50.0 50.0 2assign(resid 19 and name n) (resid 19 and name ca)(resid 19 and name c) (resid 20 and name n)1.0 120.0 75.0 2assign(resid 25 and name n) (resid 25 and name ca)(resid 25 and name c) (resid 26 and name n)1.0 120.0 75.0 2assign(resid 27 and name n) (resid 27 and name ca)(resid 27 and name c) (resid 28 and name n)1.0 120.0 75.0 2assign(resid 28 and name n) (resid 28 and name ca)(resid 28 and name c) (resid 29 and name n)1.0 120.0 75.0 2assign(resid 29 and name n) (resid 29 and name ca)(resid 29 and name c) (resid 30 and name n)1.0 120.0 60.0 2assign(resid 30 and name n) (resid 30 and name ca)(resid 30 and name c) (resid 31 and name n)1.0 125.0 75.0 2assign(resid 31 and name n) (resid 31 and name ca)(resid 31 and name c) (resid 32 and name n)1.0 120.0 75.0 2assign(resid 32 and name n) (resid 32 and name ca)(resid 32 and name c) (resid 33 and name n)1.0 174.0 50.0 2assign(resid 33 and name n) (resid 33 and name ca)(resid 33 and name c) (resid 34 and name n)1.0 60.0 50.0 2assign(resid 34 and name n) (resid 34 and name ca)(resid 34 and name c) (resid 35 and name n)1.0 159.0 50.0 2assign(resid 35 and name n) (resid 35 and name ca)(resid 35 and name c) (resid 36 and name n)1.0 156.0 50.0 2assign(resid 36 and name n) (resid 36 and name ca)(resid 36 and name c) (resid 37 and name n)1.0 120.0 60.0 2assign(resid 37 and name n) (resid 37 and name ca)(resid 37 and name c) (resid 38 and name n)1.0 120.0 60.0 2assign(resid 40 and name n) (resid 40 and name ca)(resid 40 and name c) (resid 41 and name n)1.0 120.0 60.0 2assign(resid 41 and name n) (resid 41 and name ca)(resid 41 and name c) (resid 42 and name n)1.0 120.0 60.0 2assign(resid 42 and name n) (resid.42 and name ca)(resid 42 and name c) (resid 43 and name n)1.0 120.0 60.0 2assign(resid 43 and name n) (resid 43 and name ca)(resid 43 and name c) (resid 44 and name n)1.0 120.0 60.0 2assign(resid 45 and name n) (resid 45 and name ca)
(resid 45 and name c) (resid 46 and name n) 1.0 -60.0 50.0 2！HNHBassign(resid 51 and name n) (resid 51 and name ca)(resid 51 and name c) (resid 52 and name n) 1.0 120.0 75.0 2assign(resid 53 and name n) (resid 53 and name ca)(resid 53 and name c) (resid 54 and name n) 1.0 50.0 50.0 2assign(resid 58 and name n) (resid 58 and name ca)(resid 58 and name c) (resid 59 and name n) 1.0 -60.0 50.0 2！