專利名稱：用于鑒定引起免疫反應(yīng)的抗原的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種表達(dá)載體及其在哺乳動物體內(nèi)引起完全免疫反應(yīng)的應(yīng)用。更具體地說，本發(fā)明涉及將內(nèi)源性抗原加工成用于在MHC-II上呈遞的外源性抗原的方法。本發(fā)明還涉及一種疫苗及其對哺乳動物進(jìn)行免疫接種的使用方法。
背景技術(shù)：
人體中不充分的抗原呈遞導(dǎo)致控制和清除致病性感染和惡性細(xì)胞生長的人免疫系統(tǒng)衰竭。用于慢性感染和癌癥的成功的治療用疫苗和免疫療法依賴于開發(fā)誘發(fā)能夠控制和清除攻擊性抗原的強(qiáng)烈免疫反應(yīng)的有效抗原呈遞的新手段。
細(xì)胞識別抗原的能力取決于抗原與MHC I型(MHC-I)或II型(MHC-II)蛋白的結(jié)合。例如，細(xì)胞毒性T-細(xì)胞對與MHC-I蛋白結(jié)合的抗原有反應(yīng)。因此，殺滅病毒感染的細(xì)胞的細(xì)胞毒性T細(xì)胞不會殺滅被相同病毒感染的細(xì)胞，條件是該細(xì)胞也不表達(dá)合適的MHC-I蛋白。輔助T細(xì)胞識別MHC-II蛋白。輔助T細(xì)胞的活性一般取決于對抗原呈遞細(xì)胞上的抗原的識別和“自體”MHC-II蛋白在這些細(xì)胞上的存在。這種識別與自體-MHC蛋白結(jié)合抗原的需求稱作MHC結(jié)合。發(fā)現(xiàn)MHC-I蛋白實際上存在于所有帶核細(xì)胞的表面上。發(fā)現(xiàn)MHC-II蛋白存在于包括脾臟的巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞和樹突細(xì)胞以及皮膚的朗格漢斯細(xì)胞在內(nèi)的某些細(xì)胞的表面上。
一個使哺乳動物體內(nèi)發(fā)動免疫反應(yīng)的決定性步驟就是激活識別結(jié)合在主要組織相容性復(fù)合物(MHC)-II上的外源性抗原的CD4+輔助T-細(xì)胞。在諸如樹突細(xì)胞(DCs)這樣的抗原呈遞細(xì)胞中以細(xì)胞內(nèi)體途徑俘獲并加工這些抗原(Zajac等，1998；Bona等，1998；Kalams等，1998；Mellman等，1998；Banchereau等，1998)。在內(nèi)體和溶酶體中，將所述抗原加工成在高爾基體區(qū)室內(nèi)的MHC-II上呈遞的小抗原肽類以便形成抗原-MHC-II復(fù)合物。這種復(fù)合物在細(xì)胞表面上表達(dá)，這種表達(dá)可誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞的活化。
在誘發(fā)動物體內(nèi)的有效免疫反應(yīng)中的其它決定性事件包括激活CD8+T-細(xì)胞和B細(xì)胞。當(dāng)將所需的蛋白質(zhì)以這類方式通過細(xì)胞傳遞以便作為在與MHC-I抗原復(fù)合的加工蛋白在細(xì)胞表面呈遞時，CD8+細(xì)胞被激活。B細(xì)胞可以通過其表面的免疫球蛋白(IgM和IgD)與抗原發(fā)生相互作用而不需MHC蛋白。然而，CD4+T-細(xì)胞的活化刺激免疫系統(tǒng)的全部分支。在活化時，CD4+T-細(xì)胞(輔助T細(xì)胞)產(chǎn)生白細(xì)胞介素。這些白細(xì)胞介素幫助激活免疫系統(tǒng)的其它分支。例如，輔助T細(xì)胞產(chǎn)生幫助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的白細(xì)胞介素-4(IL-4)和白細(xì)胞介素-5(IL-5)、激活CD4+和CD8+T-細(xì)胞的白細(xì)胞介素-2(IL-2)和激活巨噬細(xì)胞的γ干擾素。
由于識別結(jié)合在MHC-II上的抗原的輔助T-細(xì)胞在激活和克隆擴(kuò)充細(xì)胞毒性T-細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、天然殺傷細(xì)胞和B細(xì)胞中起主要作用，所以激活輔助T細(xì)胞對抗原作出反應(yīng)的起始事件對誘發(fā)針對該抗原的有效免疫反應(yīng)來說是決定性的。已經(jīng)報導(dǎo)了使用一種來源于溶酶體跨膜蛋白的序列刺激輔助T-細(xì)胞活化的嘗試(Wu，1995)。然而，這些嘗試沒有導(dǎo)致誘發(fā)就CD8+T-細(xì)胞和B細(xì)胞而言在所測試哺乳動物體內(nèi)的有效免疫反應(yīng)。
因此，在本領(lǐng)域中存在對引起用于治療哺乳動物體內(nèi)疾病的免疫反應(yīng)的有效和定向方式的持久需求。本發(fā)明滿足了這一需求。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個實施方案是一種表達(dá)載體，它包括均為可操作地連接的多核苷酸啟動子序列、編碼信號序列的多核苷酸、編碼抗原的多核苷酸、編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列。
在本發(fā)明的特定實施方案中，所述的多核苷酸啟動子序列選自組成型啟動子、誘導(dǎo)型啟動子和組織特異性啟動子組成的組。
在本發(fā)明的另一個特定的實施方案中，所述的編碼信號序列的多核苷酸選自乙型肝炎病毒E抗原信號序列、免疫球蛋白重鏈前導(dǎo)序列和細(xì)胞因子前導(dǎo)序列組成的組。
本發(fā)明的一個實施方案是一種表達(dá)載體，其中所述的編碼抗原的多核苷酸包括用于至少一個表位的多核苷酸序列，其中所述的至少一個表位誘發(fā)哺乳動物體內(nèi)的B細(xì)胞反應(yīng)。
本發(fā)明的另一個實施方案是一種表達(dá)載體，其中所述的編碼抗原的多核苷酸包括用于至少一個表位的多核苷酸序列，其中所述的至少一個表位誘發(fā)哺乳動物體內(nèi)的CD4+T-細(xì)胞反應(yīng)。
本發(fā)明的另一個實施方案是一種表達(dá)載體，其中所述的編碼抗原的多核苷酸包括用于至少一個表位的多核苷酸序列，其中所述的至少一個表位誘發(fā)哺乳動物體內(nèi)的CD8+T-細(xì)胞反應(yīng)。
本發(fā)明的一個特定實施方案是一種表達(dá)載體，其中所述的編碼抗原的多核苷酸包括用于至少一個表位的多核苷酸序列，其中所述的至少一個表位誘發(fā)導(dǎo)入了所述抗原的哺乳動物體內(nèi)的B細(xì)胞反應(yīng)、CD4+T-細(xì)胞反應(yīng)和CD8+T-細(xì)胞反應(yīng)。
本發(fā)明的另一個實施方案是一種表達(dá)載體，其中所述的編碼抗原的多核苷酸序列包括用于多個表位的多核苷酸序列，其中所述的多個表位誘發(fā)導(dǎo)入了所述抗原的哺乳動物體內(nèi)的B細(xì)胞反應(yīng)、CD4+T-細(xì)胞反應(yīng)和CD8+T-細(xì)胞反應(yīng)。
本發(fā)明的另一個實施方案是一種表達(dá)載體，其中所述的編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸是一種與細(xì)胞表面受體結(jié)合的配體的多核苷酸序列。在特定的實施方案中，所述的細(xì)胞結(jié)合元件選自編碼Fc片段、毒素細(xì)胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域、細(xì)胞因子、小肽和抗體的多核苷酸序列組成的組。在特定的實施方案中，編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸是一種同源多核苷酸序列或異源多核苷酸序列。
本發(fā)明的另一個實施方案是一種包括表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，其中所述的表達(dá)載體包括均為可操作地連接的多核苷酸啟動子序列、編碼信號序列的多核苷酸、編碼抗原的多核苷酸、編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列。
本發(fā)明的另一個實施方案是一種融合蛋白，其中該融合蛋白包括信號序列、抗原和細(xì)胞結(jié)合元件。在特定的實施方案中，已經(jīng)用該融合蛋白在體外轉(zhuǎn)導(dǎo)了抗原呈遞細(xì)胞。在其它實施方案中，將該融合蛋白直接給予哺乳動物。
本發(fā)明的一個特定實施方案是一種包括表達(dá)載體的疫苗，其中所述的表達(dá)載體包括均為可操作地連接的多核苷酸啟動子序列、編碼信號序列的多核苷酸、編碼抗原的多核苷酸、編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列。在特定的實施方案中，疫苗包括抗原呈遞細(xì)胞，其中用所述的表達(dá)載體在體外轉(zhuǎn)導(dǎo)了所述的抗原呈遞細(xì)胞。在其它實施方案中，疫苗包括抗原呈遞細(xì)胞，其中用所述的融合蛋白在體外轉(zhuǎn)導(dǎo)所述的抗原呈遞細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個實施方案是一種表達(dá)載體，它至少包括編碼信號序列的多核苷酸、編碼抗原的多核苷酸和編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸。
本發(fā)明的另一個實施方案是一種引起針對抗原的免疫反應(yīng)的方法，該方法包括下列步驟將表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞，其中所述的表達(dá)載體包括均為可操作地連接的多核苷酸啟動子序列、編碼信號序列的多核苷酸、編碼抗原的多核苷酸、編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列；和在下列條件下表達(dá)所述的載體以便產(chǎn)生抗原其中所述的抗原分泌自所述細(xì)胞；所述的分泌抗原被胞吞入所述細(xì)胞；在所述細(xì)胞內(nèi)加工所述的胞吞抗原；和將所述加工的抗原呈遞給細(xì)胞表面蛋白，從而引起T-細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。在特定的實施方案中，所述抗原由第一種細(xì)胞分泌并由第二種細(xì)胞攝入，其中第一種和第二種細(xì)胞是抗原呈遞細(xì)胞。在其它實施方案中，第一種細(xì)胞是非抗原呈遞細(xì)胞而第二種細(xì)胞是抗原呈遞細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個特定實施方案是一種鑒定編碼至少一種結(jié)合在MHC-II上的表位的多核苷酸序列的方法，其中的表位能夠激活CD4+輔助T細(xì)胞，所述的方法包括下列步驟將表達(dá)載體導(dǎo)入抗原呈遞細(xì)胞以便產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗原呈遞細(xì)胞，其中所述的表達(dá)載體包括均為可操作地連接的多核苷酸啟動子序列、編碼信號序列的多核苷酸、編碼測試多肽的多核苷酸、編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列；使所述的轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗原呈遞細(xì)胞與原初T-細(xì)胞或致敏的T-細(xì)胞接觸；和評價是任何的原初T-細(xì)胞還是致敏的T細(xì)胞在與所述轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗原呈遞細(xì)胞接觸時被激活，其中任何所述T-細(xì)胞的激活表明編碼測試多肽的多核苷酸是一種能夠激活CD4+輔助T細(xì)胞的基因或其片段。在特定實施方案中，所述的編碼測試多肽的多核苷酸選自由病毒基因組、細(xì)菌基因組、寄生蟲基因組和人基因組組成的cDNA文庫的組。
本發(fā)明的另一個實施方案是一種鑒定編碼至少一種結(jié)合在MHC-II上的表位的多核苷酸序列的方法，其中的表位能夠在體內(nèi)引起免疫反應(yīng)，所述的方法包括下列步驟將表達(dá)載體導(dǎo)入抗原呈遞細(xì)胞以便產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗原呈遞細(xì)胞，其中所述的表達(dá)載體包括均為可操作地連接的多核苷酸啟動子序列、編碼信號序列的多核苷酸、編碼測試多肽的多核苷酸、編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列；通過非腸道途徑給哺乳動物施用所述的轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗原呈遞細(xì)胞；收集來自脾細(xì)胞中的T-細(xì)胞并與樹突細(xì)胞一起共培養(yǎng)；和評價T-細(xì)胞的激活情況，其中所述T-細(xì)胞的激活表明編碼測試多肽的多核苷酸是一種能夠激活CD4+輔助T細(xì)胞的基因或其片段。在特定的實施方案中，所述的編碼測試多肽的多核苷酸是一種分離自腫瘤細(xì)胞系的cDNA文庫。在特定的實施方案中，所述的編碼測試多肽的多核苷酸選自由病毒基因組、細(xì)菌基因組、寄生蟲基因組和人基因組組成的cDNA文庫的組。
本發(fā)明的一個特定實施方案是一種鑒定編碼至少一種結(jié)合在MHC-II上的表位的多核苷酸序列的方法，其中的表位能夠在體內(nèi)引起免疫反應(yīng)，所述的方法包括下列步驟通過非腸道途徑給哺乳動物施用一種表達(dá)載體，其中所述的表達(dá)載體包括均為可操作地連接的多核苷酸啟動子序列、編碼信號序列的多核苷酸、編碼測試多肽的多核苷酸、編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列；通過非腸道途徑給哺乳動物施用所述轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗原呈遞細(xì)胞；收集來自脾細(xì)胞中的T-細(xì)胞并與樹突細(xì)胞一起共培養(yǎng)；和評價T-細(xì)胞的激活情況，其中所述T-細(xì)胞的激活表明編碼測試多肽的多核苷酸是一種能夠激活CD4+輔助T細(xì)胞的基因或其片段。在特定的實施方案中，所述的編碼測試多肽的多核苷酸選自由病毒基因組、細(xì)菌基因組、寄生蟲基因組和人基因組組成的cDNA文庫的組。
本發(fā)明的一個特定的實施方案是一種治療癌癥的方法，該方法包括下列步驟鑒定編碼至少一種結(jié)合在MHC-II上的表位的測試多肽，其中在用一種表達(dá)載體將抗原呈遞細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)成產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗原呈遞細(xì)胞的抗原呈遞細(xì)胞的條件下鑒定所述多肽，其中所述的表達(dá)載體包括均為可操作地連接的多核苷酸啟動子序列、編碼信號序列的多核苷酸、編碼測試多肽的多核苷酸、編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列；和評價T-細(xì)胞的激活情況，其中所述T-細(xì)胞的激活表明所述表明編碼測試多肽的多核苷酸是一種能夠激活CD4+輔助T細(xì)胞的基因或其片段；且通過非腸道途徑給哺乳動物施用抗原呈遞細(xì)胞，其中用所述的測試多肽轉(zhuǎn)導(dǎo)所述的抗原呈遞細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個特定的實施方案是一種治療癌癥的方法，該方法包括下列步驟鑒定編碼至少一種結(jié)合在MHC-II上的表位的測試多肽，其中在用一種表達(dá)載體將抗原呈遞細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)成產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗原呈遞細(xì)胞的抗原呈遞細(xì)胞的條件下鑒定所述多肽，其中所述的表達(dá)載體包括均為可操作地連接的多核苷酸啟動子序列、編碼信號序列的多核苷酸、編碼測試多肽的多核苷酸、編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列；和評價T-細(xì)胞的激活情況，其中所述T-細(xì)胞的激活表明所述表明編碼測試多肽的多核苷酸是一種能夠激活CD4+輔助T細(xì)胞的基因或其片段；且通過非腸道途徑給哺乳動物施用一種表達(dá)載體，其中所述的表達(dá)載體包括至少一種編碼測試多肽的多核苷酸和編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸且用所述的測試多肽轉(zhuǎn)導(dǎo)所述的抗原呈遞細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個特定的實施方案是一種治療病毒性感染的方法，該方法包括下列步驟鑒定編碼至少一種結(jié)合在MHC-II上的表位的測試多肽，其中在用一種表達(dá)載體將抗原呈遞細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)成產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗原呈遞細(xì)胞的抗原呈遞細(xì)胞的條件下鑒定所述多肽，其中所述的表達(dá)載體包括均為可操作地連接的多核苷酸啟動子序列、編碼信號序列的多核苷酸、編碼測試多肽的多核苷酸、編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列；和評價T-細(xì)胞的激活情況，其中所述T-細(xì)胞的激活表明所述表明編碼測試多肽的多核苷酸是一種能夠激活CD4+輔助T細(xì)胞的基因或其片段；且通過非腸道途徑給哺乳動物施用抗原呈遞細(xì)胞，其中用所述的測試多肽轉(zhuǎn)導(dǎo)所述的抗原呈遞細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個實施方案是一種治療病毒性感染的方法，該方法包括下列步驟鑒定編碼至少一種結(jié)合在MHC-II上的表位的測試多肽，其中在用一種表達(dá)載體將抗原呈遞細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)成產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗原呈遞細(xì)胞的抗原呈遞細(xì)胞的條件下鑒定所述多肽，其中所述的表達(dá)載體包括均為可操作地連接的多核苷酸啟動子序列、編碼信號序列的多核苷酸、編碼測試多肽的多核苷酸、編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列；和評價T-細(xì)胞的激活情況，其中所述T-細(xì)胞的激活表明所述表明編碼測試多肽的多核苷酸是一種能夠激活CD4+輔助T細(xì)胞的基因或其片段；且通過非腸道途徑給哺乳動物施用一種表達(dá)載體，其中所述的表達(dá)載體包括至少一種編碼測試多肽的多核苷酸和編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸且用所述的測試多肽轉(zhuǎn)導(dǎo)所述的抗原呈遞細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個實施方案是一種治療自身免疫病的方法，該方法包括下列步驟鑒定編碼至少一種結(jié)合在MHC-II上的表位的測試多肽，其中在用一種表達(dá)載體將抗原呈遞細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)成產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗原呈遞細(xì)胞的抗原呈遞細(xì)胞的條件下鑒定所述多肽，其中所述的表達(dá)載體包括均為可操作地連接的多核苷酸啟動子序列、編碼信號序列的多核苷酸、編碼測試多肽的多核苷酸、編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列；和評價T-細(xì)胞的激活情況，其中所述T-細(xì)胞的激活表明所述表明編碼測試多肽的多核苷酸是一種能夠激活CD4+輔助T細(xì)胞的基因或其片段；且通過非腸道途徑給哺乳動物施用抗原呈遞細(xì)胞，其中用所述的測試多肽轉(zhuǎn)導(dǎo)所述的抗原呈遞細(xì)胞。
本發(fā)明的一個特定的實施方案是一種治療自身免疫病的方法，該方法包括下列步驟鑒定編碼至少一種結(jié)合在MHC-II上的表位的測試多肽，其中在用一種表達(dá)載體將抗原呈遞細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)成產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗原呈遞細(xì)胞的抗原呈遞細(xì)胞的條件下鑒定所述多肽，其中所述的表達(dá)載體包括均為可操作地連接的多核苷酸啟動子序列、編碼信號序列的多核苷酸、編碼測試多肽的多核苷酸、編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列；和評價T-細(xì)胞的激活情況，其中所述T-細(xì)胞的激活表明所述表明編碼測試多肽的多核苷酸是一種能夠激活CD4+輔助T細(xì)胞的基因或其片段；且通過非腸道途徑給哺乳動物施用一種表達(dá)載體，其中所述的表達(dá)載體包括至少一種編碼測試多肽的多核苷酸和編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸且用所述的測試多肽轉(zhuǎn)導(dǎo)所述的抗原呈遞細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個實施方案是一種生產(chǎn)用于對哺乳動物進(jìn)行免疫接種的疫苗的方法，該方法包括下列步驟通過將一種表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞來轉(zhuǎn)導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞，其中所述的表達(dá)載體包括均為可操作地連接的多核苷酸啟動子序列、編碼信號序列的多核苷酸、編碼抗原的多核苷酸、編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列；和在所述抗原分泌自所述細(xì)胞的條件下表達(dá)所述載體以便產(chǎn)生抗原。在特定的實施方案中，在給哺乳動物施用抗原呈遞細(xì)胞前在體外或體內(nèi)用所述抗原轉(zhuǎn)導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個特定的實施方案是一種誘發(fā)免疫反應(yīng)的方法，該方法包括給哺乳動物共同施用細(xì)胞因子表達(dá)載體和retrogen表達(dá)載體的步驟，其中所述的retrogen表達(dá)載體包括均為可操作地連接的多核苷酸啟動子序列、編碼信號序列的多核苷酸、編碼抗原的多核苷酸、編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列。
本發(fā)明的另一個實施方案是一種誘發(fā)免疫反應(yīng)的方法，該方法包括給哺乳動物共同施用一種表達(dá)載體的步驟，其中所述的表達(dá)載體包括在一種啟動子的轉(zhuǎn)錄控制下的編碼細(xì)胞因子蛋白的多核苷酸序列和編碼融合蛋白的多核苷酸序列，其中所述的融合蛋白包括抗原和細(xì)胞結(jié)合元件。在特定的實施方案中，編碼細(xì)胞因子蛋白質(zhì)的多核苷酸序列和編碼融合蛋白的多核苷酸序列均在獨立的轉(zhuǎn)錄控制下，且其中編碼細(xì)胞因子蛋白的多核苷酸序列和編碼融合蛋白的多核苷酸序列以串聯(lián)方式位于一種表達(dá)載體中。
本發(fā)明的另一個實施方案是一種誘發(fā)免疫反應(yīng)的方法，該方法包括給哺乳動物共同施用兩種不同的retrogen表達(dá)載體的步驟，其中第一種retrogen表達(dá)載體包括均為可操作地連接的多核苷酸啟動子序列、編碼信號序列的多核苷酸、編碼第一種抗原的多核苷酸、編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列，而第二種retrogen表達(dá)載體包括均為可操作地連接的多核苷酸啟動子序列、編碼信號序列的多核苷酸、編碼第二種抗原的多核苷酸、編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列。
本發(fā)明的另一個特定的實施方案是一種誘發(fā)免疫反應(yīng)的方法，該方法包括給哺乳動物施用一種表達(dá)載體的步驟，其中所述的表達(dá)載體包括在一種啟動子的轉(zhuǎn)錄控制下的編碼第一種融合蛋白的多核苷酸序列和編碼第二種融合蛋白的多核苷酸序列，其中所述的第一種融合蛋白包括第一種抗原和第一種細(xì)胞結(jié)合元件且所述的第二種融合蛋白包括第二種抗原和第一種細(xì)胞結(jié)合元件。在特定的實施方案中，第一種和第二種抗原是不同的抗原且所述的細(xì)胞結(jié)合元件是Fc片段。在其它實施方案中，第一種和第二種抗原是不同的抗原且所述的第一種和第二種細(xì)胞結(jié)合元件是不同的細(xì)胞結(jié)合元件。另一個實施方案包括編碼第一種融合蛋白的多核苷酸序列和編碼第二種融合蛋白的多核苷酸序列均在獨立的轉(zhuǎn)錄控制下，且其中編碼第一種融合蛋白的多核苷酸序列和編碼第二種融合蛋白的多核苷酸序列以串聯(lián)方式位于一種表達(dá)載體中。
本發(fā)明的一個特定的實施方案是一種同時誘導(dǎo)CD4+和CD8+T-細(xì)胞的方法，該方法包括給予一種融合蛋白的步驟，其中所述的蛋白質(zhì)包括與細(xì)胞結(jié)合元件融合的MHC-I和MHC-II表位。
本發(fā)明的另一個實施方案是一種生產(chǎn)融合蛋白的方法，該方法包括下列步驟通過將一種表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞，其中所述的表達(dá)載體包括均為可操作地連接的多核苷酸啟動子序列、編碼信號序列的多核苷酸、編碼抗原的多核苷酸、編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列；和在所述融合蛋白分泌自所述細(xì)胞的條件下表達(dá)所述載體以便產(chǎn)生融合蛋白。在特定的實施方案中，在體外用所述融合蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞。
本發(fā)明的一個特定的實施方案是一種分泌胞內(nèi)蛋白的方法，該方法包括下列步驟將一種表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞，其中所述的表達(dá)載體包括均為可操作地連接的多核苷酸啟動子序列、編碼信號序列的多核苷酸、編碼胞內(nèi)蛋白的多核苷酸、編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列；和在所述融合蛋白分泌自所述細(xì)胞的條件下表達(dá)所述載體以便產(chǎn)生融合蛋白。更具體地說，所述編碼胞內(nèi)蛋白的多核苷酸被截短以便增加分泌功效。
本發(fā)明的另一個特定的實施方案是一種分泌膜蛋白的方法，該方法包括下列步驟將一種表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞，其中所述的表達(dá)載體包括均為可操作地連接的多核苷酸啟動子序列、編碼信號序列的多核苷酸、編碼膜蛋白的多核苷酸、編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列；和在所述融合蛋白分泌自所述細(xì)胞的條件下表達(dá)所述載體以便產(chǎn)生融合蛋白。更具體地說，所述編碼膜蛋白的多核苷酸被截短或使之發(fā)生突變以便增加分泌功效。
附圖簡述附


圖1A和附
圖1B是表示本發(fā)明retrogen策略的示意圖。使本發(fā)明的retrogen在例如一種肌細(xì)胞這樣的細(xì)胞中產(chǎn)生(附
圖1A)且然后由抗原呈遞細(xì)胞吸收(附
圖1B)。將retrogen在抗原呈遞細(xì)胞中加工并在其上表達(dá)為MHC-I或MHC-II復(fù)合物或如附
圖1A和附
圖1B中所示呈遞給B細(xì)胞受體。retrogen的MHC-I呈遞導(dǎo)致激活細(xì)胞毒性CD8+T-細(xì)胞且retrogen的MHC-II呈遞導(dǎo)致激活CD4+T-細(xì)胞。
附圖2A、附圖2B和附圖2C是一系列表達(dá)載體的圖解表示。附圖2A說明了通過如示意圖中所示產(chǎn)生融合基因并將該基因克隆入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(LNC-NGFR)或表達(dá)載體pRc/CMV而構(gòu)建的包括HBeAg(分泌性)、HBcAg(胞質(zhì))或帶有信號序列(分泌性)的Fc片段的載體。附圖2B和附圖2C說明了構(gòu)建的其它載體。
附圖3是描繪HBe-retrogen表達(dá)和分泌的蛋白質(zhì)印跡影象。用各種表達(dá)載體轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞。然后用抗-IgG或抗-HbeAg抗體沉淀培養(yǎng)基(M)和細(xì)胞裂解物(C)并通過SDS-PAGE進(jìn)行分析。