HNHBassign(resid 59 and name n) (resid 59 and name ca)(resid 59 and name c) (resid 60 and name n) 1.0 33.0 50.0 2assign(resid 60 and name n) (resid 60 and name ca)(resid 60 and name c) (resid 61 and name n) 1.0 162.0 50.0 2assign(resid 61 and name n) (resid 61 and name ca)(resid 61 and name c) (resid 62 and name n) 1.0 120.0 60.0 2assign(resid 62 and name n) (resid 62 and name ca)(resid 62 and name c) (resid 63 and name n) 1.0 120.0 60.0 2assign(resid 63 and name n) (resid 63 and name ca)(resid 63 and name c) (resid 64 and name n) 1.0 165.0 50.0 2assign(resid 74 and name n) (resid 74 and name ca)(resid 74 and name c) (resid 75 and name n) 1.0 120.0 60.0 2assign(resid 75 and name n) (resid 75 and name ca)(resid 75 and name c) (resid 76 and name n) 1.0 120.0 60.0 2assign(resid 76 and name n) (resid 76 and name ca)(resid 76 and name c) (resid 77 and name n) 1.0 120.0 60.0 2assign(resid 78 and name n) (resid 78 and name ca)(resid 78 and name c) (resid 79 and name n) 1.0 120.0 60.0 2assign(resid 83 and name n) (resid 83 and name ca)(resid 83 and name c) (resid 84 and name n) 1.0 120.0 60.0 2assign(resid 92 and name n) (resid 92 and name ca)(resid 92 and name c) (resid 93 and name n) 1.0 120.0 75.0 2！chi-2 restraintsassign(resid 2 and name ca) (resid 2 and name cb)(resid 2 and name cg1)(resid 2 and name cd1) 1.0 -60.0 40.0 2！LRCHassign(resid 31 and name ca) (resid 31 and name cb)(resid 31 and name cg) (resid 31 and name cd1) 1.0 180.0 40.0 2！LRCHassign(resid 32 and name ca) (resid 32 and name cb)(resid 32 and name cg) (resid 32 and name cd1) 1.0 180.0 40.0 2！LRCHassign(resid 74 and name ca) (resid 74 and name cb)(resid 74 and name cg1)(resid 74 and name cd1) 1.0 -60.0 40.0 2！LRCHassign(resid 90 and name ca) (resid 90 and name cb)(resid 90 and name cg1)(resid 90 and name cd1) 1.0 180.0 40.0 2！LRCH
例3利用競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合檢測(cè)法和固定化野生型GST-MSP-119來檢測(cè)阻斷性抗體在前面的研究中，直接通過MSP-142加工檢測(cè)法(Blackman et al.，1994)，或通過偶連的紅血球侵入MSP-142過程加工檢測(cè)(Guevara etal.，1997)，或以裂殖子蛋白最為抗原進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性放射性免疫檢測(cè)(Guevara et al.，1997)等方法已經(jīng)詳細(xì)說明了能夠阻斷中和抗體12.8和12.10的作用的抗體。這些研究也已經(jīng)擴(kuò)展到使用重組MSP-1和BIAcore分析方法。
將含有融合到GST上的野生型MSP-119的重組融合蛋白偶連到傳感器芯片上，這是第一次允許競(jìng)爭(zhēng)抗體結(jié)合到抗原上。然后mAbs12.8或12.10的溶液流過芯片，對(duì)第二種抗體的結(jié)合進(jìn)行定量。如果第一種抗體干擾了第二種抗體的結(jié)合，那么著就反映在第二種抗體結(jié)合數(shù)量的減少上。方法野生型GST-MSP-119偶連到CM5傳感芯片上。結(jié)合檢測(cè)溫度為25℃，固定流速為5μl/min-1。對(duì)于結(jié)合來講，允許100ug/l純化的mAbs1E1、8A12、及2F10溶解在HBS-EP緩沖液(含有150mM NaCl的10mM HEPES pH7.4，3mM EDTA和0.005％v/v山梨醇酯20)，在細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中的mAbs1E8、9C8、12D11、111.2和111.4，在HBS-EP緩沖液中的1∶10稀釋的腹水的mAbs2.2、7.5和89.1，以及在HBS-EP緩沖液中的1∶10稀釋血清的鼠α-GST抗體與固定化的野生型GST-MSP-119相互作用，時(shí)間為10分鐘。經(jīng)過5分鐘的解離低親和力的相互作用之后，添加溶解在HBS-EP緩沖液中的濃度為100ug/l的mAbs12.18或12.10，結(jié)合10分鐘。在沖洗芯片5分鐘之后，對(duì)12.8或12.10的結(jié)合進(jìn)行測(cè)定。利用pH2.4的150mM的甘氨酸-鹽酸沖洗芯片5分鐘，在需要的時(shí)候也可用pH1.8的100mM的甘氨酸-鹽酸沖洗芯片3分鐘，沖掉結(jié)合的抗體來再生芯片。
結(jié)果結(jié)果在
圖12中有示。除了負(fù)對(duì)照mAb89.1之外，其他所有的競(jìng)爭(zhēng)性抗體都結(jié)合到GST-MSP-119抗原上。正如我們所期望的，mAb12.10和12.8之間相互競(jìng)爭(zhēng)(Guevara et al.，1997)。其他不抑制加工的抗體或多或少的干擾12.8和12.10的結(jié)合。正如我們從上文的研究所預(yù)期的，mAb 1E1和7.5都阻斷12.8和12.10的結(jié)合，而2.2和111.4只阻斷12.8的結(jié)合。在這項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)的另一個(gè)尤其有效的阻斷性抗體是mAb9C8。
例4對(duì)小動(dòng)物進(jìn)行修飾GST-MSP-119免疫作用并分析其誘導(dǎo)的抗體為了確定修飾蛋白是具有免疫原性的，使用了重組GST-MSP-119融合蛋白，通過免疫作用來誘導(dǎo)抗體的出現(xiàn)。
方法用含有3[27+31+43]或4[15+27+31+43]替代的兩種抗體分別免疫鼠和兔子。兔子是利用溶解在Freund完全助劑中的MSP-119蛋白皮下免疫，然后在21、42后3天后注射200ug溶解在Freund不完全助劑中的MSP-119蛋白以加強(qiáng)免疫，收集樣品血清。
通過對(duì)寄生蟲感染的紅血球的丙酮固定化涂片的間接免疫熒光檢測(cè)，確定了結(jié)合到寄生蟲原始MSP-1蛋白上的出現(xiàn)及其水平。血清在磷酸緩沖液(PBS)中進(jìn)行梯度稀釋，室溫下在載玻片上培育30分鐘。沖洗，載玻片共軛到山羊抗兔或抗鼠IgG上的FITC共培育，沖洗，通過熒光顯微鏡進(jìn)行檢查。
這種血清也通過MSP-1次級(jí)加工檢測(cè)法來分析。通過對(duì)前述方法做了修飾的方法來對(duì)在裂殖子制劑中的MSP-1次級(jí)加工進(jìn)行定量和分析(Blackman et al.，1994)。將沖洗后的P.falciparum 3D7重新懸浮在冰冷的含有10mM CaCl2和2mM MgCl2的pH7.5的Tris-HCl緩沖液(反應(yīng)緩沖液)中。將含有大約1×109個(gè)裂殖子的等份重新懸浮在置于冰上的1.5毫升離心管中，將寄生蟲沉淀在13000×g、4℃下離心2分鐘。去除上清液，將每管的裂殖子沉淀重新懸浮在置于冰上的25μl反應(yīng)緩沖液中，向其中進(jìn)一步添加合適的蛋白酶抑制劑或抗體。維持裂殖子置于冰上的狀態(tài)20分鐘以利抗體結(jié)合，然后轉(zhuǎn)移到37℃的水浴中1小時(shí)以便進(jìn)行加工。這些檢測(cè)一直包括下列對(duì)照僅僅重新懸浮在反應(yīng)緩沖液中的正加工裂殖子樣品對(duì)照；重新懸浮在添加有1Mm PMSF的反應(yīng)緩沖液中的負(fù)加工裂殖子樣品對(duì)照；以及0時(shí)間(0h)對(duì)照，其中的加工在37℃水浴之前就已經(jīng)停止。通過基于western印跡的方法和一種經(jīng)過修飾的加工檢測(cè)法來對(duì)加工進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)檢測(cè)后物質(zhì)通過13000×g、4℃下離心30分鐘去除不溶性物質(zhì)，收集上清液。通過ELISA法確定上清液中MSP-133的數(shù)量。將50微升的稀釋樣品上清液添加到ELISA平板(NUNCF96 Cert.Maxisotp)的孔中，而在此之前此平板已經(jīng)用溶解在PBS中的4ug ml-1人mAb X509包被了，用量為100μl/孔。將平板在37℃下培育4小時(shí)，然后用0.01％PBS-Tween(PBS-T)沖洗3次。添加100μl做1∶4000稀釋的鼠mAb G13，在37℃下培育1小時(shí)，隨后沖洗，然后添加100μl做1∶1000稀釋的綿羊IgG(H+L)HRP共軛抗體來檢測(cè)已經(jīng)結(jié)合MSP-133蛋白。在37℃下培育1小時(shí)后，再一次沖洗平板，然后通過添加100μl新鮮配制的底物溶液(添加在0.05M磷酸緩沖液中的400mg l-1鄰苯二胺二氫氯化物，0.024M的檸檬酸和0.012％H2O2)，室溫下反應(yīng)20分鐘。通過添加10μl 1M的硫酸來停止反應(yīng)，測(cè)定每個(gè)樣品在492nm處的吸收。結(jié)果結(jié)果在