附圖4A、附圖4B和附圖4C是一系列描繪樹突細(xì)胞中retrogen轉(zhuǎn)導(dǎo)和表達(dá)的示意圖。用各種重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)鼠骨髓細(xì)胞；在有GM-CSF、TNF和IL-4存在的情況下使所述細(xì)胞發(fā)育成樹突細(xì)胞并用抗-NGFR染色。通過流式細(xì)胞測定法測定它們。附圖4A表示未轉(zhuǎn)導(dǎo)的樹突細(xì)胞。附圖4B表示轉(zhuǎn)導(dǎo)的樹突細(xì)胞。附圖4C是陰性對照。
附圖5A、附圖5B、附圖5C、附圖5D和附圖5E是一系列描繪如流式細(xì)胞測定法測定的樹突細(xì)胞上存在的表面標(biāo)記(MHC-I、MHC-II、共刺激和粘著分子(CD11C、CD54、CD80和CD86))的示意圖。附圖5A表示存在的CD11C表面標(biāo)記。附圖5B表示存在的CD54表面標(biāo)記。附圖5C表示存在的CD80表面標(biāo)記。附圖5D表示存在的CD86表面標(biāo)記。且附圖5E表示存在的MHC-II。
附圖6A和附圖6B說明了描繪體外通過retrogen轉(zhuǎn)導(dǎo)的樹突細(xì)胞激活原初CD4+T-細(xì)胞的兩種棒形示意圖。附圖6A表示共培養(yǎng)物中GM-CSF的含量。附圖6B表示共培養(yǎng)基中IFN-γ的含量。
附圖7A和附圖7B說明了MHC-II依賴性活化。附圖7A表示來自獲自用HBe-retrogen轉(zhuǎn)導(dǎo)并進(jìn)行了共培養(yǎng)的MHC-II-剔除(KO)或野生型(WT)C57BL/6小鼠的細(xì)胞和來自野生型小鼠的原初CD4+T-細(xì)胞的細(xì)胞因子濃度(IFN-γ)。
附圖8表示免疫接種小鼠血清中的抗體反應(yīng)。
附圖9A、附圖9B、附圖9C、附圖9D、附圖9E和附圖9F表示s-MAGE-3-Fc融合蛋白的構(gòu)建和表達(dá)。附圖9A表示重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的圖解表示。(S信號序列；IRES內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點序列)。附圖9B表示通過用小鼠抗-MAGE-3和抗小鼠IgG HRP綴合物染色的蛋白質(zhì)印跡分析測定的樹突細(xì)胞中不同構(gòu)建體的表達(dá)。附圖9C表示通過使用Image-Quant軟件的Phosphor Imager(分子動力學(xué)(MolecularDynamics))分析的附圖9B的蛋白質(zhì)印跡的蛋白質(zhì)帶的強(qiáng)度。附圖9D、附圖9E和附圖9F說明了用各構(gòu)建體轉(zhuǎn)導(dǎo)并對MHC-II(附圖9E)(M5/114.15.2)、CD40(附圖9D)(HM40-3)和CD86/B7.2(附圖9F)(GL1)(PharMingen)染色的轉(zhuǎn)導(dǎo)樹突細(xì)胞的流式細(xì)胞分析。
附
圖10A、附
圖10B、附
圖10C和附
圖10D表示共培養(yǎng)CD4+T-細(xì)胞后體內(nèi)誘發(fā)的培養(yǎng)基中免疫接種了用不同載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的樹突細(xì)胞的小鼠的CD4+Th1反應(yīng)。附
圖10A表示IFN-γ的濃度。附
圖10B表示IL-2的濃度。附
圖10C表示TNF-α的濃度。附
圖10D表示IL-4的濃度。
附
圖11A和附
圖11B表示在有或沒有抗-CD4或抗-CD8抗體存在的情況下分離自與s-MAGE-3-Fc-樹突細(xì)胞共培養(yǎng)(附
圖11A)或與HBcAg轉(zhuǎn)導(dǎo)的樹突細(xì)胞共培養(yǎng)(附
圖11B)的免疫接種小鼠的s-MAGE-3-Fc-樹突細(xì)胞的CD4+T-細(xì)胞的IFN-γ水平。
附
圖12A、附
圖12B、附
圖12C和附
圖12D表示分離自收集的小鼠脾細(xì)胞的CD4+T-細(xì)胞中的細(xì)胞因子水平，其中所述的小鼠按1000∶1的比例免疫接種了與分離自相同免疫接種小鼠排空淋巴結(jié)(LN)的樹突細(xì)胞共培養(yǎng)的樹突細(xì)胞。附
圖12B表示IL-2的濃度。附
圖12C表示TNF-α的濃度。附
圖12D表示IL-4的濃度。
附
圖13表示從分離自免疫接種小鼠的脾細(xì)胞誘發(fā)體內(nèi)細(xì)胞毒性反應(yīng)，其中將所述的小鼠在體外用照射的EL4-MAGE-3細(xì)胞重新刺激(E)并與3H-胸苷標(biāo)記的靶細(xì)胞EL4-MAGE-3或EL4-HBcAg(對照)(T)一起共培養(yǎng)。
附
圖14表示樹突細(xì)胞免疫接種后6周誘發(fā)的抗體反應(yīng)。
附
圖15表示通過在有或沒有由ELISA測定的抗-CD40L抗體(MR1，PharMingen)存在的情況下測定共培養(yǎng)物中IL-12水平而增強(qiáng)的T-細(xì)胞與s-MAGE-3-Fc-樹突細(xì)胞的相互作用。
附
圖16A和附
圖16B表示在皮內(nèi)接種EL4-MAGE-3腫瘤細(xì)胞前通過靜脈內(nèi)注射1×105個用不同構(gòu)建體轉(zhuǎn)導(dǎo)的樹突細(xì)胞而免疫接種小鼠的抗腫瘤免疫性。附
圖16A表示腫瘤的體積。附
圖16B表示各組中存活小鼠的百分比。
附
圖17說明了HPV 16E7的帶電荷的氨基酸殘基，使它們?nèi)笔б员惴€(wěn)定蛋白質(zhì)并有助于分泌。
附
圖18說明了表達(dá)載體的圖解表示。在CMV啟動子控制下分別將HBe-Fc融合基因、HBcAg(胞質(zhì))基因、HBeAg(分泌性)基因或帶有信號序列(分泌性)的Fc的cDNA片段克隆入pRc/CMV載體。黑色正方形代表信號序列。
附
圖19A和附
圖19B表示HBe-Fc、HBcAg、HBeAg和Fc構(gòu)建體的表達(dá)。附
圖19A表示如蛋白質(zhì)印跡分析測定的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的不同構(gòu)建體的表達(dá)。附
圖19B表示通過使用Image-Quant軟件的Phosphor Imager(分子動力學(xué)(Molecular Dynamics))分析的附
圖19A中蛋白質(zhì)印跡的蛋白質(zhì)帶的強(qiáng)度。
附圖20說明了體內(nèi)誘發(fā)的在用不同質(zhì)?；蛑旅舻腡細(xì)胞進(jìn)行DNA免疫接種后小鼠的T-細(xì)胞反應(yīng)，其中將所述的小鼠在免疫接種后4周處死。用HBe/cAg重組蛋白將脾細(xì)胞重新刺激5天。
附圖21A、附圖21B、附圖21C和附圖21D說明了體內(nèi)誘發(fā)的用不同質(zhì)粒免疫接種并在免疫接種后4周處死的小鼠的CD4+T-細(xì)胞反應(yīng)。附圖21A和附圖21B表示以一式兩份與HBe/cAg脈沖的樹突細(xì)胞共培養(yǎng)的CD4+T細(xì)胞。附圖21C和附圖21D表示在有或沒有抗-CD4+或抗-CD8+抗體存在的情況下來自與HBe/cAg脈沖的樹突細(xì)胞共培養(yǎng)的HBeFc免疫接種小鼠的CD4+T細(xì)胞。在共培養(yǎng)72小時后通過ELISA測定培養(yǎng)基中IFN-γ和IL-2的濃度。
附圖22說明了體內(nèi)誘發(fā)的在分離自DNA免疫接種小鼠并在體外用照射的EL4-HBcAg細(xì)胞重新刺激5天的脾細(xì)胞中的CTL反應(yīng)。將重新刺激的脾細(xì)胞(E)與3H-標(biāo)記的靶細(xì)胞EL4-HbcAg或EL4-MAGE3(對照)(T)一起共培養(yǎng)4小時。
附圖23表示抗體反應(yīng)的誘發(fā)。通過ELISA測定DNA免疫接種后4-6周時來自小鼠的HBc/eAg-特異性IgG抗體。
附圖24說明了來自樹突細(xì)胞轉(zhuǎn)移實驗中的數(shù)據(jù)。CD11c+樹突細(xì)胞分離自免疫接種了DNA疫苗的供體小鼠的脾細(xì)胞。將致敏的樹突細(xì)胞注入同源原初受體側(cè)尾靜脈。在過繼轉(zhuǎn)移后2-4周進(jìn)行T-細(xì)胞增殖測定試驗。
附圖25描繪了用于構(gòu)建鑒定結(jié)合在MHC-II上的表位的cDNA文庫的逆轉(zhuǎn)錄病毒示意圖。
附圖26描繪了能夠引起CD4+輔助T-細(xì)胞反應(yīng)的結(jié)合在MHC-II上的表位的鑒定方法的示意圖。
詳細(xì)描述本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然可以理解可以實施本申請中公開的本發(fā)明的各種實施方案并對其進(jìn)行修改而不會脫離本發(fā)明的范圍和實質(zhì)。
本文所用的術(shù)語“抗體”指的是能夠特異性地結(jié)合抗原上的特異性表位的免疫球蛋白分子。抗體可以是來源于天然來源或來源于重組來源的完整免疫球蛋白且可以是完整免疫球蛋白的免疫活性部分?？贵w一般是免疫球蛋白分子的四聚物。本發(fā)明中的抗體可以以不同形式存在，例如包括多克隆抗體、單克隆抗體、Fv、Fab和F(ab)2以及單鏈抗體和人源化抗體(Harlow等，1988；Houston等，1988；Bird等，1988)。
將本文所用的術(shù)語“抗原”定義為激發(fā)免疫反應(yīng)的分子。這種免疫反應(yīng)可以包括抗體的產(chǎn)生或特異性免疫感受態(tài)細(xì)胞的激活或兩者兼而有之。抗原可以來源于微生物、蛋白質(zhì)/抗原的亞單位、殺滅的或失活的完整細(xì)胞或裂解物。典型的微生物包括但不限于螺桿菌屬、彎曲桿菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、白喉棒狀桿菌、百日咳博德特氏桿菌、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、布氏疏螺旋體(Borreliaburgdofei)、瘧原蟲屬、單純皰疹病毒、人免疫缺陷病毒、乳頭瘤病毒、霍亂弧菌、大腸桿菌、麻疹病毒、輪狀病毒、志賀氏菌屬、傷寒沙門氏菌、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhea)。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到實際上包括所有蛋白質(zhì)或肽類在內(nèi)的任何大分子可以用作抗原。此外，抗原可以來源于重組或基因組DNA，本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到含有致病基因組或可引起免疫反應(yīng)的蛋白質(zhì)的基因或基因片段的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA可使抗原合成。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到本發(fā)明并不限于應(yīng)用基因或基因組的完整核酸序列。本身便利的是本發(fā)明包括但不限于應(yīng)用一種以上基因或基因組的部分核酸序列且可以將這些核酸序列按照各種組合進(jìn)行排列以引起所需的免疫反應(yīng)。
將本文所用的術(shù)語“自身免疫病”定義為因自身免疫反應(yīng)導(dǎo)致的疾病。自身免疫性是一種對自身抗原不合適且過度的反應(yīng)。實例包括但不限于艾迪生病、格雷夫斯病、I型糖尿病、多發(fā)性硬化、粘液性水腫、惡性貧血、風(fēng)濕熱、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和潰瘍性結(jié)腸炎。
將本文所用的術(shù)語“癌癥”定義為一種細(xì)胞增殖情況，其唯一的特征-正?？刂迫笔?導(dǎo)致不加調(diào)節(jié)的生長、缺乏分化、局部組織侵入和轉(zhuǎn)移。實例包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宮頸癌、皮膚癌、胰腺癌、結(jié)腸直腸癌、腎癌和肺癌。
本文所用的術(shù)語“細(xì)胞”、“細(xì)胞系”和“細(xì)胞培養(yǎng)物”可以互換使用。所有這些術(shù)語還包括其任何和全部隨后產(chǎn)生的子代?？梢岳斫馑凶哟蛴幸饣驘o意突變而不可能相同。
將本文所用的術(shù)語“細(xì)胞結(jié)合元件”定義為能夠結(jié)合細(xì)胞膜上的受體的蛋白質(zhì)的部分。
將本文所用的術(shù)語“DNA”定義為脫氧核糖核酸。
將本文所用的術(shù)語“樹突細(xì)胞”或“DC”定義為來源于骨髓的抗原呈遞細(xì)胞的一個實例。
將本文所用的術(shù)語“表位”定義為可以引發(fā)抗體并與抗體反應(yīng)的抗原分子上的小化學(xué)基團(tuán)?？乖梢詭в幸粋€或多個表位。大部分抗原帶有許多表位，即它們是多價的。一般來說，表位約為5個氨基酸或糖的大小。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解分子的總體三維結(jié)構(gòu)而非特定的線性序列是抗原特異性的主要標(biāo)準(zhǔn)。
將本文所用的術(shù)語“表達(dá)”定義為特定核苷酸序列通過其啟動子驅(qū)動的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。
本文所用的術(shù)語“表達(dá)載體”指的是含有編碼至少部分能夠被轉(zhuǎn)錄的基因產(chǎn)物的核酸序列的載體。在某些情況中，隨后將RNA分子翻譯成蛋白質(zhì)、多肽或肽。在其它情況中，例如在產(chǎn)生反義分子或核酶的過程中不翻譯這些序列。表達(dá)載體可以含有各種控制序列，它們指的是轉(zhuǎn)錄和可能翻譯特定宿主生物體中可操作地連接的編碼序列所必不可少的核酸序列。除控制轉(zhuǎn)錄和翻譯的控制序列外，載體和表達(dá)載體還可以含有也可產(chǎn)生其它功能的核酸序列且如下文所述。
將本文所用的術(shù)語“輔助T-細(xì)胞”定義為其基本功能是促進(jìn)其它B和T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的活化和功能的效應(yīng)T-細(xì)胞。
將本文所用的術(shù)語“異源”定義為來源于不同物種的DNA或RNA序列或蛋白質(zhì)。
將本文所用的術(shù)語“同源”定義為來源于相同物種的DNA或RNA序列或蛋白質(zhì)。
將本文所用的術(shù)語“宿主細(xì)胞”定義為表達(dá)異源核酸序列的細(xì)胞。
將本文所用的術(shù)語“免疫球蛋白”或“Ig”定義為一類起抗體作用的蛋白質(zhì)。在該類蛋白質(zhì)中包括的5個成員是IgA、IgG、IgM、IgD和IgE。IgA起初次抗體的作用，這些抗體存在于諸如唾液、眼淚、乳汁、胃腸分泌物和呼吸道和生殖泌尿道的粘液分泌物這樣的身體分泌物中。IgG起最常見的循環(huán)抗體的作用。IgM是初次應(yīng)答中產(chǎn)生的主要免疫球蛋白。它是凝集、補(bǔ)體結(jié)合和其它抗體應(yīng)答中最有效的免疫球蛋白且在防御細(xì)菌和病毒中是重要的。IgD是尚未了解抗體功能但可以用作抗原受體的免疫球蛋白。IgE是通過在接觸過敏原時使介體從肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞中釋放而介導(dǎo)即發(fā)型超敏反應(yīng)的免疫球蛋白。
將本文所用的術(shù)語“主要組織相容性復(fù)合物”或“MHC”定義為基因的特定簇，它們中的許多編碼在抗原呈遞中所涉及的與進(jìn)化相關(guān)的細(xì)胞表面蛋白，這些基因?qū)儆诮M織相容性的最重要決定簇。I型MHC或MHC-I主要在將抗原呈遞給CD8 T淋巴細(xì)胞中起作用。II型MHC或MHC-II主要在將抗原呈遞給CD4 T淋巴細(xì)胞中起作用。
將本文所用的術(shù)語“多核苷酸”定義為一條核苷酸鏈。此外，核酸是核苷酸的聚合物。因此，本文所用的核酸和多核苷酸是可互換的。本領(lǐng)域技術(shù)人員具有核酸是可以水解成單體“核苷酸”的多核苷酸這樣的一般知識。單體核苷酸可以水解成核苷酸。本文所用的多核苷酸包括但不限于通過本領(lǐng)域中可得到的任何方法獲得的所有核酸序列，所述的方法包括但不限于重組方法，即使用常規(guī)克隆技術(shù)和PCRTM從重組文庫或細(xì)胞基因組中克隆核酸序列等和通過合成方法。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到多核苷酸包括通過本領(lǐng)域中眾所周知方法得到的多核苷酸的局限突變，包括但不限于核苷酸的突變或核苷突變。
將本文所用的術(shù)語“多肽”定義為通常具有確定序列的一條氨基酸殘基鏈。本文所用的術(shù)語多肽相互包含術(shù)語“肽類”和“蛋白質(zhì)”。
將本文所用的術(shù)語“啟動子”定義為由啟動多核苷酸序列特異性轉(zhuǎn)錄所需的細(xì)胞的合成機(jī)構(gòu)或?qū)氲暮铣蓹C(jī)構(gòu)識別的DNA序列。
本文所用的術(shù)語“retrogen”或“retrogen融合蛋白”指的是帶有在如本文所述表達(dá)和加工時能夠引起哺乳動物體內(nèi)免疫反應(yīng)的表位的多肽，其中該多肽與細(xì)胞結(jié)合元件融合。
本文所用的術(shù)語“retrogen表達(dá)載體”指的是包括至少一種編碼信號序列、抗原和細(xì)胞結(jié)合元件的多肽序列的表達(dá)載體。
將本文所用的術(shù)語“RNA”定義為核糖核酸。
將本文所用的術(shù)語“重組DNA”定義為通過連接不同來源的DNA片段產(chǎn)生的DNA。
將本文所用的術(shù)語“重組多肽”定義為通過使用重組DNA方法產(chǎn)生的雜交蛋白。
將本文所用的術(shù)語“T-細(xì)胞”定義為胸腺衍生的參與各種細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的細(xì)胞。
本文所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)染的”或“轉(zhuǎn)化的”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)的”指的是外源核酸轉(zhuǎn)化入或?qū)胨拗骷?xì)胞的過程。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞包括原始主體細(xì)胞及其子代。
本文所用的術(shù)語“在轉(zhuǎn)錄控制下”或“可操作地連接的”指的是相對于多核苷酸啟動子處于正確的位置和方向上以便控制RNA聚合酶的啟動和多核苷酸的表達(dá)。
將本文所用的術(shù)語“疫苗”定義為用于在給哺乳動物施用所述物質(zhì)后激發(fā)免疫反應(yīng)且由此產(chǎn)生免疫性的物質(zhì)。
將本文所用的術(shù)語“病毒”定義為由包封在有或沒有外層脂被膜的蛋白質(zhì)外殼中的核酸(RNA或DNA)組成的顆粒，它僅能夠在完整細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和在細(xì)胞間擴(kuò)散。
本發(fā)明的一個實施方案是一種表達(dá)載體，它包括均為可操作地連接的多核苷酸啟動子序列、編碼信號序列的多核苷酸、編碼抗原的多核苷酸、編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列。
在特定的實施方案中，編碼融合蛋白(抗原細(xì)胞結(jié)合元件)的核酸序列處于啟動子的轉(zhuǎn)錄控制下。大量有關(guān)啟動子如何組織化的考慮來源于對幾種病毒啟動子的分析，這些病毒啟動子包括那些用于HSV胸苷激酶(tk)和SV40早期轉(zhuǎn)錄單位的啟動子。由近來更進(jìn)一步的工作擴(kuò)充的這些研究已經(jīng)證實啟動子由分立的功能組件構(gòu)成，它們各自由約7-20bp的DNA組成并含有一個或多個轉(zhuǎn)錄激活物或阻抑蛋白的識別位點。
在各啟動子中至少一種組件起確定RNA合成的起始位點定位的作用。它的最佳公知實例是TATA盒狀室，而在某些啟動子中缺乏TATA盒狀室，諸如用于哺乳動物末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶基因的啟動子和用于SV40基因的啟動子，位于起始位點上面的分立元件本身能夠有助于固定起始位置。
其它啟動子元件，即增強(qiáng)子，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄開始的頻率。一般來說，它們位于起始位點上游的30-110bp區(qū)，不過，近來已經(jīng)證實許多啟動子還含有起點下游的功能元件。啟動子元件之間的間隔通常是柔性的，使得當(dāng)元件彼此相互顛倒或移動時啟動子的功能是保守的。在tk啟動子中，在活性開始下降前啟動子元件之間的間隔可以增加至50bp間距。隨著啟動子的不同，看起來各個元件可以以共操作的方式起作用或獨立地起作用以便激活轉(zhuǎn)錄。
啟動子可以是一種天然與基因或多核苷酸序列相關(guān)聯(lián)的啟動子，它可以通過分離定位于編碼區(qū)段和/或外顯子上游的5’非編碼序列而獲得。將這類啟動子稱作“內(nèi)源性的”。類似地，增強(qiáng)子可以是一種天然與多核苷酸序列相關(guān)聯(lián)的增強(qiáng)子，它位于所述序列的下游或上游。另一方面，通過在重組或異源啟動子控制下給編碼多核苷酸區(qū)段定位將獲得某些優(yōu)點，所述的編碼多核苷酸區(qū)段指的是通常不與其天然環(huán)境中的多核苷酸序列相關(guān)聯(lián)的啟動子。重組或異源增強(qiáng)子也指通常不與其天然環(huán)境中的多核苷酸序列相關(guān)聯(lián)的增強(qiáng)子。這類啟動子或增強(qiáng)子可以包括其它基因的啟動子或增強(qiáng)子和分離自任何其它原核細(xì)胞、病毒細(xì)胞或真核細(xì)胞的啟動子或增強(qiáng)子以及并非“天然存在的”，即含有不同轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)的不同元件和/或改變表達(dá)的突變的啟動子或增強(qiáng)子。除了以合成方式產(chǎn)生啟動子和增強(qiáng)子的核酸序列外，使用包括PCRTM在內(nèi)的重組克隆和/或核酸擴(kuò)增技術(shù)與本文公開的組合物(美國專利4,683,202；美國專利5,928,906)也可以產(chǎn)生序列。此外，值得關(guān)注的是還可以使用在諸如線粒體、葉綠體等這樣的非核細(xì)胞器內(nèi)指導(dǎo)序列轉(zhuǎn)錄和/或表達(dá)的控制序列。
實際上，重要的是使用有效指導(dǎo)在選擇用于表達(dá)的細(xì)胞類型、細(xì)胞器和生物體內(nèi)DNA區(qū)段的表達(dá)的啟動子和/或增強(qiáng)子。分子生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員一般了解如何使用用于蛋白質(zhì)表達(dá)的啟動子、增強(qiáng)子和細(xì)胞類型的組合，例如參見Sambrook等(1989)。所用的啟動子可以是組成型的、組織特異性的、誘導(dǎo)型的和/或在指導(dǎo)導(dǎo)入DNA區(qū)段的高水平表達(dá)的適宜條件下可用的，諸如在大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)和/或肽類中有利的啟動子。該啟動子可以是異源的或內(nèi)源的。
本文列舉的實驗例中典型的啟動子序列是立即早期巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子序列。該啟動子序列是一種能夠驅(qū)動可操作連接的任何多核苷酸序列高水平表達(dá)的強(qiáng)組成型啟動子序列。然而，也可以使用其它組成型啟動子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期啟動子；小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)啟動子；人免疫缺陷病毒(HIV)長末端重復(fù)(LTR)啟動子；莫洛尼氏病毒啟動子；鳥白血病病毒啟動子；EB病毒立即早期啟動子；勞斯肉瘤病毒啟動子以及人基因啟動子，諸如但不限于肌動蛋白啟動子、肌球蛋白啟動子、血紅蛋白啟動子和肌酸啟動子。此外，本發(fā)明不應(yīng)限于使用組成型啟動子。誘導(dǎo)型啟動子也被考慮作為本發(fā)明的一部分。本發(fā)明的誘導(dǎo)型啟動子的應(yīng)用提供了一種能夠在需要表達(dá)時啟動可操作連接的多核苷酸序列表達(dá)或在不需表達(dá)時中斷表達(dá)的分子開關(guān)。誘導(dǎo)型啟動子的實例包括但不限于金屬硫蛋白啟動子、糖皮質(zhì)激素啟動子、孕酮啟動子和四環(huán)素啟動子。此外，本發(fā)明包括組織特異性啟動子的應(yīng)用，該啟動子僅在所需組織中具有活性。組織特異性啟動子在本領(lǐng)域中是眾所周知的且包括但不限于HER-2啟動子和與PSA相關(guān)聯(lián)的啟動子序列。
在本發(fā)明的特定實施方案中，所述的表達(dá)載體包括編碼信號序列的多核苷酸，所述的信號序列指導(dǎo)由此編碼的蛋白質(zhì)的加工進(jìn)入合適的細(xì)胞機(jī)構(gòu)(cellular machinery)以便使蛋白質(zhì)從所述細(xì)胞中分泌?？梢允褂冒ǖ幌抻谝倚透窝撞《綞抗原信號序列、免疫球蛋白重鏈前導(dǎo)序列、細(xì)胞因子前導(dǎo)序列等這樣的典型信號序列。指導(dǎo)蛋白質(zhì)從細(xì)胞中分泌的任何信號序列基本上適用于本發(fā)明的表達(dá)載體。除信號序列外，可以使用其它用于分泌的機(jī)理，諸如但不限于抑制蛋白質(zhì)分泌的序列的截短或缺失、抑制蛋白質(zhì)分泌的序列的點突變和使蛋白質(zhì)與裝配入病毒顆粒的病毒基因連接。
本發(fā)明的一個實施方案是一種表達(dá)載體，其中所述的編碼抗原的多核苷酸包括用于至少一個表位的多核苷酸序列，其中所述的至少一個表位誘發(fā)哺乳動物體內(nèi)的B細(xì)胞反應(yīng)。
本發(fā)明的另一個實施方案是一種表達(dá)載體，其中所述的編碼抗原的多核苷酸包括用于至少一個表位的多核苷酸序列，其中所述的至少一個表位誘發(fā)哺乳動物體內(nèi)的CD4+T-細(xì)胞反應(yīng)。
本發(fā)明的另一個實施方案是一種表達(dá)載體，其中所述的編碼抗原的多核苷酸包括至少一個表位的多核苷酸序列，其中所述的至少一個表位誘發(fā)哺乳動物體內(nèi)的CD8+T-細(xì)胞反應(yīng)。
本發(fā)明的一個特定實施方案是一種表達(dá)載體，其中所述的編碼抗原的多核苷酸包括至少一個表位的多核苷酸序列，其中所述的至少一個表位誘發(fā)導(dǎo)入了所述抗原的哺乳動物體內(nèi)的B細(xì)胞反應(yīng)、CD4+T-細(xì)胞反應(yīng)和CD8+T-細(xì)胞反應(yīng)。
本發(fā)明的另一個實施方案是一種表達(dá)載體，其中所述的編碼抗原的多核苷酸包括用于多個表位的多核苷酸序列，其中所述的多個表位誘發(fā)導(dǎo)入了所述抗原的哺乳動物體內(nèi)的B細(xì)胞反應(yīng)、CD4+T-細(xì)胞反應(yīng)和CD8+T-細(xì)胞反應(yīng)。
在本發(fā)明的特定實施方案中，所述的表達(dá)載體包括編碼抗原的多核苷酸序列。所述的編碼抗原的多核苷酸序列選自至少一種與疾病相關(guān)的多核苷酸序列，其中所述的疾病選自感染性疾病、癌癥和自身免疫病組成的組。更具體地說，所述的編碼抗原的多核苷酸是一種多核苷酸序列，它選自導(dǎo)致由病毒、細(xì)菌、真菌和原生動物組成的感染性疾病的致病微生物的組。這些編碼公知蛋白質(zhì)或其片段的DNA序列包括病毒抗原，諸如但不限于乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒抗原；人免疫缺陷病毒抗原；包括但不限于gp160、gp120和gag蛋白；乳頭瘤病毒抗原，包括但不限于E7和E6蛋白。作為有用的retrogen融合蛋白，皰疹病毒蛋白質(zhì)諸如例如由EB病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹1型和2型病毒、人皰疹6、7和8型病毒編碼的蛋白質(zhì)也是本發(fā)明所關(guān)注的。在其它實施方案中，編碼抗原的多核苷酸是一種選自乳腺癌、宮頸癌、黑素瘤、腎癌和前列腺癌組成的組的多核苷酸。此外，所述的蛋白質(zhì)可以是一種誘導(dǎo)激活針對腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)的蛋白質(zhì)，其目的在于抑制其生長和復(fù)制，即激活對黑素瘤中黑素細(xì)胞的免疫反應(yīng)的酪氨酸酶。其它與腫瘤相關(guān)的蛋白質(zhì)包括但不限于MART、trp、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、gp100、HER-2、PSA、與肺癌相關(guān)的Ras抗原和任何其它腫瘤特異性、組織特異性或與腫瘤相關(guān)的抗原。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解已知編碼與腫瘤相關(guān)抗原的多核苷酸序列且它們充分公開在科學(xué)文獻(xiàn)中且正在非常迅速地發(fā)現(xiàn)迄今為止未知的多核苷酸序列。在另一個實施方案中，所述的編碼抗原的多核苷酸序列選自包括但不限于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化、銀屑病和局限性回腸炎在內(nèi)的自身免疫病。此外，本發(fā)明應(yīng)包括編碼自身抗原的DNA以便誘發(fā)在一些情況中的免疫耐受性，其中這類耐受性對哺乳動物可能是有利的。此外，本發(fā)明應(yīng)包括編碼能夠誘發(fā)哺乳動物體內(nèi)全身性免疫反應(yīng)的抗原的DNA，其中全身性免疫反應(yīng)對哺乳動物來說是有利的。全身性免疫反應(yīng)在哺乳動物是免疫抑制的情況中對哺乳動物有利，即作為HIV感染、化療或其它免疫抑制過程的結(jié)果。這類抗原可以包括但不限于當(dāng)與抗原呈遞細(xì)胞上的Fc受體結(jié)合時用于通過這些細(xì)胞增量調(diào)節(jié)抗原呈遞的Fc抗體片段。此外，可以將諸如但不限于白細(xì)胞介素5這樣的白細(xì)胞介素用于在需要誘發(fā)全身性免疫反應(yīng)的哺乳動物體內(nèi)產(chǎn)生相似的輔助作用。本發(fā)明由此應(yīng)包括任何已知或迄今為止未知的多核苷酸序列，如果它們包含在本發(fā)明的表達(dá)載體中，那么當(dāng)將載體或由此編碼的融合蛋白導(dǎo)入哺乳動物時它們能夠激活免疫反應(yīng)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到核酸序列編碼全長蛋白質(zhì)并非必要。所表達(dá)的蛋白質(zhì)包括在抗原呈遞細(xì)胞中加工時引起所需免疫反應(yīng)的表位是完全必要的。因此，由此信息中顯然可以看出核酸序列可以編碼能引起導(dǎo)入了表達(dá)載體的動物體內(nèi)免疫反應(yīng)的任何抗原。因此，本發(fā)明決不應(yīng)限定表達(dá)載體內(nèi)包含的核酸序列類型，而應(yīng)包括通過本領(lǐng)域中可得到的任何方法獲得的任何和所有的核酸序列，所述的方法包括但不限于重組方法和通過合成方法，其中所述的重組方法包括不限于使用常規(guī)克隆技術(shù)和PCRTM從重組文庫或細(xì)胞基因組中克隆核酸序列的方法。本發(fā)明也不應(yīng)以任何方式限定核酸序列的來源，因為核酸序列可以獲自任何可得到的來源。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解獲得核酸序列的方案在本領(lǐng)域中是眾所周知的且例如如Sambrook等(1989)和Ausubel等(1997)所述。
在本發(fā)明的特定實施方案中，所述的表達(dá)載體進(jìn)一步包括編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸序列。所述的細(xì)胞結(jié)合元件是一種多肽的部分，它有利于使蛋白質(zhì)與細(xì)胞受體結(jié)合。可以將編碼與細(xì)胞受體蛋白結(jié)合的任何配體的多核苷酸用于本發(fā)明的表達(dá)載體中。典型的細(xì)胞結(jié)合元件包括但不限于免疫球蛋白Fc片段；毒素受體蛋白細(xì)胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域，諸如例如假單胞菌外毒素結(jié)合結(jié)構(gòu)域；細(xì)胞因子，例如白細(xì)胞介素5和白細(xì)胞介素6；任何類型的抗體分子等。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到任何的抗體能夠結(jié)合抗原呈遞細(xì)胞表面上的細(xì)胞表面標(biāo)記，從而啟動抗原/抗體復(fù)合物的攝入。因此，可以將抗體或其片段用作啟動攝入的細(xì)胞結(jié)合元件。典型的抗體包括但不應(yīng)限于抗CDC11、抗CD54、抗CD80和抗CD86。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到所述的細(xì)胞結(jié)合元件可以是同源的或異源的。例如，F(xiàn)c片段可以是同源的或異源的。因此，本發(fā)明不應(yīng)以任何方式限定所述細(xì)胞結(jié)合元件的來源，因為用于細(xì)胞結(jié)合元件的序列可以獲自任何可得到的來源，包括但不限于使用常規(guī)克隆技術(shù)和PCRTM等從重組文庫或細(xì)胞基因組中克隆DNA的方法和通過合成方法。
除了使用已知結(jié)合元件的部分外，本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到通過本領(lǐng)域中眾所周知的典型篩選步驟可以鑒定小肽類。篩選DNA文庫(cDNA或基因組)以便鑒定有效地與抗原呈遞細(xì)胞結(jié)合的小肽類。一旦鑒定了這些肽類，則對所述肽測序并用作本發(fā)明中的細(xì)胞結(jié)合元件。
在表達(dá)中，一般包括聚腺苷酸化序列以便對轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行適當(dāng)?shù)木巯佘账峄２⒉徽J(rèn)為聚腺苷酸化序列的性質(zhì)對成功實施本發(fā)明來說是決定性的和/或可以使用任何這類序列。優(yōu)選的實施方案包括適宜和/或已知在各種靶細(xì)胞中充分起作用的SV40聚腺苷酸化序列、LTR聚腺苷酸化序列和/或牛生長激素聚腺苷酸化序列。作為表達(dá)載體的元件另外所關(guān)注的是轉(zhuǎn)錄終止位點。這些元件能用于提高信息水平和/或使從插入的編碼抗原和細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸序列到載體的其它序列的連續(xù)減少到最低限度。
特異性起始信號也是有效翻譯編碼序列所需的。這些信號包括ATG起始密碼子或相鄰序列?？赡苄枰峁┌ˋTG起始密碼子在內(nèi)的外源翻譯控制信號。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠便利地測定它并提供必要的信號。眾所周知起始密碼子必須與所需編碼序列讀框“符合”以便確保整個插入片段的翻譯。外源翻譯控制信號和起始密碼子可以是天然的或合成的。通過包含合適的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子元件可以提高表達(dá)的效率。
為了使載體在宿主細(xì)胞中增殖，它可以含有一個或多個復(fù)制起點(通常稱作“ori”)，它是在該位點上開始復(fù)制的特異性核酸序列。另一方面，如果宿主細(xì)胞是酵母，那么可以使用自主復(fù)制序列(ARS)。在表達(dá)載體在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制是有利的情況中，載體可以通過整合序列整合入細(xì)胞的基因組，所述的整合序列即逆轉(zhuǎn)錄病毒長末端重復(fù)序列(LTRs)、腺伴隨病毒的ITR序列，它們存在于所述載體中；或另一方面，所述載體自身可以含有DNA復(fù)制起點和其它有利于載體在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的序列，同時該載體維持附加型。例如，表達(dá)載體可以任選地包括EB病毒(EBV)的DNA復(fù)制起點和編碼EBV EBNA-1蛋白的序列以便載體的附加型復(fù)制在導(dǎo)入了該載體的細(xì)胞中得到促進(jìn)。例如，帶有EBV起點和核心抗原EBVA-1編碼的DNA構(gòu)建體能夠在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)復(fù)制到高拷貝數(shù)并且例如商購自Invitrogen(San Diego，CA)。
重要的是應(yīng)注意在本發(fā)明中，為適宜的蛋白質(zhì)表達(dá)而將所述表達(dá)載體整合入宿主細(xì)胞的基因組并不是必要的。相反，所述的表達(dá)載體還可以以附加型分子形式存在于所需細(xì)胞中。例如，存在某些細(xì)胞類型，其中表達(dá)載體復(fù)制以便表達(dá)所需蛋白質(zhì)并不是必要的。這些細(xì)胞是那些諸如肌細(xì)胞這樣通常不復(fù)制且仍然完全能夠進(jìn)行基因表達(dá)的細(xì)胞。可以將表達(dá)載體導(dǎo)入非分化細(xì)胞非在沒有表達(dá)載體復(fù)制的情況下表達(dá)由此編碼的蛋白質(zhì)。
為了鑒定含有本發(fā)明核酸構(gòu)建體的細(xì)胞，在體外或體內(nèi)通過使標(biāo)記包含在表達(dá)載體中來鑒定所述細(xì)胞。這類標(biāo)記為細(xì)胞提供了可鑒定的改變，從而可以便利地鑒定含有所述表達(dá)載體的細(xì)胞。一般來說，選擇標(biāo)記是一種提供選擇特性的標(biāo)記。正選擇標(biāo)記是一種在有標(biāo)記存在的情況下使其進(jìn)行選擇的標(biāo)記，而負(fù)選擇標(biāo)記是一種其存在可防止其進(jìn)行選擇的標(biāo)記。正選擇標(biāo)記的實例是藥物抗性標(biāo)記。
通常包含藥物選擇標(biāo)記有助于轉(zhuǎn)化體的克隆和鑒定，例如產(chǎn)生新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、zeocin和組氨醇抗性的基因是有用的選擇標(biāo)記。除了產(chǎn)生鑒別基于實施條件的轉(zhuǎn)化體的表型的標(biāo)記外，還關(guān)注包括諸如GFP這樣的篩選性標(biāo)記在內(nèi)的其它類型的標(biāo)記，其基礎(chǔ)是比色分析。另一方面，可以使用諸如單純皰疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)這樣的篩選性酶。本領(lǐng)域技術(shù)人員還了解如何將免疫性標(biāo)記與FACS分析結(jié)合使用。例如，在表達(dá)載體中包含NGFR(神經(jīng)生長因子受體)是為了有利于通過使用流式細(xì)胞測定法篩選包括所述載體的細(xì)胞，從而檢測該細(xì)胞表面上的NGFR表達(dá)。并不認(rèn)為所用的標(biāo)記是重要的，條件是它能夠與編碼基因產(chǎn)物的核酸一起同時被表達(dá)。選擇和篩選性標(biāo)記的其它實例對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是眾所周知的。
所述的表達(dá)載體還可以包括原核細(xì)胞的DNA復(fù)制起點和編碼用于選擇包括所述表達(dá)載體的原核細(xì)胞的檢測標(biāo)記的基因，例如一種抗生素抗性基因，諸如例如氨芐西林抗性基因。
此外，可以將所述的表達(dá)載體以RNA而不是DNA的形式提供給細(xì)胞。載體的核心成分與本文所述的用于DNA載體的那些成分相同且另外可以添加用于使體液中和組織和細(xì)胞中的RNA保持穩(wěn)定的其它成分。
將本文所述的各種成分彼此連接以產(chǎn)生本發(fā)明的表達(dá)載體的實際方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的且例如如Sambrook等(1989)、Ausubel等(1994)和Gerhardt等(1994)所描述。
在特定的實施方案中，所述的表達(dá)載體選自病毒載體、細(xì)菌載體和哺乳動物載體組成的組。存在包括上述組成中至少一部分或全部的大量表達(dá)載體系統(tǒng)?？梢詫⒁栽松锖?或真核生物載體為基礎(chǔ)的系統(tǒng)用于本發(fā)明以便產(chǎn)生核酸序列、或其關(guān)連多肽類、蛋白質(zhì)類和肽類。許多這類系統(tǒng)是商購的和可廣泛得到的。
昆蟲細(xì)胞/桿狀病毒系統(tǒng)可以產(chǎn)生異源核酸片段的高水平蛋白質(zhì)表達(dá)，諸如它們描述在美國專利號5,871,986、4,879,236中；且例如這些系統(tǒng)可以在下列商品名下購買來自INVITROGEN的MAXBAC2.0和來自CLONTECH的BACPACKTMBACULOVIRUS EXPRESSION SYSTEM。
表達(dá)載體系統(tǒng)的其它實例包括STRATAGENE的包括合成蛻皮激素誘導(dǎo)型受體的COMPLETE CONTROLTM誘導(dǎo)型哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)或其pET表達(dá)系統(tǒng)，即一種大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。另一種誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)的實例商購自INVITROGEN，它攜帶T-REXTM(四環(huán)素調(diào)節(jié)的表達(dá))系統(tǒng)，即一種使用全長CMV啟動子的誘導(dǎo)型哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)。INVITROGEN還提供了一種稱作甲醇畢赤酵母(Pichia methanolica)表達(dá)系統(tǒng)的酵母表達(dá)系統(tǒng)，設(shè)計它是為了在甲基營養(yǎng)酵母甲醇畢赤酵母中產(chǎn)生高含量的重組蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解如何表達(dá)諸如表達(dá)構(gòu)建體這樣的載體以便產(chǎn)生核酸序列或其關(guān)連多肽、蛋白質(zhì)或肽。
通過將表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞而產(chǎn)生包括表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。將DNA導(dǎo)入細(xì)胞或宿主細(xì)胞是分子生物學(xué)領(lǐng)域中眾所周知的技術(shù)且例如如Sambrook等(1989)、Ausubel等(1994)和Gerhardt等(1994)所描述。細(xì)胞的轉(zhuǎn)染方法包括磷酸鈣沉淀法、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法、DEAE葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法、電穿孔等。另一方面，可以使用參考文獻(xiàn)和其中提供的實施例中所述的常規(guī)技術(shù)用本發(fā)明的retrogen表達(dá)載體簡單轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。宿主細(xì)胞包括原核細(xì)胞或真核細(xì)胞且它包括能夠復(fù)制載體和/或表達(dá)由載體編碼的異源基因的任何可轉(zhuǎn)化的生物體?？梢圆⑶乙呀?jīng)將宿主細(xì)胞用作載體的受體。宿主細(xì)胞可以來源于原核生物或真核生物，這取決于所需的結(jié)果是載體的復(fù)制還是載體編碼的核酸序列的部分或全部的表達(dá)?？梢缘玫接米魉拗骷?xì)胞的大量細(xì)胞系和培養(yǎng)物且它們可以通過美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得，ATCC是一個作為活的培養(yǎng)物和遺傳材料的存檔的組織(www.atcc.org)。它在本領(lǐng)域中是眾所周知的且本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定合適的宿主。一般來說，這要以載體主鏈和所需結(jié)果為基礎(chǔ)。例如，可以將質(zhì)粒或粘粒導(dǎo)入原核生物的宿主細(xì)胞以用于許多載體的復(fù)制。用作載體復(fù)制和/或表達(dá)的宿主細(xì)胞的細(xì)菌細(xì)胞包括DH5α、JM109和KC8以及許多諸如SURE感受態(tài)細(xì)胞和SOLOPACKTM金細(xì)胞(STRATAGENE，La Jolla，CA)這樣的商購細(xì)菌宿主細(xì)胞。另一方面，可以將諸如大腸桿菌LE392這樣的細(xì)菌細(xì)胞用作噬菌體病毒的宿主細(xì)胞。可以用作宿主細(xì)胞的真核細(xì)胞包括但不限于酵母、昆蟲和哺乳動物。復(fù)制和/或表達(dá)載體用的哺乳動物真核宿主細(xì)胞的實例包括但不限于HeLa、NIH3T3、Jurkat、293、Cos、CHO、Saos和PC12。酵母菌株的實例包括但不限于YPH499、YPH500和YPH501。來自各種細(xì)胞類型和生物體的許多宿主細(xì)胞是可得到的且它們對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的。類似地，可以將病毒載體與真核或原核宿主細(xì)胞，特別是一種允許復(fù)制或表達(dá)載體的宿主細(xì)胞結(jié)合使用。
此外，可以以病毒載體形式將所述的表達(dá)載體提供給細(xì)胞。病毒載體技術(shù)在本領(lǐng)域中是眾所周知的且例如如Sambrook等(1989)、Ausubel等(1994)和Gerhardt等(1994)以及其它病毒學(xué)和分子生物學(xué)指南中所描述。用作載體的病毒包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒和慢病毒屬。
某些載體可以使用允許在原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中復(fù)制和/或表達(dá)的控制序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會進(jìn)一步認(rèn)識到培養(yǎng)所述的所有宿主細(xì)胞以維持它們并允許復(fù)制載體的條件。大規(guī)模生產(chǎn)載體以及生產(chǎn)由載體編碼的核酸及其關(guān)連多肽類、蛋白質(zhì)類或肽類的技術(shù)和條件也是可以理解的和公知的。
本發(fā)明的一個特定實施方案是一種包括信號序列和抗原和細(xì)胞結(jié)合元件的融合蛋白。本發(fā)明還包括retrogen蛋白或融合蛋白作為疫苗的應(yīng)用?？梢酝ㄟ^在包括表達(dá)載體的任何細(xì)胞內(nèi)表達(dá)retrogen蛋白并從細(xì)胞、細(xì)胞碎片和細(xì)胞培養(yǎng)基中分離retrogen蛋白而獲得retrogen蛋白。特別可以將親和柱純化方法用于純化本發(fā)明的retrogen，因為根據(jù)定義retrogen包括細(xì)胞結(jié)合元件?？梢詫ㄅ鋵?xì)胞受體或諸如蛋白質(zhì)A或蛋白質(zhì)G這樣的通用蛋白質(zhì)的親和柱用于從細(xì)胞成分中分離retrogen。另一個實施方案是一種包括在體外用所述融合蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗原呈遞細(xì)胞的疫苗。
在其它實施方案中，疫苗包括所述的表達(dá)載體，其中所述的表達(dá)載體包括均為可操作地連接的編碼啟動子序列的多核苷酸、編碼分泌信號序列的多核苷酸序列、編碼抗原的多核苷酸、編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸和編碼聚腺苷酸化序列的多核苷酸。可以將包括所述表達(dá)載體的所述疫苗直接對哺乳動物的部位給藥，在這些部位中存在可以向其中導(dǎo)入在該載體內(nèi)所包含的所述序列、表達(dá)和可能引起針對所需蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)的細(xì)胞。在這種情況中，以在一種藥物載體中和制劑形式給予所述的表達(dá)載體，使得DNA能夠進(jìn)入細(xì)胞并在其中被表達(dá)。然后所表達(dá)的蛋白質(zhì)可以進(jìn)入抗原呈遞細(xì)胞以用于本文所述的加工和MHC呈遞。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到可以以各種方式給予DNA且隨注射途徑的不同可能需要操作DNA的組合物。非腸道注射的典型途徑包括但不限于肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下和皮內(nèi)。此外，通過將表達(dá)載體的DNA直接注入哺乳動物的組織而將表達(dá)載體的DNA導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞并不是必要的。相反，可以使用將所述表達(dá)載體導(dǎo)入哺乳動物的其它方式，包括但不限于非侵入性壓力注射、鼻內(nèi)、口服等。
導(dǎo)入哺乳動物的DNA的量是足以在細(xì)胞中有效表達(dá)DNA的量，使得足夠量的蛋白質(zhì)被表達(dá)并從其中分泌，然后該蛋白質(zhì)被抗原呈遞細(xì)胞吸收并在其上表達(dá)為MHC復(fù)合物。本文將這樣的DNA量稱作DNA的“治療量”。構(gòu)成治療量的DNA的精確濃度可以由將這類化合物給予哺乳動物的本領(lǐng)域技術(shù)人員便利地確定且當(dāng)然會隨其中包含的成分和包括但不限于導(dǎo)入了DNA的組織和哺乳動物的年齡和健康情況在內(nèi)的其它因素而改變。
本發(fā)明的另一個特定的實施方案是一種包括用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞的疫苗。將這些轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞以藥物組合物的形式給予哺乳動物，目的在于在其中引起免疫反應(yīng)。細(xì)胞中retrogen蛋白質(zhì)的表達(dá)使retrogen蛋白從細(xì)胞中分泌。然后分泌的retrogen蛋白可以被哺乳動物體內(nèi)的抗原呈遞細(xì)胞吸收以用于在其中加工和由此表達(dá)為MHC-I或MHC-II復(fù)合物。當(dāng)真核細(xì)胞是抗原呈遞細(xì)胞時，retrogen蛋白可以在其中表達(dá)、從其中分泌并可以重新進(jìn)入細(xì)胞以便加工和抗原的MHC呈遞。當(dāng)真核細(xì)胞不是抗原呈遞細(xì)胞時，細(xì)胞表達(dá)和分泌retrogen蛋白，隨后它被抗原呈遞細(xì)胞吸收以用于抗原的MHC呈遞。用于本發(fā)明的非抗原呈遞細(xì)胞包括不能加工MHC呈遞用抗原的任何細(xì)胞，即肌細(xì)胞?？乖蔬f細(xì)胞包括樹突細(xì)胞(DC)、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞等。另外包括的腫瘤細(xì)胞可以是能夠或不能加工MHC呈遞用抗原的細(xì)胞。
還可以將所述的表達(dá)載體導(dǎo)入哺乳動物的干細(xì)胞，可以直接在體內(nèi)導(dǎo)入哺乳動物或更優(yōu)選在體外導(dǎo)入從哺乳動物中分離并在將載體導(dǎo)入細(xì)胞后重新導(dǎo)入哺乳動物的細(xì)胞。還可以按照體外手段將表達(dá)載體導(dǎo)入哺乳動物中的其它細(xì)胞。當(dāng)將載體導(dǎo)入哺乳動物的細(xì)胞時，所述載體立即表達(dá)由此編碼的蛋白質(zhì)并不是必要的，因為更為需要的可能是在稍后的時間時在細(xì)胞中表達(dá)蛋白質(zhì)。在這種情況中，所述的表達(dá)載體優(yōu)選包括誘導(dǎo)型啟動子，它在將合適的誘導(dǎo)物給予哺乳動物或哺乳動物細(xì)胞時被激活。體外技術(shù)在本領(lǐng)域中是眾所周知的且例如在美國專利號5,399,346中描述。
另一個實施方案是一種至少包括編碼信號序列的多核苷酸、編碼抗原的多核苷酸和編碼細(xì)胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多核苷酸的表達(dá)載體。
本發(fā)明的另一個實施方案是一種引起針對抗原的免疫反應(yīng)的方法。更具體地說，該方法使用本發(fā)明的表達(dá)載體操縱細(xì)胞以便產(chǎn)生內(nèi)源性抗原，如同它們是外源性抗原。這種新型抗原呈遞策略包括用新型重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞以便產(chǎn)生和分泌由抗原和細(xì)胞結(jié)合元件組成的融合蛋白。分泌的融合蛋白通過受體介導(dǎo)的胞吞作用被胞吞入或“以逆向方式”被轉(zhuǎn)運入抗原呈遞細(xì)胞(Daeron，1997；Serre等，1998；Ravetch等，1993)。作為結(jié)果，盡管已經(jīng)以內(nèi)源方式產(chǎn)生，但是在本公開說明書中所稱的融合蛋白或“retrogen”因其分泌后的逆向轉(zhuǎn)運而在附加型途徑中被加工并作為結(jié)合在MHC-II上的外源性抗原片段在抗原呈遞細(xì)胞的細(xì)胞表面上被呈遞?？乖蔬f細(xì)胞表面上的抗原的MHC-II結(jié)合的抗原片段激活CD4+T-細(xì)胞，該細(xì)胞隨后刺激CD8+T-細(xì)胞和巨噬細(xì)胞以及B-細(xì)胞，從而誘發(fā)細(xì)胞和體液免疫。
在本發(fā)明中還發(fā)現(xiàn)也可以在融合蛋白的合成、分泌和胞吞過程中的胞質(zhì)途徑內(nèi)加工retrogen蛋白且它與抗原呈遞細(xì)胞表面上的MHC-I相關(guān)聯(lián)，從而直接激活CD8+T-細(xì)胞。在本領(lǐng)域中和例如由Kovacsovics-Bankowski等在1995年描述了通過攝入的抗原激活CD8+T-細(xì)胞。此外，如上所述和另外在本文中更詳細(xì)地描述的，通過分泌的retrogen可以激活B細(xì)胞。因此，B細(xì)胞的激活在本系統(tǒng)中明顯被增強(qiáng)，因為CD4+細(xì)胞也激活B細(xì)胞。因此，這種策略使用一致的機(jī)理來激活免疫系統(tǒng)中所有的分支。
在特定的實施方案中，將表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞以便產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。在細(xì)胞中表達(dá)retrogen蛋白導(dǎo)致retrogen蛋白從細(xì)胞中分泌。然后分泌的retrogen蛋白被哺乳動物體內(nèi)的抗原呈遞細(xì)胞吸收以用于在其中加工和由此表達(dá)為MHC-I或MHC-II復(fù)合物。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞或第一種細(xì)胞分泌抗原且分泌的抗原被攝入細(xì)胞，即屬于相同或不同細(xì)胞的第二種細(xì)胞。當(dāng)真核細(xì)胞是抗原呈遞細(xì)胞時，retrogen蛋白可以在其中表達(dá)、從其中分泌并可以重新進(jìn)入細(xì)胞以便加工和抗原的MHC呈遞。當(dāng)真核細(xì)胞不是抗原呈遞細(xì)胞時，細(xì)胞表達(dá)和分泌retrogen蛋白，隨后它被抗原呈遞細(xì)胞吸收以用于抗原的MHC呈遞。用于本發(fā)明的非抗原呈遞細(xì)胞包括不能加工MHC呈遞用抗原的任何細(xì)胞，即肌細(xì)胞。抗原呈遞細(xì)胞包括樹突細(xì)胞(DC)、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞等。另外包括的腫瘤細(xì)胞可以是能夠或不能加工MHC呈遞用抗原的細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個實施方案是一種引起針對抗原的免疫反應(yīng)的方法，該方法包括直接給哺乳動物施用所述表達(dá)載體的步驟。
本發(fā)明還包括一種篩選或鑒定多核苷酸序列的方法，所述的多核苷酸序列編碼至少一種能夠引起哺乳動物體內(nèi)免疫反應(yīng)的結(jié)合在MHC-II上的表位。優(yōu)選所鑒定的多肽是一種引起有利于哺乳動物的免疫反應(yīng)的多肽。該方法包括獲得分離的DNA分子群體并篩選那些分離的DNA分子的步驟，這些DNA分子編碼至少一種能夠激活CD4+輔助T-細(xì)胞的結(jié)合在MHC-II上的表位。DNA分子在本文中稱作“測試DNA”或“測試多核苷酸序列”。將測試多核苷酸序列克隆入本發(fā)明的表達(dá)載體，在該載體中它位于例如附圖25中所述的信號序列與細(xì)胞結(jié)合元件之間。在該方法中，通過將包括測試多核苷酸序列的載體導(dǎo)入抗原呈遞細(xì)胞來轉(zhuǎn)導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞、使轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗原呈遞細(xì)胞與原初T-細(xì)胞或致敏T-細(xì)胞接觸且通過評價是任何原初T-細(xì)胞還是致敏T-細(xì)胞在與所述轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗原呈遞細(xì)胞接觸時被激活來評估轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞在體外對原初CD4+T-細(xì)胞的能力。轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗原呈遞細(xì)胞對T細(xì)胞的激活表示其中包含的測試多核苷酸序列是編碼至少一種能夠激活CD4+輔助T-細(xì)胞以引起哺乳動物體內(nèi)免疫反應(yīng)的表位的多核苷酸序列、基因或其片段。在本測定試驗中可以使用的合適的對照品包括用包括已知不會激活哺乳動物體內(nèi)免疫反應(yīng)的分離的多核苷酸序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞(陰性對照)和用包括已知激活哺乳動物體內(nèi)免疫反應(yīng)的分離的多核苷酸序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞(陽性對照)。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到可以將這種篩選過程用于篩選人基因組以便鑒定編碼蛋白質(zhì)或表位的基因，所述的蛋白質(zhì)或表位由可用于癌癥或自身免疫病的免疫療法或用于基因療法的CD4+T-細(xì)胞識別。此外，可以篩選包括細(xì)菌、病毒或寄生蟲的基因組在內(nèi)的其它基因組。