圖13中有示。這兩種修飾蛋白產(chǎn)生的抗體可與感染寄生蟲的紅血球中的MSP-1反應(yīng)，與其血清的反應(yīng)效價(jià)為1∶10000，這與通過同樣的方法，利用含有野生型MSP-1序列的重組蛋白的免疫作用產(chǎn)生的血清的反應(yīng)效價(jià)相同。這表明修飾蛋白能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生可與原始蛋白反應(yīng)的抗體。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中的濃度條件下，雖然在對(duì)照中沒有抗體抑制加工，但免疫作用誘導(dǎo)的抗體是能夠部分抑制加工的。
例5設(shè)計(jì)和合成優(yōu)化用于Pichia Pastoris異源表達(dá)的Plasmodium Falciparum裂殖子表面蛋白基因片段已經(jīng)對(duì)Plasmodium Falciparum裂殖子表面蛋白-1(MSP-1)41.1kDa編碼片段的編碼序列進(jìn)行了重新設(shè)計(jì)來優(yōu)化其在PichiaPastoris中的異源表達(dá)。優(yōu)化的DNA片段是經(jīng)過PCR基因裝配來合成的，以兩個(gè)片段MSP-133和MSP-119的形式存在。利用按優(yōu)化的MSP-119構(gòu)建物的表達(dá)載體來轉(zhuǎn)化Pichia βastoris細(xì)胞。重組菌株顯示出能夠表達(dá)高水平的非糖基化的、正確折疊的MSP-119蛋白。
人瘧疾寄生蟲Plasmodium Falciparum的富含AT的基因組編碼的蛋白很少能夠在異源體系中表達(dá)(Withers-Martinez et al.，1999)。甲基營養(yǎng) 酵母Pichia(Komagataella)pasroris是二硫橋蛋白如惡性瘧原蟲裂殖子表面蛋白-1(MSP-1)C-末端片段表達(dá)的合適體系(White et al.，1994；Morgan et al.，1999)。在P.Pastoris表達(dá)體系中，避免由于富含AT片段引起的過早轉(zhuǎn)錄終止是很重要的(Romanos et al.，1991)。已經(jīng)確定了P.Pastoris的高表達(dá)基因的密碼子(Sreekrishna et al.，EP 0 586 892 AI)。因此，利用新穎的計(jì)算機(jī)軟件，設(shè)計(jì)了含有優(yōu)化在P.Pastoris中表達(dá)的密碼子用途的MSP-142片段(Withers-Martinez et al.，1999)。上文已經(jīng)表明在P.Pastoris中表達(dá)時(shí)MSP-119片段上部分糖基化的，并且在純化過程中碳水化合物要用酶法去除(Morgan et al.，1999)。因此，在合成MSP-142蛋白序列中引入了兩個(gè)特異點(diǎn)突變來防止在NxS/T位點(diǎn)(在MSP-133內(nèi)的一個(gè)潛在位點(diǎn)，也是在MSP-119序列Asn 1的一個(gè)已知位點(diǎn))的N-糖基化。
通過基因組裝聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)合成的MSP-142多肽序列(Stemmer et al..1995.Withers-Martinez et al..1999)是以單獨(dú)的MSP-133和MSP-119片段存在的。將優(yōu)化的MSP-119片段亞克隆到一個(gè)新穎的修飾Pichia表達(dá)載體中，然后將其轉(zhuǎn)化到P.pasroris宿主菌株SMD1168中，并且分離到幾株單獨(dú)的轉(zhuǎn)化株。已經(jīng)證明其中的三株轉(zhuǎn)化株可有效的表達(dá)非糖基化的、正確折疊的MSP-119。在低拷貝數(shù)的轉(zhuǎn)化株中也觀察到了優(yōu)化基因的強(qiáng)表達(dá)。一株具有中等水平G418抗性的多拷貝轉(zhuǎn)化株表達(dá)了純化的MSP-119，其表達(dá)水平與前述含有原始P.falciparum DNA的高效表達(dá)菌株相同。因此，很有可能從合成優(yōu)化基因的高水平G418抗性轉(zhuǎn)化株得到更高水平的產(chǎn)量。方法基因裝配第一次對(duì)P.falciparum MSP-142(41.1kDa)片段蛋白序列做兩個(gè)氨基酸替代來除去N-糖基化信號(hào)，該序列的SWISS-PROT編號(hào)為P04933位置1264-1621。序列NYT(在N-末端部分，位置1445)和序列NIS(在C-末端片段的開始；位置1526)分別替代為QYT和NIA。然后利用S.Cerevisiae密碼子通過DNA-STAR將此蛋白序列進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。這個(gè)序列已經(jīng)被CODOP程序引用(Withers-Martinez etal.，1999)。利用這個(gè)程序，應(yīng)用得自高效表達(dá)的P.Pastoris基因(Sreekrishna et al..EP 0 586 892 A1)的密碼子用途的額外密碼子表(