這種T-細(xì)胞的體外激活測定試驗可以適合于高流通量自動測定試驗以便有利于同時檢測許多不同的測試多核苷酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到可以操作本發(fā)明以便用含有各種可能表位序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞?？梢詫⑥D(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞置于含有原初T-細(xì)胞的96孔平板內(nèi)并可以通過摻入T-細(xì)胞的DNA中的放射性的自動評價、使用臨床免疫學(xué)中便于獲得的技術(shù)來評估T-細(xì)胞的激活情況。
在其它實施方案中，可以進(jìn)一步評價由測試多核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物以便體內(nèi)評估哺乳動物中的免疫反應(yīng)的激活。除了將通過導(dǎo)入包括測試多核苷酸序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞經(jīng)非腸道途徑給予哺乳動物外，本測定試驗與體外測定試驗相同。在特定的實施方案中，直接將包括測試多核苷酸序列的表達(dá)載體給予哺乳動物。從脾細(xì)胞中收集T-細(xì)胞并與樹突細(xì)胞一起共培養(yǎng)。評價T-細(xì)胞的激活情況以便測定編碼測試多肽的測試多核苷酸是否能夠激活CD4+輔助T-細(xì)胞。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到可以將這種篩選過程用于鑒定可用于治療癌癥、病毒性感染和自身免疫病的結(jié)合在MHC-II上的表位。
如本文所述，可以通過在分子生物學(xué)領(lǐng)域中常用的任何普通方法獲得所述的測試多核苷酸序列。例如，測試多核苷酸序列可以獲自表達(dá)文庫，該文庫可以表達(dá)其功能未知的蛋白質(zhì)。測試多核苷酸序列還可以獲自表達(dá)已知功能但迄今為止尚未得知具有激活哺乳動物體內(nèi)免疫系統(tǒng)的特性的蛋白質(zhì)的表達(dá)文庫。典型的表達(dá)cDNA文庫包括但不限于腫瘤細(xì)胞、病毒基因組、細(xì)菌基因組、寄生蟲基因組和人基因組。還可以使用組合的方法獲得測試多核苷酸序列，其中最初尚不了解所述的多核苷酸序列是否編碼蛋白質(zhì)；且此外尚不了解所述的多核苷酸序列是否編碼能夠激活免疫反應(yīng)的蛋白質(zhì)。也可以通過合成方法獲得測試多核苷酸序列，其中在自動合成儀中合成多核苷酸序列，將不連續(xù)長度的片段克隆入所述的表達(dá)載體并如本文所述進(jìn)行測試。
并不始終必要的是免疫反應(yīng)是保護(hù)性的，但僅僅是對宿主哺乳動物有利。例如，對哺乳動物可能有利的是在對抗原的免疫反應(yīng)對哺乳動物有害的情況中誘發(fā)免疫耐受性，例如在諸如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化和局限性回腸炎等這樣的某些自身免疫病中，可以通過誘發(fā)針對攻擊抗原的免疫耐受性而獲得的免疫反應(yīng)的減少是需要的。在這種情況中，DNA包括編碼攻擊抗原的DNA，然后所述的攻擊抗原在哺乳動物細(xì)胞中被表達(dá)且隨后在抗原呈遞細(xì)胞中被加工以便在其表面上被表達(dá)為MHC-I和/或MHC-II復(fù)合物，從而在哺乳動物體內(nèi)誘發(fā)對所述抗原的免疫耐受性。
在另外的實施方案中，將所鑒定的多核苷酸序列用作治療癌癥、病毒性感染或自身免疫病的方法。更具體地說，將所鑒定的編碼測試多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)導(dǎo)入抗原呈遞細(xì)胞并通過非腸道途徑將轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗原呈遞細(xì)胞直接給予哺乳動物以便治療癌癥、病毒性感染或自身免疫病。此外，通過非腸道途徑將至少含有編碼測試多肽和細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸的表達(dá)載體直接給予哺乳動物以便治療癌癥、病毒性感染或自身免疫病。
本發(fā)明的另一個實施方案是一種生產(chǎn)對哺乳動物進(jìn)行免疫接種的疫苗的方法，該方法包括下列步驟通過將本發(fā)明的表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞并表達(dá)所述載體以便在所述抗原分泌自所述細(xì)胞的條件下產(chǎn)生抗原來轉(zhuǎn)導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞。在特定的實施方案中，在將抗原呈遞細(xì)胞給予哺乳動物前用所述抗原在體外或離體轉(zhuǎn)導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞?？梢酝ㄟ^非腸道方式給予本發(fā)明的所有疫苗。
在特定的實施方案中，誘發(fā)免疫反應(yīng)的方法包括將表達(dá)載體和細(xì)胞因子表達(dá)載體共同給予生物體的步驟。大量研究已經(jīng)證實通過共同給予細(xì)胞因子表達(dá)質(zhì)?？梢蕴岣邔Ω鱾€質(zhì)粒的反應(yīng)。應(yīng)注意從表達(dá)載體局部合成的細(xì)胞因子的皮克至納克量過低以致于不能對哺乳動物整體產(chǎn)生系統(tǒng)性作用，但仍然可以強(qiáng)烈地影響局部細(xì)胞因子環(huán)境和由此影響對給予的抗原的免疫反應(yīng)。細(xì)胞因子的實例包括但不限于GM-CSF和IL-2。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到可以將用于細(xì)胞因子的多核苷酸序列和用于抗原的多核苷酸序列混入一種表達(dá)載體，由此消除使用兩種獨立的載體。除了細(xì)胞因子外，含有未甲基化的CpG序列的質(zhì)粒提高細(xì)胞介導(dǎo)(Th1)的反應(yīng)(Carson等，1997)。CpG序列基元包括但不限于RRCpGYY。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到在本發(fā)明中用表達(dá)載體補(bǔ)充細(xì)胞因子或添加CpG序列基元導(dǎo)致免疫反應(yīng)的增強(qiáng)。
在本發(fā)明的某些實施方案中，內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(IRES)元件用于生成多基因或多順反子信息。IRES元件能夠繞過5’甲基化帽依賴性翻譯的核糖體掃描模型并在內(nèi)部位點上啟動翻譯(Pelletier和Sonenberg，1988)。已經(jīng)描述了來自細(xì)小核糖核酸病毒科的兩個成員(脊髓灰質(zhì)炎和腦心肌炎)的IRES元件(Pelletier和Sonenberg，1988)和來自哺乳動物信息的IRES(Macejak和Sarnow，1991)。IRES元件可以與異源可讀框連接?？梢砸黄疝D(zhuǎn)錄多個可讀框；通過IRES將它們各自分離，從而生成多順反子信息。各可讀框通過IRES元件接近用于有效翻譯的核糖體?？梢允褂脝我粏幼?增強(qiáng)子有效表達(dá)多個核酸序列以便轉(zhuǎn)錄單個信息(美國專利5,925,565和5,935,819)。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到不必使用基因的整個核酸序列。代之以可以將結(jié)合在MHC I型和II型上的表位的部分核酸序列彼此融合，從而產(chǎn)生由一種啟動子轉(zhuǎn)錄的嵌合融合基因。例如，本發(fā)明的一個特定實施方案是一種同時誘導(dǎo)CD4+和CD8+T-細(xì)胞的方法，該方法包括給予一種融合蛋白的步驟，其中所述的蛋白質(zhì)包括與細(xì)胞結(jié)合元件融合的MHC-I和MHC-II表位。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到多個抗原序列的應(yīng)用使得通過給予一種疫苗治療各種疾病成為可能。
本發(fā)明的另一個特定的實施方案是一種誘發(fā)免疫反應(yīng)的方法，該方法包括給哺乳動物施用一種表達(dá)載體的步驟，其中所述的載體包括在一種啟動子的轉(zhuǎn)錄控制下的編碼第一種融合蛋白的多核苷酸序列和編碼第二種融合蛋白的多核苷酸序列，其中所述的第一種融合蛋白包括第一種信號序列、第一種抗原和第一種細(xì)胞結(jié)合元件且所述的第二種融合蛋白包括第二種信號序列、第二種抗原和第一種細(xì)胞結(jié)合元件。在特定的實施方案中，第一種和第二種信號序列是相同的信號序列，第一種和第二種抗原是不同的抗原且所述的細(xì)胞結(jié)合元件是Fc片段。在其它實施方案中，第一種和第二種信號序列是相同的、第一種和第二種抗原是不同的抗原且第一種和第二種細(xì)胞結(jié)合元件是相同的細(xì)胞結(jié)合元件。其它實施方案包括第一種和第二種信號序列是不同的、第一種和第二種抗原是不同的抗原且第一種和第二中細(xì)胞結(jié)合元件是相同的細(xì)胞結(jié)合元件或第一種和第二種信號序列是相同的、第一種和第二種抗原是不同的抗原且第一種和第二種細(xì)胞結(jié)合元件是不同的細(xì)胞結(jié)合元件。另一個實施方案包括編碼第一種融合蛋白的多核苷酸序列和編碼第二種融合蛋白的多核苷酸序列均在獨立的轉(zhuǎn)錄控制下，且其中編碼第一種融合蛋白的多核苷酸序列和編碼第二種融合蛋白的多核苷酸序列以串聯(lián)方式位于一種表達(dá)載體中。
本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到可以將多個核酸序列以串聯(lián)方式克隆入所述載體，使得各核酸序列是一個獨立的整體。各整體含有驅(qū)動各個核酸序列表達(dá)的啟動子，從而由一種載體表達(dá)獨立的抗原。這項技術(shù)使用用于轉(zhuǎn)錄各個信息的多個啟動子有效地表達(dá)了核酸序列。
本發(fā)明的另一個實施方案是一種生產(chǎn)融合蛋白的方法，該方法包括將本發(fā)明的表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞并表達(dá)所述載體以便在所述融合蛋白分泌自所述細(xì)胞的條件下產(chǎn)生融合蛋白的步驟。在特定的實施方案中，在體外用融合蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞。更具體地說，將所述的融合蛋白通過非腸道方式給予哺乳動物。
本發(fā)明的一個特定的實施方案是一種分泌胞內(nèi)蛋白的方法，該方法包括將表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞并表達(dá)所述載體以便在所述融合蛋白分泌自所述細(xì)胞的條件下產(chǎn)生融合蛋白的步驟，其中所述的表達(dá)載體包括均為可操作地連接的多核苷酸啟動子序列、編碼信號序列的多核苷酸、編碼胞內(nèi)蛋白的多核苷酸、編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列。更具體地說，將編碼胞內(nèi)蛋白的多核苷酸序列截短或使之發(fā)生突變以便提高分泌的效率。在特定的實施方案種，所述的胞內(nèi)蛋白是HPV 16 E7。
本發(fā)明的另一個特定的實施方案是一種分泌膜蛋白的方法，該方法包括將表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞并表達(dá)所述載體以便在所述融合蛋白分泌自所述細(xì)胞的條件下產(chǎn)生融合蛋白的步驟，其中所述的表達(dá)載體包括均為可操作地連接的多核苷酸啟動子序列、編碼信號序列的多核苷酸、編碼膜蛋白的多核苷酸、編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列。更具體地說，將編碼膜蛋白的多核苷酸序列截短或使之發(fā)生突變以便提高分泌的效率。在特定的實施方案中，所述的膜蛋白是EBV核心抗原1。
本發(fā)明還包括一種試劑盒，它包括本發(fā)明的組合物和描述通過外膜給哺乳動物的細(xì)胞或組織施用該組合物的說明書。在另一個實施方案中，該試劑盒包括適合于在將本發(fā)明的化合物給予哺乳動物前溶解或懸浮所述組合物的溶劑(優(yōu)選無菌的)。劑量和制劑可以配制并給予本發(fā)明的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞和融合蛋白(活性組分)以便通過使所述活性組分與生物體內(nèi)活性劑的作用部位接觸的任何方式治療各種疾病狀態(tài)?？梢詫⑺鼈兣c作為各個治療活性組分或與治療活性組分的組合的藥物一起通過可得到的任何常規(guī)方法來給藥?？梢詥为毥o予它們，不過，一般將它們與以選擇的給藥途徑和標(biāo)準(zhǔn)藥物操作為基礎(chǔ)選擇的藥物載體一起給藥。
可以以諸如膠囊劑、片劑和粉劑這樣的固體劑型或諸如酏劑、糖漿劑、乳劑和混懸劑這樣的液體劑型通過口服方式給予所述的活性組分。還可以將所述的活性組分配制成通過注射、快速輸注、鼻咽吸入或皮膚吸收的非腸道給藥的劑型?？梢酝ㄟ^肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或作為栓劑給予所述的活性劑。
膠囊含有活性組分和諸如乳糖、蔗糖、甘露糖醇、淀粉、纖維素衍生物、硬脂酸鎂、硬脂酸等這樣的粉狀載體?？梢允褂妙愃频南♂寗┮员阒瞥蓧褐破瑒??？梢詫⑵瑒┖湍z囊劑制備成緩釋產(chǎn)品以便在數(shù)小時的期限內(nèi)使藥物連續(xù)釋放?？梢越o壓制片劑包糖衣或包薄膜衣以便掩蓋任何不令人滿意的味道并防止片劑接觸空氣或可以將壓制片劑包腸溶衣以便在胃腸道內(nèi)選擇性地崩解。
用于口服給藥的液體劑型可以含有著色劑和調(diào)味劑以便增加患者的可接受性。
一般來說，水、合適的油、鹽水、右旋糖(葡萄糖)水溶液和相關(guān)的糖溶液以及諸如丙二醇或聚乙二醇這樣的二醇類是合適的非腸道用溶液的載體。非腸道給藥用溶液含有活性組分、合適的穩(wěn)定劑且如果必要含有緩沖物質(zhì)。單獨或組合使用的諸如硫酸氫鈉、亞硫酸鈉或抗壞血酸這樣的抗氧化劑是合適的穩(wěn)定劑。還使用檸檬酸及其鹽和乙二胺四乙酸鈉(EDTA)。此外，非腸道用溶液可以含有諸如苯扎氯胺、羥苯甲酸甲酯或羥苯甲酸丙酯和氯代丁醇這樣的防腐劑。合適的藥物載體描述在《Remington氏藥物科學(xué)》(Remington’s PharmaceuticalSciences)中，在本領(lǐng)域種它是一本標(biāo)準(zhǔn)的參考書。
可以將本發(fā)明的活性組分配制成可將其懸浮在適用于哺乳動物且特別是人的藥物上可接受的組合物中的形式。這類制劑包括應(yīng)用諸如胞壁酰二肽衍生物(MDP)這樣的佐劑或描述在美國專利號4,082,735、4,082,736、4,101,536、4,185,089、4,235,771和4,406,890中所述的類似物。可利用的其它佐劑包括礬(PierceChemical Co.)、脂A、海藻糖二霉菌酸酯和二甲基二辛酸十八烷溴化銨(DDA)、弗氏佐劑和IL-12。其它成分可以包括聚氧化丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物(Pluronic)、非離子型表面活性劑和諸如角鯊烯這樣的產(chǎn)生代謝變化的油(美國專利4,606,918)。
另外，可以將標(biāo)準(zhǔn)制藥方法用于控制作用期限。它們在本領(lǐng)域中眾所周知的且包括控釋制劑且可以包括例如聚合物、聚酯類、聚氨基酸、聚乙烯吡咯烷酮、乙烯乙酸乙烯酯、甲基纖維素、羧甲基纖維素或硫酸魚精蛋白這樣的合適大分子。可以調(diào)節(jié)大分子的濃度和導(dǎo)入的方法以便控制釋放。另外，可以將所述的試劑混入諸如聚酯類、水凝膠、聚(乳酸)或乙烯乙酸乙烯酯共聚物這樣的聚合物顆粒中。除混入外，還可以將這些試劑用于捕集微囊中的化合物。
用于給予本發(fā)明化合物的有用的藥物劑型如下所述。
膠囊劑通過給兩段硬膠囊各填充100毫克粉狀活性組分、175毫克乳糖、24毫克滑石和6毫克硬脂酸鎂的裝填物來制備膠囊劑。
軟膠囊制備活性組分溶于大豆油中的混合物并用正位移泵將其注入膠囊以便形成含有100毫克活性組分的軟膠囊。然后洗滌并干燥該膠囊。
片劑通過常規(guī)方法制備片劑，使得劑量單位為100毫克活性組分、0.2毫克膠體二氧化硅、5毫克硬脂酸鎂、275毫克微晶纖維素、11毫克玉米淀粉和98.8毫克乳糖?？梢詫⒑线m的包衣材料用于增加可口性或用于延緩吸收。
可注射的劑型通過在10％(體積)的丙二醇和水中攪拌1.5％(重量)的活性組分來制備適合于經(jīng)注射給藥的非腸道用組合物。用氯化鈉將該溶液制成等滲溶液并滅菌。
混懸劑制備用于口服給藥的水混懸劑，使得每5毫升含有100毫克精細(xì)分散的活性組分、200毫克羧甲基纖維素鈉、5毫克苯甲酸鈉、1.0克的山梨醇溶液U.S.P.和0.025毫升香草醛。
因此，可以通過各種途徑輸送本發(fā)明的藥物組合物并輸送至哺乳動物體內(nèi)的不同部位以獲得特定的作用(例如，參見Rosenfeld等，1991；Rosenfeld等，1991a；Jaffe等，參見上文；Berkner，參見上文)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到盡管可以使用一種以上的給藥途徑，但是特定的途徑可以比另一種途徑產(chǎn)生更為迅速和更為有效的反應(yīng)。通過包括將所述制劑施用于體腔或滴注入體腔、吸入或吹入氣溶膠在內(nèi)的給藥或通過包括肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜、皮下、皮內(nèi)以及局部給藥在內(nèi)的非腸道導(dǎo)入可以完成局部或全身輸送。
可以將本發(fā)明的活性組分制成單位劑型，其中例如茶匙、片劑、溶液或栓劑這樣的各劑量單位含有預(yù)定量的組合物，可以單獨含有或以與其它活性劑聯(lián)用的方式含有它們。本文所用的術(shù)語“單位劑型”指的是適合作為人和哺乳動物受治療者的單位劑量的物理分散單位，各單位含有預(yù)定量的以單獨或以與其它活性劑聯(lián)用形式的本發(fā)明組合物，所述的量按照足以產(chǎn)生所需作用的量來計算，如果合適，該組合物中還含有藥物上可接受的稀釋劑、載體或賦形劑，本發(fā)明對單位劑型的說明取決于所實現(xiàn)的特定作用和與特定宿主中的藥物組合物相關(guān)的藥效學(xué)。
本文所述的這些方法決非包含了全部方法，而其它方法也適合于特定的應(yīng)用，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。此外，通過與已知發(fā)揮所需作用的化合物類似可以進(jìn)一步近似得到所述組合物的有效量。液體制劑和/或毫微型膠囊在某些實施方案中，為了將表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，關(guān)注的是液體制劑和/或毫微型膠囊的應(yīng)用。
毫微型膠囊一般以穩(wěn)定和/或可再現(xiàn)的方式捕集化合物。為了避免以胞內(nèi)聚合物過載導(dǎo)致的副作用，應(yīng)使用能夠在體內(nèi)降解的聚合物設(shè)計這類超微粒(大小在0.1μm左右)。所關(guān)注的是用于本發(fā)明的滿足這些要求的可降解的聚烷基氰基丙烯酸酯毫微型顆粒和/或易于制備這類顆粒。
在本發(fā)明的一個特定的實施方案中，所述的表達(dá)載體可以與脂類結(jié)合?？梢允古c脂類結(jié)合的表達(dá)載體包囊在脂質(zhì)體的水層內(nèi)、散布在脂質(zhì)體的脂雙層內(nèi)、通過與脂質(zhì)體和寡核苷酸連接的連接分子與脂質(zhì)體結(jié)合、在脂質(zhì)體中捕集、與脂質(zhì)體復(fù)合、分散在含有脂類的溶液中、與脂類混合、與脂類合并、作為混懸液包含在脂類中、包含在膠束內(nèi)或與膠束復(fù)合否則與脂類結(jié)合。與脂類或脂類/表達(dá)載體結(jié)合的本發(fā)明組合物并不限于溶液形式的任何特定結(jié)構(gòu)。例如，它們可以作為膠束存在于雙層結(jié)構(gòu)中或具有“可收縮的”結(jié)構(gòu)。還可以簡單地使它們散布在溶液中，可能形成大小或形狀不均勻的聚集物。
脂類是可以屬于天然存在或合成的脂類的脂肪物質(zhì)。例如，脂類包括在細(xì)胞質(zhì)中天然存在的脂滴以及本領(lǐng)域中眾所周知含有長鏈脂族烴類及其衍生物類型的化合物，諸如脂肪酸類、醇類、胺類、氨基醇類和醛類。
可以將磷脂類用于制備本發(fā)明的脂質(zhì)體且它們可以攜帶凈正電荷、負(fù)電荷或呈電中性。可以將磷酸二乙酰酯用于提供脂質(zhì)體上的負(fù)電荷并可以將硬脂酰胺用于提供脂質(zhì)體上的正電荷。該脂質(zhì)體可以由一種或多種磷脂類制成。
呈電中性的脂類可以包括不帶電荷的脂類、基本上不帶電荷的脂類或帶有相同數(shù)量的正電荷和負(fù)電荷的脂類混合物。合適的磷脂類包括磷脂酰膽堿類和其它本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的磷脂類。
適用于本發(fā)明的脂類可以獲自商品來源。例如，二肉豆蔻基磷脂酰膽堿(“DMPC”)可以獲自Sigma Chemical Co.；磷酸二鯨蠟酯(“DCP”)獲自K & K Laboratories(Plainview，NY)；膽固醇(“Chol”)獲自Calbiochem-Behring；二肉豆蔻基磷脂酰甘油(“DMPG”)和其它脂類可以獲自Avanti Polar Lipids，Inc.(Birmingham，AL.)。可以將脂類的氯仿或氯仿/甲醇儲備溶液儲存在約-20℃下。優(yōu)選將氯仿用作唯一的溶劑，因為它比甲醇更易于蒸發(fā)。
來自諸如卵或大豆磷脂酰膽堿、腦磷脂酸、腦或植物磷脂酰肌醇、心磷脂和植物或細(xì)菌磷脂酰乙醇胺這樣天然來源的磷脂類并不優(yōu)選作為主要磷脂即構(gòu)成50％或50％以上總磷脂組合物的磷脂，這是由于所得脂質(zhì)體的不穩(wěn)定性和滲漏程度所造成的。
“脂質(zhì)體”是一種包括通過產(chǎn)生包封的脂雙層或聚集物而形成的各種單層和多層脂小泡的通用術(shù)語。脂質(zhì)體的特征在于具有帶有磷脂雙層膜的囊狀結(jié)構(gòu)和內(nèi)部水介質(zhì)。多層脂質(zhì)體具有通過水介質(zhì)隔離的多脂層。它們在磷脂類懸浮于過量水溶液中時自發(fā)形成。脂成分在形成封閉結(jié)構(gòu)前進(jìn)行自身重排并捕集脂雙層之間的水和溶解的溶質(zhì)(Ghosh和Bachhawat，1991)。然而，本發(fā)明還包括在溶液中具有不同結(jié)構(gòu)而非正常囊狀結(jié)構(gòu)的組合物。例如，可以推定脂類是一種微團(tuán)結(jié)構(gòu)或僅作為不均勻的脂類分子聚集物存在。還關(guān)注lipofectamine-核酸復(fù)合物。
磷脂類在分散在水中時可以形成非脂質(zhì)體的各種結(jié)構(gòu)，這取決于脂類與水的摩爾比。在低比例下脂質(zhì)體是優(yōu)選的結(jié)構(gòu)。脂質(zhì)體的物理特征取決于pH、離子強(qiáng)度和/或存在的二價陽離子。脂質(zhì)體可以表現(xiàn)出對離子和/或極性物質(zhì)的低滲透性，而在升溫下發(fā)生顯著改變其滲透性的相變。相變包括從稱作凝膠態(tài)的稠密填充的有序結(jié)構(gòu)改變成稱作液態(tài)的疏松填充的無序結(jié)構(gòu)。這種情況在特征相變溫度下發(fā)生和/或?qū)е聦﹄x子、糖類和/或藥物的滲透性增加。
脂質(zhì)體通過4種不同的機(jī)理與細(xì)胞發(fā)生相互作用通過諸如巨噬細(xì)胞和/或中性粒細(xì)胞這樣的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬細(xì)胞的胞吞作用；通過非特異性弱疏水作用和/或靜電力和/或通過與細(xì)胞表面成分的特異性相互作用吸附在細(xì)胞表面；通過將脂質(zhì)體的脂雙層插入質(zhì)膜而與漿細(xì)胞融合，同時將脂質(zhì)體內(nèi)含物釋放入細(xì)胞質(zhì)；和/或通過將脂質(zhì)體脂類轉(zhuǎn)入細(xì)胞和/或亞細(xì)胞膜和/或反之亦然，但不結(jié)合脂質(zhì)體內(nèi)含物。改變脂質(zhì)體制劑可以改變操作機(jī)理，不過，可以同時實施一種以上的機(jī)理。
已經(jīng)在體外極為成功地進(jìn)行了脂質(zhì)體介導(dǎo)的寡核苷酸轉(zhuǎn)運和外源DNA的表達(dá)。Wong等(1980)證實了在培養(yǎng)的雞胚胎、HeLa和肝細(xì)胞瘤細(xì)胞中進(jìn)行脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運和外源DNA的表達(dá)的可行性。Nicolau等(1987)成功地完成了靜脈注射后大鼠體內(nèi)脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。
在本發(fā)明的某些實施方案中，可以將脂類與血凝病毒(HVJ)結(jié)合。已經(jīng)證實了這種情況，從而有利于與細(xì)胞膜的融合和促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入脂質(zhì)體包裹的DNA(Kandeda等，1989)。在其它實施方案中，脂類可以與核非組蛋白染色體蛋白質(zhì)(HMG-1)復(fù)合或與之一起使用(Kato等，1991)。在其它實施方案中，脂類可以與HVJ和HMG-1復(fù)合或與之一起使用。即已經(jīng)成功地將這類表達(dá)載體用于在體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)移和表達(dá)寡核苷酸，然后它們可應(yīng)用于本發(fā)明。盡管在DNA構(gòu)建體中使用細(xì)菌啟動子，但是在脂質(zhì)體內(nèi)包括合適的細(xì)菌聚合酶也是需要的。
可以通過不同方法制備本發(fā)明使用的脂質(zhì)體。脂質(zhì)體的大小根據(jù)合成方法的不同而改變。懸浮在水溶液中的脂質(zhì)體一般呈球形囊泡的形狀，它們帶有一層或多層脂雙層分子的同心層。各層由通式XY代表的平行排列的分子組成，其中X是親水部分而Y是疏水部分。在水混懸液中，同心層的排列使得親水部分傾向于保持與水相接觸，而疏水區(qū)傾向于自結(jié)合。例如，當(dāng)水相存在于脂質(zhì)體內(nèi)和不存在于脂質(zhì)體內(nèi)時，脂類分子均可以形成稱作片層的XY-YX排列的雙層。當(dāng)一種以上脂類分子的親水和疏水部分彼此結(jié)合時，可以形成脂類的聚集物。這些聚集物的大小和形狀取決于許多不同的變化因素，諸如溶劑的性質(zhì)和溶液中存在的其它化合物。
可以按照公知的實驗室技術(shù)制備本發(fā)明范圍內(nèi)的脂質(zhì)體。在一個優(yōu)選的實施方案中，通過在例如玻璃梨形燒瓶這樣的容器內(nèi)混合脂質(zhì)體脂類來制備脂質(zhì)體。該容器應(yīng)具有大于預(yù)計脂質(zhì)體混懸液體積10倍的體積。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在約40℃和負(fù)壓下除去溶劑。溶劑通常在約5分鐘-2小時內(nèi)被除去，這取決于所需的脂質(zhì)體的體積?？梢栽谡婵罩械母稍锲鲀?nèi)進(jìn)一步干燥所述組合物。因隨時間變質(zhì)的傾向而一般在約1周后棄去干燥的脂類。
通過陣搖至所有液體膜重新懸浮可以使干燥的脂類在無菌的不含致熱原的水中水合成約25-50mM磷脂。然后可以將這種水脂質(zhì)體分離成等分部分、將它們各自置于小瓶內(nèi)、凍干并在真空中密封。
在另一種選擇中，可以按照其它公知的實驗室方法制備脂質(zhì)體Bangham等(1965)的方法，將該文獻(xiàn)的內(nèi)容引入本文作為參考；Gregoiradis的方法，如《生物學(xué)和藥物中的藥物載體》(DRUG CARRIERSIN BIOLOGY AND MEDICINE)中所述，G.Gregoiradis編輯(1979)287-341頁，將該文獻(xiàn)的內(nèi)容引入本文作為參考；Deamer和Uster在1983年所述的方法，將該文獻(xiàn)的內(nèi)容引入作為參考；和如Szoka和Papahadjopoulos在1978年所述的反相蒸發(fā)法。上述方法在其捕集含水物質(zhì)的相應(yīng)能力及其相應(yīng)的含水空間與液體比方面存在差異。
可以使如上所述制備的干燥脂類或凍干脂質(zhì)體脫水并在抑制性肽溶液中再溶解和用例如DPBS這樣的合適溶劑稀釋成合適的濃度。然后在渦流混合器中劇烈振搖該混合物。通過以29,000×g離心除去未包裹的核酸并洗滌脂質(zhì)體沉淀。將洗滌的脂質(zhì)體重新懸浮至合適的總磷脂濃度、例如約50-200mM。可以按照標(biāo)準(zhǔn)方法測定包裹的核酸的量。在測定脂質(zhì)體制劑中包裹的核酸的量后，可以將該脂質(zhì)體稀釋成合適的濃度并在4℃下儲存至應(yīng)用為止。
包括所述脂質(zhì)體的藥物組合物通常包括無菌的藥物上可接受的載體或稀釋劑，諸如水或鹽水溶液?；虔煼ǖ慕o藥本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到可以將本發(fā)明的表達(dá)載體用于基因療法。就基因療法而言，本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到所用的載體必須含有可操作地與啟動子連接的有意義的基因。就反義基因療法而言，有意義的基因的反義序列可操作地與啟動子連接。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到在某些情況中，諸如3’UTR調(diào)節(jié)序列這樣的其它序列可用于表達(dá)有意義的基因。如果合適，可以按照本領(lǐng)域中公知的方式將基因療法的載體配制成固體、半固體、液體或氣態(tài)形式的制劑以適合于其相應(yīng)的給藥途徑?？梢詫⒈绢I(lǐng)域中公知的方法用于防止組合物的釋放和吸附，直到它達(dá)到靶器官或確保組合物的定時釋放為止。應(yīng)使用不會使本發(fā)明組合物無效的藥物上可接受的劑型。在藥物劑型中，可以將所述組合物單獨使用或以合適的結(jié)合方式以及組合方式與其它具有藥物活性的化合物一起使用。必須給予足夠量的含有治療核酸序列的載體以便提供藥理上有效劑量的基因產(chǎn)物。
本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到可以將不同的轉(zhuǎn)運方法用于將載體給藥入細(xì)胞。實例包括(1)使用物理方式的方法，諸如電穿孔(電)、基因槍(物理力)或應(yīng)用大體積的液體(壓力)；和(2)使所述載體與諸如脂質(zhì)體、凝集的蛋白質(zhì)或轉(zhuǎn)運蛋白分子這樣的另一種整體復(fù)合的方法。
因此，本發(fā)明提供了一種將治療基因轉(zhuǎn)入宿主的方法，該方法包括使用任何上述給藥途徑或本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知且適合于特定應(yīng)用的可選擇途徑給予本發(fā)明的載體，優(yōu)選作為組合物的一部分的步驟?？梢砸罁?jù)治療作用(例如與所治療特定疾病相關(guān)的某些癥狀的緩解)或另外通過證實轉(zhuǎn)移的基因或基因在宿主內(nèi)的表達(dá)監(jiān)測按照本發(fā)明將載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞的有效基因轉(zhuǎn)移(例如，使用與測序、RNA印跡或DNA雜交結(jié)合的聚合酶鏈反應(yīng)；或檢測宿主細(xì)胞內(nèi)核酸的轉(zhuǎn)錄測定試驗；或使用免疫印跡分析、抗體介導(dǎo)的檢測、mRNA或蛋白質(zhì)半衰期研究；或檢測由轉(zhuǎn)移的核酸編碼的蛋白質(zhì)或多肽或因這類轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的對水平或功能的影響的顆?；囼?。
本文所述的這些方法決不意味著包含所有方法且可以使用適合于特定應(yīng)用的其它方法，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。此外，可以通過與已知發(fā)揮所需作用的化合物類似而進(jìn)一步近似得到所述組合物的有效量。
此外，實際劑量和方案可以根據(jù)是否將所述組合物與其它藥物組合物聯(lián)用給藥或根據(jù)個體之間的藥代動力學(xué)、藥物性能和代謝方面的差異來改變。類似地，劑量可以在體外應(yīng)用中改變，這取決于所用的特定細(xì)胞系(例如，基于存在于細(xì)胞表面上的載體受體的數(shù)量或所用的特定載體用于基因轉(zhuǎn)移以便在該細(xì)胞系中復(fù)制的能力)。此外，每個細(xì)胞中添加的載體量能夠隨插入載體的治療基因的長度和穩(wěn)定性以及序列的性質(zhì)來改變且它特別是一種需要根據(jù)經(jīng)驗確定的參數(shù)且可以因并不是本發(fā)明方法固有的因素(例如，與合成相關(guān)的成本)而改變它。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)特定情況中的要求方便地進(jìn)行任何必要的調(diào)整。
含有治療基因的細(xì)胞還可以含有一種自殺基因(即編碼可以用于破壞細(xì)胞的產(chǎn)物的基因，諸如單純皰疹病毒胸苷激酶)，這是可能的。在許多基因療法的情況中，需要能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)用于治療目的的基因，而且需要具有一旦完成療法、成為無法控制的或不會導(dǎo)致可預(yù)計的或所需的結(jié)果就破壞宿主細(xì)胞的能力。因此，可以通過啟動子驅(qū)動治療基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá)，不過，所述自殺基因的產(chǎn)物在沒有前體藥物的情況下仍保持無害。一旦療法完成或不再需要或需求治療，則前體藥物的給藥會導(dǎo)致自殺基因產(chǎn)物對細(xì)胞成為致命性的。可以使用的自殺基因/前體藥物組合的實例是單純皰疹病毒-胸苷激酶(HSV-tk)和9-[1，3-二羥-2-丙氧甲基]鳥嘌呤、無環(huán)鳥苷或FIAU；氧化還原酶和環(huán)己酰亞胺；胞嘧啶脫氨酶和5-氟胞嘧啶；胸苷激酶胸苷酸激酶(Tdk∶Tmk)和AZT；以及脫氧胞苷激酶和胞嘧啶阿糖胞苷。
通過實例提供了下列實施例且它們不以任何方式來限定本發(fā)明的范圍。
實施例1逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中HBe抗原的構(gòu)建和表達(dá)盡管由HBV前CC基因編碼HBcAg和HBeAg蛋白，但是分泌性HBeAg蛋白開始于HBcAg的起始密碼子上游29個殘基的起始密碼子。修復(fù)獲自美國典型培養(yǎng)保藏中心(Rockville，MD)的HbeAg基因以便修正兩個突變。發(fā)現(xiàn)這兩個突變因在74位密碼子上產(chǎn)生移碼的單堿基對缺失而發(fā)生，從而在84和85位上產(chǎn)生兩個連續(xù)的終止密碼子。通過使用PCR誘變插入缺失的堿基來修正這些突變。使在病毒感染過程中裂解的HBeAg的富含精氨酸的C’-末端序列(aa 150-185)缺失。然后使截短的HBeAg基因與IgG Fc片段進(jìn)行符合讀框的融合。將HBe-retrogen融合基因(HBe-retrogen)克隆入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(LNC-NGFR)或表達(dá)載體pRc/CMV。使用本領(lǐng)域可獲得的技術(shù)構(gòu)建包括HBcAg(胞質(zhì))和HBeAg(分泌)的載體且所述的技術(shù)例如由Sambrook等(1989)和Ausubel等(1997)描述。將IgG Fc片段基因與IgG信號前導(dǎo)序列融合并如附圖2A中所示克隆入表達(dá)載體中。以這種方式，如附圖2A中所示構(gòu)建含有HBeAg基因(分泌)、帶有信號前導(dǎo)序列的Fc片段基因(分泌性)或HBcAg基因(胞質(zhì))的一系列對照逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
為了評價HBe-Fc融合蛋白的表達(dá)和分泌，用不同的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞并在48小時后對所述細(xì)胞進(jìn)行放射性標(biāo)記。正如附圖3中所示，當(dāng)用抗人IgG或抗-HBeAg抗體(Sigma Chemical Co.St.Louis，MO)沉淀時，在細(xì)胞裂解物和培養(yǎng)基中均檢測到了符合HBeAg-Fc融合蛋白的蛋白質(zhì)帶。
對轉(zhuǎn)染細(xì)胞的免疫熒光染色還顯示出一種典型的分泌性蛋白質(zhì)圖式。僅在獲自轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞裂解物中觀察到了HBcAg蛋白并且在所述培養(yǎng)基和所述細(xì)胞裂解物中均觀察到了HBeAg和Fc片段蛋白質(zhì)。這些結(jié)果表明有效地產(chǎn)生了HBeAg-Fc蛋白(HBe-retrogen)且它們分泌自細(xì)胞。
實施例2樹突細(xì)胞(DCs)中HBe-retrogen的轉(zhuǎn)導(dǎo)和表達(dá)為了在DCs中評價“retrogen”策略，使用瞬時轉(zhuǎn)染法由PA317包裝細(xì)胞生產(chǎn)含有HBe-retrogen或包括NGFR標(biāo)記的各種對照基因(附圖2A)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。鼠骨髓細(xì)胞獲自C57BL/B6小鼠。在補(bǔ)充了鼠干細(xì)胞因子(SCF)和IL-6的培養(yǎng)基中刺激所述細(xì)胞并將其用下文所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等轉(zhuǎn)導(dǎo)。Des的轉(zhuǎn)導(dǎo)在裝有含10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)的10mm培養(yǎng)皿中以約40％的融合率培養(yǎng)獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville，MD)的PA317包裝細(xì)胞。用10-15μm濾膜轉(zhuǎn)染這些細(xì)胞。
從小鼠肢體骨中沖洗出鼠骨髓、使之通過尼龍篩網(wǎng)并用氯化銨排空紅細(xì)胞。在用RPMI-1640充分洗滌后，在37℃下用家兔補(bǔ)體和一組單克隆抗體、抗-CD4+、抗-CD8+、抗-B細(xì)胞和抗-MHC型陽性細(xì)胞混合物在RPMI-1640中將所述細(xì)胞培養(yǎng)40-60分鐘。在用RPMI-1640充分洗滌后，將5×105個細(xì)胞/ml懸浮在補(bǔ)充了6％FBS、80ng mSCF/ml和20Ur mIL-6/ml的RPMI-1640中。將該細(xì)胞平板固定在12孔培養(yǎng)平板(3ml/孔)中，在37℃和5％CO2下培養(yǎng)過夜且然后用含有相同組分的新鮮培養(yǎng)基替換。在進(jìn)行48小時培養(yǎng)后，將所述細(xì)胞通過離心收集，重新懸浮在1.5ml的逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液中并平板固定在24孔培養(yǎng)平板上，將該平板用10mg/ml濃度的逆轉(zhuǎn)錄柄蛋白(Retronectin)包被。在37℃下以2,500rpm將所述細(xì)胞離心90-120分鐘且然后在37℃和5％CO2下將它們再培養(yǎng)3-4小時以便進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。接著用補(bǔ)充了5％FBS、10ng mSCF/ml、60ng mGM-CSF/ml和100U mIL-4/ml的2.5mlRPMI-1640(R&D Systems，Minneapolis，MN)替換逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液過夜。接下來將轉(zhuǎn)導(dǎo)過程重復(fù)2-3次。轉(zhuǎn)導(dǎo)后，洗滌細(xì)胞并在含有mGM-CSF和mIL-4的Opti-MEM(GIBCO，Grand Island，NY)中培養(yǎng)幾天以便在收集前進(jìn)一步使DCs成熟(Banchereau等，1998；Inaba等，1992)。轉(zhuǎn)導(dǎo)的評價(表達(dá)的測定)在培養(yǎng)幾天后，在骨髓衍生的DCs上表達(dá)顯示出典型的DC形態(tài)和高水平的MHC、粘著和共同刺激分子(CD11、CD54、CD80和CD86)的所述細(xì)胞(附圖4A-4C和5A-5E)。正如通過抗-NGFR染色所測定的，培養(yǎng)物中的細(xì)胞被轉(zhuǎn)導(dǎo)了約20-30％。在RT-PCR測定中證實轉(zhuǎn)錄了DCs中的HBe-retrogen基因。
如下進(jìn)行RT-PCR測定使用Trizoal(Gibco-BRL Grand Island，NY)從DCs中提取細(xì)胞RNA并在37℃下將其用不含RNASE的DNASE處理30分鐘。在進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后，將cDNAs用作使用對應(yīng)于HBeAg基因的引物對的PCR反應(yīng)的模板。通過經(jīng)瓊脂糖的電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析。
這些結(jié)果共同表明將HBe-retrogen融合基因有效轉(zhuǎn)導(dǎo)入了鼠骨髓細(xì)胞并在骨髓衍生的DCs中表達(dá)。有意義的是MHC-II和共同刺激分子在包括轉(zhuǎn)導(dǎo)HBe-retrogen的DCs上的表面表達(dá)明顯高于所述分子在用HBeAg或HBcAg轉(zhuǎn)導(dǎo)的DCs上的表達(dá)。這一觀察結(jié)果提示Fc與受體的結(jié)合激活了DCs。
實施例3原初CD4+-T-細(xì)胞的體外活化為了評價轉(zhuǎn)導(dǎo)的DCs是否能夠在細(xì)胞培養(yǎng)物中致敏原初CD4+-T-細(xì)胞，將分離自C57BL/B6小鼠脾細(xì)胞的原初CD4+-T-細(xì)胞與用實施例1的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的鼠DCs按1∶20的比例(DCs∶T-細(xì)胞)一起共培養(yǎng)。使用富含CD4+T細(xì)胞的柱(R&D Systems，Minneapolis，MN)從小鼠脾臟懸浮液中分離CD4+T細(xì)胞。使用富含CD8+T細(xì)胞的柱(R&D Systems，Minneapolis，MN)從小鼠脾臟懸浮液中分離CD8+T細(xì)胞。在37℃和5％CO2下用補(bǔ)充了10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)純化的CD4+或CD8+T細(xì)胞。
當(dāng)將原初CD4+-T-細(xì)胞與用HBeAg、HBcAg或Fc片段基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的DCs一起共培養(yǎng)時，在培養(yǎng)基中通過ELISA僅檢測到低或背景水平的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和干擾素(IFN)-γ。此外，當(dāng)監(jiān)測到細(xì)胞數(shù)量或3H-胸苷摻入率時，沒有觀察到明顯的T-細(xì)胞增殖。相反，當(dāng)將原初CD4+-T-細(xì)胞與用HBe-retrogen轉(zhuǎn)導(dǎo)的DCs一起共培養(yǎng)5天時，T-細(xì)胞活躍地增殖且在培養(yǎng)基中檢測到了高水平的GM-CSF和IFN-γ(附圖6A和6B)。這些結(jié)果提示不能將分泌性HBeAg或胞質(zhì)HBcAg有效加工和由DCs呈遞給MHC-II。相反，在Fc-受體介導(dǎo)的攝入和呈遞給DCs中的MHC-II后能有效加工分泌性HBe-retrogen，從而導(dǎo)致原初CD4+T-細(xì)胞的體外活化。
在含有轉(zhuǎn)導(dǎo)的DCs的共培養(yǎng)物中沒有檢測到明顯的原初CD8+T-細(xì)胞活化。在細(xì)胞培養(yǎng)物中沒有檢測到原初CD8+T-細(xì)胞活化可能是由于在HBeAg中僅存在一種已知結(jié)合在MHC-I上的表位和CD4+-T-細(xì)胞是CD8+T-細(xì)胞的有效活化所需要的這一事實(Ridge等，1998)。
為了使用retrogen策略進(jìn)一步證實結(jié)合在MHC-II上的抗原呈遞，使用MHC-II剔除(KO)C57BL/6小鼠(Charles River，NY)，其中消除了MHC-II通過DCs的抗原呈遞。用HBe-retrogen轉(zhuǎn)導(dǎo)來源于野生型(WT)或MHC-II KO小鼠的DCs且然后將它們與獲自WT小鼠的CD4+T-細(xì)胞按1∶20的比例一起共培養(yǎng)。正如附圖7A和7B中所示，在含有轉(zhuǎn)導(dǎo)的KO-DCs的共培養(yǎng)物的培養(yǎng)基中僅檢測到低濃度的GM-CSF和IFN-γ，而沒有觀察到明顯的T-細(xì)胞增殖。相反，當(dāng)將CD4+T-細(xì)胞與用轉(zhuǎn)導(dǎo)的WT DCs一起共培養(yǎng)5天時，T-細(xì)胞活躍地增殖且在培養(yǎng)基中檢測到了高濃度的GM-CSF和IFN-γ(附圖7A和7B)。
實施例4輔助和細(xì)胞毒性T-細(xì)胞的體內(nèi)誘導(dǎo)以及B-細(xì)胞的免疫反應(yīng)評價體內(nèi)retrogen抗原呈遞策略的可能性。將小鼠(C57BL/6)分成4組(4-6只小鼠/組)并通過腹膜內(nèi)注射對每只小鼠給予用HBcAg、HBeAg、Fc或HBe-retrogen在含有50,000U IL-2(ChironCorp.Emmeryville，CA)的0.2ml PBS中轉(zhuǎn)導(dǎo)的約50萬個DCs。在最終給藥后的不同的時間處死小鼠并收集外周血液、脾臟和其它器官。分離T-細(xì)胞以便使用富含CD4或CD8+T-細(xì)胞的柱(R&D Systems，Minneapolis，MN)進(jìn)行分析。
在第一次注射后3個月，處死小鼠并收集外周血液、脾臟和其它組織樣品。從總體檢查中可以看出，在給予HBe-retrogen-轉(zhuǎn)導(dǎo)的DCs的小鼠體內(nèi)的腹腔中的淋巴結(jié)顯著擴(kuò)大，而正常小鼠和給予其它構(gòu)建體的小鼠體內(nèi)淋巴結(jié)小至難以觀察到。組織學(xué)檢查還顯示在給予HBe-retrogen-DCs的小鼠腹部淋巴結(jié)中的T-細(xì)胞和B-細(xì)胞增殖活躍。
實施例5TH1和TH2輔助T-細(xì)胞的誘導(dǎo)將如實施例4中所述免疫接種的小鼠用于測定TH1和TH2輔助T-細(xì)胞的誘導(dǎo)情況。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到了測定TH1和TH2細(xì)胞的誘導(dǎo)的重要性。眾所周知CD4+-T-細(xì)胞具有下列功能1)它們幫助B-細(xì)胞發(fā)育成產(chǎn)生抗體的漿細(xì)胞；2)它們幫助CD8+-T-細(xì)胞成為活化的細(xì)胞毒性T-細(xì)胞；和3)它們引起遲發(fā)過敏性。這些功能通過CD4細(xì)胞的兩種亞群來完成TH1細(xì)胞介導(dǎo)遲發(fā)過敏性并主要產(chǎn)生IL-2和γ干擾素(IFN-γ)，而TH2細(xì)胞具有B-細(xì)胞輔助功能且主要產(chǎn)生IL-4和IL-5。
使用抗-CD4柱(R&D Systems，Minneapolis，MN)從免疫接種的小鼠脾臟中分離CD4+-T-細(xì)胞且然后將這些細(xì)胞與用重組HBeAg蛋白脈沖的小鼠DCs一起共培養(yǎng)。在T-細(xì)胞∶DCs之比為1000∶1的細(xì)胞共培養(yǎng)物中僅2天后，來自給予HBe-retrogen-DCS的CD4+-T-細(xì)胞增殖活躍。在所述共培養(yǎng)基中檢測到了高濃度的GM-CSF和IFN-γ(刺激巨噬細(xì)胞和CD8+-T-細(xì)胞)以及IL-4和IL-5(刺激B-細(xì)胞)?？?CD4抗體而非抗-CD8抗體顯著阻斷了細(xì)胞因子在這些共培養(yǎng)的T-細(xì)胞中的產(chǎn)生。相反，當(dāng)將獲自免疫接種了HBeAg-、HBcAg-或Fc-DCs的小鼠的CD4+-T-細(xì)胞與HBeAg-DCs一起共培養(yǎng)時，在共培養(yǎng)基中僅檢測到了低濃度的GM-CSF、IFN-γ、IL-4和IL-5而沒有觀察到活躍的T-細(xì)胞的增殖。由于IL-4和IL-5主要由TH2產(chǎn)生且GM-CSF和IFN-γ主要由TH1細(xì)胞產(chǎn)生，所以這些結(jié)果表明HBe-retrogen-轉(zhuǎn)導(dǎo)的DCs有效激活TH1和TH2T-細(xì)胞。
實施例6高滴度抗-HBeAg抗體的誘導(dǎo)如實施例4中所述給小鼠免疫接種以便測定抗體的水平。給小鼠免疫接種HBe-retrogen-轉(zhuǎn)導(dǎo)的DCs在小鼠體內(nèi)誘發(fā)了高滴度的、長期的抗-HBe/cAg抗體反應(yīng)。正如附圖8中所示，在給予HBe-retrogen-轉(zhuǎn)導(dǎo)的DCs的小鼠血清中檢測到的抗-HBeAg抗體的滴度顯著高于給予HBeAg-轉(zhuǎn)導(dǎo)的DCs的小鼠體內(nèi)的抗-HBeAg抗體的滴度。使用ELISA評價免疫接種小鼠血清中抗-HBeAg抗體的水平。簡單地說，在4℃下用連續(xù)稀釋的血清在封閉性緩沖液中將包被了HBcAg重組蛋白的微量滴定板(50ng/孔)培養(yǎng)2小時。用針對在封閉性緩沖液中稀釋的小鼠IgG的過氧化物酶接合的抗體培養(yǎng)后檢測結(jié)合的抗體。將獲自ChironCorp.(Emmergyville，CA)的多克隆抗-HBcAg抗體用作陽性對照而將正常小鼠血清用作陰性對照。將抗體滴度定義為具有OD450值的最高稀釋度，它高于陰性水平的2倍。
所觀察到的抗體產(chǎn)生的倍增可能是由于CD4+輔助T-細(xì)胞較強(qiáng)活化造成的。免疫接種了HBcAg-轉(zhuǎn)導(dǎo)的DCs的小鼠血清中抗-HBe/cAg抗體水平明顯較低可能是由于HBcAg的胞質(zhì)定位和CD4+T-細(xì)胞活化缺乏所造成的。因此，HBe-retrogen在誘發(fā)免疫接種它的哺乳動物體內(nèi)的抗體反應(yīng)方面顯著優(yōu)于其它HBeAg和HBcAg構(gòu)建體。這些小鼠模型的研究結(jié)果共同表明用HBe-retrogen轉(zhuǎn)導(dǎo)的DCs誘發(fā)了CD4+-和CD8+-T-細(xì)胞的強(qiáng)有力的活化以及B-細(xì)胞的活化。
實施例7胞內(nèi)腫瘤抗原的載體構(gòu)建MAGE-3是一種缺乏用于內(nèi)源性MHC-II呈遞途徑的引導(dǎo)序列的胞質(zhì)和核內(nèi)蛋白，它使得在MHC-II上呈遞變得不可能或難以在MHC-II上進(jìn)行呈遞。由于沒有小鼠的同源物，所以將人MAGE-3基因與來源于人趨化因子RANTES基因的信號前導(dǎo)序列連接以便使MAGE-3分泌。使用下列引物對將編碼全長MAGE-3基因的質(zhì)粒用作模板以便擴(kuò)增MAGE-3 DNA5’-引物(A)(SEQ ID No.1)5’-ACGCGTCGACATGCCTCTTGAGCAGAGGAGTCAG-3’，它相當(dāng)于帶有附加Sal I限制位點的MAGE-3基因的1-24位多核苷酸序列；和3’-引物(B)(SEQ ID No.2)5’-CCGCTCGAGTCACTCTTCCCCCTCTCTCAAAAC-3’，它相當(dāng)于帶有Xho I位點的MAGE-3基因的921-945位多核苷酸序列。通過使用下列引物對的PCR擴(kuò)增來產(chǎn)生來源于人RANTES基因的附加的信號前導(dǎo)序列5’-引物(C)(SEQ ID No.3)5’-ACGCGTCGACATGAAGGTCTCCGCGGCAGCCCTCGCTGTCATCCTCATTGCTACTGCCCTCTGCGCTCCTGCATCTGCCATGCCTCTTGAGCAGAGGAGTCAG-3’，它相當(dāng)于RANTES信號前導(dǎo)序列且相當(dāng)于帶有Sal I位點的MAGE-3基因的1-24位多核苷酸序列；和3’-引物(B)。通過使用5’-引物-C和3’-引物(D)的PCR來產(chǎn)生不含終止密碼子的信號-MAGE-3片段(s-MAGE-3)(SEQID No.4)5’-ATAAGAATGCGGCCGCTCTCTTCCCCCTCTCTCAAAAC-3’，它相當(dāng)于帶有Not I位點的MAGE-3的921-942位多核苷酸序列。屬于最有效的APCs的DCs表達(dá)IgG Fc受體(FcγRs)，它介導(dǎo)有效結(jié)合在MHC-II和MHC-I上的抗原的特許抗原攝入途徑。因此，將來源于可有效與鼠DCs上的Fc受體結(jié)合的人IgGla的Fc片段cDNA與修飾的MAGE-3基因進(jìn)行符合讀框的融合以便通過DCs介導(dǎo)MAGE-3的攝入(附圖9A)。然后將分泌性MAGE-3融合基因(s-MAGE-3-Fc)克隆入鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pFB-Neo(Stratagene)(附圖9A)。通過應(yīng)用含有人IgGla重鏈cDNA的質(zhì)粒pEE6/CLL-1作為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)生人IgG cDNA Fc片段。用于PCR反應(yīng)的引物對是5’-引物(E)，(SEQ ID No.5)5’-ATAAGCGGCCGCTAAAACTCACACATGCCCA-3’，它相當(dāng)于帶有附加Not I位點的重鏈的785-802位多核苷酸序列；和3’-引物(F)(SEQ IDNo.6)5’-CCGCTCGAGTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3’，它相當(dāng)于帶有Xho I位點的重鏈的1447-1468位多核苷酸序列。將鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pFB-Neo(Stratagene)用于本研究。通過對不含終止密碼子的s-MAGE-3片段、Fc和Sal I/Xho I切割的pFB-Neo進(jìn)行三段連接來構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體s-MAGE-3-Fc。通過分別將s-MAGE-3或MAGE-3基因插入Sal I/Xho I切割的pFB-Neo來構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體s-MAGE-3或MAGE-3。為了構(gòu)建IgG Fc表達(dá)載體，通過兩次PCR反應(yīng)將人IgGFc cDNA片段與免疫球蛋白重鏈(VH)信號前導(dǎo)序列連接。在第一次PCR反應(yīng)中，將IgG Fc cDNA用作應(yīng)用下列引物對進(jìn)行擴(kuò)增的模板5’引物，(SEQ ID No.7)5’-GCAGCTCCCAGATGGGTCCTGTCCAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCAC-3’，它相當(dāng)于重鏈的785-815位多核苷酸序列和部分VH-前導(dǎo)序列；和3’-引物F(SEQ ID No.6)。應(yīng)用第一次PCR產(chǎn)物作為模板的第二次PCR使用下列引物對進(jìn)行5’引物，(SEQ ID No.8)5’-ACGCGTCGACATGGGAACATCTGTGGTTCTTCCTTCTCCTGGTGGCAGCTCCCAGATGGGTCCTGTCC-3’，它相當(dāng)于帶有附加Sal I位點的VH-分泌信號前導(dǎo)序列的N-末端多核苷酸序列和；和3’-引物F(SEQ ID No.6)。然后將帶有信號前導(dǎo)序列的Fc cDNA克隆入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。通過將MAGE-3插入XhoI/XbaI-切割的pcDNA3.1(Invitrogen)來構(gòu)建表達(dá)載體pcDNA3.1-MAGE-3。還構(gòu)建了表達(dá)天然胞內(nèi)MAGE-3、分泌性s-MAGE-3或分泌性Fc片段的幾種對照逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(附圖9A)。通過限制酶分析鑒定所得的各載體并通過DNA測序來進(jìn)一步證實。