圖14)，獲得了10個(gè)隨機(jī)序列。因此，這個(gè)密碼表應(yīng)該是能夠反映其在高效表達(dá)菌株中的應(yīng)用。選出了含有最少的不適宜密碼子(6)的隨機(jī)序列，并且將這些密碼子人工替換為優(yōu)選的密碼子。然后將這些序列通過DNA-STAR來分析，以檢查出可引起轉(zhuǎn)錄終止的富含AT的序列，并對(duì)他們進(jìn)行直接的或反向復(fù)制。然后又產(chǎn)生了一組50個(gè)編碼最終序列的重疊寡核苷酸。他們是由42nt長(zhǎng)的49個(gè)寡核苷酸組成，一個(gè)長(zhǎng)為42nt，另一個(gè)長(zhǎng)為48nt。每個(gè)寡核苷酸與其相鄰寡核苷酸有21bp的重疊，但沒有缺口。估計(jì)其Tm在60℃到77℃。通過Oswel合成的寡核苷酸只有40nmol的規(guī)模，不經(jīng)純化就放入去離子水中。也合成了用于擴(kuò)增步驟的不同長(zhǎng)度的多種外部引物，其Tm在62℃到64℃，并且含有在隨后的擴(kuò)增步驟中用于連接的5′-末端磷酸基團(tuán)。反向引物也包括一個(gè)翻譯終止密碼子(UAA在互補(bǔ)鏈上)。在使用前將所有的寡核苷酸在ddH2O稀釋到10μM。
利用一個(gè)Biometra cycler，在200μL的薄壁管中，在下列條件下，按照所描述的(Stemmer et al.，1995；Withers-Martinez et al.，1999)，進(jìn)行PCR介導(dǎo)的基因裝配和擴(kuò)增。
基因裝配反應(yīng)(反應(yīng)1)50μL的體積2單位Vent多聚酶(New England Biolabs)0.4mM dNTPs1 x Vent多聚酶緩沖液所包含的每種寡核苷酸濃度為200nM的寡核苷酸混合物循環(huán)32個(gè)循環(huán)(2h 33m)變性94℃ 30s退火52℃ 30s延伸72℃ 3m利用不同的外部引物和50個(gè)寡核苷酸組的亞組分別合成了MSP-142(41.1kDa)區(qū)的三個(gè)片段N-末端片段(bp1-423)21個(gè)寡核苷酸中間片段(bp337-786)22個(gè)寡核苷酸C-末端片段(bp787-1074)14個(gè)寡核苷酸C-末端片段產(chǎn)生了一個(gè)10.6kDa的片段(MSP-119).N-末端和中間片段有337bp和423bp之間部分的重疊，將他們?cè)贐gIII位點(diǎn)(371-376)進(jìn)行剪接，生成了一個(gè)786bp的片段，它能編碼30.5kDa的MSP-133蛋白。擴(kuò)增反應(yīng)(反應(yīng)2)100uL的體積10uL等份的基因組裝反應(yīng)4單位Vent多聚酶(New England Biolabs)0.4mM dNTPs1 x Vent多聚酶緩沖液1uM外部引物循環(huán)32個(gè)循環(huán)(2h 55m)變性94℃ 45s退火52℃ 45s延伸72℃ 3m最后延伸72℃ 5m然后將PCR產(chǎn)物通過Centricon-100裝置(Amicon)過濾純化，在T4DNA連接酶的作用下，16℃下通過鈍頭末端連接過夜從而將其直接克隆到載體中。
將合成的MSP-119基因直接克隆到P.pastoris表達(dá)載體中去。利用Pml來消化修飾pPIC9KHXa載體，并且用小牛堿性磷酸酶來處理，而這個(gè)修飾載體含有His6標(biāo)記和插入到pPIC9K SnaB I位點(diǎn)的因子Xa裂解位點(diǎn)(見
圖15)。通過一個(gè)含有His6標(biāo)記、因子Xa裂解位點(diǎn)、在pPIC9K載體的SnaBI位點(diǎn)中的PmII限制性位點(diǎn)的36bp的合成寡核苷酸就造就了一個(gè)Hxa載體。
將PCR產(chǎn)物的N-末端和中間片段克隆到去磷酸化的pUC118載體的SmaI位點(diǎn)之上。然后對(duì)含有插入序列的質(zhì)?？寺∵M(jìn)行排序。隨后將含有正確的合成序列的克隆進(jìn)行消化，得到的兩個(gè)片段通過凝膠來純化。N-末端片段克隆是利用EcoRI和BglII來進(jìn)行消化的，而中間片段克隆是利用HindIII和BglII.來進(jìn)行消化的。重組片段是在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行純化的，并且利用QLAGEN提取試劑盒來洗提。然后將純化的N-末端和中間片段通過連接作用剪接到pUC118載體中，而這個(gè)pUC118載體是先經(jīng)過HindIII和EcoRI消化，然后又利用小牛堿性磷酸酶處理的。這樣就產(chǎn)生了完整的合成MSP-133編碼序列。將PCR產(chǎn)物的N-末端片段和中間片段克隆入去磷酸化的pUC118載體的SmaI位點(diǎn)。對(duì)含有插入物的質(zhì)粒克隆進(jìn)行排序。隨后將含有正確合成序列的消化，得到的兩個(gè)片段通過凝膠進(jìn)行純化。N-末端片段克隆是利用EcoRI和BglII來進(jìn)行消化的，而中間片段克隆是利用HindIII和BglII.來進(jìn)行消化的。重組片段是在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行純化的，并且利用QLAGEN提取試劑盒來洗提。然后將純化的N-末端和中間片段通過連接作用剪接到pUC118載體中，而這個(gè)pUC118載體是先經(jīng)過HindIII和EcoRI消化，然后又利用小牛堿性磷酸酶處理的。這樣就產(chǎn)生了完整的合成MSP-133編碼序列。方法表達(dá)和純化通過以前公開的電穿孔技術(shù)對(duì)甲基營養(yǎng)酵母Pichia(Komagataella)pastoris菌株SMD116進(jìn)行轉(zhuǎn)化(Morgan et al.，1999).此外，利用Hybond-N+膜分離到一些G-418抗性菌株(Fairlieet al..1999).。
通過在基礎(chǔ)緩沖葡萄糖培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的10ml培養(yǎng)物來進(jìn)行轉(zhuǎn)化株表達(dá)篩選。收集細(xì)胞，然后將其重新懸浮在10ml基礎(chǔ)緩沖乙醇培養(yǎng)基中至在OD600時(shí)的吸光度為1.0，并且生長(zhǎng)過夜至濃度為在OD600時(shí)的2.5-3.0。通過離心去除細(xì)胞，在冰上，利用15％三氯乙酸沉淀1.2ml上清液，時(shí)間為30分鐘。樣品在4℃的MICROFUGE中14000rpm離心30分鐘，蛋白沉淀用冷丙酮沖洗2次。樣品重新懸浮在12μlddH2O中，在用DTT還原之后，按照使用手冊(cè)，預(yù)先灌注NOVEX丙烯酰氨凝膠，取5μl懸浮液進(jìn)行電泳。凝膠使用的是NOVEX 4-12％丙烯酰氨梯度或10％的丙烯酰氨，以及在MES緩沖液中的Bis/Tris凝膠。蛋白凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色(Sigma)除了忽略了對(duì)合成基因產(chǎn)物進(jìn)行的酶法去糖基化作用之外，按照以前所述操作，得到了均一純化的MSP-119(Morgan et al.，1999)。方法NMR正如以前所述，在25℃下，在樣品濃度為1.1-2.5mM時(shí)得到了1維1H和二維{1H/5N}-HSQC光譜(Morgan et al.，1999)。結(jié)果
圖15中展示了合成DNA片段的序列及預(yù)想的蛋白。表3是對(duì)序列所進(jìn)行的所有提高的總結(jié)。
表3 密碼子使用總密碼優(yōu)選的 苯優(yōu)選 ％AT子數(shù) 密碼 的密碼子 含量P.falciparum MSP1 358 140 28 7441.1KDa片段合成41.1KDa片段 358 276 0 58表3.密碼子應(yīng)用(用途)
圖16在瓊脂糖凝膠上展示了對(duì)MSP-133(兩個(gè)部分)和MSP-119合成片段進(jìn)行的PCR基因裝配反應(yīng)。它證明在每種情況下都得到了單獨(dú)的、大小正確的主要產(chǎn)物。按照在方法部分所描述的對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行亞克隆、篩選以及測(cè)序。
利用包含在修飾的pPIC9K載體(pPIC9K-Hxa，
圖15)中用合成MSP-119構(gòu)建物來轉(zhuǎn)化P.Pastoris。合成MSP-119產(chǎn)物在三株獨(dú)立的轉(zhuǎn)化株中的表達(dá)在
圖17中的蛋白凝膠上有示。如上文方法部分中所描述的那樣，通過對(duì)培養(yǎng)上清液進(jìn)行三氯乙酸沉淀來制備樣品。它證明在每個(gè)樣品中都得到了單一的主要產(chǎn)品，這與所期望的MSP-119蛋白的遷移相對(duì)應(yīng)。樣品遷移的較對(duì)照稍微較慢，而對(duì)照樣品有一個(gè)短的C-末端標(biāo)記序列，這在以前的文獻(xiàn)中有描述(Morgan etal.，1999)。沒有由于糖基化作用而導(dǎo)致的異源的、緩慢遷移的重組蛋白的跡象。因此，非糖基化的合成MSP-119可通過轉(zhuǎn)化酵母進(jìn)行有效的表達(dá)。對(duì)低拷貝轉(zhuǎn)化株(對(duì)0.25mg/ml G418有抗性)來講，純化的MSP-119的產(chǎn)量(通過UV吸收來測(cè)定)是16mg/ml，而對(duì)于中等G418抗性轉(zhuǎn)化株(對(duì)1.0mg/ml G418有抗性)來講產(chǎn)量就上升增加到24mg/ml。這可與分離高G-418抗性菌株之前、含有原始惡性瘧原蟲編碼序列的低拷貝P.Pastoris轉(zhuǎn)化株的1-2mg/l的產(chǎn)量相對(duì)比(Morgan et al.，1999)。這表明合成的MSP-119構(gòu)建物有利于重組蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步分離具有更高拷貝的轉(zhuǎn)化株可對(duì)其做進(jìn)一步的提高。