實施例8逆轉(zhuǎn)錄病毒的生產(chǎn)和骨髓衍生的DC的轉(zhuǎn)導(dǎo)通過瞬時轉(zhuǎn)染生產(chǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。將包裝細(xì)胞(PA317)在裝有含10％加熱失活的FBS(Gibco-BRL)的DMEM的100-mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)并用通過使用Lipofectin生產(chǎn)的不含內(nèi)毒素的QIAGEN試劑盒(Gibco-BRL)制備的10-15μg逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒(來自實施例7，即胞內(nèi)MAGE-3、分泌性s-MAGE-3或分泌性Fc片段)轉(zhuǎn)染。在培養(yǎng)過夜后，用含有5％FBS的DMEM替換所述培養(yǎng)基。48小時后，如上所述收集含有重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的培養(yǎng)基并過濾(0.22μm)(Chen等，1997)。為了產(chǎn)生DCs，從小鼠肢體骨中沖洗出骨髓細(xì)胞，使之通過尼龍篩網(wǎng)并用氯化銨排空紅細(xì)胞。在用RPMI-1640充分洗滌后，在37℃下用家兔補(bǔ)體(Calbiochem)和由抗-CD4、抗-CD8、抗-CD45R/B220和抗-MHC-II組成的單克隆抗體混合物(PharMingen and BioSourceInternational)在RPMI-1640中將所述細(xì)胞培養(yǎng)40-60分鐘。在用RPMI-1640充分洗滌后，將在補(bǔ)充了6％FBS、80ng mSCF/ml(R&DSystem)和20個單位(U)mIL-6/ml(BioSource International)的RPMI-1640中的細(xì)胞(5×105個細(xì)胞/ml)平板固定在12孔培養(yǎng)平板(2.5ml/孔)中，在37℃和5％CO2下培養(yǎng)過夜且然后向其中重新加進(jìn)新鮮培養(yǎng)基。在進(jìn)行48小時培養(yǎng)后，使所述細(xì)胞充分旋轉(zhuǎn)，重新懸浮在1.5ml的逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液中，以10-20ng/ml的濃度平板固定在包被了逆轉(zhuǎn)錄柄蛋白(PanVera)的24孔培養(yǎng)平板上并在37℃和5％CO2下培養(yǎng)3-4小時。接著用補(bǔ)充了5％FBS、10ng鼠干細(xì)胞因子(mSCF)/ml、60ng mGN-CSF/ml(BioSource International)和100UmIL-4/ml(R&D Systems)替換上清液過夜。將轉(zhuǎn)導(dǎo)過程重復(fù)2-3次且通過該過程通常轉(zhuǎn)導(dǎo)了約30％的BM細(xì)胞。在最終的轉(zhuǎn)導(dǎo)后，洗滌細(xì)胞并在含有mGM-CSF和mIL-4的Opti-MEM(Gibco-BRL)中培養(yǎng)幾天以便使DC進(jìn)一步分化。如上所述使用50％FCS-RPMI-1640沉降過程進(jìn)一步富集DCs(Inaba等，1992)。
在培養(yǎng)幾天后，細(xì)胞的主要級分顯示出不同的DC形態(tài)。正如通過逆轉(zhuǎn)錄(RT)-PCR測定試驗所證實的，轉(zhuǎn)導(dǎo)DCs中的s-MAGE-3-Fc、s-MAGE-3、MAGE-3或Fc基因得到了轉(zhuǎn)錄。將定量蛋白質(zhì)印跡分析用于證實蛋白質(zhì)通過轉(zhuǎn)導(dǎo)DCs中的構(gòu)建體的表達(dá)和分泌。簡單地說，在冰上用緩沖液(Boehringer Mannheim)(10mM Tris 150mM NaCl(pH7.4)、1％TX-100(Sigma)、0.5mM PMSF和蛋白酶抑制劑混合物片)將轉(zhuǎn)導(dǎo)的DCs裂解10分鐘。然后用針對MAGE-3的家兔多克隆抗體沉淀細(xì)胞裂解物和培養(yǎng)基，隨后用蛋白質(zhì)A-瓊脂糖(Sigma)培養(yǎng)。接著將沉淀物重新懸浮于20μl加樣緩沖液中。將蛋白質(zhì)樣品(20μl)上10％SDS-PAGE凝膠并轉(zhuǎn)移到Hybond PVDF膜(Amersham PharmacialBiotech)上，在4℃下通過在含有5％脫脂奶粉(Carnation)和0.1％(v/v)Tween-20(Fisher Scientific)的PBS(pH7.5)中過夜培養(yǎng)將該膜封閉。在用緩沖液(含有0.1％(v/v)Tween-20的PBS)洗滌后，在室溫下將該膜用針對在含有2.5％脫脂奶粉和0.1％Tween-20(1∶400)的PBS緩沖液中稀釋的MAGE-3的小鼠單克隆抗體培養(yǎng)1小時。在洗滌后，在室溫下將該膜用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗小鼠IgG(Amersham Pharmacial Biotech)在緩沖液(1∶10,000)中培養(yǎng)1小時。在最終的洗滌后，用ECL+化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(AmershamPharmacial Biotech)使該膜顯影并在Kodak膠片上曝光。測定膠片上蛋白質(zhì)印跡的蛋白質(zhì)帶強(qiáng)度并通過帶有Image-Quant 1.2版本軟件的Phosphor Imager(Molecular Dynamics)進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)有效地產(chǎn)生了s-MAGE-3-Fc和s-MAGE-3蛋白質(zhì)且它們分泌自DCs，而MAGE-3保留在胞內(nèi)(附圖9B和9C)。在轉(zhuǎn)導(dǎo)的DCs中表達(dá)了相差無幾水平的s-MAGE-3-Fc、s-MAGE-3和MAGE-3蛋白質(zhì)。
實施例9Fc對DC的相互作用Fc與DCs上FcγRs的相互作用引發(fā)細(xì)胞活化，從而導(dǎo)致對抗原呈遞中所涉及的細(xì)胞表面分子的增量調(diào)節(jié)。檢驗表面標(biāo)記以便評價轉(zhuǎn)導(dǎo)的DCs中s-MAGE3-Fc的表達(dá)是否可以誘發(fā)DC活化。通過流式細(xì)胞測定法測定用s-MAGE-3-Fc、s-MAGE-3或載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的DCs的表面標(biāo)記。簡單地說，在4℃下用阻斷FcγRs的抗-CD16/CD32抗體(2.4G2，PharMingen)將DCs預(yù)培養(yǎng)30-60分鐘。然后在4℃下用初次抗體將DCs培養(yǎng)30分鐘，隨后用抗小鼠或抗家兔IgG-FITC綴合物進(jìn)行培養(yǎng)。在充分洗滌后，通過帶有CellQuest軟件的FACScan(BectonDickinson)分析DCs。正如附圖9D、9E和9F中所示，在來源于用s-MAGE-3-Fc轉(zhuǎn)導(dǎo)的BM細(xì)胞的DCs上和在有LPS存在的情況下的DCs上表達(dá)的MHC II型、CD40和CD86的水平高于在用s-MAGE-3或載體對照品轉(zhuǎn)導(dǎo)的DCs上表達(dá)的MHC II型、CD40和CD86的水平。這些結(jié)果提示融合蛋白Fc的分泌和隨后的與FcγRs相互作用激活DCs。
實施例10體內(nèi)有效TH1的誘導(dǎo)為了評價MAGE-3的分泌和隨后的攝入是否可以促進(jìn)這種抗原在體內(nèi)的免疫原性，將DCs用s-MAGE-3-Fc、s-MAGE-3、MAGE-3或Fc通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)且然后通過靜脈注射給C57BL/6小鼠一次(溶于30μl含有50,000U IL-2(chiron)的PBS的0.5-1×105DC/小鼠)。在免疫接種4-6周后，處死小鼠并收集外周血液、脾臟和其它組織樣品。免疫接種了s-MAGE-3-Fc-DCs的小鼠體內(nèi)的淋巴結(jié)基本上擴(kuò)大，對此可以考慮病原體感染，而在給予了用s-MAGE-3、MAGE-3或Fc轉(zhuǎn)導(dǎo)的DCs的小鼠體內(nèi)沒有出現(xiàn)這種情況。
為了確定免疫接種轉(zhuǎn)導(dǎo)的DCs是否可以誘發(fā)CD4+輔助T細(xì)胞的反應(yīng)，從免疫接種小鼠的脾細(xì)胞中分離CD4+T-細(xì)胞且然后將它們與骨髓(BM)衍生的用s-MAGE-3-Fc轉(zhuǎn)導(dǎo)的DCs一起共培養(yǎng)。簡單地說，使用CD4+或CD8+T-細(xì)胞富集柱(R&D System)從脾細(xì)胞混懸液中分離CD4+或CD8+ T-細(xì)胞且然后在進(jìn)一步分析前在補(bǔ)充了10％FBS的RPMI-1640中培養(yǎng)24-48小時。在37℃下將來自免疫接種小鼠的排空的淋巴結(jié)用0.1％DNA酶I(級分IX，Sigma)和1mg/ml膠原酶(RocheMolecular Biochemicals)的混合物消化40-60分鐘。使用抗CD11c(N418)Micro-Beads(Miltenyi Biotec Inc)從淋巴結(jié)或脾的細(xì)胞混懸液中確切分離DCs以便進(jìn)一步研究。在以CD4+ T-細(xì)胞與DCs的不同比例共培養(yǎng)2周的過程中，來自免疫接種了s-MAGE-3-DCs、MAGE-3-DCs或Fc-DCs的小鼠的CD4+T-細(xì)胞沒有活躍地增殖且在共培養(yǎng)基中僅檢測到了低水平的IL-2、IFN-γ、TNF-α和IL-4(附
圖10A、10B、10C和10D)。將來自免疫接種小鼠的CD4+T-細(xì)胞與DCs按1000∶1的比例(T細(xì)胞∶DC，2×105∶2×102)一起共培養(yǎng)不同的時間。收集共培養(yǎng)物中的上清液且隨后通過ELISA、按照制造商的說明(PharMingen)檢測細(xì)胞因子濃度。相反，在與來自免疫接種了s-MAGE-3-Fc-DCs的小鼠的CD4+ T-細(xì)胞的共培養(yǎng)過程中，甚至僅在按1∶1000(DC∶T-細(xì)胞)比例共培養(yǎng)48小時后在共培養(yǎng)基中檢測到了高水平的IL-2和IFN-γ。抗-CD4而非抗-CD8抗體通過共培養(yǎng)的細(xì)胞阻斷了細(xì)胞因子的產(chǎn)生(附
圖11A)。重復(fù)實驗顯示出了相似的結(jié)果。為了進(jìn)一步測定T-細(xì)胞反應(yīng)的特異性，將用表達(dá)無關(guān)乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的BM衍生的DCs與來自s-MAGE-3-Fc-DCs免疫接種小鼠的CD4+T-細(xì)胞一起共培養(yǎng)。在共培養(yǎng)基中僅檢測到了低水平的IFN-γ和其它細(xì)胞因子(附
圖11B)。此外，使用抗-CD11c微珠(Miltenyi Biotec Inc.)分離來自免疫接種后6周小鼠淋巴結(jié)的DCs并將其與來自相同免疫接種小鼠的CD4+ T-細(xì)胞一起共培養(yǎng)。正如附
圖12A、12B、12C和12D中所示，僅在來自s-MAGE-3-Fc-DCs免疫接種小鼠的細(xì)胞共培養(yǎng)物中檢測到了高水平的IL-2、IFN-γ和TNF-α。這些結(jié)果表明用s-MAGE-3-Fc轉(zhuǎn)導(dǎo)的Dcs可以返回到淋巴樣器官或組織中且比用天然MAGE-3或s-MAGE-3轉(zhuǎn)導(dǎo)的DCs更有效地激活Th1反應(yīng)。
實施例11體內(nèi)CTLs的誘導(dǎo)進(jìn)行JAM或“合理的另一種方法”試驗以便測定免疫接種了s-MAGE-3-Fc-DCs是否可以誘發(fā)強(qiáng)CTL反應(yīng)。將JAM試驗用于測定細(xì)胞毒性活性。簡單地說，在免疫接種后的不同時間點處死小鼠并在RPMI1640 10％FBS中培養(yǎng)脾細(xì)胞的單細(xì)胞混懸液。在37℃下在5％CO2中在24-孔平板(Costar)內(nèi)將總計4×106個脾細(xì)胞用8×104γ-照射的(10,000拉德)同源的EL4-MAGE-3細(xì)胞或EL4-HBcAg細(xì)胞/2ml重新刺激4-6天、收集且然后重新懸浮至1×107個細(xì)胞/ml。為了標(biāo)記靶細(xì)胞，以2μCi/ml的終濃度將3H-胸苷加入到5×105/ml EL4-MAGE-3或EL4-HBcAg細(xì)胞中。在進(jìn)行6小時培養(yǎng)后，將所述細(xì)胞用PBS溫和洗滌一次并重新懸浮于培養(yǎng)基中(1×105個細(xì)胞/ml)。然后在37℃下在96孔圓底平板(200μl/孔)中將不同數(shù)量的效應(yīng)細(xì)胞與恒定數(shù)量的靶細(xì)胞(1×104/孔)一起共培養(yǎng)4小時，此后將細(xì)胞及其培養(yǎng)基抽吸到纖維玻璃濾膜(Filter Mate Harvester，Packard)上，然后將該濾膜用水充分洗滌。在將該濾膜干燥并置于96孔平板上后，向各孔中加入25μl MicroScint 20(Packard)。在TopCount NXT微量平板閃爍和發(fā)光計數(shù)器(Packard)中對平板進(jìn)行計數(shù)。在一些實驗中，用抗-CD4或抗-CD8抗體(30μl/孔，PharMingen)將重新刺激的效應(yīng)細(xì)胞群體培養(yǎng)30-60分鐘以便在細(xì)胞毒性測定試驗前排空CD4+或CD8+T-細(xì)胞。將特異性殺滅百分比定義為(在沒有T-細(xì)胞存在情況下保留的靶細(xì)胞DNA(自發(fā))-在有T-細(xì)胞存在情況下保留的靶細(xì)胞DNA)/保留的自發(fā)DNA×100?？?H-胸苷摻入值通常與自發(fā)保留值相似。在體外在RPMI-1640、10％FBS中用同源細(xì)胞EL4-MAGE-3重新刺激來自免疫接種小鼠的脾細(xì)胞且然后將它們與3H-胸苷標(biāo)記的EL4-MAGE-3細(xì)胞按不同的效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞比例一起共培養(yǎng)以便測定特異性殺滅率。通過用MAGE-3表達(dá)載體(pcDNA3.1-MAGE-3)轉(zhuǎn)染和Zeocin(Invitrogen)選擇確定EL4-MAGE-3細(xì)胞且證實它們可通過PCR和免疫沉淀測定法表達(dá)MAGE-3。
來自免疫接種s-MAGE-3-Fc-DCs的小鼠的脾細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺滅比來自免疫接種s-MAGE-3、MAGE-3或Fc的小鼠的那些脾細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺滅更為有效(附
圖13)。通過s-MAGE-3-Fc-DCs-免疫接種小鼠脾細(xì)胞沒有能力殺滅表達(dá)無關(guān)HBcAg的EL4-HBcAg細(xì)胞(附
圖13)并通過使用抗-CD8而非抗-CD4抗體對殺滅的抑制進(jìn)一步證實了殺滅的特異性。因此，這些結(jié)果證明了s-MAGE-3-Fc-DCs誘發(fā)CTL反應(yīng)的優(yōu)良能力，這是由于TH1增強(qiáng)和受體介導(dǎo)的抗原攝入交叉致敏所導(dǎo)致的。
實施例12抗體的誘導(dǎo)由于抗體還在抗腫瘤免疫性方面起作用，所以通過ELISA測定免疫接種小鼠血清中的抗-MAGE-3的抗體滴度(類似于實施例10)。通過ELISA檢測免疫接種小鼠血清中的抗-MAGE-3抗體。簡單地說，在室溫下在封閉緩沖液(KPL，Gathersburg，MD)中用連續(xù)稀釋的血清將包被了重組MAGE-3蛋白質(zhì)(各50ng/孔)的微量滴定平板(Dynatech)培養(yǎng)2小時。在用針對封閉緩沖液中稀釋的小鼠IgG(Sigma)的過氧化物酶接合的抗體培養(yǎng)后檢測結(jié)合的抗體。將抗MAGE-3的單克隆抗體用作陽性對照并將正常小鼠血清用作陰性對照。將抗體滴度定義為使用大于0.2的ODA450得到的最高稀釋度。正常小鼠血清的背景ODA450低于0.1。在DC免疫接種后2周誘導(dǎo)抗-MAGE-3抗體且在免疫接種后4-6周達(dá)到峰值。
正如附
圖14中所示，在s-MAGE-3-Fc-DC免疫接種小鼠血清中檢測到的抗-MAGE-3抗體的滴度顯著高于在免疫接種了s-MAGE-3-DCs或MAGE-3-DCs小鼠血清中檢測到的抗-MAGE-3抗體的滴度。通過缺乏抗免疫接種小鼠體內(nèi)無關(guān)HBcAg的抗體來證實抗體反應(yīng)的特異性。這些發(fā)現(xiàn)的結(jié)果共同表明s-MAGE-3-Fc-DCs在誘導(dǎo)CD4+Th、CD8+CTL和B-細(xì)胞反應(yīng)方面優(yōu)于MAGE-3-DCs或s-MAGE-3-DCs。
實施例13輔助T-細(xì)胞增強(qiáng)的相互作用就DCs上的MHC-II而言識別其特異性肽類的致敏的CD4+TH顯著增加了它們與條件DCs的相互作用。這種通過CD40-CD40L的相互作用可以引起DC產(chǎn)生IL-12且對于生成CTL反應(yīng)的T-細(xì)胞輔助細(xì)胞來說是關(guān)鍵的。為了測試這種手段是否可以增強(qiáng)CD4+TH與s-MAGE-3-Fc-DCs的相互作用，測定在與致敏的CD4+T-細(xì)胞的共培養(yǎng)物中通過轉(zhuǎn)導(dǎo)的DCs產(chǎn)生的IL-12。從免疫接種了s-MAGE-3-Fc-DCs的小鼠體內(nèi)分離致敏的CD4+T-細(xì)胞且然后將它們與用s-MAGE-3-Fc、s-MAGE-3、s-MAGE-3或Fc轉(zhuǎn)導(dǎo)的BM衍生的DCs一起共培養(yǎng)。正如附
圖15中所示，在CD4+T-細(xì)胞與s-MAGE-3-Fc-DCs的共培養(yǎng)物中觀察到了IL-12的產(chǎn)生顯著增加，而在與s-MAGE-3-Fc或s-MAGE-3-DCs的共培養(yǎng)物中沒有觀察到這種情況。在致敏的CD4+T-細(xì)胞上通過用CD40L阻斷來抑制通過s-MAGE-3-Fc-DCs產(chǎn)生IL-12。Fc在DCs中的表達(dá)在較低的程度上也非特異性地強(qiáng)化IL-12的產(chǎn)生。這些結(jié)果與實施例10、11和12數(shù)據(jù)的體內(nèi)結(jié)果一起表明MAGE-3的分泌和隨后FcγRs-介導(dǎo)的攝入導(dǎo)致MAGE-3在DCs上交叉呈遞以便誘導(dǎo)TH1和CTL反應(yīng)。
實施例14
由s-MAGE-3-Fc-DCs誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫為了檢驗抗-MAGE-3免疫反應(yīng)的強(qiáng)化是否能夠?qū)е掠行У目鼓[瘤免疫性，進(jìn)行攻擊實驗。EL4-MAGE-3細(xì)胞系來源于在同源小鼠體內(nèi)快速生長的親本腫瘤EL-4系并將它們用于攻擊實驗。當(dāng)皮內(nèi)植入同源C57BL/6小鼠時，EL4-MAGE-3細(xì)胞(0.5-1×106個細(xì)胞)顯示出類似于親本EL-4細(xì)胞的侵害性腫瘤生長，從而僅在接種后3-5天在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生肉眼可見的腫瘤并通常在接種后1個月導(dǎo)致小鼠死亡。為了測試s-MAGE-3-Fc-DCs抑制EL4-MAGE-3腫瘤生長的能力，給小鼠以靜脈注射的方式免疫接種2次(間隔7天)用s-MAGE-3-Fc、s-MAGE-3、s-MAGE-3或Fc轉(zhuǎn)導(dǎo)的1×105DCs，隨后用EL4-MAGE-3細(xì)胞攻擊(1×106)。通過在第0天和第7天靜脈注射給C57BL/6小鼠免疫接種1×105轉(zhuǎn)導(dǎo)的DCs且然后在第二次免疫接種后1周用1×106呈指數(shù)生長的EL4-MAGE-3或EEL4-HBcAg細(xì)胞以皮內(nèi)方式進(jìn)行攻擊。每隔2-3天測量一次腫瘤大小，其中如下計算腫瘤體積(最長直徑)×(最短直徑)2。
正如附
圖16A中所示，盡管免疫接種s-MAGE-3-DCs、MAGE-3-DCs、s-MAGE-3乃至Fc-DCs(非特異性免疫刺激劑)確實產(chǎn)生了一定程度的保護(hù)作用，但是在免疫接種了s-MAGE-3-Fc-DCs的小鼠體內(nèi)將腫瘤生長抑制到極高的程度。由這些構(gòu)建體顯示出的抗腫瘤活性的效能與其誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的能力相關(guān)。免疫接種s-MAGE-3-DCs的小鼠的存活時間始終顯著長于免疫接種其它載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的DCs的小鼠的存活時間(附
圖16B)。由s-MAGE-3-Fc-DCs誘導(dǎo)的抗腫瘤活性是特異性的，這是因為免疫接種s-MAGE-3-Fc-DCs并用野生型EL4或EL4-HBcAg細(xì)胞攻擊的小鼠發(fā)展成了致命的腫瘤并在1個月內(nèi)死亡。S-MAGE-3-Fc-DCs還部分抑制了小鼠體內(nèi)建立的EL4-MAGE-3腫瘤的生長，不過，該免疫系統(tǒng)在這種模型中可能不具有有效控制致命性腫瘤快速生長的足夠反應(yīng)時間。
實施例15
HBe抗原在哺乳動物表達(dá)載體中的構(gòu)建編碼全長HBV(adw亞型)基因組的質(zhì)粒獲自美國典型培養(yǎng)保藏中心(ATCC)。發(fā)現(xiàn)HBV前核心/核心基因含有單一堿基對缺失，它造成在79位密碼子上移碼，從而產(chǎn)生84和85位上的兩個連續(xù)的終止密碼子。通過使用PCR誘變插入缺失的堿基來修復(fù)該基因并通過DNA測序來證實。通過使用下列引物對對修復(fù)的HBV基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增來產(chǎn)生全長HBeAg基因(5’-引物(P-A)(SEQ ID No.9)5’-TTAAGCTTATGCAACTTTTTCACCTCTGCCTAATC-3’，它相當(dāng)于帶有附加HindIII限制位點的HBV基因組的1904-2020位多核苷酸序列；和3’-引物(P-B)(SEQ ID No.10)5’-TTTCTAGFAATCGATTAACATTGAGATTCCCGAGA-3’，它相當(dāng)于帶有Xba I和Cla I位點的HBV基因組的2437-2457位多核苷酸序列。通過使用下列引物對的PCR擴(kuò)增來產(chǎn)生帶有缺失的在病毒感染過程中裂解的富含精氨酸的HBeAg的C’-末端序列(aa 150-185)的截短的HBeAg基因(5’-引物(P-A)(SEQ ID No.9)和3’-引物(SEQ ID No.11)5’-GTGCGGCCGC TCTAACAACAGTAGTTTCCGGAAGTGT-3’，它相當(dāng)于帶有附加Not I限制位點的HBV基因組的2324-2350位多核苷酸序列。通過使用下列引物對的PCR擴(kuò)增來產(chǎn)生全長HBcAg基因(5’-引物(SEQID No.12)5’-TTAAGCTTATGGACATTGACCCTTATAAAGAATTTGGAGC-3’，它相當(dāng)于帶有附加HindIII限制位點的HBV基因組的1901-1932位多核苷酸序列；和引物P-B(SEQ ID No.10)。通過使用含有人IgG重鏈cDNA的質(zhì)粒pEE6/CLL-1作為模板的PCR擴(kuò)增來產(chǎn)生人IgG cDNA Fc片段。用于PCR反應(yīng)的引物對是5’-引物(SEQ ID No.13)5’-ATAAGCGGCCGCTAAAACTCACACATGCCCA-3’，它相當(dāng)于帶有附加Not I位點的重鏈的785-802位多核苷酸序列；和3’-引物(P-C)(SEQ IDNo.14)5’-TATTCTAGATCGATCACTCATTTACCCGGAGACAGG-3’，它相當(dāng)于帶有Cla I位點的重鏈的1447-1468位多核苷酸序列。將pRc/CMV載體(Invitrogen)用于本研究。通過三段連接截短的HBe片段、IgG Fc和HindIII/Cla I切割的pRc/CMV載體來構(gòu)建表達(dá)載體HBe-Fc，它表達(dá)由與IgG Fc進(jìn)行符合讀框的融合的截短的HBeAg組成的分泌性HBe-Fc融合蛋白。通過將HBeAg基因插入HindIII/Cla I切割的pRc/CMV載體來構(gòu)建表達(dá)分泌性HBeAg蛋白的表達(dá)載體HBeAg。通過將HBcAg基因插入HindIII/Cla I切割的pRc/CMV載體來構(gòu)建表達(dá)胞質(zhì)HBcAg蛋白的表達(dá)載體HBcAg。為了構(gòu)建IgG Fc表達(dá)載體，通過兩次PCR反應(yīng)將人IgG Fc cDNA片段與小鼠VH信號前導(dǎo)序列連接。在第一次PCR反應(yīng)中，將IgG Fc cDNA用作使用下列引物對進(jìn)行擴(kuò)增的模板(5’-引物(SEQ ID No.15)5’-GCAGCTCCCAGATGGGTCCTGTCCAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCAC-3’，它相當(dāng)于重鏈和部分VH-前導(dǎo)序列的785-815位多核苷酸序列；和3’-引物(P-C)(SEQ ID No.14))。應(yīng)用第一次PCR產(chǎn)物作為模板的第二次PCR使用下列引物對進(jìn)行(5’引物，(SEQ ID No.16)5’-TTAAGCTTCATATGGGAACATCTGTGGTTCTTCCTTCTCCTGGTGGCAGCTCCCAGATGGGTCCTGTCC-3’，它相當(dāng)于帶有附加HindIII和NdeI位點的VH-前導(dǎo)序列的N-末端多核苷酸序列和；和3’-引物P-C(SEQ ID No.14))。然后將帶有前導(dǎo)序列的Fc cDNA克隆入HindIII/ClaI切割的-pRc/CMV載體。通過限制酶分析來鑒定這些得到的載體并通過DNA測序來證實。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌菌株(XL-1藍(lán))并在37℃和有50μg/ml氨芐西林存在的情況下使其從單菌落開始生長16-20小時。使用不含內(nèi)毒素的純化試劑盒(Qiagen)、按照標(biāo)準(zhǔn)方案分離DNA。將DNA重新懸浮于不含內(nèi)毒素的PBS(Sigma)中至終濃度為1mg/ml。OD260/280之比在1.8-2.0的范圍。將DNA儲存在-200℃下并在免疫接種的該天之前通過限制消化來分析。
將來源于人IgG1a的Fc片段用作細(xì)胞結(jié)合元件以便促進(jìn)模型HBV核殼蛋白的攝入，這是由于DCs表達(dá)IgG Fc受體(FcγRs)的結(jié)果，該受體介導(dǎo)用于與MHC-II和I-有效結(jié)合的抗原呈遞的特定抗原攝入途徑。盡管HBcAg和HBeAg由HBV前C/C基因編碼，但是分泌性HBeAg蛋白從HbcAg起始密碼子上游的29個殘基的起始密碼子開始。HBeAg以符合讀框的形式與人IgGla Fc片段cDNA基因融合且然后被克隆入pRc/CMV。IgGla Fc片段可以有效地與小鼠APCs上的Fc受體結(jié)合。構(gòu)建含有HBeAg基因(分泌性)、帶有分泌信號前導(dǎo)序列的Fc片段(分泌性)或HBcAg基因(胞質(zhì))的對照載體(附
圖18)。使鼠骨髓DCs產(chǎn)生。簡單地說，在補(bǔ)充了6％的FBS、60ng mHM-CSF/ml和100UmIL-4/ml的RPMI-1640中將骨髓干細(xì)胞培養(yǎng)4天。然后在含有重組HBeAg(100μg/ml)和HBcAg(100μg/ml)蛋白(American ResearchProducts，Boston，MA)的混合物的培養(yǎng)基中將DCs再培養(yǎng)4天。將脈沖的DCs(PDCs)用1×PBS以1000rpm洗滌2次、持續(xù)5分鐘并重新懸浮于RPMI 1640中以便進(jìn)一步分析。通過使用放射性標(biāo)記和免疫沉淀/SDS-聚丙烯酰胺凝膠分析(PAGE)發(fā)現(xiàn)有效地產(chǎn)生了HBeAg-Fc蛋白(HBe-Fc)且它們分泌自轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(附
圖19A)。通過蛋白質(zhì)A珠直接沉淀胞內(nèi)和分泌的HBe-Fc，這表明融合蛋白保留了其對蛋白質(zhì)A的結(jié)合能力。
實施例16TH1、輔助T-細(xì)胞通過HBe-Fc DNA疫苗的體內(nèi)誘導(dǎo)給小鼠免疫接種以便評價這種體內(nèi)策略。將C57BL/6或BALB/c小鼠分成4組并且通過肌內(nèi)注射一次100μg(25-50μg(μl)/四頭肌)HBcAg、HBeAg、Fc或HBeAg-Fc DNA給各只小鼠進(jìn)行免疫接種。在免疫接種2-4周后，處死小鼠并采集外周血液、脾臟和其它組織樣品。
首先，用重組HBe/cAg蛋白將來自免疫接種DNA疫苗后2-4周小鼠的脾細(xì)胞重新刺激5天。從重新刺激的脾細(xì)胞中分離T-細(xì)胞且然后通過使用3-胸苷結(jié)合測定試驗進(jìn)行評價。正如附圖20中所示，來自免疫接種HBe Fc構(gòu)建體或HBe-Fc DNA疫苗致敏的T細(xì)胞的小鼠的T細(xì)胞增殖活躍。相反，來自免疫接種HBeAg、HBcAg或Fc DNA疫苗或HBeAg、HBcAg或Fc DNA疫苗致敏的T細(xì)胞的小鼠的T細(xì)胞沒有顯示出活躍地增殖。
類似于實施例5，將來自免疫接種小鼠的CD4+T-細(xì)胞與使用重組HBeAg和HBcAg脈沖的DCs一起共培養(yǎng)。在與不同比例的T-細(xì)胞與DCs的6天共培養(yǎng)過程中，來自免疫接種HBeAg、HBcAg或Fc構(gòu)建體的小鼠的CD4+ T-細(xì)胞沒有顯示出活躍地增殖且在共培養(yǎng)基中僅檢測到了低濃度的IL-2和IFN-γ(附圖21A和附圖21B)。相反，在與來自免疫接種HBe-Fc構(gòu)建體的小鼠的CD4+ T-細(xì)胞的共培養(yǎng)中，CD4+ T-細(xì)胞僅在甚至以1∶1000(DC∶T-細(xì)胞)比例的48小時共培養(yǎng)后也活躍地增殖。此外，共培養(yǎng)基中的IL-2和IFN-γ濃度顯著高于在與來自給予了HBeAg或HBcAg構(gòu)建體的小鼠的CD4+ T-細(xì)胞的共培養(yǎng)物中的IL-2和IFN-γ濃度(附圖21A和附圖21B)?？?CD4而非抗-CD8抗體通過共培養(yǎng)的細(xì)胞顯著阻斷了這些細(xì)胞因子的產(chǎn)生(附圖21C和附圖21D)。此外，以平行方式將一種無關(guān)抗原即重組HBsAg蛋白(AmericanResearch Products，Boston，MA)用于與HBe/cAg一起脈沖DCs。HBsAg脈沖的DCs不能在所述試驗中刺激HBe-Fc構(gòu)建體免疫接種小鼠的CD4+T-細(xì)胞，從而證明了由HBe-Fc構(gòu)建體免疫接種誘發(fā)的CD4+T輔助1細(xì)胞反應(yīng)的特異性。這些結(jié)果表明HBe-Fc構(gòu)建體可以比HBeAg或HBcAg構(gòu)建體更為有效地激活TH1。在任何實驗中沒有檢測到顯著濃度的IL-4。由此IL-2和IFN-γ主要由TH1細(xì)胞產(chǎn)生。該結(jié)果表明HBe-Fc構(gòu)建體誘發(fā)TH1反應(yīng)。