一維質(zhì)子NMR實(shí)驗(yàn)證明合成的MSP-119蛋白的光譜與前文研究的蛋白的光譜很相似(Morgan et al.，1999)，它代表了一種正確折疊的蛋白(數(shù)據(jù)沒有給出)。這通過{1H/15N}-HSQC光譜(
圖18)得到進(jìn)一步的確定，這個(gè)光譜也顯示合成產(chǎn)物結(jié)構(gòu)與前文研究的蛋白是相同的，僅僅是在N-末端有些微的差別，這與獨(dú)特的N-末端標(biāo)記序列和糖基化位點(diǎn)的S3->A突變相一致。前文也已經(jīng)給出了原始惡性瘧原蟲序列產(chǎn)物的主鏈NH質(zhì)子和15N化學(xué)漂移數(shù)據(jù)(Morgan et al.，1999)。在除N-末端區(qū)之外的兩個(gè)光譜的相似性是這兩個(gè)蛋白形式是結(jié)構(gòu)相似、折疊正確的有力的證據(jù)。
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權(quán)利要求
1.瘧原蟲裂殖子表面蛋白1(MSP-1)C-末端片段的非天然變體，其中，該變體具有(1)與天然的瘧原蟲MSP-119相比，具有降低的對(duì)至少第一種抗體的親和性，第一種抗體能阻斷第二種抗體的結(jié)合，而第二種抗體是抑制瘧原蟲MSP-142的蛋白酶解裂解的，以及(2)與該天然的瘧原蟲MSP-119相比，對(duì)至少一種第三種抗體基本上具有相同的親和性，第三種抗體能抑制MSP-142蛋白酶解裂解。
2.權(quán)利要求1中的變體，其中該瘧原蟲MSP-119和瘧原蟲MSP-142是惡性瘧原蟲MSP-119和MSP-142。
3.權(quán)利要求1或2中的變體，其中第一個(gè)抗體是選自mAbs 1E1、2.2，7.5，9C8和111.4。
4.權(quán)利要求1或2中的變體，其中第二和/或三個(gè)抗體是選自mAbs12.8，12.10和5B1。
5.惡性瘧原蟲裂殖子表面蛋白-1(MSP-1)C-末端非天然變體，含有在SEQ ID No.1中所示的惡性瘧原蟲裂殖子MSP-119的第14、15、27、31、34、43、48和53位的任一氨基酸處進(jìn)行的修飾，或在其他惡性瘧原蟲MSP-119多肽的等價(jià)位置上的氨基酸的修飾。
6.權(quán)利要求5中的變體，其中該修飾是選自Gln14→Arg、Gln14→Gly、Asn15→Arg、Glu27→Tyr、Leu31→Arg、Tyr34→Ser、Tyr34→Ile，、Glu43→Leu、Thr48→Lys及Asn53→Arg，以及其他惡性瘧原蟲MSP-119多肽的等價(jià)位置上的氨基酸的修飾。
7.權(quán)利要求6中的變體，其中該替代是選自[Glu27→Tyr，Leu31→Arg和Glu43→Leu]，[Glu27→Tyr，Leu31→Arg，Tyr34→Ser和Glu43→Leu]，[Asn15→Arg，Glu27→Tyr，Leu31→Arg和Glu43→Leu]以及在其他瘧原蟲MSP-119多肽上的等價(jià)位置進(jìn)行的替代作用。
8.權(quán)利要求5-7中的任一權(quán)利要求中的變體，進(jìn)一步包括在在SEQ ID No.1中所示的惡性瘧原蟲裂殖子MSP-119氨基酸序列的Cys12和/或Cys28處的突變。
9.權(quán)利要求8中的變體，其中的突變是選自Cys12→Ile、Cys28→Trp，、Cys12→Ala和Cys28→Phe的替代作用。
10.權(quán)利要求9中的變體，其中的替代是選自[Cys12→Ile，Asn 15→Arg，Glu27→Tyr，Cys28→Trp，Leu31→Arg，Glu43→Leu]，[Cys12→Ile，Asn 15→Arg，Glu27→Tyr，Cys28→Trp，Leu31→Arg，Glu43→Leu，Asn53→Arg]，[Cys12→Ile，Asn 15→Arg，Glu27→Tyr，Cys28→Trp，Leu31→Arg，Tyr34→Ser，Glu43→Leu，Asn53→Arg]以及在其他瘧原蟲MSP-119多肽上的等價(jià)位置進(jìn)行的替代作用。
11.一種生產(chǎn)用于疫苗組合物制備的瘧原蟲MSP-1變體的方法，這種方法包括修飾瘧原蟲MSP-1 C-末端片段的一或多個(gè)氨基酸殘基，產(chǎn)生的衍生物具有(1)與天然的瘧原蟲MSP-119相比，具有降低的對(duì)至少第一種抗體的親和性，第一種抗體能阻斷第二種抗體的結(jié)合，而第二種抗體是抑制瘧原蟲MSP-142的蛋白酶解裂解的，以及(2)與該天然的瘧原蟲MSP-119相比，對(duì)至少一種第三種抗體基本上具有相同的親和性，而該第三種抗體可抑制MSP-142的蛋白酶解裂解。
12.利用權(quán)利要求11的方法獲得的非天然瘧原蟲MSP-1變體。
13.編碼權(quán)利要求1-10或12中的變體的多核苷酸，它被可操作的連接到能夠指導(dǎo)該核苷在一個(gè)宿主細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)節(jié)序列上。
14.權(quán)利要求13中的多核苷酸，它含有在該宿主細(xì)胞中最優(yōu)化表達(dá)的序列。
15.權(quán)利要求13或14中的多核苷酸，其中的宿主細(xì)胞是Pichiapasroris。
16.包含權(quán)利要求13、14或15中的多核苷酸的核酸載體.