實施例17體內(nèi)CTLs的誘導(dǎo)為了測定免疫接種HBe-Fc構(gòu)建體是否可以誘發(fā)CTL反應(yīng)，與實施例11類似進(jìn)行JAM試驗。在含有合成肽HBcAg13-27的培養(yǎng)基中將來自不同免疫接種小鼠的脾細(xì)胞在體外重新刺激4-6天且然后與3H-標(biāo)記的肽(HBcAg13-27)脈沖的靶細(xì)胞EL-4(H-2b)和p815(H-2d)按不同效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞比例一起共培養(yǎng)以便測定靶細(xì)胞的殺滅率。正如附圖22中所示，來自免疫接種HBe-Fc構(gòu)建體的小鼠的脾細(xì)胞顯示出對靶細(xì)胞的殺滅顯著高于來自免疫接種HBeAg或HBcAg的小鼠的那些脾細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺滅率。通過這些脾細(xì)胞沒有能力殺滅帶有H-2d背景的HBcAg脈沖的p815靶細(xì)胞并通過抗-CD8而非抗-CD4抗體對殺滅率的抑制來證實了殺滅的特異性。此外，還將HBsAg用于重新刺激來自HBe-Fc構(gòu)建體免疫接種小鼠的脾細(xì)胞且沒有觀察到通過HBsAg-再刺激的脾細(xì)胞可顯著殺滅HBcAg-脈沖的靶細(xì)胞。由HBe-Fc構(gòu)建體誘發(fā)的優(yōu)良細(xì)胞毒性反應(yīng)是由于T輔助1增強(qiáng)和由DCs對攝入的HBe-Fc融合蛋白進(jìn)行直接的MHC-I型呈遞所導(dǎo)致的。
實施例18抗體的誘導(dǎo)為了測定HBe-Fc-DC的免疫接種是否可以誘發(fā)抗體反應(yīng)，與實施例6類似在收集的免疫接種了不同載體的小鼠血清中測定抗-HBe/cAg的抗體滴度。正如附圖23中所示，在免疫接種HBe-Fc構(gòu)建體的小鼠血清中檢測到了抗-HBe/cAg抗體。通過缺乏抗免疫接種小鼠體內(nèi)HBsAg的抗體來證實抗體反應(yīng)的特異性。相反，在免疫接種HBeAg或HBcAg構(gòu)建體的小鼠體內(nèi)檢測到了顯著低的抗體滴度(附圖23)。這些結(jié)果共同表明HBe-Fc DNA在誘發(fā)CD4+T輔助細(xì)胞1和CD8+細(xì)胞毒性T-細(xì)胞以及B-細(xì)胞反應(yīng)反應(yīng)方面顯著優(yōu)于表達(dá)原初HBeAg或HBcAg的DNAs。
實施例19DCs通過HBe-Fc DNA疫苗接種的系統(tǒng)性活化為了評價HBe-Fc或HBeAg蛋白從轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞中分泌并通過體循環(huán)以進(jìn)行抗原呈遞的可能性，進(jìn)行DC轉(zhuǎn)移實驗。將DCs從免疫接種小鼠體內(nèi)分離并轉(zhuǎn)入幼鼠以便評價轉(zhuǎn)化的DCs是否可以致敏原初CD4+和CD8+T-細(xì)胞。在1個月后處死免疫接種HBeAg-Fc、PEA-HBe或?qū)φ誅NA疫苗的小鼠。將小鼠CD11c(N418)MicroBeads(Miltenyi Biotec)用于從小鼠脾臟中分離DCs。將CD11c+DCs注入(IP或IV)幼鼠(約1-5×105/小鼠)。在DC轉(zhuǎn)移2-4周后，處死小鼠并監(jiān)測不同小鼠的抗原特異性CD4+和CD8+T-細(xì)胞反應(yīng)。正如附圖24中所示，來自HBe-Fc免疫接種小鼠脾細(xì)胞的DCs有效激活了原初T-細(xì)胞反應(yīng)，而來自HBe或HBc免疫接種小鼠脾細(xì)胞的DCs沒有在幼鼠體內(nèi)激活T-細(xì)胞。該結(jié)果與PCR和攝入測定試驗的結(jié)果共同表明通過FcγR-介導(dǎo)的抗原胞吞作用可促進(jìn)DC抗原呈遞。
實施例20改變的膜和胞內(nèi)蛋白的分泌可以將含有防止蛋白質(zhì)膜運輸和分泌的序列或缺乏分泌用信號序列的膜蛋白和胞內(nèi)蛋白用于本發(fā)明的策略而不需進(jìn)一步修改。預(yù)計阻斷蛋白質(zhì)分泌的序列的缺失或突變可以導(dǎo)致蛋白質(zhì)分泌。膜蛋白通常含有高比例的疏水氨基酸，由此改變這些蛋白質(zhì)的疏水性，使得它們被靶向而分泌。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到還可以將retrogen策略用于增強(qiáng)這些蛋白質(zhì)的免疫原性。用于缺失或突變膜蛋白的兩個實例是HPVE7和EBV蛋白。
E7是一種胞質(zhì)蛋白。一段帶電荷殘基的存在阻礙了該蛋白質(zhì)的分泌。消除這些殘基有利于蛋白質(zhì)的分泌并使該蛋白質(zhì)保持穩(wěn)定(附
圖17)。因此，通過兩次PCR反應(yīng)使HPV 16 E7蛋白的一段帶電荷殘基在該構(gòu)建體中缺失(實心方塊)。結(jié)果是在與前導(dǎo)信號(IL-2)連接后截短的E7蛋白的分泌得到了顯著提高。
EBV核心抗原1是一種核蛋白，它含有一段會干擾蛋白質(zhì)膜運輸和分泌的疏水氨基酸殘基。在一項研究中，使EBNA1蛋白中的該段疏水氨基酸殘基缺失。結(jié)果是截短的EBNA1蛋白在與前導(dǎo)信號序列連接后可有效地從細(xì)胞中分泌。
除所述序列缺失或截短外，本領(lǐng)域技術(shù)人員還認(rèn)識到還可以使該序列發(fā)生突變以便降低蛋白質(zhì)的疏水性。位點定向誘變通過將一種或多種多核苷酸序列改變導(dǎo)入所選擇的DNA而制備和測試了序列變體。
一般來說，首先獲得單鏈載體或融合雙鏈載體的兩個鏈，在其序列中包括編碼所需蛋白質(zhì)或遺傳因子的DNA序列。然后使用單鏈DNA制備物使以合成方式制備的含有所需突變序列的寡核苷酸引物退火，當(dāng)選擇雜交條件時要考慮到失配的程度。使雜交產(chǎn)物接觸諸如大腸桿菌聚合酶I(克列諾片段)這樣的DNA聚合酶以便完成對含有突變的鏈的合成。因此，形成異源雙鏈，其中一個鏈編碼原始的非突變序列而第二個鏈帶有所需的突變。接著將這種雙鏈載體用于轉(zhuǎn)化諸如大腸桿菌細(xì)胞這樣的合適的宿主細(xì)胞并選擇包括帶有突變序列排列的重組載體的克隆。
位點定向誘變公開在美國專利5,220,007、5,284,760、5,354,670、5,366,878、5,389,514、5,635,377和5,789,166中。
除膜蛋白外，還可以修飾胞內(nèi)蛋白，從而產(chǎn)生分泌。一種這樣的修飾方法僅在于添加信號前導(dǎo)序列。例如，MAGE是一種缺乏分泌用信號序列的蛋白質(zhì)。在實施例7中，通過使用PCR技術(shù)將信號序列添加到MAGE中。向MAGE中添加信號序列能夠使這種胞內(nèi)蛋白得到分泌。另一種對胞內(nèi)蛋白的修飾方法是改變通常屬于一種胞內(nèi)蛋白的前體，使得它類似于成熟蛋白而得到分泌。例如，IL-1β前體蛋白是一種胞質(zhì)蛋白，且可分泌成熟蛋白。因此，Siders和Mizel(《生物學(xué)與化學(xué)雜志》(J.Biol.Chem.)1995)截短了該前體蛋白中的氨基酸殘基。他們的解釋是使100-104位之間的幾個氨基酸缺失可將截短蛋白質(zhì)的分泌水平增加到成熟IL-1β的水平。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠應(yīng)用這種信息來改變其它胞內(nèi)蛋白。
進(jìn)一步的修飾包括應(yīng)用從細(xì)胞中釋放的病毒顆粒。因此，將retrogen與病毒基因融合并裝配入用于釋放的病毒顆粒。病毒顆粒由被蛋白質(zhì)殼包圍的核酸基因組構(gòu)成。通過本領(lǐng)域中眾所周知方法中的任何一種來包裝病毒顆粒。
實施例21蛋白質(zhì)的糖基化在本領(lǐng)域中已知IgG-Fc的糖基化對通過FcγR識別使效應(yīng)細(xì)胞得到最佳活化來說是必不可少的。因此，必須在能夠進(jìn)行糖基化的系統(tǒng)中產(chǎn)生含有Fc部分的重組融合蛋白，條件是與FcγR結(jié)合對其可能的應(yīng)用來說是必不可少的。通常將桿狀病毒昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)用于產(chǎn)生高產(chǎn)率的重組蛋白。該系統(tǒng)向糖蛋白中添加核心寡糖和外臂(outer arm)糖殘基的能力對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是眾所周知的且使一種合適的系統(tǒng)表達(dá)和純化HBe-Fc融合蛋白成為可能。
構(gòu)建tHBeAgFc質(zhì)粒中包含的1230bp的HBeFc片段，它表達(dá)由與IgG Fc以符合讀框形式融合的截短的HBeAg組成的分泌性HBe-Fc蛋白。簡單地說，使用帶有pFB1供體質(zhì)粒的pFastBac系統(tǒng)(Gibco BRL)產(chǎn)生重組HBe-Fc桿狀病毒。首先使用下列引物從tHBeAgFc模板對HBe-Fc片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增分別是5’引物(DEQ ID NO.17)5’-GATCGAATTCATGCAACTTTTTCACCTCTGC-3’和3’引物(DEQ ID NO.18)5’-GATCAAGCTTTCATTTACCCGGAGACAGGGA-3’，從而將EcoRI和HindIII限制位點導(dǎo)入5’和3’末端。將這種PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠純化、消化并連入EcoRI/HindIII切割的pFB1供體質(zhì)粒中。通過限制酶分析鑒定所得的載體(pFB1-HBeFc)并通過DNA測序來證實。通過用pFB1-HBeFc供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH10Bac大腸桿菌將來自供體質(zhì)粒的HBe-Fc表達(dá)彈夾轉(zhuǎn)座入桿狀病毒基因組。當(dāng)轉(zhuǎn)座入桿粒破壞lacZα肽的表達(dá)時，通過X-gal選擇來鑒定重組桿狀病毒。通過小量制備分離重組桿粒DNA并按照制造商的說明將其用于轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞。
通過用0.5ml的病毒儲備液轉(zhuǎn)染50ml、2×106個細(xì)胞/ml的Sf9細(xì)胞混懸液培養(yǎng)物來擴(kuò)增獲自起始轉(zhuǎn)染的病毒儲備液并在48小時后收集上清液。然后使該儲備液再進(jìn)行兩個循環(huán)的擴(kuò)增，此時＞90％的細(xì)胞產(chǎn)生重組HBe-Fc，正如通過對感染細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色所監(jiān)測到的。接著將擴(kuò)增的儲備液用于將4份100ml的Sf9細(xì)胞培養(yǎng)物感染72-90小時。收集上清液并在4℃下通過以14,000RPM離心20分鐘來使該上清液凈化。接下來使澄清的上清液通過5ml洗滌吸附劑凝膠柱(Boehringer Mannheim)以便除去可能干擾蛋白質(zhì)回收的泊洛沙姆(pluronic)。然后通過以1ml/分鐘的流速過蛋白質(zhì)G柱(Pharmacia)從上清液中純化重組HBe-Fc蛋白。將該柱用10個體積的100mM、pH6.0的Tris和10mM、pH 6.0的Tris依次洗滌并用10個體積pH 2.7的100mM甘氨酸將所述蛋白質(zhì)洗脫在1ml級分中。立即通過添加1/10體積的1M、pH 8.0的Tris將所有級分的pH調(diào)節(jié)至中性。通過A280測定含有蛋白質(zhì)的級分并通過12％SDS-PAGE進(jìn)行分離以便測定純度。然后使純化的級分進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。簡單地說，在還原(R)或非還原(NR)條件下通過12％SDS-PAGE分離了15μg含有主要蛋白質(zhì)的洗脫級分、將它們轉(zhuǎn)到硝化纖維上、印跡并使用ECL蛋白質(zhì)印跡檢測試劑展開。初次抗體、家兔抗-HBc、二次抗體、小鼠抗-家兔-過氧化物酶綴合物。
實施例22結(jié)合在MHC-II上的抗原的鑒定本發(fā)明用于鑒定結(jié)合在MHC-II上的病毒抗原，即HIV、HCV、EBV、細(xì)菌抗原、其它病原體抗原、腫瘤抗原和涉及自身免疫病的自身抗原。將本發(fā)明中的表達(dá)載體進(jìn)行修飾以便包括“測試”多核苷酸。尚不了解引起免疫反應(yīng)的多核苷酸序列。本發(fā)明的策略鑒定了用于開發(fā)新疫苗的新抗原/表位。
首先使用來自所選擇的細(xì)胞即腫瘤細(xì)胞的mRNA構(gòu)建cDNA文庫。當(dāng)由以極高水平表達(dá)所關(guān)注的多核苷酸序列的細(xì)胞或組織制備cDNA時，可以通過最小的努力選擇含有所述多核苷酸序列的多個cDNA克隆。就較少轉(zhuǎn)錄的多核苷酸序列而言，可以將各種方法用于在制備文庫前富集特定的mRNAs。將逆轉(zhuǎn)錄病毒用作所述文庫的載體。逆轉(zhuǎn)錄病毒文庫提供了將高復(fù)雜度文庫輸送入實際上任何的有絲分裂活性細(xì)胞類型以表達(dá)克隆的理想方式。因為病毒顆粒以高效感染，所以它們可輸送比基于轉(zhuǎn)染的方法更為復(fù)雜的文庫。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到可以將任何的載體用于該文庫。通過使用本領(lǐng)域中眾所周知的方法來構(gòu)建cDNA文庫。簡單地說，由腫瘤樣品建立腫瘤細(xì)胞系。通過與來源于單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的哺乳動物腫瘤裂解物脈沖的DCs共培養(yǎng)使來自相同哺乳動物外周血液的CD4+ T-細(xì)胞膨脹。鑒定由膨脹的自體CD4+T-細(xì)胞識別的這些腫瘤細(xì)胞。接下來將所述細(xì)胞系平板固定在96孔中。將膨脹的自體CD4+T-細(xì)胞添加到96孔中并監(jiān)測96孔共培養(yǎng)基中IFN-γ或GM-CSF的濃度。下一步是培養(yǎng)并從陽性腫瘤細(xì)胞中提取mRNA。將分離的mRNA轉(zhuǎn)化成cDNA并插入例如帶有GFP標(biāo)記的慢病毒載體這樣的載體中或?qū)y試cDNAs克隆入本發(fā)明的表達(dá)載體。將測試cDNAs克隆入例如附圖25中所述的信號序列與細(xì)胞結(jié)合元件之間的載體中。一旦構(gòu)建了cDNA文庫，就將病毒載體轉(zhuǎn)染入包裝細(xì)胞。接著用重組載體轉(zhuǎn)導(dǎo)來源于來自具有相同MHC-II基因型的哺乳動物單核細(xì)胞的未成熟DCs并測定效率。將轉(zhuǎn)導(dǎo)的DCs與膨脹的自體CD4+T-細(xì)胞一起共培養(yǎng)。通過ELISA(GM-CSF)或經(jīng)流式細(xì)胞排列的IL2表面表達(dá)來鑒定陽性克隆。對該陽性克隆進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測序以便測定蛋白質(zhì)(附圖26)。
篩選人基因組以便鑒定編碼由CD4+ T-細(xì)胞識別的蛋白質(zhì)和表位的多核苷酸序列。將這些多核苷酸序列用于癌癥療法或誘發(fā)對自身免疫病療法的免疫耐受性或用于基因療法。這種基本的篩選過程為用于設(shè)計小治療分子的表位提供了鑒定方法。
因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到可以將這種篩選過程進(jìn)行改變以便篩選不同的基因組，即人、病毒、細(xì)菌或寄生蟲基因組。cDNA文庫的構(gòu)建在本領(lǐng)域中是眾所周知的。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠應(yīng)用這種信息來改變本發(fā)明以便鑒定抗原。
本說明書中所述的全部專利和公開出版物表明了本發(fā)明涉及的本領(lǐng)域技術(shù)人員的水平。將全部專利和公開出版物引入本文作為參考，就如同特別和分別指定將各個公開文獻(xiàn)引入作為參考一樣。
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本領(lǐng)域技術(shù)人員會輕易地理解為適應(yīng)本發(fā)明的目的可以對本發(fā)明進(jìn)行充分的修改并獲得所述的以及其中固有的結(jié)果和優(yōu)點。本文所述的疫苗、載體、方法、步驟和技術(shù)是目前優(yōu)選實施方案的代表且是典型的而不用來限定范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員對其中所作的改變和其它應(yīng)用也包括在本發(fā)明或由所附權(quán)利要求范圍定義的范圍內(nèi)。
序列表<110>CHEN，SI-YI AND ZHAOYANG，YOU<120>用于鑒定引起免疫反應(yīng)的抗原的組合物和方法<130>TBA<140>TBA<141>TBA<150>60/132,752<151>1999-05-06<150>60/132,750<151>1999-05-06<160>19<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>34<212>DNA<213>人類<400>1acgcgtcgac atgcctcttg agcagaggag tcag 34<210>2<211>33<212>DNA<213>人類<400>2ccgctcgagt cactcttccc cctctctcaa aac 33<210>3<211>103<212>DNA<213>人類<400>3acgcgtcgac atgaaggtct ccgcggcagc cctcgctgtc atcctcattg ctactgccct 60ctgcgctcct gcatctgcca tgcctcttga gcagaggagt cag 103<210>4<211>38<212>DNA<213>人類<400>4ataagaatgc ggccgctctc ttccccctct ctcaaaac 38<210>5<211>31<212>DNA<213>人類<400>5ataagcggcc gctaaaactc acacatgccc a 31<210>6<211>33<212>DNA<213>人類<400>6ccgctcgagt catttacccg gagacaggga gag 33<210>7<211>55<212>DNA<213>人類<400>7gcagctccca gatgggtcct gtccaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcac 55<210>8<211>68<212>DNA<213>人類<400>8acgcgtcgac atgggaacat ctgtggttct tccttctcct ggtggcagct cccagatggg 60tcctgtcc 68<210>9<211>35<212>DNA<213>乙型肝炎病毒<400>9ttaagcttat gcaacttttt cacctctgcc taatc35<210>10<211>34<212>DNA<213>乙型肝炎病毒<400>10tttctagaat cgattaacat tgagattccc gaga 34<210>11<211>37<212>DNA<213>乙型肝炎病毒<400>11gtgcggccgc tctaacaaca gtagtttccg gaagtgt 37<210>12<211>40<212>DNA<213>乙型肝炎病毒<400>12ttaagcttat ggacattgac ccttataaag aatttggagc 40<210>13<211>31<212>DNA<213>人類<400>13ataagcggcc gctaaaactc acacatgccc a 31<210>14<211>36<212>DNA<213>人類<400>14tattctagat cgatcactca tttacccgga gacagg36<210>15<211>55<212>DNA<213>人類(前30)/鼠(后25)<400>15gcagctccca gatgggtcct gtccaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcac 55<210>16<211>69<212>DNA<213>鼠<400>16ttaagcttca tatgggaaca tctgtggttc ttccttctcc tggtggcagc tcccagatgg 60gtcctgtcc 69<210>17<211>31<212>DNA<213>乙型肝炎病毒<400>17gatcgaattc atgcaacttt ttcacctctg c 31<210>18<211>31<212>DNA<213>人類<400>18gatcaagctt tcatttaccc ggagacaggg a 31<210>19<211>98<212>PRT<213>人類乳頭瘤E7型病毒<400>19Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln1 5 10 15Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Ser Asp Ser Ser20 25 30Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp35 4045Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr5055 60Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu65 70 7580Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln85 9095Lys Pro
權(quán)利要求
1.一種表達(dá)載體，它包括均為可操作地連接的多核苷酸啟動子序列、編碼信號序列的多核苷酸、編碼抗原的多核苷酸、編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列。
2.權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其中所述的多核苷酸啟動子序列選自組成型啟動子、誘導(dǎo)型啟動子和組織特異性啟動子組成的組。
3.權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體，其中所述的組成型啟動子選自下列啟動子組成的組猿猴病毒40(SV40)早期啟動子、小鼠乳腺瘤病毒啟動子、人免疫缺陷病毒長末端重復(fù)啟動子、莫洛尼氏病毒啟動子、鳥白血病病毒啟動子、EB病毒立即早期啟動子、勞斯肉瘤病毒啟動子、人肌動蛋白啟動子、人肌球蛋白啟動子、人血紅蛋白啟動子、巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子和人肌酸啟動子。
4.權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體，其中所述的誘導(dǎo)型啟動子選自金屬硫蛋白啟動子、糖皮質(zhì)激素啟動子、孕酮啟動子和四環(huán)素啟動子組成的組。
5.權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體，其中所述的組織特異性啟動子選自HER-2啟動子和與PSA相關(guān)聯(lián)的啟動子組成的組。
6.權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其中所述的編碼信號序列的多核苷酸選自乙型肝炎病毒E抗原信號序列、免疫球蛋白重鏈前導(dǎo)序列和細(xì)胞因子前導(dǎo)序列組成的組。
7.權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其中所述的編碼抗原的多核苷酸包括用于至少一個表位的多核苷酸序列，其中所述的至少一個表位誘發(fā)哺乳動物體內(nèi)的B細(xì)胞反應(yīng)。
8.權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其中所述的編碼抗原的多核苷酸包括用于至少一個表位的多核苷酸序列，其中所述的至少一個表位誘發(fā)哺乳動物體內(nèi)的CD4+T-細(xì)胞反應(yīng)。
9.權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其中所述的編碼抗原的多核苷酸包括用于至少一個表位的多核苷酸序列，其中所述的至少一個表位誘發(fā)哺乳動物體內(nèi)的CD8+T-細(xì)胞反應(yīng)。
10.權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其中所述的編碼抗原的多核苷酸包括用于至少一個表位的多核苷酸序列，其中所述的至少一個表位誘發(fā)導(dǎo)入了所述抗原的哺乳動物體內(nèi)的B細(xì)胞反應(yīng)、CD4+T-細(xì)胞反應(yīng)和CD8+T-細(xì)胞反應(yīng)。
11.權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其中所述的編碼抗原的多核苷酸包括用于多個表位的多核苷酸序列，其中所述的多個表位誘發(fā)導(dǎo)入了所述抗原的哺乳動物體內(nèi)的B細(xì)胞反應(yīng)、CD4+T-細(xì)胞反應(yīng)和CD8+T-細(xì)胞反應(yīng)。
12.權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其中所述的編碼抗原的多核苷酸是一種多核苷酸序列，它選自至少一種與疾病相關(guān)的多核苷酸序列，其中所述的疾病選自感染性疾病、癌癥和自身免疫病組成的組。
13.權(quán)利要求12所述的表達(dá)載體，其中所述的編碼抗原的多核苷酸是一種多核苷酸序列，它選自至少一種來自感染性疾病的多核苷酸序列，其中所述的感染性疾病是由選自病毒、細(xì)菌、真菌和原生動物組成的組的致病微生物引起的。
14.權(quán)利要求13所述的表達(dá)載體，其中所述的編碼抗原的多核苷酸是一種多核苷酸序列，它選自至少一種來自病毒基因的多核苷酸序列，其中所述的病毒基因選自乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、乳頭瘤病毒和皰疹病毒組成的組。
15.權(quán)利要求14所述的表達(dá)載體，其中所述的乙型肝炎病毒是乙型肝炎病毒e抗原或乙型肝炎病毒核心抗原。
16.權(quán)利要求14所述的表達(dá)載體，其中所述的人免疫缺陷病毒是gp160或gp120。
17.權(quán)利要求14所述的表達(dá)載體，其中所述的乳頭瘤病毒是乳頭瘤病毒E7或乳頭瘤病毒E6。
18.權(quán)利要求14所述的表達(dá)載體，其中所述的皰疹病毒選自下列病毒組成的組單純皰疹1型病毒、單純皰疹2型病毒、EB病毒、巨細(xì)胞病毒、人皰疹6型病毒、人皰疹7型病毒和人皰疹8型病毒。
19.權(quán)利要求12所述的表達(dá)載體，其中所述的疾病選自乳腺癌、宮頸癌、黑素瘤、腎癌和前列腺癌組成的組。
20.權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其中所述的編碼用于抗原的序列的多核苷酸是一種多核苷酸序列，它選自編碼酪氨酸酶、MART、trp、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、gp100、HER-2、Ras和PSA的多核苷酸序列組成的組。
21.權(quán)利要求12所述的表達(dá)載體，其中所述的疾病選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化、銀屑病和局限性回腸炎組成的組。
22.權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其中所述的編碼抗原的多核苷酸編碼Fc抗體片段或白細(xì)胞介素。
23.權(quán)利要求22所述的表達(dá)載體，其中所述的多核苷酸序列編碼白細(xì)胞介素5。
24.權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其中所述的編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸是一種與細(xì)胞表面受體結(jié)合的配體的多核苷酸序列。
25.權(quán)利要求24所述的表達(dá)載體，其中所述的配體的多核苷酸序列選自編碼Fc片段、毒素細(xì)胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域、細(xì)胞因子、小肽和抗體的多核苷酸序列組成的組。
26.權(quán)利要求25所述的表達(dá)載體，其中所述的多核苷酸序列編碼假單胞菌外毒素細(xì)胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
27.權(quán)利要求25所述的表達(dá)載體，其中所述的多核苷酸序列編碼白細(xì)胞介素5或白細(xì)胞介素6。
28.權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其中所述的編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸是一種同源多核苷酸序列或異源多核苷酸序列。
29.權(quán)利要求28所述的表達(dá)載體，其中所述的編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸是一種同源Fc片段。
30.權(quán)利要求28所述的表達(dá)載體，其中所述的編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸是一種異源Fc片段。
31.權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其中所述的表達(dá)載體進(jìn)一步包括有利于將所述表達(dá)載體整合入細(xì)胞基因組的整合信號序列。
32.權(quán)利要求31所述的表達(dá)載體，其中所述的整合信號序列是一種病毒長末端重復(fù)序列或腺伴隨病毒ITR序列。
33.權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其中所述的載體選自病毒載體、細(xì)菌載體和哺乳動物載體組成的組。
34.一種包括表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，其中所述的表達(dá)載體包括均為可操作地連接的多核苷酸啟動子序列、編碼信號序列的多核苷酸、編碼抗原的多核苷酸、編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列。
35.權(quán)利要求34所述的細(xì)胞，其中所述的細(xì)胞是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。
36.權(quán)利要求35所述的細(xì)胞，其中所述的真核細(xì)胞選自由酵母、昆蟲和哺乳動物組成的真核細(xì)胞的組。
37.一種包括信號序列、抗原和細(xì)胞結(jié)合元件的融合蛋白。
38.一種包括表達(dá)載體的疫苗，其中所述的表達(dá)載體包括編碼啟動子序列的多核苷酸、編碼分泌信號序列的多核苷酸、編碼抗原的多核苷酸、編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸和編碼聚腺苷酸化序列的多核苷酸，其中所述的序列均是可操作地連接的。
39.一種包括抗原呈遞細(xì)胞的疫苗，其中在體外用權(quán)利要求37所述的融合蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)所述的抗原呈遞細(xì)胞。
40.一種包括抗原呈遞細(xì)胞的疫苗，其中在體外用權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)所述的抗原呈遞細(xì)胞。
41.一種包括權(quán)利要求37所述的融合蛋白的疫苗。
42.一種表達(dá)載體，它至少包括編碼信號序列的多核苷酸、編碼抗原的多核苷酸和編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸。
43.一種引起針對抗原的免疫反應(yīng)的方法，該方法包括下列步驟將表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞，其中所述的表達(dá)載體包括均為可操作地連接的多核苷酸啟動子序列、編碼信號序列的多核苷酸、編碼所述抗原的多核苷酸、編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列；和在下列條件下表達(dá)所述的載體以便產(chǎn)生所述的抗原其中所述的抗原分泌自所述細(xì)胞；所述的分泌抗原被胞吞入所述細(xì)胞；在所述細(xì)胞內(nèi)加工所述的胞吞抗原；和將所述加工的抗原呈遞給細(xì)胞表面蛋白，從而引起T-細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。
44.權(quán)利要求43所述的方法，其中將所加工的抗原呈遞給選自MHC-I、MHC-II或B-細(xì)胞受體組成的組的細(xì)胞表面蛋白。
45.權(quán)利要求43所述的方法，其中所述的抗原由第一種細(xì)胞分泌并由第二種細(xì)胞攝入。
46.權(quán)利要求45所述的方法，其中所述的第一種細(xì)胞和第二種細(xì)胞是抗原呈遞細(xì)胞。
47.權(quán)利要求45所述的方法，其中所述的第一種細(xì)胞是非抗原呈遞細(xì)胞且所述的第二種細(xì)胞是抗原呈遞細(xì)胞。
48.權(quán)利要求47所述的方法，其中所述的第一種細(xì)胞是肌細(xì)胞。
49.一種引起針對抗原的免疫反應(yīng)的方法，該方法包括通過非腸道途徑直接給哺乳動物施用權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體的步驟。
50.權(quán)利要求43所述的方法，其中所述的多核苷酸啟動子序列選自組成型啟動子、誘導(dǎo)型啟動子和組織特異性啟動子組成的組。
51.權(quán)利要求50所述的方法，其中所述的組成型啟動子選自下列啟動子組成的組猿猴病毒40(SV40)早期啟動子、小鼠乳腺瘤病毒啟動子、人免疫缺陷病毒長末端重復(fù)啟動子、莫洛尼氏病毒啟動子、鳥白血病病毒啟動子、EB病毒立即早期啟動子、勞斯肉瘤病毒啟動子、人肌動蛋白啟動子、人肌球蛋白啟動子、人血紅蛋白啟動子、巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子和人肌酸啟動子。
52.權(quán)利要求50所述的方法，其中所述的誘導(dǎo)型啟動子選自金屬硫蛋白啟動子、糖皮質(zhì)激素啟動子、孕酮啟動子和四環(huán)素啟動子組成的組。
53.權(quán)利要求50所述的表達(dá)載體，其中所述的組織特異性啟動子選自HER-2啟動子和與PSA相關(guān)聯(lián)的啟動子組成的組。
54.權(quán)利要求43所述的方法，其中所述的編碼信號序列的多核苷酸選自乙型肝炎病毒e抗原信號序列、免疫球蛋白重鏈前導(dǎo)序列和細(xì)胞因子前導(dǎo)序列組成的組。
55.權(quán)利要求43所述的方法，其中所述的編碼抗原的多核苷酸是一種多核苷酸序列，它選自至少一種與疾病相關(guān)的多核苷酸序列，其中所述的疾病選自感染性疾病、癌癥和自身免疫病組成的組。
56.權(quán)利要求55所述的方法，其中所述的編碼抗原的多核苷酸是一種多核苷酸序列，它選自至少一種來自感染性疾病的多核苷酸序列，其中所述的感染性疾病是由選自病毒、細(xì)菌、真菌和原生動物組成的組的致病微生物引起的。
57.權(quán)利要求56所述的方法，其中所述的編碼抗原的多核苷酸是一種多核苷酸序列，它選自至少一種來自病毒基因的多核苷酸序列，其中所述的病毒基因選自乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、乳頭瘤病毒和皰疹病毒組成的組。
58.權(quán)利要求57所述的方法，其中所述的乙型肝炎病毒是乙型肝炎病毒e抗原或乙型肝炎病毒核心抗原。
59.權(quán)利要求57所述的方法，其中所述的人免疫缺陷病毒是gp160或gp120。
60.權(quán)利要求57所述的方法，其中所述的乳頭瘤病毒是乳頭瘤病毒E7或乳頭瘤病毒E6。
61.權(quán)利要求57所述的方法，其中所述的皰疹病毒選自下列病毒組成的組單純皰疹1型病毒、單純皰疹2型病毒、EB病毒、巨細(xì)胞病毒、人皰疹6型病毒、人皰疹7型病毒和人皰疹8型病毒。
62.權(quán)利要求55所述的方法，其中所述的疾病選自乳腺癌、宮頸癌、黑素瘤、腎癌和前列腺癌組成的組。
63.權(quán)利要求55所述的方法，其中所述的疾病選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化、銀屑病和局限性回腸炎。
64.權(quán)利要求43所述的方法，其中所述的編碼抗原的多核苷酸編碼Fc抗體片段或白細(xì)胞介素。
65.權(quán)利要求64所述的方法，其中所述的多核苷酸序列編碼白細(xì)胞介素5。
66.權(quán)利要求43所述的方法，其中所述的編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸是一種與細(xì)胞表面受體結(jié)合的配體的多核苷酸序列。
67.權(quán)利要求66所述的方法，其中所述的配體的多核苷酸序列選自編碼Fc片段、毒素細(xì)胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域、細(xì)胞因子、小肽和抗體的多核苷酸序列組成的組。
68.權(quán)利要求67所述的方法，其中所述的多核苷酸序列編碼假單胞菌外毒素細(xì)胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
69.權(quán)利要求67所述的方法，其中所述的多核苷酸序列編碼白細(xì)胞介素5或白細(xì)胞介素6。
70.權(quán)利要求43所述的方法，其中所述的編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸是一種同源多核苷酸序列或異源多核苷酸序列。
71.權(quán)利要求70所述的方法，其中所述的編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸是一種同源Fc片段。
72.權(quán)利要求70所述的方法，其中所述的編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸是一種異源Fc片段。
73.權(quán)利要求43所述的方法，其中所述的表達(dá)載體進(jìn)一步包括有利于將所述表達(dá)載體整合入細(xì)胞基因組的整合信號序列。
74.權(quán)利要求73所述的方法，其中所述的整合信號序列是一種病毒長末端重復(fù)序列或腺伴隨病毒ITR序列。
75.權(quán)利要求43所述的方法，其中所述的載體選自病毒載體、細(xì)菌載體和哺乳動物載體組成的組。
76.一種鑒定編碼至少一種結(jié)合在MHC-II上的表位的多核苷酸序列的方法，其中的表位能夠激活CD4+輔助T細(xì)胞，所述的方法包括下列步驟將表達(dá)載體導(dǎo)入抗原呈遞細(xì)胞以便產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗原呈遞細(xì)胞，其中所述的表達(dá)載體包括均為可操作地連接的多核苷酸啟動子序列、編碼信號序列的多核苷酸、編碼測試多肽的多核苷酸、編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列；使所述的轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗原呈遞細(xì)胞與原初T-細(xì)胞或致敏的T-細(xì)胞接觸；和評價是任何的原初T-細(xì)胞還是致敏的T細(xì)胞在與所述轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗原呈遞細(xì)胞接觸時被激活，其中所述T-細(xì)胞的激活表明編碼測試多肽的多核苷酸是一種能夠激活CD4+輔助T細(xì)胞的基因或其片段。
77.權(quán)利要求76所述的方法，其中所述的編碼測試多肽的多核苷酸是一種分離自腫瘤細(xì)胞系的cDNA文庫。
78.權(quán)利要求76所述的方法，其中所述的編碼測試多肽的多核苷酸選自由病毒基因組、細(xì)菌基因組、寄生蟲基因組和人基因組組成的cDNA文庫的組。
79.一種鑒定編碼至少一種結(jié)合在MHC-II上的表位的多核苷酸序列的方法，其中的表位能夠在體內(nèi)引起免疫反應(yīng)，所述的方法包括下列步驟將表達(dá)載體導(dǎo)入抗原呈遞細(xì)胞以便產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗原呈遞細(xì)胞，其中所述的表達(dá)載體包括均為可操作地連接的多核苷酸啟動子序列、編碼信號序列的多核苷酸、編碼測試多肽的多核苷酸、編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列；通過非腸道途徑給哺乳動物施用所述的轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗原呈遞細(xì)胞；收集來自脾細(xì)胞中的T-細(xì)胞并與樹突細(xì)胞一起共培養(yǎng)；和評價T-細(xì)胞的激活情況，其中所述T-細(xì)胞的激活表明編碼測試多肽的多核苷酸是一種能夠激活CD4+輔助T細(xì)胞的多核苷酸序列或其片段。
80.權(quán)利要求79所述的方法，其中所述的編碼測試多肽的多核苷酸是一種分離自腫瘤細(xì)胞系的cDNA文庫。
81.權(quán)利要求79所述的方法，其中所述的編碼測試多肽的多核苷酸選自由病毒基因組、細(xì)菌基因組、寄生蟲基因組和人基因組組成的cDNA文庫的組。
82.一種鑒定編碼至少一種結(jié)合在MHC-II上的表位的多核苷酸序列的方法，所述的表位能夠在體內(nèi)引起免疫反應(yīng)，所述的方法包括下列步驟通過非腸道途徑給哺乳動物施用一種表達(dá)載體，其中所述的表達(dá)載體包括均為可操作地連接的多核苷酸啟動子序列、編碼信號序列的多核苷酸、編碼測試多肽的多核苷酸、編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列；收集來自脾細(xì)胞中的T-細(xì)胞并與樹突細(xì)胞一起共培養(yǎng)；和評價T-細(xì)胞的激活情況，其中所述T-細(xì)胞的激活表明編碼測試多肽的多核苷酸是一種能夠激活CD4+輔助T細(xì)胞的多核苷酸或其片段。
83.權(quán)利要求82所述的方法，其中所述的編碼測試多肽的多核苷酸是一種分離自腫瘤細(xì)胞系的cDNA文庫。
84.權(quán)利要求82所述的方法，其中所述的編碼測試多肽的多核苷酸選自由病毒基因組、細(xì)菌基因組、寄生蟲基因組和人基因組組成的cDNA文庫的組。
85.一種治療癌癥的方法，該方法包括下列步驟鑒定編碼至少一種結(jié)合在MHC-II上的表位的測試多肽，其中在用一種表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞的條件下鑒定所述多肽，所述的表達(dá)載體包括均為可操作地連接的多核苷酸啟動子序列、編碼信號序列的多核苷酸、編碼測試多肽的多核苷酸、編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列；并評價T-細(xì)胞的激活情況，其中所述T-細(xì)胞的激活表明所述編碼測試多肽的多核苷酸是一種能夠激活CD4+輔助T細(xì)胞的基因或其片段；和通過非腸道途徑給哺乳動物施用抗原呈遞細(xì)胞，其中用所述的測試多肽轉(zhuǎn)導(dǎo)所述的抗原呈遞細(xì)胞。
86.一種治療癌癥的方法，該方法包括下列步驟鑒定編碼至少一種結(jié)合在MHC-II上的表位的測試多肽，其中在用一種表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞的條件下鑒定所述多肽，所述的表達(dá)載體包括均為可操作地連接的多核苷酸啟動子序列、編碼信號序列的多核苷酸、編碼測試多肽的多核苷酸、編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列；并評價T-細(xì)胞的激活情況，其中所述T-細(xì)胞的激活表明所述編碼測試多肽的多核苷酸是一種能夠激活CD4+輔助T細(xì)胞的基因或其片段；和通過非腸道途徑給哺乳動物施用一種表達(dá)載體，其中所述的表達(dá)載體至少包括編碼所述測試多肽的多核苷酸和一種編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸。
87.一種治療病毒性感染的方法，該方法包括下列步驟鑒定編碼至少一種結(jié)合在MHC-II上的表位的測試多肽，其中在用一種表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞的條件下鑒定所述多肽，所述的表達(dá)載體包括均為可操作地連接的多核苷酸啟動子序列、編碼信號序列的多核苷酸、編碼測試多肽的多核苷酸、編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列；并評價T-細(xì)胞的激活情況，其中所述T-細(xì)胞的激活表明所述編碼測試多肽的多核苷酸是一種能夠激活CD4+輔助T細(xì)胞的基因或其片段；和通過非腸道途徑給哺乳動物施用抗原呈遞細(xì)胞，其中用所述的測試多肽轉(zhuǎn)導(dǎo)所述的抗原呈遞細(xì)胞。
88.一種治療病毒性感染的方法，該方法包括下列步驟鑒定編碼至少一種結(jié)合在MHC-II上的表位的測試多肽，其中在用一種表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞的條件下鑒定所述多肽，所述的表達(dá)載體包括均為可操作地連接的多核苷酸啟動子序列、編碼信號序列的多核苷酸、編碼測試多肽的多核苷酸、編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列；并評價T-細(xì)胞的激活情況，其中所述T-細(xì)胞的激活表明所述編碼測試多肽的多核苷酸是一種能夠激活CD4+輔助T細(xì)胞的基因或其片段；和通過非腸道途徑給哺乳動物施用一種表達(dá)載體，其中所述的表達(dá)載體至少包括編碼所述測試多肽的多核苷酸和一種編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸。
89.一種治療自身免疫病的方法，該方法包括下列步驟鑒定編碼至少一種結(jié)合在MHC-II上的表位的測試多肽，其中在用一種表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞的條件下鑒定所述多肽，所述的表達(dá)載體包括均為可操作地連接的多核苷酸啟動子序列、編碼信號序列的多核苷酸、編碼測試多肽的多核苷酸、編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列；并評價T-細(xì)胞的激活情況，其中所述T-細(xì)胞的激活表明所述編碼測試多肽的多核苷酸是一種能夠激活CD4+輔助T細(xì)胞的基因或其片段；和通過非腸道途徑給哺乳動物施用抗原呈遞細(xì)胞，其中用所述的測試多肽轉(zhuǎn)導(dǎo)所述的抗原呈遞細(xì)胞。
90.一種治療自身免疫病的方法，該方法包括下列步驟鑒定編碼至少一種結(jié)合在MHC-II上的表位的測試多肽，其中在用一種表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞的條件下鑒定所述多肽，所述的表達(dá)載體包括均為可操作地連接的多核苷酸啟動子序列、編碼信號序列的多核苷酸、編碼測試多肽的多核苷酸、編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列；并評價T-細(xì)胞的激活情況，其中所述T-細(xì)胞的激活表明所述編碼測試多肽的多核苷酸是一種能夠激活CD4+輔助T細(xì)胞的基因或其片段；和通過非腸道途徑給哺乳動物施用一種表達(dá)載體，其中所述的表達(dá)載體包括至少一種編碼所述測試多肽的多核苷酸和一種編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸。
91.一種生產(chǎn)用于對哺乳動物進(jìn)行免疫接種的疫苗的方法，該方法包括下列步驟通過將一種表達(dá)載體導(dǎo)入所述抗原呈遞細(xì)胞來轉(zhuǎn)導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞以便產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗原呈遞細(xì)胞，其中所述的表達(dá)載體包括均為可操作地連接的多核苷酸啟動子序列、編碼信號序列的多核苷酸、編碼抗原的多核苷酸、編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列；和在所述抗原分泌自所述細(xì)胞的條件下表達(dá)所述載體以便產(chǎn)生抗原。
92.一種權(quán)利要求41所述疫苗的給藥方法，其中在對哺乳動物給藥前在體外用所述疫苗轉(zhuǎn)導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞。
93.一種權(quán)利要求38所述疫苗的給藥方法，其中通過非腸道途徑給予所述疫苗。
94.一種權(quán)利要求41所述疫苗的給藥方法，其中在對哺乳動物給藥前在體內(nèi)用所述疫苗轉(zhuǎn)導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞。
95.一種誘發(fā)免疫反應(yīng)的方法，該方法包括給哺乳動物施用細(xì)胞因子表達(dá)載體和retrogen表達(dá)載體的步驟，其中所述的retrogen表達(dá)載體包括均為可操作地連接的多核苷酸啟動子序列、編碼信號序列的多核苷酸、編碼抗原的多核苷酸、編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列。
96.權(quán)利要求95所述的方法，其中所述的細(xì)胞因子表達(dá)載體含有用于GM-CSF的序列。
97.權(quán)利要求95所述的方法，其中所述的細(xì)胞因子表達(dá)載體含有用于IL-2的序列。
98.一種誘發(fā)免疫反應(yīng)的方法，該方法包括給哺乳動物施用一種表達(dá)載體的步驟，其中所述的表達(dá)載體包括在一種啟動子的轉(zhuǎn)錄控制下的編碼細(xì)胞因子蛋白的多核苷酸序列和編碼融合蛋白的多核苷酸序列，其中所述的融合蛋白包括信號序列、抗原和細(xì)胞結(jié)合元件。
99.權(quán)利要求98所述的方法，其中編碼細(xì)胞因子蛋白的多核苷酸序列和編碼融合蛋白的多核苷酸序列均在獨立的轉(zhuǎn)錄控制下，且其中編碼細(xì)胞因子蛋白的多核苷酸序列和編碼融合蛋白的多核苷酸序列以串聯(lián)方式位于一種表達(dá)載體中。
100.一種誘發(fā)免疫反應(yīng)的方法，該方法包括給哺乳動物施用兩種不同的retrogen表達(dá)載體的步驟，其中第一種retrogen表達(dá)載體包括均為可操作地連接的多核苷酸啟動子序列、編碼信號序列的多核苷酸、編碼第一種抗原的多核苷酸、編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列，而第二種retrogen表達(dá)載體包括均為可操作地連接的多核苷酸啟動子序列、編碼信號序列的多核苷酸、編碼第二種抗原的多核苷酸、編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列。
101.一種誘發(fā)免疫反應(yīng)的方法，該方法包括給哺乳動物施用一種表達(dá)載體的步驟，其中所述的表達(dá)載體包括在一種啟動子的轉(zhuǎn)錄控制下的編碼第一種融合蛋白的多核苷酸序列和編碼第二種融合蛋白的多核苷酸序列，其中所述的第一種融合蛋白包括第一種信號序列、第一種抗原和第一種細(xì)胞結(jié)合元件且所述的第二種融合蛋白包括第二種信號序列、第二種抗原和第二種細(xì)胞結(jié)合元件。
102.權(quán)利要求101所述的方法，其中所述的第一種和第二種信號序列是相同的信號序列，第一種和第二種抗原是不同的抗原且所述的第一種和第二種細(xì)胞結(jié)合元件是Fc片段。
103.權(quán)利要求101所述的方法，其中所述的第一種和第二種信號序列是相同的信號序列，第一種和第二種抗原是不同的抗原且所述的第一種和第二種細(xì)胞結(jié)合元件是相同的細(xì)胞結(jié)合元件。
104.權(quán)利要求101所述的方法，其中所述的第一種和第二種信號序列是不同的信號序列，第一種和第二種抗原是不同的抗原且所述的第一種和第二種細(xì)胞結(jié)合元件是相同的細(xì)胞結(jié)合元件。
105.權(quán)利要求101所述的方法，其中所述的第一種和第二種信號序列是相同的信號序列，第一種和第二種抗原是不同的抗原且所述的第一種和第二種細(xì)胞結(jié)合元件是不同的細(xì)胞結(jié)合元件。
106.權(quán)利要求101所述的方法，其中所述的第一種和第二種信號序列是不同的信號序列，第一種和第二種抗原是不同的抗原且所述的第一種和第二種細(xì)胞結(jié)合元件是不同的細(xì)胞結(jié)合元件。
107.權(quán)利要求101所述的方法，其中編碼第一種融合蛋白的多核苷酸序列和編碼第二種融合蛋白的多核苷酸序列均在獨立的轉(zhuǎn)錄控制下，且其中編碼第一種融合蛋白的多核苷酸序列和編碼第二種融合蛋白的多核苷酸序列以串聯(lián)方式位于一種表達(dá)載體中。
108.一種同時誘導(dǎo)CD4+和CD8+T-細(xì)胞的方法，該方法包括給予一種融合蛋白的步驟，其中所述的蛋白質(zhì)包括與細(xì)胞結(jié)合元件融合的MHC-I和MHC-II表位。
109.一種生產(chǎn)融合蛋白的方法，該方法包括下列步驟通過將一種表達(dá)載體導(dǎo)入所述抗原呈遞細(xì)胞來轉(zhuǎn)導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞以便產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗原呈遞細(xì)胞，其中所述的表達(dá)載體包括均為可操作地連接的多核苷酸啟動子序列、編碼信號序列的多核苷酸、編碼抗原的多核苷酸、編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列；和在所述融合蛋白分泌自所述細(xì)胞的條件下表達(dá)所述載體以便產(chǎn)生融合蛋白。
110.一種融合蛋白的給藥方法，該方法包括在對哺乳動物給藥前在體外用所述融合蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞的步驟。
111.一種融合蛋白的給藥方法，該方法包括通過非腸道途徑給哺乳動物施用所述融合蛋白的步驟。
112.一種分泌胞內(nèi)蛋白的方法，該方法包括下列步驟將一種表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞，其中所述的表達(dá)載體包括均為可操作地連接的多核苷酸啟動子序列、編碼信號序列的多核苷酸、編碼胞內(nèi)蛋白的多核苷酸、編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列；和在所述融合蛋白分泌自所述細(xì)胞的條件下表達(dá)所述載體以便產(chǎn)生融合蛋白。
113.權(quán)利要求112所述的方法，其中所述編碼胞內(nèi)蛋白的多核苷酸的一定區(qū)被截短以便增加分泌功效。
114.權(quán)利要求112所述的方法，其中使所述編碼胞內(nèi)蛋白的多核苷酸的一定區(qū)發(fā)生突變以便增加分泌功效。
115.權(quán)利要求112所述的方法，其中所述編碼胞內(nèi)蛋白的多核苷酸是HPV 16 E7。
116.一種分泌膜蛋白的方法，該方法包括下列步驟將一種表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞，其中所述的表達(dá)載體包括均為可操作地連接的多核苷酸啟動子序列、編碼信號序列的多核苷酸、編碼膜蛋白的多核苷酸、編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列；和在所述融合蛋白分泌自所述細(xì)胞的條件下表達(dá)所述載體以便產(chǎn)生融合蛋白。
117.權(quán)利要求116所述的方法，其中所述編碼膜蛋白的多核苷酸的一定區(qū)被截短以便增加分泌功效。
118.權(quán)利要求116所述的方法，其中使所述編碼膜蛋白的多核苷酸的一定區(qū)發(fā)生突變以便增加分泌功效。
119.權(quán)利要求12所述的方法，其中所述編碼膜蛋白的多核苷酸是EBV核心原1。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種表達(dá)載體,其中所述的表達(dá)載體包括均為可操作地連接的多核苷酸啟動子序列、編碼信號序列的多核苷酸、編碼抗原蛋白或肽的多核苷酸、編碼細(xì)胞結(jié)合元件的多核苷酸和多核苷酸聚腺苷酸化序列。更具體地說,本發(fā)明涉及引起針對哺乳動物體內(nèi)抗原的免疫反應(yīng)的方法,該方法包括下列步驟:將所述表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞;在所述抗原分泌自所述細(xì)胞的條件下表達(dá)該載體以便產(chǎn)生抗原;使所分泌的抗原胞吞入細(xì)胞;加工所述抗原;并將片段呈遞給受體以便引起T－細(xì)胞反應(yīng)。此外,本發(fā)明涉及一種疫苗及其使用方法。本發(fā)明還涉及結(jié)合在MHC－II上的表位的鑒定方法。
文檔編號C12N5/08GK1368885SQ00809172
公開日2002年9月11日 申請日期2000年5月5日 優(yōu)先權(quán)日1999年5月6日
發(fā)明者S-Y·陳, Z·尤 申請人:威克福雷大學(xué)