17.含有權(quán)利要求16中的載體的宿主細(xì)胞。
18.一種藥物組合物，它包含有權(quán)利要求1-10或12中的任一變體，權(quán)利要求13-15中的任一多核苷酸，或包含權(quán)利要求16中的載體以及一種藥物上可接受的載體或稀釋劑。
19.權(quán)利要求18中的組合物，其進(jìn)一步包含一種免疫原性瘧原蟲多肽或片段或其衍生物。
20.制備抗-MSP-1抗體的方法，其包括對(duì)權(quán)利要求1-10或12中的任一多肽給藥、對(duì)權(quán)利要求13-15中的任一多核苷酸給藥或?qū)?quán)利要求16中的載體給藥于哺乳動(dòng)物。
21.制備多克隆抗-MSP-1抗體的方法，其包括對(duì)權(quán)利要求1-10或12中的任一多肽給藥、對(duì)權(quán)利要求13-15中的任一多核苷酸給藥或?qū)?quán)利要求16中的載體給藥于哺乳動(dòng)物，并且從該哺乳動(dòng)物中抽取血清。
22.利用權(quán)利要求20或21制備的抗體。
23.誘導(dǎo)抗由惡性瘧原蟲誘導(dǎo)的瘧疾的免疫的方法，該方法包括對(duì)權(quán)利要求1中的多肽、權(quán)利要求13中多核苷酸或權(quán)利要求16中的載體以有效劑量給藥于需要這種免疫的人。
24.免疫哺乳動(dòng)物的方法，該方法包括對(duì)權(quán)利要求1中的多肽、權(quán)利要求13中多核苷酸或權(quán)利要求16中的載體以有效劑量給藥。
25.權(quán)利要求24中的方法，其中該哺乳動(dòng)物是已經(jīng)進(jìn)行抗瘧疾免疫的哺乳動(dòng)物。
26.治療發(fā)生在人類病人身上的瘧疾感染的方法，其包括對(duì)病人給藥以有效劑量的權(quán)利要求18或19中的藥物組合物。
27.用于治療的權(quán)利要求1-10或12中的任一變體、 13-15中的任一多核苷酸或權(quán)利要求16中的載體。
24.已經(jīng)在其中貯存有MSP-119NMR模型的計(jì)算機(jī)可讀媒介。
25.編碼瘧原蟲MSP-1多肽的核酸，其中的核酸是經(jīng)優(yōu)化用來在異源宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)的。
26.權(quán)利要求25中的核酸，其中的異源宿主是Pichia pasroris細(xì)胞。
27.權(quán)利要求25或26中的核酸，其中的多肽是選自一包含有圖2E和2C中所示序列的MSP-142多肽、包含有圖2C中所示序列的MSP-119多肽、以及包含有圖2E中所示序列的MSP-133多肽。
28.權(quán)利要求25-27中的任一核酸，其中的核酸包含的序列是選自圖2A、2B和2D所示的序列。
29.包含有權(quán)利要求25-28中的任一核酸的核酸載體。
30.包含有權(quán)利要求29中的載體的宿主細(xì)胞。
31.一種藥物組合物，其包含有權(quán)利要求25-27中的任一核酸、權(quán)利要求29中的載體以及藥物上可接受的載體或稀釋劑。
32.權(quán)利要求31中的組合物，其進(jìn)一步包含有一種免疫原性瘧原蟲多肽或片段或其衍生物。
全文摘要
提供了用于抗瘧疾疫苗中的瘧原蟲裂殖子表面蛋白1(MSP－1)C－末端片段的非天然變體,該變體具有:(1)與天然的瘧原蟲MSP－文檔編號(hào)C12N15/09GK1372568SQ00809259
公開日2002年10月2日 申請(qǐng)日期2000年4月20日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月20日
發(fā)明者A·霍爾德, B·比德薩爾, J·菲尼, W·莫甘, S·賽德, C·烏特海皮布爾 申請(qǐng)人:醫(yī)療研究局